Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кооперативные взаимодействия миелопероксидазы лейкоцитов и опсонинов плазмы крови в системах антимикробной и антиоксидантной защиты

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Кооперативные взаимодействия миелопероксидазы лейкоцитов и опсонинов плазмы крови в системах антимикробной и антиоксидантной защиты"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

-

> ^Г

На правах рукописи ЯНКОВСКИЙ Олег Юлианович

КООПЕРАТИВНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ ЛЕЙКОЦИТОВ И ОПСОНИНОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ В СИСТЕМАХ АНТИМИКРОБНОЙ И АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ

03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 1997

Работа выполнена в лаборатории этимологии Санкт-Петербургского Государственного Университета и лаборатории биохимии ГосНИИ особо чистых биопрепаратов (Санкт-Петербург)

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор С,Н.Лызлова доктор биологических наук В.Н.Кокряков

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор биологических наук,

профессор И. П. Адшарин доктор биологических наук, ст.н.с. С.М. Попов доктор биологических наук, профессор В.А. Рогозкин

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

Защита состоится " Ц " Ое/см^/ья 1997 г. в " /б " часов на заседании диссертационного совета Д 063.57.19 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете (199034, Санкт-Петербург, Университетская наб.,7/9, ауд.90)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан "¿7/ " 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Н.Д.Ещенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Нейтрофильные лейкоциты оснащены мощной системой микробицидных факторов и как эффекторные клетки острого воспаления формируют первую линию защиты организма от инфицирующих микроорганизмов [Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989]. Наряду с уничтожением фагоцитированных микроорганизмов эти клетки способны поражать микробы и в околоклеточном пространстве путем секреции (экзоцитоза) биоцидных факторов. Экстрацеллю-лярные факторы лейкоцитов могут вновь захватываться клетками (ней-трофилами и макрофагами) и использоваться для усиления антимикробного действия последних, то есть их "довооружения" (arming) [Heifetz е.а., 1980; Zabucchi е.а., 1989; Klebanoff, 1992]. Этот феномен впервые открыт в России и получил название "резорбтивной резистентности фагоцитов" [Пигаревский В.Е., 1978]. С другой стороны, наличие биоцидных факторов нейтрофилов в экстрацеллюлярном пространстве является основной причиной повреждения собственных тканей организма в очаге воспаления [Маянский Д.Н., 1991]. Ключевая роль в уничтожении поглощенных микроорганизмов, в инактивации микробов во внеклеточной среде очага воспаления, а также при сопутствующем повреждении тканей нейтрофилами принадлежит миелоперокси-дазе (МПО) — ферменту, продуцирующему наиболее разрушительные формы "активного кислорода" (АФК) [Weiss, 1983]. Основным механизмом, ограничивающим повреждающее действие МПО в очаге воспаления, признана система антиоксидантной защиты организма [Halliwell, 1994]. Физиологические ингибиторы МПО-катализа до настоящего времени не известны. В условиях исчерпания ресурса анти-оксидантов в очаге воспаления, генерируемые ферментом АФК приобретают собственное патогенетическое значение при многих заболеваниях [Halliwell, 1992]. Сведения о наличии других механизмов, подавляющих негативный эффект экстрацеллюлярной МПО, отсутствуют. Мы предположили, что один из способов ограничения повреждающего действия МПО в очаге воспаления может быть сопряжен с механизмом резорбтивной резистентностью фагоцитов и опосредован захватом клетками фермента из внешней среды. Однако на поверхности лейкоцитов отсутствуют специфические рецепторы к МПО (в отличие от ряда других факторов нейтрофилов), а белки-переносчики этого фермента к

фагоцитам неизвестны. В рамках феномена "резорбтивной резистентности" наиболее рациональным путем поражения микроба представляется одновременный захват клеткой объекта фагоцитоза и МПО. Поэтому при поиске белков-возможных переносчиков фермента фагоцитам представляло интерес исследовать в первую очередь возможность взаимодействия МПО с белками плазмы крови, выполняющими функции опсонинов, то есть с белками, способными связываться с объектом фагоцитоза и рецепторами лейкоцитов. В качестве основных объектов исследования были выбраны белки, играющие ключевую роль при осуществлении фагоцитарной реакции — фибронектин (ФН) и иммуноглобулины.

Наличие сродства опсонинов к МПО могло бы иметь важное значение в рамках антимикробной и антиоксидантной систем защиты организма. Во-первых, это концентрирование экстрацеллюлярной МПО вблизи патогена в околоклеточном пространстве, что перенацеливало бы общее биоцидное действие фермента преимущественно в микроби-цидное. Во-вторых, захват клеткой МПО в комплексе с патогеном обеспечил бы поражение последнего уже в фагосоме лейкоцита, что могло бы иметь особое значение для уничтожения микроорганизмов, предотвращающих слияние фагосомы с гранулами фагоцита, содержащими бактерицидные факторы. Наконец, сродство МПО к опсонинам выполняло бы роль механизма для удаления МПО из околоклеточного пространства и уменьшения ее повреждающего действия на окружающие ткани.

Цель и задачи исследования. Основная цель настоящей работы состояла в изучении возможности взаимодействия МПО с опсонинами и в выяснении общих закономерностей такого взаимодействия. При наличии данного эффекта (как базисного для усиления микробицидно-го потенциала фагоцитов и подавления повреждающего действия МПО) на основе выявленных закономерностей предполагалось наметить пути для конструирования новых подходов в антиоксидантной терапии и способов коррекции функционирования микробицидных систем.

Непосредственными задачами работы являлись:

1. Определение количества молекул МПО в нейтрофиле и в МПО-содержащих гранулах, а также концентрации фермента в последних.

2. Исследование влияния экстрацеллюлярной МПО на функциональную активность нейтрофилов.

3. Определение возможности комплексообразования МПО с ФН, 1ёО,

4. Оценка параметров комплексообразования МПО с опсонинами.

5. Изучение влияния лигандов ФН на взаимодействие ФН с МПО.

6. Определение способности ФН ассоциировать белки, модифицированные продуктом МПО-катализа — гипохлоритом.

7. Сравнительная оценка устойчивости супероксиддисмутазы (СОД) и ее пролонгированных форм к действию лейкоцитарных АФК.

Научное значение и новизна работы.

1. В ходе работы определено ранее неизвестное количество молекул МПО в нейтрофиле и в пероксидазосомах клетки, а также концентрация фермента в этих органеллах.

2. Впервые установлено модулирующее действие экстрацеллюляр-ной МПО в отношении нейтрофилов: стимуляция фагоцитоза и подавление продукции супероксидных радикалов в присутствии компонентов плазмы крови.

3. Выявлена способность МПО образовывать комплексы с ключевыми опсонинами плазмы крови: ФН, ^М и ^(5. Определены равновесные кинетические параметры комплексообразования МПО с ФН и 1«С (Кс| и ш(), а также термодинамические параметры взаимодействия МПО с ФН (АО0, АН° и АБ0). Установлено, что "движущей силой" комплексообразования МПО с ФН является энтропийная составляющая свободной энергии (-ТА8).

4. Установлено, что опсонины, кооперируя друг с другом (ФН и [gG) по механизму комплексообразования, образуют новые МПО-свя-зывающие участки с резко усиленным сродством к ферменту.

5. Дополнен спектр естественных лигандов ФН: показано, что к их числу следует отнести МПО и окислительно модифицированные гипохлоритом (продуктом МПО-катализа) белки.

6. Установлена способность ФН ингибировать секрецию нейтро-филами МПО.

7. Расширено представление об организации системы антиоксидан-тной защиты, куда включены механизмы, лимитирующие образование АФК в процессе утилизации молекулярного кислорода; механизмы, ингибирующие специализированные генераторы АФК; а также новый каталитический механизм, нацеленный на уничтожение наиболее реакционных АФК (метионилсульфоксидредуктазный цикл). Данный ре-докс-цикл потенциально способен как участвовать в редокс-регулятор-

ных процессах, так и контролировать уровень протеолитической деструкции.

8. Обосновано наличие каталитического механизма продукции син-глетного кислорода, опосредованного МПО, снимающее противоречие между регистрируемым уровнем генерации этого агента фагоцитирующими нейтрофилами и мощностью известных некаталитических механизмов образования данного оксиданта.

9. Предложен механизм сочетанной продукции миелопероксидазой синглетного кислорода и гипохлорита, объясняющий причину сложной структурной организации этого фермента и необходимость редокс-взаимодействия между его субъединицами, а также генерацию сходных количеств обоих оксидантов фагоцитирующими нейтрофилами.

10. Расширены представления о механизмах гуморально-клеточной кооперации при воспалении за счет обоснования наличия у белков-участников защитных реакций не только "профессиональных" эффек-торных, но и регуляторных функций. Приведена аргументация в пользу сигнальной роли АФК лейкоцитов как модуляторов функций защитных клеток.

Научно-методическое значение работы.

1. Разработан комбинированный аффиннохроматографический метод одновременного выделения высокоочищенных препаратов ФН и плазминогена (ПГ), позволяющий получать более гомогенные и стабильные препараты ФН, чем лучшие зарубежные аналоги.

2. Разработан универсальный метод получения высокоочищенной МПО (метод апробирован при использовании в качестве сырья лейкоцитарной массы периферической крови человека и свиньи, а также свежезаготовленного и криоконсервированного костного мозга).

3. Модифицированы традиционные методы очистки ]gG и ^М путем включения этапов, позволяющих удалить электрофоретически не-регистрируемые примеси.

4. Разработан метод прямой иммобилизации ФН на матрицу носителя.

5. Разработан метод получения иммобилизованного ФН с единообразной ориентацией ет молекул на поверхности сорбента путем использования в качестве спейсера одного из лигандов этого белка.

6. Модифицирован метод реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) для выявления связывающей способности поливалентных белков.

Практическое значение работы. Работа носит в основном экспериментально-теоретический характер. Результатом проведенных исследований явилось объяснение многих неясных аспектов кооперации гуморальных факторов с лейкоцитами и лейкоцитарными факторами. Получены также результаты, характеризующиеся практической направленностью для биотехнологии и медицины:

1. Предложенный нами метод одновременной очистки ФН и ПГ легко поддается масштабированию и может быть использован в качестве первого этапа в производствах препаратов крови без нарушения их технологических схем. Данный метод не влияет на качество исходного сырья, истощая его (плазму крови) лишь от целевых для этого метода белков: ФН и ПГ.

2. Разработан более адекватный критерий оценки устойчивости различных препаратов СОД для антиоксидантной терапии, чем базирующиеся на оценке рН- и термостабилыюсти фермента, и учитывающий реальную окислительно-деструктивную обстановку в очаге воспаления: степень чувствительности фермента к повреждающему действию НгОг, НО' и гипохлорита (субстрата и продуктов МПО-катали-за).

3. Разработан экспресс-метод оценки биосовместимости гемокон-тактных материалов для эфферентной терапии, а также индивидуальной чувствительности пациента к таким материалам. Метод основан на определении интенсивности продукции АФК лейкоцитами крови.

4. Разработан способ повышения биосовместимости гемоконтакт-ных материалов, предусматривающий использование антиоксидантов в гемоперфузионных методах лечения.

5. Предложен новый подход для антиоксидантной терапии, потенциально обеспечивающий концентрирование СОД в патологических участках и одновременное подавление активности генераторов АФК.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Данные о количестве молекул МПО в нейтрофилах и их перок-сидазосомах — основа для реальной оценки биоцидного потенциала этих клеток и их ресурса как источника МПО, выделяемой в околоклеточное пространство.

2. Субъединичная организация молекулы МПО обеспечивает соче-танную каталитическую продукцию синглетного кислорода и гипохлорита, определяет уникальные ферментативные и биоцидные свойства этой пероксидазы.

3. Взаимодействие экстрацеллкйярной МПО с опсонинами плазмы крови — потенциальный механизм довооружения клеток этим ферментом, обеспечивающий снижение повреждающего действия МПО в очаге воспаления.

4. Система антиоксидантной защиты организма включает не только традиционные молекулы-антиоксиданты, но и факторы, ингибиру-ющие и элиминирующие специализированные и неспециализированные генераторы АФК, а также филогенетически сформированные механизмы утилизации молекулярного кислорода без образования его токсических форм.

5. Белки-участники защитных реакций, наряду с их "профессиональными" эффекторными функциями, способны выполнять роль молекул-сигнализаторов, а также выступать в качестве предшественников биологически активных пептидов. Эти их свойства могут использоваться в механизмах сопряжения гуморальных и клеточных реакций при развитии воспаления.

Апробация работы. Материалы, использованные в диссертационной работе, докладывались и представлялись на конференции "Механизмы интеграции биологических систем", Ленинград, 1977; на Всесоюзном симпозиуме "Окислительные ферменты животной клетки", Горький, 1978; на 3-м Всесоюзном симпозиуме по медицинской энзи-мологии, Астрахань, 1979; на 1-м Всесоюзном биофизическом съезде, Москва, 1982; на конференции "Вопросы эволюционной физиологии", Ленинград, 1982; на 6-м Всесоюзном симпозиуме "Химия белков и пептидов", Рига, 1983; на конференции "Механизмы нервной интеграции", Ленинград, 1984; на Всесоюзном симпозиуме "Система мозговых и внемозговых пептидов", Ленинград, 1984; на Всесоюзной конференции "Создание и внедрение малоотходной технологии производства антибиотиков", Москва, 1984; на 3-м Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции лизосом", Тбилиси, 1986; на заседании Ленинградского отделения Всесоюзного общества иммунологов, Ленинград, 1988; на Юбилейной сессии кафедры биохимии Ленинградского ун-та, Ленинград, 1989; на Международной конференции "Medical Biotechnology, Immunization and AIDS", St.Petersburg, 1991; на 1-м Съезде иммунологов России, Новосибирск, 1992; на конференции "Актуальные проблемы инфекционной патологии", С.-Петербург, 1993; на Международной конференции "Biotechnology St.Petersburg'94", С.-Петербург, 1994; на Международной конференции "19th European Cystic Fibrosis Conference",

France, Paris, 1994; на заседании секции С.-Петербургского биохимического общества, С.-Петербург, 1994; на 3-й Международной конференции "AIDS, Cancer and Related Problems", St.Petersburg, 1995; на конференции "Актуальные вопросы военноморской и клинической медицины", С.-Петербург, 1995; на Международном конгрессе "Intern. Congr. on Free Radicals in Health and Disease", Turkey, Istanbul, 1995; на ежегодном собрании международного общества по кислороду "Oxygen'95", USA, Pasadena, 1995; на 8-м международном двухгодичном собрании "VIII Bienial Meet. Int. Soc. Free Radical Res.", Spain, Barcelona, 1996; на 3-м Съезде трансфузиологов России, С.-Петербург, 1996; на 2-м Биохимическом съезде, Москва, 1997. Тезисы сообщений опубликованы в материалах съездов, конференций и симпозиумов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 66 печатных работ (включая 9 проблемно-теоретических статей и 1 главу монографии).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 265 машинописных страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (описания материалов и методов исследования, результатов собственных иследований и их обсуждения), проблемно-теоретической части, заключения, выводов и списка цитированной литературы (433 источника). Материал диссертации проиллюстрирован 14 таблицами и 32 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Препараты белков — объектов настоящего исследования — получали из донорской крови человека. МПО выделяли из лейкоцитарной фракции (лейкомассы) с использованием разработанной нами схемы очистки [7]*, ФН и плазминоген (ПГ) — при помощи предложенного нами комбинированного аффиннохромагографического метода сочетан-нош выделения и очистки обоих белков из плазмы крови [19, 22]. Для выделения IgG и IgM в качестве сырья использовали дефибринирован-

*) Арабские цифры в квадратных скобках - ссылки на собственные работы (приведены в конце автореферата).

ную плазму крови, истощенную от ФН и ПГ. Очистку иммуноглобулинов вели по стандартным методикам [Брок Й., 1987]: IgG — из сыворотки, истощенной от эуглобулинов диализом против Н20, IgM — из эуглобулиновой фракции, обогащенной этим белком [27]. Препарат IgG, предназначенный для изучения белок-белкового взаимодействия с МПО и ФН, истощали от электрофоретически нерегистрируемых примесей антиглобулинов класса IgG на иммобилизованном IgG и дополнительно очищали на иммобилизованном белке A Staphilococcus aureus [27]. Термоагрегированный IgG получали инкубацией раствора этого белка 30 мин при 63°С, выдерживанием раствора в течение ночи при 4°С с последующим его осветлением с помощью центрифугирования (1000 g, 15 мин) [Salvarrey е.а., 1989].

Для иммобилизации на твердофазный носитель (агарозу 4Б) МПО, IgG, белка А и желатины использовали процедуру Rouslahti е.а. (1982), L-лизина — метод Chibber е.а. (1974). Иммобилизацию ФН непосредственно на матрицу, а также на желатинизированную матрицу вели по разработанным нами методикам [27, 32]. Непосредственная иммобилизация ФН на активированный носитель по стандартной методике оказалась невозможна вследствие аутоагрегации белка. Разработанный нами прием заключался в медленной подаче раствора ФН (20 мл/ч) к перемешивающейся суспензии BrCN-активированного носителя при комнатной температуре. Метод иммобилизации ФН на агарозе через его лиганд (желатину) заключался в полном насыщении желатин-ага-розы очищенным ФН и фиксацией его глутаровым альдегидом с последующим восстановлением оснований Шиффа боргидридом натрия [31]. Полученные препараты иммобилизованных белков обладали следующими характеристиками: ФН-агароза— 4,2 мг белка/мл геля (10,9 мкМ), эффективность иммобилизации — 100%; ФН-желатин-агароза — 1,6 мг ФН/мл геля (4,2 мкМ), эффективность иммобилизации — 100%; МПО-агароза — 5 мг/мл геля (38,7 мкМ), эффективность иммобилизации — 100%; IgG-агароза — 2,6 мг/мл геля (20,1 мкМ), эффективность иммобилизации — 52%; желатин-агароза— 2,53 мг/мл геля, эффективность иммобилизации — 67,2%; белок А-агароза — 3,75 мг/ мл геля, эффективность иммобилизации — 69%. Лизин-агарозу, жела-тин-агарозу и гепарин-агарозу (последний сорбент — производства ф-Kemotex, Эстония) использовали для выделения и очистки ФН и ПГ, белок А-агарозу и IgG-агарозу — для доочистки IgG. Иммобилизованные ФН, IgG и МПО — для изучения взаимодействия этих белков

друг с другом методом количественной аффинной хроматографии в варианте распределительного равновесия [Winzor, 1988].

Оценку наличия взаимодействия МПО с ФН, IgG и IgM проводили адаптированным для этой цели методом РИГА, где в качестве аналога антигена использовали для сенсибилизации бараньих эритроцитов МПО, а аналогом антител (жидкофазного реагента) выступали ФН или полученные нами препараты иммуноглобулинов, предварительно истощенные эритроцитами барана от антиэритроцитарных антител. Этот же метод был нами использован для оценки возможности жидкофазного ФН взаимодействовать с эритроцитами, сенсибилизированными гипохлорит-окисленными белками (IgG, ЧСА и ПГ). Модификацию белков этим продуктом МПО-катализа вели при концентрации последнего, регистрируемой в очаге воспаления (50 мкМ) [33]. Для получения гипохлорита был применен метод окисления NaOH газообразным хлором, генерируемым в ходе взаимодействия перманганата с концентрированной НС1 [Карякин, Ангелов, 1974]. Окислительную модификацию СОД осуществляли гипохлоритом, Н2О2 или гидроксильным радикалом (НО). Последний генерировали с помощью реакции восстановления Н2О2 двухвалентным железом [Visser е.а., 1991]. Обработку препарата ФН катепсином G и эластазой нейтрофилов проводили в соответствии с рекомендацией Vartio е.а. (1982): реакционную смесь инкубировали в течение 6 и 8 ч (37°С) при соотношении ФН/протеина-зы равном 250:1. Фрагмент ФН, взаимодействующий с МПО, выделяли на иммобилизованном ферменте.

Антисыворотку к ФН получали иммунизацией кроликов породы Шиншилла, антитела к ФН — методом аффинной хроматографии на ФН-агарозе. Иммунохимическую оценку препаратов ФН вели методами ракетного иммуноэлектрофореза (РИЭФ), радиальной иммунодиф-фузии (РИД) и иммуноблоттинга, IgG и IgM — методом РИД с применением стандартной клинической тест-системы.

ПААГ-электрофорез препаратов белков осуществляли по методу U.Laemmly (1970).

Активность МПО определяли орто-дианизидиновым [Klebanoff, 1965] и тетраметилбензидиновым (ТМБ) [Suzuki е.а., 1983] методами, СОД — по кверцетиновому методу Костюка и др. [1990], ПГ — по Robbins е.а. (1983), используя в качестве субстрата D-Val-Leu-Lys-pNA.

Количество молекул МПО в нейтрофиле оценивали методом ЭПР, используя в качестве эталонного образца препарат МПО известной

концентрации. Количество пероксидазосом в нейтрофилах и их объем определяли электронно-цитохимически и стереологически [10].

Функциональный ответ нейтрофилов в присутствии экстрацеллю-лярной МПО изучали постановкой реакции фагоцитоза, определяя количество поглощенных лейкоцитами дрожжей Saccharomyces cerevisiae [18], а также оценивая степень генерации клетками супероксидного радикала с помощью НСТ-теста [14]. Реакцию экзоцитоза нейтрофилов исследовали методом Suzuki е.а. (1983), регистрируя степень высвобождения МПО клетками во внеклеточную среду с помощью ТМБ. Суммарную продукцию различных АФК лейкоцитами крови в ответ на взаимодействие с гемоконтактными материалами исследовали с помощью реакции люминолзависимой хемилюминесценции [Cohen е.а., 1983]. Определение показателей проводили с использованием люмино-метра 1251 (LKB) по программе 251-124.

Результаты экспериментов обрабатывали с помощью методов вариационной статистики [Ашмарин И.П. и др., 1975, Плохинский H.A., 1970].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. СОДЕРЖАНИЕ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ В НЕЙТРОФИЛЕ И ЕГО ПЕРОКСИДАЗОСОМЕ

Исследования биоцидного потенциала МПО ограничены в основном экспериментами in vitro, а данные о ее микробицидном и цитоток-сическом (повреждающем) действии получены, как правило, с использованием очищенного препарата фермента. Точные данные о количестве МПО в нейтрофиле до начала настоящего исследования отсутствовали, что ограничивало развитие представлений об истинной роли и степени участия этого биоцидного фактора в реализации нейтрофи-лами защитных и повреждающих эффектов в очаге воспаления.

Согласно приблизительной оценке, по данным ряда исследований, количество МПО в нейтрофиле человека достигает 3-5% от сухого веса клетки. В настоящей работе с помощью очищенного препарата МПО (в качестве эталонного образца) методом ЭПР определено количество молекул этого фермента в нейтрофиле: 2,2-107. С использованием электронно-цитохимического и стереологического методов установлено среднее количество пероксидазо-положительных гранул в клетке (440 пе-

роксидазосомы) и их средний объем (3,5-Ю-14 мл). Следовательно, количество молекул МПО в одной грануле составляет 5-104, а их концентрация — 2,4 мМ. Полученные данные позволяют поставить на реальную основу дальнейшее развитие представлений о биоцидной функции нейтрофилов: способствовать корректной оценке их микробицид-ного потенциала, ресурса нейтрофилов в качестве источника в околоклеточное пространство МПО (фактора защиты и одновременно повреждающего агента), определить потенциал отдельной МПО-содержа-щей гранулы, что может иметь существенное значение при изучении вопросов внутриклеточного уничтожения микроорганизмов.

2. МОДУЛЯЦИЯ ЭКСТРАЦЕЛЛЮЛЯРНОЙ МИЕЛОИЕРОКСИДАЗОЙ ФАГОЦИТОЗА И ПРОДУКЦИИ 02~ НЕЙТРОФИЛАМИ IN VITRO

В задачу настоящего исследования входило изучение возможности экстрацеллюлярной МПО влиять на функциональную активность нейтрофилов, то есть клеток, секретирующпх этот белок во внеклеточное пространство. В условиях эксперимента МПО в концентрации, соответствующей верхнему пределу ее содержания в нормальной плазме крови (1,2 нМ), не оказывала влияния ни на фагоцитоз нейтрофилами дрожжевых клеток (табл. 1), ни на уровень продукции лейкоцитами Oi (табл. 2), регистрируемого по образованию гранул диформазана.То же самое наблюдается при добавлении различных количеств МПО к изолированным и отмытым нейтрофилам. Однако при постановке реакции фагоцитоза с нейтрофилами, сорбированными на стекле из цельной крови, а также при постановке реакции восстановления НСТ в

Таблица 1. Влияние МПО на фагоцитарную активность нейтрофилов (Нф) человека

Вариант Нф цельной крови Изолированные НФ (2-106кл/мл)

% активных Нф N п % активных Нф N п

Контроль 9,6±1,3 15,0 8 8,1 12,3 4

МПО (1,2 нМ) 10,2±1,1 13,8 6 7,6 14Д 4

МПО (60 нМ) 24,5±2,6 ** 31,4 8 9 Л 11,5 4

МПО (0,6 мкМ) 20,6±2,8 ** 28,4 8 8,4 12,6 4

N— среднее число поглощенных дрожжей на 100 Нф; п — количество опытов, ** — отличия от контроля, р<0,01.

Таблица 2. Влияние МПО на восстановление НСТ нейтрофилами

(Нф) человека

Вариант Плазма крови (5-106кл/мл) Изолированные Нф (5-106 кл/мл)

% активных Нф п % активных Нф п

Контроль 24,1 ±3,6 8 14,2±1,9 4

МПО (1,2 нМ) 22,6±3,7 8 12,8 4

МПО (60 нМ) 11,8±2,4 ** 8 15,0 4

МПО (0,6 мкМ) 8,2±1,6 ** 8 13,4 4'

Обозначения как в табл. 1

присутствии плазмы крови был получен выраженный эффект МПО. Если в первом случае белок оказывал стимулирующее действие в отношении поглотительной функции клеток, то во втором МПО проявила дозозависимое подавление реакции восстановления нитросинего тет-разолия (НСТ), причем эффект наблюдался лишь в группе доноров с исходно повышенной НСТ-активностью нейтрофилов (которая не проявлялась у изолированных клеток). Эти данные явились для нас первым указанием на возможную кофакторную роль компонентов плазмы крови в проявлении МПО ее лейкоцитотропного эффекта.

3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ С ОПСОНИНАМИ ПЛАЗМЫ КРОВИ

Для выявления МПО-связывающей активности у ФН нами был применен медод РИГА с эритроцитами барана, сенсибилизированными МПО. Выбор метода был обусловлен тем, что ФН, аналогично антителам (для оценки титров которых и был разработан метод РНГА), в результате идентичности его субъединиц обладает по меньшей мере бивалентностью для связывания лигандов. Наряду с ФН, в качестве жидкофазных реагентов в этом методе были испытаны в качестве партнеров для взаимодействия с МПО и другие опсонины: ^М и тер-моагрегированный (имитатор иммунного комплекса [8а1уаггеу е.а.,

1989]). Результаты исследования показали (табл.3), что ФН и вызывают агглютинацию эритроцитов, на поверхности которых локализована МПО. Это свидетельствует не только о сродстве их к МПО, но и о поливалентном характере связывания данного фермента этими белками. Отсутствие аналогичного эффекта у оставляя открытым вопрос о его аффинитете к МПО, исключает наличие у него такой поливалентности.

14

Таблица 3. Агглютинация МПО-сенсибилизированных эритроцитов опсонинами плазмы крови

Жидкофазный реагент Титры РИГА (>;=6, ¿>=0,05) ФН 1 1/8000-1/16000 ФН2 1/500-1/1000 ФН3 1/2-1/8 ФН 1/2000-1/4000 ЧСА 1/2-1/4

Жидкофазный реагент Титры РИГА (п=6, /7=0,05) 1Ь'0 3 1/2-1/4 180 1/4-1/8 ^Оагр 1/32-1/64 ^М 3 1/4-1/8 18М 1/500-1/1000

О и 2>— эритроциты сенсибилизированы желатиной или актином —лиганда-ми ФН (положительные контроли);3) — эритроциты сенсибилизированы ЧСА (отрицательный контроль).

4. КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ МИЕЛОИЕРОКСИДАЗЫ И ОПСОНИНОВ

Анализ комплексообразования МПО с опсонинами методом количественной аффинной хроматографии в варианте распределительного равновесия показал следующее (рис. 1). Иммобилизованные на агаро-зе ФН и ^О ассоциируют жидкофазную МПО с Кс1, равными, соответственно, 2,43 мкМ и 3,43 мкМ. С другой стороны, иммобилизованная МПО по отношению к жидкофазным ФН и ^О ведет себя различным образом: ассоциация ФН с МПО имеет место (Кс1=0,88 мкМ), тогда как с нативным комплексообразование не обнаруживается. Однако при использовании в качестве жидкофазного реагента термоагрегиро-ванного [ц,0 ПцОагр) взаимодействие было выраженным: Кс1=2,13 мкМ.

Сопоставление концентраций иммобилизованных белков (см. Материал н методы) с концентрациями участков связывания для жидко-фазных партнеров (т,) выявило следующее. В случае иммобилизованного ФН эти значения очень близки (с некоторым превышением т,): т(= 13,06 мкМ при концентрации ФН 10,9 мкМ. Эмпирически установлено [Туркова, 1980], что при иммобилизации белков значительная доля их связывающих участков оказывается недоступной лигандам. Это же демонстрируют и наши данные. Так, у иммобилизованной МПО доля ее ФН и ^Сагр-связывающих участков составляет, соответственно, 26,4% и 22,7% от концентрации иммобилизованного белка. Следо-

Рис.1. Графики Скэтчарда взаимодействия МПО с твердофазными ФН (7) и (2) и взаимодействия ФН (3) и термоагрегированного ^О (4) с твердофазной МПО.

р — концентрация свободных, ч — концентрация связанных на сорбенте МПО (1,2), ФН (3) и (4), мкм.

8 10 12

вательно, превышение значений mt для МПО у иммобилизованного ФН над его концентрацией свидетельствует о наличие нескольких участков связывания в структуре одной молекулы. Об этом же говорят данные РНГА.

При изучении взаимодействия МПО с Clq нам не удалось десор-бировать ассоциированный белок ни одним из использованных элюи-рующих растворов, что свидетельствует об особо прочной связи МПО с этим опсонином.

5. МОДУЛЯЦИЯ ЛИГАНДАМИ ФИБРОНЕКТИНА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФИБРОНЕКТИНА С МИЕЛОПЕРОКСИДАЗОЙ

В данных экспериментах в качестве твердофазного реагента использован ФН, связанный с матрицей агарозы через его лиганд — желатину (рис. 2, 3). Это преследовало несколько целей. Во-первых, желатина как дополнительный компонент взаимодействия МПО с ФН связывается с тем же самым доменом молекулы ФН, что и Clq, но не ассоциирует МПО. Следовательно, можно было бы отдифференцировать вклад

Рис. 2. Графики Скэтчарда взаимодействия МПО с твердофазным ФН (связанным с матрицей через желатин). Концентрация иммобилизованного ФН 1,6 мг/мл (4,2 мкМ), объем сорбента (ФН—жела-тин-агароза) 2 мл, циркулирующий раствор — PBS. Элюирующий раствор: 0,05 М глицин-HCl, рН 2,8 в 0,5 М NaCl. Объем элюата 3,5 мл. р — концентрация свободной МПО в циркуляции, q — концентрация связанной МПО на сорбенте, мкМ. 1 — температура 8°С (Kd=2,23 мкМ, mt=5,8 мкМ); 2 — температура 21°С (Kd=0,94 мкМ, mt=7,58 мкМ)

Рис. 3. Графики Скэтчарда взаимодействия МПО с комплексом 0H-IgGarrer. в растворе (/), с твердофазным ФН, связанным с матрицей через желатин (2) и одновременно с иммобилизованным ФН и комплексом ФН-IgGarpen в растворе (3). р — концентрация свободной МПО в циркуляции; q — концентрация связанной МПО на сорбенте. Концентрация иммобилизованного ФН 4,2 мкМ, концентрация термоагрегиро-ванного IgG 1,27 мкМ, объем сорбента 2 мл, температура 21°С, циркулирующий раствор PBS, элюирующий раствор 0,05 М глицин-HCl, рН 2,8 в 0,5 М NaCl, объем элюата 3,5 мл; концентрация участков связывания МПО на ФН nit2=9,45 мкМ, на комплексах OH-IgGaIpCI: та =1,29 мкМ; константы диссоциации комплекса МПО-ФН К^г = 0,94 мкМ, комплекса MnO-(®H-IgGarper.) Кц = 0,06 мкМ.

10 q, мкМ

Clq во взаимодействии ФН с МПО, исключив собственную МПО-связывающую активность этого опсонина. Поскольку ФН связывает Clq в области коллагеноподобной структуры последнего, а в ряде случаев коллаген (желатина) усиливает аффинитет ФН к другим его лигандам, представлялось необходимым проанализировать аналогичную возможность и в отношении МПО. Дополнительным аргументом использования желатин-агарозы для иммобилизации ФН явилось предположение, что в таком варианте, в отличие от непосредственной иммобилизации ФН на активированную матрицу, все молекулы этого белка должны быть симметрично ориентированы благодаря локализации коллаген-свя-зывающего домена в N-концевой области обеих полипептидных цепей данного опсонина.

Исследование показало, что взаимодействие ФН с МПО в данном случае характеризуется более низким значением Kd (0,94 мкМ), чем в предыдущем варианте (Ка=2,43 мкМ). Концентрация участков связывания для МПО на ФН в этом варианте равна 7,6 мкМ, что почти в два раза превышает концентрацию ФН на желатин-агарозе (4,2 мкМ). Следовательно, нам действительно удалось получить "ориентированный" на матрице ФН, который оснащен двумя МПО-связывающими участками (по одной на каждой из двух его субъединиц). Однако усиление желатиной аффинитета ФН к МПО является лишь кажущимся, поскольку взаимодействие жидкофазного ФН с иммобилизованной МПО характеризуется Kci=0,88 мкМ, что практически совпадает с 10=0,94 мкМ для ФН-желатин-агарозы.

Добавление в жидкую фазу к МПО фиксированного количества (1,27 мкМ) другого лиганда ФН, IgGarp, трансформировало график Скэтчардав криволинейную форму [31]. Это может свидетельствовать о возникновении на сорбенте как минимум двух независимых центров связывания для МПО. Тогда график представляется функцией с четырьмя параметрами: Kdb Kd2, mtj, mt2. Значения этих констант, оцененные графически методом линейной аппроксимации, равны, соответственно, 0,086 мкМ, 1,02 мкМ, 1,95 мкМ и 9,45 мкМ. Компьютерный анализ кривой по критерию наименьших квадратов методом градиентного спуска выявил следующее. Константа диссоциации комплекса ФН—МПО была известна из предыдущего опыта (Kd2=0,94), а другие, вычисленные на основе этой величины, константы обладали следующими значениями: Kdi=0,06 мкМ (против 0,086 мкМ); тц=1,29мкМ (против 1,95 мкМ); т,2=9,45мкМ (против 9,45 мкМ). Близость соот-

ветствующих констант друг другу, полученных двумя независимыми методами, свидетельствует в пользу нашего предположения о наличии двух независимых МПО-связывающих центров различного типа. Мы полагаем, что дополнительный центр с резко увеличенным сродством к МПО (Kdi=0,06 мкМ или 0,086 мкМ) сформирован комплексом ФН-IgGarp- Так, в соответствии с известным выражением [LR]=[Rt][L]/(Kci+[L]) рассчитанная концентрация связанного на сорбенте IgGarp составляет 1,19 мкМ, что практически совпадает со значением mti=l ,29 мкМ.

6. ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ И ФИБРОНЕКТИНА

В работе в качестве твердофазного реагента использовали ФН, иммобилизованный на агарозном носителе через его лиганд — желатину, поскольку в этом варианте константа Kj (0,94 мкМ) практически совпадает с константой взаимодействия жидкофазного ФН с иммобилизованной МПО (Ка=0,88 мкМ) (см. рис 1, 2). Кроме того, только в этом случае все молекулы ФН практически единообразно ориентированы в пространстве, а их МПО-связывающие участки максимально доступны для фермента (см. раздел 5). К тому же, непосредственная иммобилизация ФН на BrCN-активированную агарозу ведет к увеличению значения константы диссоциации комплекса ФН-МПО (Kj=2,43 мкМ), свидетельствуя в пользу снижения аффинитета взаимодействия обоих белков. С другой стороны, применение ФН в виде жидкофазного реагента ограничено склонностью его к аутоагрегации при пониженной температуре. Кроме того, регистрация уровня содержания жидкофазного реагента по его ферментативной активности (МПО) является практически более удобной, чем по его иммунореактивности (ФН) методом РИЭФ.

Взаимодействие МПО и ФН исследовали при 8°С, а для анализа результатов использовали также данные, полученные при 20°С (раздел 5). Соответствующие Kd при обеих температурах составляли 2,23 мкМ (8°С) и 0,94 мкМ (20°С), a mt — 5,8 мкМ (8°С) и 7,58 мкМ (20°С), то есть, понижение температуры вызывает уменьшение связывающей способности ФН не только за счет увеличения К& но и в результате снижения доступности или количества МПО-специфических центров. Уровень неспецифического взаимодействия МПО со всеми

сорбентами относительно специфического взаимодействия при различных концентрациях фермента составлял 3,7-7,1% (20°С) и 5,8-9,2% (8°С) (рис. 4). Анализ экспериментальных данных (с использованием известных соотношений^бо =-КТ1пКасс',дОо=/1Но-ТА8о; 1пКасс= = '¿Но 'ИТ -\-ASoZR, и предположения о линейной зависимости 1аКасс от 1/7) показал следующее. Взаимодействие МПО с ФН является экзерго-ническим процессом при обеих температурах: -30,26 кДж/моль (8°С) и -34,05 кДж/моль (20°С). Положительное значение энтальпии (+45,5 кДж/моль) говорит об эндотермической природе этой реакции и о возможности дальнейшего усиления взаимодействия с ростом температуры. Основную роль при комплексообразовании ФН с МПО играет энтропия: +0,27 кДж/моль.К.

Общий итог результатов исследований взаимодействия МПО с оп-сонинами плазмы крови заключается в следующем. МПО является специфическим лигандом таких ключевых факторов защитной системы организма как ФН, ^М и В ходе реализации своих функций, как известно, указанные белки действуют кооперативно. Это находит отражение и при ассоциации МПО, где имеет место резкое (почти 17-крат-

ное) усиление аффинитета в результате комплексообразования ФН с IgGarp (имитатором комплекса антиген-антитело). Таким образом, благодаря способности опсонинов фиксировать МПО — с одной стороны, а с другой — опосредовать поглощение фагоцитами опсонизи-рованных частиц, создаются предпосылки для вовлечения в эти клетки экстрацеллюлярной МПО и, как следствие, их довооружения этим ферментом. Кроме того, удаление МПО из зоны ее деструктивного действия может происходить и при отсутствии микроорганизмов как объекта опсонизации и служить механизмом, ограничивающим негативный эффект нейтрофилов в очаге воспаления. Наряду с этим, благодаря способности опсонинов концентрировать МПО вблизи "маркированного" ими для захвата фагоцитом патогена, возможно, обеспечивается создание условий для селективного действия фермента на микробы уже в экстрацеллюлярной пространстве.

7. МОДУЛЯЦИЯ ФИБРОИЕКТИНОМ СЕКРЕТОРНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ

Способность ФН подавлять продукцию во внеклеточную среду супероксидных радикалов активированными нейтрофилами [Torok е.а., 1986] явилась для нас основанием экспериментальной проверки возможности этого белка ингибировать секрецию в экстрацеллюлярное пространство более разрушительного агента — МПО.

Экзоцитоз нейтрофилами МПО в ответ на стимуляцию клеток регистрировали по возрастанию пероксидазной активности в культураль-ной (надосадочной) жидкости клеток. Постановку эксперимента осуществляли в соответствии с методом Suzuki е.а. (1983).

Таблица 4. Влияние фибронектина (ФН) на секреторную активность

нейтрофилов человека

Вариант Активность МПО* (АЛ 655 нм/мин/мл) п

Контроль 0,17±0,04 6

ФН (1 мкМ) 0Д4±0,06 6

ФМЛФ(1 мкМ) 1,11 ±0,09 6

ФМЛФ (1 мкМ)+ФН (1 мкМ) 0,56±0,07 (р=0,01) 6

*) активность регистрировали с помощью ТМБ-метода

Преинкубация клеток с ФН перед внесением стимулятора — фор-милметионилового пептида (ФМЛФ) — позволила нам обнаружить еще один тип биологической активности ФН: подавление экзоцитоза МПО-содержащих гранул нейтрофилов (табл. 4). Это свойство белка удачно вписывается в перечень других активностей ФН как фактора, минимизирующего лейкоцит-зависимые деструктивные процессы в тканях. При этом использованная нами концентрация ФН (1 мкМ= 450 мкг/мл) находится в пределах физиологических колебаний уровня этого белка в плазме крови человека (250-450 мкг/мл).

8. СВЯЗЫВАНИЕ ФИБРОНЕКГИНОМ ГИПОХЛОРПТ-ОКИСЛЕННЫХ БЕЛКОВ

Среди повреждающих лейкоцитарных факторов АФК обладают не только мощным разрушительным потенциалом, но и редокс-модулиру-ющими активностями. Показано, что окислительная модификация ряда белков плазмы крови (ЧСА, ^С и др.) продуктом МПО-катализа — гипохлоритом — способна привести к образованию субстанций с выраженным провоспалительным действием [Ьипес, 1984; Магхе.а., 1985]. Однако компенсаторные механизмы, лимитирующие действие таких факторов в очаге воспаления, не известны. Базируясь на неспецифической опсонической природе ФН и его ключевой роли в удалении продуктов распада поврежденных клеток и тканей, мы исследовали методом РНГА возможную способность этого белка ассоциировать ги-похлорит-окисленные ЧСА и Белки обрабатывали ОСГ (50 мкМ, 30 мин, т.е. в патофизиологической концентрации оксиданта) и, наряду с их нативными формами, использовали для сенсибилизации бараньих эритроцитов. В отличие от нативных белков, модифицированные их формы продемонстрировали выраженную ФН-ассоциирующую активность (табл. 5).

Эти данные являются первым свидетельством наличия в организме механизмов, нацеленных на элиминацию окислительно поврежденных структур. Способность же ФН подавлять генерацию активированными лейкоцитами Ог~ [Тогок е.а., 1986], секрецию ими МПО, потенциально обеспечивать удаление последней из зоны ее деструктивного действия может служить дополнительным аргументом в пользу расширения представлений об организации системы антиоксидангной защиты организма (раздел 12).

Таблица 5. Агглютинация фибронектином эритроцитов, сенсибилизированных ОС1-модифицированными ЧСА и ^О.

Сорбированный Актин ЧСА ЧСА+ОСГ 180 1цСЛ-ОС1-

белок

Титры РИГА 1/500- 1/8-1/16 1/500- 1/64-1/128 1/1000-

(п=6, р=0,05) -1/1000 -1/1000 -1/2000

9. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ УСТОЙЧИВОСТИ НАТИВНОЙ И ПРОЛОНГИРОВАННЫХ ФОРМ СУИЕРОКСИД-ДИСМУТАЗЫ К ЛЕЙКОЦИТАРНЫМ ОКСИДАНТАМ

Цитоплазматический фермент СОД — наиболее перспективный препарат для антиоксидантной терапии — является объектом воздействия в очаге воспаления таких неутилизируемых им оксидантов как Н2О2, НО* и гипохлорит (ОСГ). Тем не менее, сравнительная оценка качества модифицированных форм СОД (более приспособленных для лечебных целей) по отношению к нативному белку ведется с использованием только традиционных критериев инженерной энзимологии: рН-и термочувствительности. Цель данного раздела работы состояла в изучении возможности использования дополнительного критерия: устойчивости к выше перечисленным оксидантам, концентрации которых соответствуют регистрируемым в очаге воспаления.

Наряду с нативным ферментом (СОДнат) был испытан ряд производных СОД, аналоги которых за рубежом находятся на стадии клинических и доклинических испытаний. А именно — это СОД, конъюги-рованная с альдегидцекстраном (СОД-АД) и полиэтиленгликолем (СОД-ПЭГ), а также СОД, олишмеризованная глутаровым альдегидом (СОД-ГА). Результаты исследования сведены для наглядности в схематизированную таблицу 6.

Полученные данные указывают на то, что однозначного усиления или уменьшения устойчивости СОД, регистрируемой по остаточной ферментативной активности, в результате модификации не наблюдается. При этом, неоднозначность проявляется не только в отношении данной модификации к действию различных оксидантов, но и в отношении конкретного оксиданта (в зависимости от типа реакции "доза-эффект" или "время экспозиции-эффект"). Однако характер эксперимен-

Таблица 6. Сравнительная оценка устойчивости модифицированных форм СОД к действию оксидантов (по отношению к нативному белку)

Фермент ОСГ НО Н202

д 1 д / д | 1

сод11ах СОД-ГА СОД-ПЭГ СОД-АД эта 0 + лон + + эта 0 0 0 лон 0 + 0 эталон + 0 0

д — зависимость доза-эффект; / — временная зависимость; 0 — отличия не обнаружены; + — усиление устойчивости;--уменьшение устойчивости

тальных кривых (здесь не показаны) свидетельствует о неоднородности популяции молекул СОД в образцах, подвергнутых действию оксидантов. Об этом говорит сложный характер кривых, не подчиняющихся канонической зависимости А^ =Л'оехр[ к((ф]. Как известно, используемые в настоящее время способы модификации белков (в том числе и СОД) не обеспечивают получения строго гомогенных популяций молекул. Тем не менее, характер экспериментальных кривых говорит о том, что среди модифицированных молекул в данной конкретной их популяции имеются формы с повышенной устойчивостью к оксидан-там. Именно они, вероятно, и искажают экспоненциальную форму кривых. В этом случае в перспективе возможно создание технологий для получения такта модификаций или препаратов, обогащенных ими. Критерием отбора последних и должна выступать их сравнительно повышенная устойчивость к оксидантам очага воспаления.

10. ПРОДУКЦИЯ АФК ЛЕЙКОЦИТАМИ КРОВИ КАК ИНТЕГРАЛЬНЫЙ ПОКАЗАТЕЛЬ БИОСОВМЕСТИМОСТИ ГЕМОКОНТАКТНЫХ МАТЕРИАЛОВ

Основным ограничением использования гемосорбционных методов в клинике являются индуцированные ими осложнения, несущие признаки генерализованного воспалительного процесса. Определяющая роль в их генезе принадлежит системе контактной активации плазмы крови. Поскольку активация этой системы на чужеродных поверхностях ведет к инициации других гуморальных систем, а продукты последних (как и активированные компоненты самой контактной системы) стимулируют лейкоциты крови, мы предположили следующее. Адек-

ватным и быстро регистрируемым критерием оценки биосовместимости гемосорбентов могли бы служить изменения уровня продукции АФК лейкоцитами крови. Наиболее быстрым и универсальным способом регистрации продукции АФК лейкоцитами служит метод люми-нол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ).

В задачу исследования входили: 1) оценка корректности метода ХЛ для индикации реактивности перфузируемой через сорбенты крови; 2) сопоставление уровней ХЛ крови, перфузируемой через различные сорбенты; 3) определение динамики изменения количества лейкоцитов в системном кровотоке при гемоперфузии через различные сорбенты.

Эксперименты проводили на морских свинках, к системе кровообращения которых подключали экстракорпоральный контур с различными сорбентами по схеме артерия -> вена. Время гемоперфузии — 60 мин. Забор крови для исследований проводили до начала гемоперфузии, на 30-й и 60-й мин, а также через 1 и 2 ч после окончания процедуры. Пробы крови отбирали перед колонкой с сорбентом (системный кровоток) и сразу же после нее. В пробах подсчитывали общее количество лейкоцитов и отдельно нейтрофилов. Параллельно в каждой пробе измеряли ХЛ (люминометр ЬКВ-У/аИас 1251). Контролем служили животные, для которых использовали экстракорпоральный контур без сорбента.

Результаты исследования [36, 38] показали, что перфузия крови через любой из 11 использованных сорбентов сопровождается выраженной ХЛ. Причем, разные типы сорбентов обладают различной индуцибель-ной активностью, что свидетельствует о перспективе использования ХЛ в качестве критерия оценки биосовместимости гемоконтактных материалов. ХЛ крови имела место не только сразу же после прохождения ею сорбента, но и перед колонкой, что говорит о значительной генерации АФК в системном кровотоке животного. В ходе гемоперфузии существенно снижалась концентрация лейкоцитов в циркуляции (р=0,01), а спустя 1 и 2 ч после прекращения процесса наблюдался резкий ее подъем (р=0,01 в сравнении с нормальными показателями). Особенно четко эта динамика проявлялась в отношении нейтрофилов и их соотношения с другими клетками белой крови. Все отмеченные события демонстрируют признаки развития генерализованного воспаления в результате взаимодействия перфузируемой крови с гемосорбентами. Таким образом, метод регистрации ХЛ лейкоцитов крови может служить в качестве адекватного и быстрого критерия оценки биосовмес-

тимости опытных партий сорбентов для использования их в эфферентной терапии. Этот же метод может быть применен в клинических условиях для индивидуального подбора конкретному пациенту наиболее совместимого сорбционного и иного гемоконтактного материала.

11. УСИЛЕНИЕ БИОСОВМЕСТИМОСТИ ГЕМОСОРБЕНТОВ АНТИОКСИДАНТАМИ

Генерируемые лейкоцитами АФК, как известно, не только осуществляют микробицидную функцию и повреждающее действие, но и выступают в качестве типичных медиаторов воспаления [26]. В рамках предыдущего и данного разделов работы важным является то, что АФК способны активировать эндотелиальные клетки сосудов и усиливать адгезивные свойства нейтрофилов [Limb е.а., 1991; Lucchesi, 1994]. Базируясь на этих фактах, в данном исследовании мы осуществляли ге-моперфузию на морских свинках на фоне подачи в кровь животных СОД. Это отразилось не только в достоверном снижении XJI (т.е. и накопления АФК), но и в значительном уменьшении степени падения числа лейкоцитов в крови в процессе гемоперфузии [37]. Таким образом, применение антиоксидантов при гемосорбции может послужить дополнительным способом для расширения сферы использования эфферентных методов терапии.

12. ПРОБЛЕМНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ РАБОТЫ

Данный раздел диссертационной работы посвящен изложению материала, касающегося развиваемых автором представлений о некоторых сторонах функционирования в очаге воспаления структур и механизмов, являвшихся объектом данного исследования, и сопряженных с ними систем [6, 8, 9, 11, 12, 16, 20, 26, 33]. Представленный в работе материал проанализирован с точки зрения полифункциональности белков-участников защитных реакций, совмещения такими белками эф-фекторных (профессиональных) функций с их ролью в качестве молекул-сигнализаторов и неспециализированных предшественников биологически активных пептидов, а также конструктивной роли неспецифического протеолиза в образовании таких олишпептидов и в механизмах процессинга белков-антигенов, функции редокс-факторов (в том числе и АФК) в модуляции клеточной активности.

В работе акцентируется внимание на том, что эффект такого обязательного компонента воспалительного процесса, как неспецифический

протеолиз, не ограничивается только деструктивным, повреждающим действием. При наличии одних и тех же белков-субстратов и при ведущем участии определенной группы неспецифических протеиназ (в острой фазе воспаления — это катепсин О и эластаза нейтрофилов) будет наблюдаться стереотипная картина — преимущественное накопление среди образующихся продуктов ограниченного протеолиза лишь определенных олигопептидов. Как правило, такие субстанции проявляют активность типичных медиаторов воспаления: индуцируют хемотаксис и экзоцитоз лейкоцитов (в том числе и секрецию МПО), продукцию последними АФК и др. [11, 12], что, очевидно, является эво-люционно отобранным признаком. Аналогичное явление — продукция пептидов-сигнализаторов по механизму неспецифического протеолиза, по-видимому, имеет место и в ходе процессинга белков-антигенов. В данном случае неспецифический характер внутрифаголизосо-мального протеолиза и особенности третичной структуры конкретного белка-антигена во многом определяют отбор определенных пептидов — иммуногенных фрагментов белка антиген-представляющими клетками различных видов иммунизируемых животных [16].

В этом же разделе работы приведена аргументация в пользу необходимости расширения представлений об организации одной из ключевых компенсаторных систем организма — системы антиоксидант-ной защиты. Наряду с традиционными механизмами ликвидации АФК и других оксидантов, в качестве элементов такой системы должны рассматриваться механизмы, обеспечивающие утилизацию О2 без образования возбужденных и реактивных промежуточных форм его восстановления. Сюда относятся оксидазные и оксигеназные ферментные системы, осуществляющие двух- и четырехэлектронное восстановление молекулы О2 в обход спинового запрета. К этой же группе относятся и белки-переносчики, обратимо связывающие молекулу кислорода. По-видимому, эти механизмы играют ведущую роль в защите организма от токсичности кислорода [6]. Элементами системы антиоксидантной защиты должны рассматриваться также факторы, подавляющие и/или элиминирующие специализированные и неспециализированные генераторы АФК [32]. К последним, в частности, могут быть отнесены естественные аутоантитела к ксантиноксидазе, ингибирующие генерацию 02~ этим ферментом, а также ФН — способный ингибировать продукцию нейтрофилами 02~, секрецию МПО и обеспечивать удаление последней из области ее повреждающего действия.

Представлена также аргументация в пользу существования специализированного ферментативного механизма для нейтрализации особо разрушительных оксидантов (ОС1-, '02, НО* и хлораминов — первичных и вторичных продуктов катализа МЛ О) — метионилсульфоксид-редуктазного цикла. Этот редокс-цикл потенциально способен обеспечивать сопряжение в контроле развития окислительных и протеолити-ческих деструктивных процессов, а также принимать участие в процессах редокс-регуляции [23].

Предложен механизм каталитической продукции ]02, а также модель сочетанного образования в ходе МПО-катализа '02 и ОСГ. Данная модель обоснована термодинамически и снимает противоречие между регистрируемой продукцией 'Ог фагоцитирующими нейтрофи-лами и недостаточной мощностью у предложенных ранее механизмов (некаталитических) его образования этими клетками. Кроме того, в рамках предложенной модели находит объяснение существующая неопределенность, связанная с особенностями структуры и функционирования МПО, весьма отличными от других геминовых пероксидаз: необходимости четвертичной структуры, редокс-взаимодействия гемсодер-жащих субъединиц, преимущественного окисления 02-промежуточной формой фермента — Соединением II [25, 34].

Заключительный фрагмент этой части работы посвящен обоснованию нового подхода к антиоксидантной терапии [32]. Традиционные способы использования в клинике нативных и модифицированных форм СОД обладают существенным недостатком: в них не предусмотрен механизм концентрирования лечебных препаратов фермента в патологических очагах — участках интенсивной генерации АФК. Нами обсуждается и обосновывается реальная возможность решения задачи целенаправленной доставки в очаг воспаления СОД путем использования конъюгированных с ферментом носителей, обладающих сродством к структурам, экспрессируемым только в патологических очагах. Этому условию среди естественных для организма субстанций отвечают ФН или его желатинсвязывающий домен, а также естественная популяция среди молекул — аутоантитела к ксантиноксидазе (КО) или их РаЬ-фрагменты, "опознающие" в качестве "маркеров воспаления" коллаген и КО. С точки зрения технологии получения этих векторных молекул преимуществом является значительное количество их в плазме крови и простые способы очистки данных белков.

выводы

1. В нейтрофилах и в пероксидазосомах нейтрофилов человека содержится 2,2-107и 5-104 молекул миелопероксидазы (МПО), соответственно. Концентрация МПО в пероксидазосоме составляет 2,4 мМ.

2. Экстрацеллюлярная МПО при участии компонентов плазмы крови стимулирует фагоцитарную реакцию нейтрофилов, подавляя одновременно накопление супероксидных радикалов.

3. МПО и ключевые опсонины плазмы крови (фибронектин, и 1§М) образуют специфические комплексы. Взаимодействие жидкофаз-ной МПО с иммобилизованными фибронектином (ФН) и а также иммобилизованной МПО с жидкофазными ФН и термоагрегирован-ным ^С (но не нативным) характеризуется следующими константами диссоциации (К^): 2,43 и 3,43 мкМ; 0,88 и 2,13 мкМ, соответственно.

4. Комплексообразование МПО и ФН является экзергоническим процессом (-34,05 кДж/моль), характеризуется положительным изменением энтальпии (+45,5 кДж/моль), а сам процесс определяется энтропийной составляющей свободной энергии: -79,5кДж/моль. Взаимодействие ФН с термоагрегированным 1«С! ведет к образованию нового типа МПО-связывающих участков с резко повышенным аффинитетом: Ка=0,06 мкМ.

5. Ассоциация фибронектином МПО и окислительно-модифицированных белков, а также подавление им в физиологических концентрациях секреции нейтрофилами МПО отражают участие ФН в антиокси-дантной защите.

6. Молекулярные механизмы довооружения фагоцитов экстрацеллю-лярной МПО с участием опсонинов способны обеспечить уменьшение повреждающего действия этого фермента в очаге воспаления путем концентрирования МПО у объекта фагоцитоза и удаления ее в результате фагоцитоза опсонизированных частиц.

7. Молекулярной основой высоких биоцидных свойств МПО явилось эволюционно закрепленное в пределах одной молекулы (в ее субъединичной организации) свойство молекул геминовых пероксидаз вступать в редокс-взаимодействие. Структурная организация МПО обеспечивает сочетанную генерацию ферментом гипохлорита и синглетного кислорода.

8. Метионилсульфоксидредуктазный цикл потенциально способен каталитически разлагать наиболее опасные оксиданты (гипохлорит, НО*,

хлорамины и синглетный кислород), принимать участие в редокс-регу-ляции и выступать в качестве механизма сопряжения окислительных и протеолитических деструктивных прцессов.

9 Механизмы утилизации молекулярного кислорода, а также механизмы ингибирующие или элиминирующие специализированные и неспециализированные генераторы активных форм кислорода (АФК) являются элементами системы антиоксидантной защиты организма (как и ликвидаторы оксидантов — молекулы-антиоксиданты).

10. Процессы неспецифического протеолиза в очаге воспаления создают условия для преимущественного накопления определенных оли-гопептидов, эволюционно отобранных в качестве молекул-сигнализаторов. Этот же механизм лежит в основе селекции иммуногенных фрагментов в ходе процессинга белков-антигенов.

11. Разработан новый критерий оценки устойчивости перспективных препаратов супероксиддисмутазы для лечебных целей, учитывающий реальную окислительно-деструктивную обстановку в очаге воспаления: степень чувствительности фермента к повреждающему действию неутилизируемых им оксидантов.

12. Разработан новый критерий оценки биосовместимости гемокон-тактных материалов: уровень хемилюминесценции лейкоцитов в ответ на взаимодействие с такими материалами. Обоснован интегральный характер предложенного критерия, а также новый способ уменьшения неблагоприятного побочного действия сорбционных методов эфферентной терапии (предусматривающий применение антиоксидантов).

13. Обоснован новый подход в антиоксидантной терапии, предусматривающий создание искусственного кооперативного комплекса, обладающего механизмом концентрирования лекарственных форм СОД в патологических очагах с одновременным подавлением генераторов активных форм кислорода.

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Раменская Н.П., Янковский О.Ю., Кокряков В.Н. Изучение кооперативного антибактериального эффекта миелолероксидазы и катионовых белков нейтрофилов кролика // Вестник ЛГУ. - 1977. - № 9, вып.2. - С. 137.

2. Янковский О.Ю., Довнар Т.Е. К механизму антимикробного действия ми-елопероксидазы. Адсорбция фермента на поверхности E.coli // Доклады АН СССР. - 1978. - Т.242, №6. - С.1445-1446.

3. Янковский О.Ю., Кокряков В.Н., Лызлова С.Н. Физико-химические и кинетические характеристики миелопероксидазы нейтрофильных лейкоцитов // Укр. биохим. ж. - 1979. - Т.51, № 5. - С.492-197.

4. Янковский О.Ю., Довнар Т.Е., Ткаченко A.A. К механизму антимикробного действия миелопероксидазы. Роль адсорбции фермента на поверхности клетки мишени // ЖМЭИ. - 1981. - № 6. - С.58-61.

5. Янковский O.IO. Образование возбужденных форм кислорода в ферментативных системах (миелопероксидаза) // 1-й Всес. биофизич. съезд. Тез. докл. - Москва, 1982. - С. 127.

6. Янковский О.Ю. Механизмы защиты от токсического действия кислорода и способы использования реактивных форм кислорода в живых системах// Ж. общей биологии. - 1983. - Т.44, № 1. - С.62-70.

7. Янковский О.Ю., Монахенко И.В. Способ выделения миелопероксидазы // Авторское свидет. на изобрет. - № 1113407 (регистр. 15.05.1984 г.)

8. Янковский О.Ю. Пептиды-регуляторы, происходящие из неспециализированных белков-предшественников // Ж. эвол. биохим. физиолог. -1985. - Т.21, № 1. - С.62-69.

9. Янковский О.Ю., Довнар Т.Е. Роль протеиназ лейкоцитов и продуктов деградации белков в защитных реакциях // Ж. общей биологии. - 1985. -Т.46, № 1. - С. 93-101.

10. Фролова В.М., Хангулов С.В., Янковский О.Ю., Роговин В.В. Изучение пероксидазосом нейтрофильных лейкоцитов человека // Вопросы мед. химии. - 1985. - Т.З, вьш.6. - С.54-57.

11. Янковский О.Ю., Довнар Т.Е. К проблеме специфичности выщепления пептидов-регуляторов из неспециализированных белков-предшественников И Ж. эвол. биохим. физиолог. - 1986. - Т.22, № 1. - С. 11-16.

12. Янковский О.Ю., Довнар Т.Е. Локализация биологически активных пептидов и их аналогов в структуре белков-участников защитных реакций // Вестник ЛГУ. - 1986. - Сер. 3, вып. 1. - С.56-61.

13. Говорова Н.Ю., Шаронов Б.П., Янковский О.Ю., Лызлова С.Н. Инактивация реактивных форм кислорода, генерируемых миелопероксидазой, сывороточными белками // Доклады АН СССР. - 1986. - Т.290, № 2. - С.480-483.

14. Янковский О.Ю., Довнар Т.Е., Кинго З.Н., Леонтьева Л.И., Сорочинская Е.й. Активация нейтрофильных лейкоцитов фрагментом лизоцима человека II Вестник ЛГУ. - 1987. - Сер. 3, вып. 1. - С.64-67.

15. Говорова Н.Ю., Шаронов Б.П., Лызлова С.Н., Янковский О.Ю. Особенности хемшпоминесценции люминола, возбужденной при каталитическом действии миелопероксидазы II Биохимия. - 1987. - Т.52, вып.10. - С.1670-1676.

16. Янковский О.Ю., Довнар Т.Е. Механизм выщепления иммуногенных фрагментов белков (процессинг антигенов) // Иммунология. - 1988. - № 1. -С.82-83.

17. Янковский О.Ю., Говорова Н.Ю., Шаронов Б.П., Лызлова С.Н. Получение миелопероксидазы лейкоцитов периферической крови и костного мозга// Вестник ЛГУ. - 1988. - Сер. 3, вып. 1. - С.71-76.

18. Янковский О.Ю., Ерашова Н.С., Кинго З.Н. Стимуляция миелоперокси-дазой фагоцитарной реакции нейтрофильных лейкоцитов // Вестник ЛГУ. -1989. - Сер.З, №4. - С. 102-104.

19. Yankovsky O.Yu., Zhebrun А.В., Borovkova Y.A. An affinity-based modified and combined method for separation of purified fibronectin // Intern. Conf. on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS. St.Petersburg, June 1218, 1991. - P.6-7 (Abstr).

20. Янковский О.Ю., Слепенков C.B. Белки как молекулы-сигнализаторы (некоторые аспекты иммунорехуляции) // Вестник СПбГУ. - 1992. - Сер.З, вып. 1. - С.76-81.

21. Янковский О.Ю., Алешина Г.М., Боровкова Ю.А., Хилажетдинова Л.Р. Фрагмент фибронектина (70 кДа) — продукт гидролиза катепсином G и эластазой нейтрофилов, специфически взаимодействующий с миелопе-роксидазой // Актуальные проблемы инфекционной патологии. Ч.З: Иммунология и биотехнология. Тез. докл. - С.-Петербург, 1993. - С.49.

22. Govorova N.Yu., Yankovsky O.Yu., Yablunovskaya I.A., Podsukhina G.M., Sokolov A.N., Khilazhetdinova L.R. Combined affinity chromatographic method of the obtaining of the individually purified proteins: fibronectin and plasminogen // Intern.Confer."Biotechnology St. Petersburg'94". - 1994. -C.92 (Abstr.64).

23. Yankovsky O.Yu. Methionine(Met)-Met sulfoxide(MetO)-MetOpeptide reductase(MetOR) redox cycle as a possible catalitic mechanism of antioxidant system // 3rd Intern.Confer."AIDS, Cancer and Related Problems". -St. Petersburg. - 1995. - C.81 (Abstr.).

24. Yankovsky O.Yu., Kuznetsov S.I., Churilova I.V., Kanajev P.A., Rintsin O.V., Aismont Yu.A. Accumulation of Of under column-haemoperfusion and it prevention by the injection of antioxidants // Intern. Congr. on Free Radicals in Health and Disease. - Istanbul (Sept. 6-10, 1995), 1995.

25. Yankovsky O.Yu. Singlet oxygen '02 as a possible catalytic product of myeloperoxidase (MPO) // Intern. Congr. on Free Radicals in Health and Disease. - Istanbul (Sept. 6-10, 1995), 1995.

26. Янковский О.Ю., Слепенков C.B. Редокс-факторы как модуляторы клеточных функций // Вестник СПбГУ. - 1995. - Сер.З, вып.З. - С.78-84.

27. Янковский О.Ю., Яблуновская И.А., Кокряков В.Н., Алешина Г.М., Говорова Н.Ю., Хилажетдинова Л.Р., Гаврилова Ю.В. Образование комплекса между миелопероксидазой и опсонинами плазмы крови человека // Бюлл. эксперим. биол. мед. - 1995. - Т.СХХ, № 9. - С.320-322.

28. Янковский О.Ю., Хилажетдинова Л.Р., Кокряков В.Н., Алешина Г.М., Яблуновская И.А., Говорова Н.Ю., Подсухина Г.М., Гаврилова Ю.В., Леонова Р. И. Термодинамические параметры комплексообразования фибронекти-на плазмы крови и миелопероксидазы // Биохимия. - 1995. - Т.60, вып.8. -С. 1217-1220.

29. Yankovsky O.Yu., Kuznetsov S.I. The chemiluminescence (CL) of leukocytes as a useful witness of the compatibility of sorbents for hemoperfusion // Oxygen'95. - Pasadena (Nov. 16-20, 1995), 1995. (Abstr. 2-62).

30. Yankovsky O.Yu., Khilazhetdinova L.R. Comparative study of the sensitivity of the native and three modified SOD forms to Н2Ог, HO and OCl~ // Oxygen'95. - Pasadena (Nov. 16-20, 1995), 1995. (Abstr. 2-63).

31. Янковский О.Ю., Яблуновская И.А., Кокряков B.H., Алешина Г.М., Хи-лажетдинова Л.Р., Говорова НЛО., Подсухина Г.М., Гаврилова Ю.В., Вах-рушев А.В., Леонова Н.В. Комплексообразование миелопероксидазы и фиб-ронектина и его модуляция лигандами фибронектина // Вопросы мед. химии. - 1996. - Т.42, вып.2. - С. 137-140.

32. Янковский О.Ю. Перспективы создания пролонгированных форм супе-роксиддисмутазы, ориентированных в очаг воспаления // Биотехнология. -1996. - № 5. - С.748-751.

33. Yankovsky O.Yu., Leonova N.V., Nurutdinova M.N., Lyslova S.N. The ability of fibronectin (FN) to combine oxidazed proteins // VIII Biennial Meet. Int. Soc. Free Radical Res. - Barcelona (1-5 Oct. 1996), 1996. - C.307.

34. Yankovsky O.Yu. To the reason of complicated structure of myeloperoxidase (MPO): possible mechanism of the simultaneous formation of ОСГ and '02 // VIII Bienial Meet. Int. Soc. Free Radical Res. - Barcelona (1-5 Oct. 1996),

1996. - C.308.

35. Янковский О.Ю., Слепенков С.В., Кокряков В.Н., Лызлова С.Н. Миело-пероксидаза (пероксидаза нейтрофильных гранулоцитов) // Ферменты и нуклеиновые кислоты / Под ред.В.Г.Владимирова и С.Н.Лызловой. - СПб: изд-во СПбГУ, 1997. - С.69-76 (152 е.).

36. Кузнецов С.И., Янковский О.Ю., Рынцын О.В., Буркова Н.В., Эйсмонт Ю.А., Тюкавин А.И. Способ оценки индивидуальной чувствительности больных к гемоконтактным препаратам при использовании гемосорбци-онных технологий // Заявка на патент № 97101930/14, приоритет от 10.02.1997 г.

37. Кузнецов С.И., Янковский О.Ю., Рынцын О.В., Буркова Н.В., Эйсмонт Ю.А., Тюкавин А.И. Способ проведения гемосорбции К Заявка на патент № 97102277/14, приоритет от 14.02.1997 г.

38. Кузнецов С.И., Янковский О.Ю., Буркова Н.В., Рынцын О.В., Эйсмонт Ю.А., Канаев П.А., Чурилова И.В., Болдырев А.Г., Тюкавин А.И. Продукция активных форм кислорода (АФК) лейкоцитами как интегральный показатель биосовместимости гемосорбентов // Эфферентная терапия. -

1997. - № 2. - С.46-56.