Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональное состояние полиморфноядерных лейкоцитов и их влияние на функции макрофагов при некоторых бактериальных инфекциях

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Функциональное состояние полиморфноядерных лейкоцитов и их влияние на функции макрофагов при некоторых бактериальных инфекциях"

„ оа

2 1з и-и

Ка призах рукописи

ПЛЕХОВА Наталья Геннадьевна

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯ ЭЛИМОРФНОЯДЕРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ 'А **Х ВЛИЯНИЕ НА ФУНКЦИИ МАКРОФАГОВ ПРИ НЕКОТОРЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЯХ

03.00.11. - эмбриология, гистология, цитология

АВТОРЕФЕРАТ ^г-У

диссертации на соискание ученой степени я кандидата биологических наук

ВЛАДИВОСТОК-1996

Диссертация выполнена в Институте эпидемиологии и микробиолс: СО РАМН з лаборатории патоморфологии и электрон! микроскопии.

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук Л.М.Исачкова Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук В.В.Исаева Кандидат медицинских наук О.Г.Полушин

Ведущая организация: Институт морфологил человека РАМН.

Защита состоится " -13" 1996 г. в -/ & ^Час. на заседаня

Специалюирогитого совета Д. 084. 24. 01. при Владивостокском Гс сударствснном медицинском университете го адресу: 690600, г. Влад восток, пр. Острякова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Владивостокского Государственного медицинского университета.

Автореферат разослан" 44." .¿тфл^ И 96 г.

Ученый секретс Специали?ирог-иного совета кандидат Оиоло- веских нэлте

Г.М.Холодс1п:о

Актуальность проблемы. Активное развитие современной им-нологии за последшою четверть века определило положение о том,

0 система, обеспечивающая устойчивость макроорганизма к воздей-зшо патогенов, является единой и носит название клеточно-гумораль-й иммунофагоцитарной системы (Н.Ю.Громыхина, 1993; Б.С.На-;в, 1986; И.М.Шевак,1987). Как известно, одним из высокодифферен-рованкых клеточных элементов иммунофагоцитарной системы явля-ся полиморфноядерные лейкоциты. На современном этапе исследо-зий, помимо гидролитических ферментов, выявлены и изучены че-ре бактерицидные системы нейтрофильных гранулоцитов, специали-юванных для обезвреживания микроорганизмов. К ним относят елопероксидазную систему, лизоцим, лактоферрйк и антимикробе катионные белки (В.Е.Пигаревский, 1978; Ю.А. Мазинг, 1994). Ли-:омные катионные белки открыты и исследованы сравнительно не-шо и систематическое изучение их содержания в полиморфнодцер-х лейкоцитах при инфекционных заболеваниях только начинается.

наш взгляд, на данном этапе значительный интерес представляют [ исследования в зависимости от вида возбудителя, остроты и тяже-

1 патологического процесса. Кроме того, оценка кооперативного кггвия миелопероксидазы и катионных белков в сопоставлении с гоцитарной активностью нейтрофильных гранулоцитов, по мне-о некоторых авторов (Н.И.Бахов, 1988; A.W. Segal, 1993), дает воз-кность выявить их максимальный бактерицидный эффект и усло-[, при которых он проявляется.

Особое внимание ни современном этапе привлекает вопрос о пени участия полиморфноядерных лейкоцитов в кооперации с клет-ш миелоидного ряда в очаге воспаления при бактериальных инфек-[х ( К.Н.Кокряков, 1988; В.Н.Галанкин, 1991; K.-P-Leung, 1989). Не-орыми авторами указывается на ведущую роль дефенсинов челове-ких нейтрофилов как физиологических медиаторов, способных регу-ювать функциональную активность моноцитов (С.Б.Ткаченко, 3; И.К.Долгушин, 1990). Поэтому для нас также представило инее изучить влияние нейтрофилов на бактерицидные свойства мак-)агов.

Цель настоящего исследования

Дать характеристику активности микробицидных компотов полиморфноядерных лейкоцитов и оценить степень их

влияния на функции макрофагов при некоторых бактериальных i фекциях.

Для достижения указанной цели были решены следующие за;

чи:

1. Дать м'орфофункциональную характеристику поли-мононуклеарных фагоцитов в динамике псевдотуберкулезной, салы неялезной и стафилококковой инфекций в эксперименте.

2. Определить функциональную активность полиморфнояд ных лейкоцитов и макрофагов при их взаимодействии с различны плазиндными вариантами Yersinia pseudotuberculosis.

3. С помощью математических методов дать сравнительн морфофункциональную характеристику количественных показатез фагоцитирующих клеток при воспалительных процессах различт этиологии.

4. Исследовать "in vitro" влияние продуктов секреции интактн и активированных нейтрофилов на функциональную активность м рофагов.

научная новизна и теоретическое значение работы

Впервые с помощью комплекса цитоморфологических мето; исследования и регрессионного анализа дана сравнительная мор функциональная характеристика клеток нмнунофагоцнтарной с темы (поли- и мононуклеарных лейкоцитов) при некоторых бакте альных инфекциях. По результатам количественного определения ы лопероксидазы, катионных белков и лизоцима охарактеризовано стояние основных бактерицидных систем полиморфноядерг лейкоцитов при их взаимодействии с патогенными бактериями {] sinia pseudotuberculosis, Salmonella гурЫтилит, Staphylococcus aure Выявлено, что характер изменения цитохимических и количествен! показателей полиморфноядерных лейкоцитов имеет определенные с бенности при инфекционных процессах, вызванных возбудителя различающимися по способности противостоять бактерицидному з действию фагоцитов. Показана ыикробищодная активность моно- и линуклеарных лейкоцитов в отношении различных по вирулентно плазмндных вариантов Y. pseudotuberculosis. С помощью электро* цитохимической микроскопии получены новые данные о i реэкдагащем действии микробицндных компонентов полимофноя; ных лейкоцитов, в частности, миелопероксидазы, на ультрас

фу бактериальных клеток, которые расширяют имеющиеся пргдета-гния о феномене внеклеточной бактерицидности нейтрофильных шулоцитов в отношении У. pseudotuberculosis, лежащей в основе »вития нефагоцитарного типа резистентности организма. В системе in •о установлено, что суперлатанты интактных и активированных ней-эфилов оказьтают макрсфагстимулирующее действие, проявляющее-в усилении бактерицидной и пролиферативной активности макро-гоз.

Апробация диссертации

Материалы исследования доложены и обсуждены на 1 и 2-ой •иональных межинститутских научных конференциях молодых уче-х, Владивосток, 1991 и 1992 гг. ; региональной научно-практической гферепции " Здоровье и болезни человека на Дальнем Востоке", 1ДИВОСТОК ; 1993 г. ; международной научной конференции " >nonuclear phagocyte system in normal and pathological states ", Нсзо->ирск, 1990 г., научно-практической конференции " Инфекционная х>логия в Приморском крае ", Владивосток; 1989,1994 гг.. Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 работ. Объем и структура диссертации юта состоит из введения, обзора литературы, четырех глав ственных исследований, заключения и выводов. Диссертация ожена на 148 страницах машинописного текста, содержит 24 рисун-и 5 таблиц. Список цитированной литературы включает 98 чественных и 126 иностранных источников.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При изученных бактериальных инфекциях наблюдается общая денция снижения интраяейхоцитарных микробицидных компонен-, что связано с секреторной дегрануляцией полиморфноядеркых коцитов. Интенсивность и характер этого процесса зависят от вида фулентности патогенного агента.

2. По данным электронно-цитохимической микроскопии поли-ононуклеарные фагоциты периферической крови экскретаруют во клеточное пространство как бактерицидные (миелопероксидаза), и протеолигаческие (кислая фосфатаза) компоненты, которые спо-[1Ы вызывать повреждающее, L-трансформирующее действие 1ефагоцитированные бактерии.

3. Супернатанты иктактлых и активированных нейтрофилов

оказывают макрофагстимулирующее действие, усиливая бактери цидную и пролиферативную активность мононуклеарных фагоцито Это можно отнести к одному из проявлений кооперативных связей м но- и полинуклеарных фагоцитов.

Материалы и методы исследования

Исследования выполнены на 450 морских свинксх массой 15' 200 гр., 20 мышах-самцах 1-2-х недельного возраста линии СНзНе, i мышах-гибридах Fi (СВА*С 57 Bi) массой 1В-25 гр., 250 беспороднь половозрелых белых мьппах-самцах. Животные были получ^^ы из га томника РАМН "Рапполово" и использованы в опытах после 1-2-х н дельного карантина. Уход и все процедуры осуществлялись в соотвег ствии с нормами и правилами обращения с лабораторными животнь ми.

С целью изучения функциональной активности поли- и монс нуклеарных лейкоцитов делали мазки периферической крови и перитс неального экссудата зараженных животных в динамике инфекций. Дл получения статистически достоверных результатов на один показ; тель использовали 6-10 животных. В качестве источника гэпуляци нейтрофилов использовалась периферическая кровь 30 кадровых дс норов.

В качестве инфекционных агентов и объектов фагоцитоза в даг ной работе были взяты следующие виды бактерий: Yersini pseudotuberculosis, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus.

Для моделирования экспериментального псевдотуберкулез использовали штаммы Y.pseudotuberculosis с различной плозмидно: характеристикой: 1) вирулентные штаммы с одновременным присутст вием двух плазмид молекулярной массой 48 и 82 МегаДальтон (МД] 2) вирулентные штаммы с наличием единственной плазмиды вирулеш ности мол. массой 45 МД; 3) слабовирулентный штамм, содержащий плазмиду мол. массой 82 МД (pVM 82); 4) слабовирулентные бес , плазмидные штаммы. Суспензии бактерий использовали для внутримы щечного и внутрибрюшинного заражения морских свинок из расчета при псевдотуберкулезе 200-250 тыс. м.к., при сальмонеллезе 150-201 тыс. м.к. и при стафилококковой инфекции 550-600 тыс. м.к. hi морскую свинку.

Для исследования секреторной активности, популяцию нейтро филов получали с помощью метода центрифугирования на двойно», градиенте плотности. по методу Е.А.Крашенниково1

'1987). Продукты секреции нейтрофилов получали после контакта хле-ок с латексом и вышеуказанными бактерггями (соотношение 1:10). В :ачестве контрольных препаратов брали супернатант интактных ранулоцитов (Н.А.Лопатт<ин, 1985; И.И.Дслгушин, 1988). Супернзтан-ы, содержащие продукты секреции нейтрофилов, вносили за 60 мин. ;о заражения двухсуточной культуры макрофагов, полученной по ме-оду М. Simonet с соавт. (1985).

Из гематологических показателей у инфицированных живот-ых определяли морфологический состав крови по лейкоцитарной фор-гуле.

Гистохимические методы.

Лизосомально-катионный тест. Активность лизосомальных ка-ионных белков определяли по методу В.Е. Пигарезсхого и "O.A. Яазинга (1987), в качестве субстрата использовали сптфтовый 1 % аствор анионного красителя прочного зеленого Far* Green FSF Serva).

Выявление миелопероксшгазы. Активность миелопероксрдазы пояиморфноядерных лейкоцитов оценивали, используя в качестве кисляемого субстрата 3,3" -диаминобензидгш (Serva) в спирт^зом асгзоре по методу Graham-Knoll (1966).

НСТ-тест. Показатели НСТ-теста определяли по методике, v.o-ифицированной Е.П. Голубинским и соавт. (1985).

Выявление лизоцима. Лизоцим в гейкоцитах определяли по етоду Л.П. Бушмелевой и соавт. (1986). "3 качестве субстрата ис-ользовали 0.01 % раствор гистамина. /

Фагоцитоз. Определяли количестве поглощетп'.'лх бактерий Е>4) и процент участвующих в фагоцитозе моно- и полинуклеарных :йкоцитов (ФП). По методике (P.Garlinski, 1987) определяй внутри-теточную бактерицидную активность фагс"*ггов. Методы яудаоизотопной метки.

Определение продукции макрофагами интерлейкига-1 под вли-шем супернатанта нейтрофилов проводили по методу Т.В. Михеенко 991), а также изучали ггролифератшшую атсппшость макрофагов по етоду J.Bird, 1983. Выявляли количество меченых Н3-урчдином бактс-т, поглощенных макрофагами.

Электронно-микроскопические исследования.

Для выявления пероксидаз в нейтрофилах по методу Ф.Г.Д;^. ейхоу и Д. Кваглино (1983), использовали две инку-

бационные среды: насыщенный раствор свободного основания 3,3'-,щ минобензидина в трис-HCl буфере и раствор тетрахлорпда выше! званного соединения в пропандиоловом буфере. Для выявления кисл фосфатазы использовали инкубационную среду следующего соста] 0.8 % раствор нитрата свинца на основе трис-малеатного буфер, 120 мг. а-глицерофосфата Ка.Образцы фиксировали в 1% раствс глютаральдещда на основе 0,1 моль/л какодилат-ЕС1 бyфq Дофиксацию проводили 2 % раствором четырехокиси осмия. Пос дегидратации лейкоконцентраты заключали в эпон-аралдит. Сре: просматривали под электронным микроскопом JEM 100S.

методы статистической обработки.

В работе были использованы методы корреляционного и р< рессионного анализов, расчеты произведены с использованием пр граммы электронных таблиц Ехсе11-4.1 на компьютере типа IBM-1 386. Для выявления различий между цифровыми показателями опыта х и контрольных групп животных применяли t-критерий Стьюдента F-критерий Фишера. Для построения графиков использовали пр грамму Harvard-Graphics 3.2.

Резуль та ты исследования.

Характеристика полинуклеарных лейкоцитов при ъ

взаимодействии с yersinia pseudotuberculosis.

Проведенные исследования показали, что при фагоцитозе бак] рий псевдотуберкулеза гранулоцитами периферической крови зараже ных и интактных животных, in vitro, количество клеток с поглощены ми микроорганизмами было незначительным. Так, при совмести* экспозиции полиморфноядерных лейкоцитов интактных животных вирулентным двухплазмидным штаммом Y.pseudotuberculosis через ; мин. ФП составил 10 ±1.02 %, ФЧ - 0.72±0.06, через 120 мкн. 10±0.8 и 1.2±0.08 соответственно. Для гранулоцитов зараженных животш через 30 мин. экспозиции ФП колебался от 10±0.2% (12 ч. после з ражения) до 1±0.16 % (30 ч.после заражения), а ФЧ составляло < 0.72±0.06 до 0.08±0.007 соответственно. Через 120 мин. экспозиции ф гоцитарные показатели оставались в пределах указанных величин. Ф гоцитоз носил незавершенный характер.

В очаге воспаления (система in vivo) фагоцитарные показать для полиморфноядерных лейкоцитов были несколько вьш

!ак, через 15 мин. после заражения животных ФП соста! та 14±1.?5 и Ч - 2.32±0.2, через 30 мин. 9±1.05 % и 1.3±0.08 соотр?тствекнс В льнейшем фагоцтгарные показатели снижались: через 6 после />а-:ния ФП составил 4.3Ю.55 % и ФЧ 0.23+0.02, а через 12 часов пссле эажения бактерии в полиморфноядерных лейкощг'-гх ритонеального экссудата не выявлялись.

При изучении активности бактерицидных комле чггов тгуэд-»рфноядерных лейкоцитов периферической крови у зар".:т<енных ; -ситных на протяжении всего наблюдаемого времени показатели средче-цитохимического коэффициента (СЦК) по содержанию "гиелопо^х-цазы, лизоцима :: катиочных белков достоверно (р<0,0Р были гт:ке нтрольных цифр. Показатели СЦК для миелопероксид ^ы чере- 15 т., 2, 6, 9, и 30 час. после заражения составили 1.61±0. 2, 1.34±С 03, >±0.1, 0.86±0.05 и 0.75±0.48 соответственно, при контрег? 1.625±С' ж тех же сроках инфекции СЦК для лизоцима соотвстс" "енно с-хга-л 1.01 ±0.55, 0.83±0.05, 0.78±0.08, 0.31±0.06 и 0.4б±0.02 (гои кошг лче )72±0.07) и для хатиотгзого белка СЦК - 0.76±0.4:~ 1.02±0.С25, >±0.057, 0.5±0.03 и 0.15±0.04 (при контроле 1.41±0.051). Показаг.-ли ДК для полиморфноядерных лейкоцитов перитонеальк:~"о экссудата тактных живота:« достоверно (р<0.05) были более вы ;.'.ие, чем ; дя анулоцитов периферической крови и составили для мтг. опероксг да- 2.5±0.15, для лизоцима - 1.21 ±0.07 и для :<атиошт,,гх белкст -г5±0.17. У опытных животных показатели СЦК для кгг: ,онных Сел-в через 15 мин., 2, 4, 7, 12, и 30 час. после заражеш'а состзг\ 'ли >9±0.12, 1.13±0.1?5, 0.49±0.08, 0.47±0.05, 1.49±0.24 и 0.57±\07 сосптет-зенно и для лкзоцима - 1.09±0.07, 1.02±0.08, 0.49±0.01Ч 0.47г",04, >7±0.05 и 0.34±0.025. Что же касается динамики колипсс ^а миелепе-ксидазьт в гракулецитах очага воспаления, то сна носи;: л несколько ой характер. В гяпалыг- ?, сроки инфекции наблюдалось достоверное вышение показателей СЦК, которые в дальнейшем начинали салься, достигая минимальных цифр через 7 часов после заражения, к, через 15 мин., 2,4, 7, 12 л 30 час. после заражения показатели СЦК ставили 2.83±0.18, 1.59±0.15, 1.56±0.12,1.09±0.09, 0.93±0.08 и 0.16±0.02 этветственно.

Отсутствие тенденции к восстановлению в этот срок содержания гионных белков и миелопероксидазы п гранулоцитах животных, жженных У.рз^лйогиЬегайо^, по нашему мнению, харах-

теризует снижение бактерицидного потенциала этих клеток результате их дегрануляции. При использовании метода электронн цитохимической микроскопии, нами подтверждена дегрануляция не трофилов в ответ на присутствие Y.pseudotuberculosis. Этот проце проявляется наличием гранул с положительной реакцией на миелог роксидазу на клеточной стенке внутри- и внеклеточно расположенш бактерий. Обращает на себя внимание, что при этом часть бактер! претерпевала ультраструктурные изменения клеточной стенки, свил тельствующие об L-трансформации их по сферопластному типу. V тановленная нами особенность функционального состояния гранулоц тов при псевдотуберкулезе в начальные сроки инфекции, которая bi ражается в .снижении фагоцитарной активности по отношению Y.pseudotuberculosis на фоне высокой напряженности интралейкоц тарных бактерицидных систем (активная дегрануляция) , по H.H. Г ланкину (1989), определяется ка;с относительный гракулоцитарный hj мунодефицит. Тем не менее, полученные нами результаты позволяв высказать предположение о наличии внеклеточного бактерицидно) воздействия полиморфноядерных лейкоцитов на данный возбудител что может быть одним из механизмов развития нефагоцитарного thi резистентности.

В последнее время выявлено, что при аллергических и гнойное птических заболеваниях встречаются иммунодефицигаые состояш по системе нейтрофильных гранулоцитов, утяжеляющие течение инфе ций (И.В.Кестерова, 1989). Подобная зависимость была обнаружена н ми при экспериментальной псездотуберкулезной инфекции, вызваннс различными по вирулентности штаммами возбудителя, связанной с i плазмидной характеристикой. Так, определено, что у животны зараженных слабовируленткыми бесплаз мидными штамма\ Y.pseudotuberculosis и штаммами, содержащими плазмиду мол. массс 82 МД (Рис. 1), к 28 суткам инфекции в гранулоцитах^ происходило а тивное накопление катионных белков, что свидетельствовало о лучше восстановлении бактерицидного потенциала этих клеток по кислоро, независимой системе. В случае заражения животных вирулентным штаммами иерсиний, содержащими плазмиду мол. массой 45 МД ш две плазмиды - 48 и 82 МД, интралейкоцитарное содержание катио] ных белков восстанавливалось менее активно.

На модели первичной культуры макрофагов, с помощь

\

*ис.1. Изменение количества катионных белков в нейтрофилах периферической крови при заражении различными плазмидными вариантами Y.pseudotuberailosis I.-l 184-3260/р.0 MD; II.- 3260/рр.48, 82 MD; III.-1182-3260/p.82 MD; 1У-Н709/р.45.По оси ординат - логарифм значений СЦК в относительных единицах, по оси абсцисс - д тителыюсть инфекции. Нпклопы зависимостей (линии) получены с помощью метода наименьших квадратсз.

1етода фазово-кстгграсгиой микроскопии нами установлено, что лишь [ебольшая часть фагоцитированных иерсиний, содержащих плазмиду ирулентности мол. массой 45-48 МД, подвергалась фагоцитозу макро-эагами. Основная же часть бактерий оставалась жизнеспособной, ока-ывая цитотоксическое действие на клеточную культуру. Фагоцитарная ктивностъ макрофагов была обратно пропорциональна вирулентно-ти штаммов Y.pseudotuberculosis, связанной с их плазмидным профилем рис.2).

J.D. Goguen с соавторами (1986) при сЕггоопткче ?ком и лектронно-микроскопичесхом изучении взаимодействия перет^гзае-юй культуры макрофагоз с Y.pestis и Y.pseudotuberculosis, и меющих »азличную плазмидную характеристику, также выявили, что птгаммы ¡актер™, содержащие плазмиду вирулентности, оказывают цитото-хическое действие на фагоциты. Подобное слияние плязмиды (ирулентности мол. массой 42-48 МД у иерсиний на бункцио-илъчую аттивность нейтрофилез описывалось и други-

Рйс. 2. Фагоцитарная активность макрофагов по отношению к различным плазмидным вариантам Y.pseudotuberculosis. По оси ординат - фагоцитарное число, по оси абсцисс - время зкспозиции.Штаммы Y.pseudotuberculosis: 1- 1184-3260/р.0 md, 2 - 86 í-995/р.о md, 3-1182-3260/р.82 md, 4-889/р.82 md, 5- 500- 995/р.45 md, 6-Н709/р.45 md, 7-3260/рр.48,82 md, 8 -889/рр. 48,82 md..

мк авторами ( LBolin, 1988; R.Rosqvist, 1994). Вместе с тем Н.О.Тимченко (1989) не обнаружила четких различий фагоцитарно активности макрофагов в отношении Y.pseudotuberculosis с различно плазмидней характеристикой. Как сообщает АЛ. Гинцбург (1989 такие различия зависят от условий эксперимента, а именно: состав культура^ной среды, температурного режима культивирования 6ai терий, разновидностей макрофагов.

Сравнительная морфофункциональная характеристик moho- и полинуклеарных фагоцитов при воспалительны процессах различной этиологии.

Как известно, биологические свойства возбудителя способы определять реактивность клеток иммунофагоцигарной сист<

«ы, в частности, моно- и полинуклеарных лейкоцитов ( М.В.Войно-Ясенецкий, 1981; А.И.Струков, 1982). В связи с этим, сравнительное ^следование функционального состояния лейкоцитов мы сочли целесообразным провести при использовании микроорганизмов, различающихся по способности противостоять бактерицидному воздействию фагоцитов. Полученные результаты позволили нам подойти к ксмп-тексной оценке состояния фагоцитирующих клеток при их взаимодействии с агентами как хорошо обезвреживающимися бактерицидными системами лейкоцитов (Staphylococcus aureus), так и устойчивы. к юс воздействию (Yersinia pseudotuberculosis и Salmonella typhimuriwv,).

При заражении животных вирулентными штаммами бактерий, способных к внутриклеточному паразитированию и генерализатщи [Y.pseudotuberculosis и S. typhimurium), было установлено, что первыми в эчаге воспаления (перитонеальный экссудат) появляются гранулоциты ¡рис.З/а), а в последующем (свыше 9 часов после заражения) преобладают макрофаги. Подобная реакция клеток описывалась и другчми исследователями при экспериментальной псевдотуберкулелюй инфекции у мышей и кроликов, вызванной внутрибрюшинным и интрг'.на-зальпым заражением вирулентными штаммами иерсиний (Н.М.Ачич-ков, 1972; Н.Н.Беседнова, 1986; Ю.А.Мазинг, 1982). Напротив, при заражении агентами, вызывающими локальное воспаление (St. aureus и стерильное вазелиновое масло), в эти же сроки выявлено псрвона^лль-яое накопление макрофагов (рисЗ/б), сменяющееся притоком полиморфноядерных лейкоцитов. Таким образом, в первые 30 часов после заражения, нами определена различная периодичность появления в очаге госпаления моно- и полинуклеарных лейкоцитов в зависимости от вида возбудителя.

В целом, при анализе полученных результатов по опенке функции микробицидных компонентов полиморфноядерных лейкоцитов в гечегае воспалительных процессов различной этиологии в системе in vivo была выявлена различная реакция гранулоцитов как г. периферической крови, так и в очаге воспаления. Если при асептическом госпалении, вызванном стерильным вазелиновым маслом, происходило умеретшо выраженное снижение содержания микробицидных компонентов, то при заражении патогенными бактериями ферментативная реакция полиморфноядерных лейкоцитов но-

b

¡00 т

-0,6 -0,05 0,5 1,05 1,6 1зТ

Рис.3. Изменение количества а) нейтрофилов; б) макрофагов в очаге юспаленкя. I - заражение Y.pseudotuberculosis\ II - заражение St. aureus; III - заражение S. typhimurium; IV - асептическое воспалено. По оси ордгшат процент нейтрофилов и макрофагов от общего количества клеток, ьо оси абсцисс логарифм длительности инфекции. Наклоны зависимостей (линии) получены с помощью метода наименьшее квадратов.

)сила более сложный характер, особенно при заражении животных pseudotuberculosis и S.typhimimum . Обнаружено, что при заражении явотиых этими бактериями наблюдалось продолжительное сниже-ie содержания миелоперокскдазы в пояиморфноядерных лейкоцитов ¡ага воспаления (рис.4/а.), что указьшало на более активное ее расхо->ванис гранулоцитами в ответ на введение бактерий. Что же касается ггимикробных катионных белков в гранулоцитах, то при первона-льном снижении их количества, в дальнейшем динамика показателей >сила волнообразный характер, не достигая контрольных цифр ис.4/б). Это позволило заключить, что кислород-независимая сис-ма (катионные белки) также участвует з процессе взаимодействия с истериями, однако менее активно, чем кислород-зависимая система шелопероксидаза). Полученные результаты дополняют данные ггературы о функционировали бактерицидных систем

>лиморфноядерных лейкоцитов, указывающими на то, что in vitro pseudotuberculosis и S.typhimurium обезвреживаются фракциями кати-шых белков (P.Elsbach, 1979, 1983; W.Pruzanski, 1984; P.G.Quie, 1984; Weiss, 1986). Опираясь на свои результаты, мы можем гово-ггь об одновременном участии обеих бактерицидных систем щиморфноядерных лейкоцитов в обезвреживании данных бактерий.

Общеизвестно, что наличие инфекционного процесса в орга-1зме ведет к изменению клеточного состава периферической крови. В юведекных нами экспериментах после заражения животных всеми >емя использованными видами возбудителей обнаружено повышение юцента полиморфноядерных лейкоцитов от общего количества ядро-держащих клеток. Выявленное при этом к концу срока наблюдения О часов) повышенное содержание миелопероксидазы б •лиморфноядерных лейкоцитах животных, зараженных S. vhimurium и St.aureus, по-видимому, мо>,<но связать с выбросом кле-к костно-мозгового пула. Кроме того, к этому времени выявлялась нденция к восстановлению интралейкоцитарного содержания тионных белков у этих групп животных. По Ю-А.Мазингу (1993) это ляется благоприятным прогностическим фактором при данных ин-;кциях, который не определялся нами при заражении животных pseudotuberculosis.

а з j «

v

2 т - [

О |

+ +,Ч J

0,6 igT

1,2 1,8

б

-h

-h

-0,6

-0,05 0,5 1,05 IgT

1,6

Рис.4. Иг •2iir,xrо количества а) миелопероксидазы; б) катионных белков р "»Гггр^фипах очага воспаления. I - заражение Y.pseudotubercu-lr %11 - заражение St.aureus] III - заражение S. typhimurium; IV-:.< тпг- rcoe воспаление. По оси ординат значение СЦК в относи-т'-^лхиг. единицах, по оси абсцисс логарифм длительности инфек-ггг". К" лоны зависимостей (линии) получетты с помощью метода кг-гмс^ ттчх квадратов.

влияние продуктов секреции нейтрофилов на функци-нальную активность макрофагов.

Известно, что в динамике инфекционного процесса стимулиро-анные нейтрофилы способны изменять функциональную активность азличных клеток, в том числе и макрофагов (И.И.Долгушин, 1986-92: ,А. Крашенникоза, 1987: J. Bird, 1983: D.L. Lefkowitz, 1992).С целью пределения взаимодействия этих клеток в процессе обезвреживания актерий нами было изучено влияние супернатантов нейтрофилов на екоторые функции первичной культуры макрофагов.

Установлено, что субпопуляция нейтрофилов, выделенная из онорской периферической крови и затем активированная в течение 60 ин. различными объектами фагоцитоза, способна посредством рас-воримых дегранулиросанных биологически активных веществ оказы-ать влияние на бактерицидную и пролиферативную активность макро-агов. При анализе данных, полученных с использованием в качестве оъекта фагоцитоза Y. pseudotuberculosis, обращает на себя внимание эт факт, что супернатанты нейтрофилов способны стимулировать фа-эцитарную активность макрофагов. Под влиянием всех изученных ви-эв супернатантов активизируется не только поглотительная, но и греваривающая активность макрофагов в отношении вирулентных ггаммов иерсиний (рис.6.). Подобное повышение бактерицидной ак-1вности мононуклеарных фагоцитов под влиянием супернатантов ней-эофилов, внесенных за 60 мин. до начала фагоцитоза, наблюдалось наи и в отношении St.aureus (рис.5).

Поскольку появление моно- и полинуклеарных лейкоцитов в гаге воспаления разделено временным промежутком, то предположе-яе о влиянии секретируемых нейтрофилами веществ на активность акрофагов вполне оправдано. Нам представляется возможным в шном случае говорить о наличии такого явления как резорбтивная юточная резистентность. По ЮА. Мазингу (1993), суть этого явле-т состоит в том, что мононуклеарные фагоциты способны приобре-11ъ принципиально новые свойства за счет резорбции (эндоцитоза, се-»егации) антимикробных катионных белков полиморноядерных ¡йкоцитов. На основании собственных и литературных данных '.P.Speer, 1984; B.Cantinieaux, 1988; K.-P.Leung, 1989), мы можем (ворить о том, что мононуклеарные фагоциты способны погло-

Рис.5. Количество жизнеспособных St. kureus после фагоцитоза их макрофагами, стимулированными супернатантами нейтрофшхов.Ре-зультаты представлены как процентное отношение к контрольной величине (ось ординат), контроль составил 100 % и равен для St. aureus 387±12.9 колоний ± ошибка среднего (р<0.05), по оси абсцисс - время экспозиции, I - одновременное внесение супернатанта и бактерий, II - внесение суперна-танта за 60 мин. до начала фагоцитоза. 1.- супернатант неактивированных нейгрофилов, 2.- суперна-тант активированных латексом нейтрофилов, 3. - супернатант акгсюиропашшх бактериями нейтрофилоз.

ис.6. Количество жизнеспособных У.ряеийошЪетайот после фагоцитоза их макрофагами,стимулированными супернатантами нейтро-филов. Результаты представлены как процентное отношение к контрольной величине (ось ординат), контроль составил 100 % и равен для У.ряеийошЪегсиЬж 302±0.8 колоний ± ошибка среднего (р<0.05), по оси абсцисс - время экспозиции, I - одновременное внесение супернатанта и бактерий, II - внесение суперна-танта за 60 мин. до начала фагоцитоза.

1. - супернатант неактивированных нейтрофилов, 2.- супернатант активированных латексом нейтрофилов, 3. - супернатант активированных бактериями нейтрофилов.

лг,

иг. ть не только катионные белки, выделяемые нейтрофилами, но и дру п' ? бактерицидные компоненты (миелопегоксидазу), что повышает и б ггерицидный потенциал, недостаточно выраженный у зрелых макро фтгов (G.R.Elliot, 1986; L.Heifets, 1980).

В свою очередь, бактерицидное де йствие продуктов секрещи не"ггрофилов на внеклеточно расположенные бактерии повьппает эф фе ггивность фагоцитоза их макрофагами. В макрофагах первично! культуры количество жизнеспособных бактерий, обработанных до на чат:а фагоцитоза супернатантами нейтрофилов, достоверно уменьша до-"-, по сравнению с контрольной культурой. Кроме того, npi эл лсгронно-цитохимическом исследовании установлено, чтомакрофа ги гакже способны выделять протеолитические ферменты (кислая фос фатаза), оказывая переваривающее действие как на внутри-, так и вне клеточно расположенные Y. pseudotuberculosis.

С помощью метода радиоизотопной метки обнаружено повы шение пролиферативной активности макрофагов под влиянием супер натантов интактных, активированных латексом и S.typhimurium ней трофилов. Это согласуется с данными J, Bird (1983) и S.K. Chape (1983) о подобном влиянии та макрофаге лизатов гранул, а также дру гих видов супернатантов нелрофилоз. Что же касается остальных ис пользованных нами агентов стимуляции, то такого повышения актив ности макрофагов не было установлено. Следовательно, степень влия ния супернатантов нейтродилов на пролиферативную активност макрофагов зависит от объе ла стимуляции нейтрофилов.

Таким образом, опираясь на литературные и собственны данные, впервые полученные с помощью комплекса цитоморфологиче ских методов исследования * регрессионного анализа результатов, мс жно констатировать, -:то реактивность полиморфноядерны лейкоцитов в очаг? воспаления и г> периферической крови имеет on ределенные особенности г?и инф лсцисгльтх процессах, вызванны возбудителями, различают тмися по способности противостоять бак терицидному воздействию • Фагоцитоз. Полученные результаты распгс ряют имеющиеся предсташг :ия о феномене внеклеточной бактерицид ности нейтрофильных грахг лоцитоп в отношении Y. pseudotuberculosis лежащей в основе развитие нефгл оцитарного типа резистентносг организма.

ВЫВОДЫ

1. На основании комплекса цитоморфологических методов [сследования и регрессионного анализа полученных результатов сгановлено, что при воспалительных процессах, вызванных Yersinia | pseudotuberculosis^ SalmonellaJ typhimuriuml и Staphylococcus aureus\ pe-кция полиморфноядерных лейкоцитов характеризуется стимуляцией ак кислород-зависимого (миелопероксидаза), так и кислород-незави-имого (антимикробные катионные белки) метаболизма.

2. Изменение активности микробицидных компонентов поли-юрфноядерных лейкоцитов, реагирующих на присутствие патоген-ого агента посредством секреторной дегрануляцик, зависит от его ви-овой принадлежности.

3. В ранние сроки изученных инфекций показана различная ериодичность накопления в очаге воспаления моно- и полкнукле-рных фагоцитов. После введения возбудителей, способных к внут-иклеточному паразитированию (У.pseudotuberculosis, S. typhimurium ), перитонеальном экссудате первоначально преобладают полкморф-оядерные лейкоциты, а затем макрофаги. После введения агента, в от-ошение которого наблюдается активный фагоцитоз лейкоцитами (St. ureus), смена клеточных реакций происходит в обратной последова-гльносгл.

4. При инфекционном процессе, вызываемом . плазмидсодержа-[ими вирулентными штаммами ~У.pseudotuberculosis, j в начальные юки инфекции выявлен относительный гранулоцитарный иммуноде-ицкт, характеризующийся низкой фагоцитарной активностью поли-орфноздерных лейкоцитов при высокой напряженности шпралейко-этарных бактерицидных систем (активная дегрануляция).

5. На модели псевдотуберкулезного микроба с помощью [екгронно-цитохимической микроскопии показано, что под влиянием жтерицидных компонентов полиморфноядерных лейкоцитов, в частости, миелопероксидазы, возникают ультраструктурные изменения иктериальных клеток, характерные для L-трансформации сферопласт->го типа, что является одним из признаков обезвреживаний бактерий.

6. В системе in vitro установлено, что супернаташы кнтактных и ггивированных нейтрофилов повышают эффективность

фагоцитарной функции макрофагов и их пролиферативную акп ность. Это является одним из механизмов, лежащих в основе фс мирования резорбтивной клеточной резистентности.

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1. Изменение функциональной активности полиморфно^ ных лейкоцитов при псевдотуберкулезной инфекции. // Жуг микробиол. - 1989. - N1. - С.72-75 (соавтор Л.М.Исачкова).

2. Ультраструктурные изменения бактерий в процессе развит резистентности к псевдотуберкулезному микробу. II Всесоюзн. Hay практ. конференция "Иерсиниозы": Тез. докл. - Владивосток, 1989. С.32-34 (соавторы: JI.M. Исачкова, А.А. Жаворонков).

3. Динамика простагландинов и циклических нуклеотидст больных псевдотуберкулезом и при экспериментальной псевдотуСс кулезной интоксикации в условиях применения индометацина. // Т. же. - С. 61-63 (соавторы: А.П. Прокопенкова, Л.М. Исачкова).

4. Влияние эндотоксина, выделенного из Yersinia pseud tuberculosis, на бактерицидную активность полиморфноядерных леГт< цитов. // Научно-практич. конференция "Инфекционная патология Приморском крае": Тез. докл. - Владивосток, 1989. - С. 110-111 (соавт ры: JI.M. Исачкова, А.П. Прокопенкова, Р.П. Горшкова).

5. О механизме действия эндотоксина псевдотуберкулезно микроба. // Там же. - С. 72-75 (соавторы: Л.М. Исачкова, А.П. Прокопенкова, Р.П. Горшкова).

6. Клинико-морфологическая характеристика иммунного стат са и пути коррекции его при иерсиниозах. // Тезисы докл. рабоче совещания "Иммуномодуляторы / природного происхождения",- Влад восток, 1990.-С. 92-94(соавторы: Л.М. Исачкова, А.П. Прокстенк ва).

7. Применение иммуностимуляторов в комплексной тграга больных иерсиниозами. // Там же. - С. 91-92 (соавторы: А.П. Прок пенкова, Л.М.Исачкова).

8. Effect ci intact and active neutrophils on phagocytosis с Yersinia pseudotu berculosis by macrophages.// In: Abstracts mononuclei phagocyte system in normal and pathological states. - Novosibirsk, 1990. - ; 165-168 (et al. Ъ.ЪMsachkova).

9. К вопросу о биологическом действии эндотоксина Yersinia eudotuberculosis. // Журн. микробиол. - 1990. - N 10. - С. 7-10 эавторы: JI.M. Исачкова, А.П. Прокопенкова).

10. Фагоцитоз макрофагами Yersinia pseudotuberculosis с раз-[чной плазмкд-ассоциированной вирулентностью. //Науч.-практ. нференция "Здоровье и болезни человека на Дальнем востоке": Тез. кл.-Владивосток, 1993.- С.71.

11. Клинико-экспериментальное обоснование применения дометацина и гепарина для лечения больных иерсиниозами. // 1учн.-практ. конференция "Актуальные проблемы химиотерапии ктериальных инфекций": Тез. докл. - М., 1991. - С. 261-263 »авторы: JI.M. Исачкова, А.П. Прокопенкова).

12. Роль им"уисфагоцитарной системы в защите орг-ттизма от гвдотуберкулезной инфекции. // Сб. научных работ молодмх ученых кггитута эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. - Новоси-рск, 1992. - С. 83-90 (соавтор: Н.А.Трапезникова).

13. Фагоцитоз полиморфноядерными лейкоцитами п^рифериче-эй крови гт.гг'т-щых плазмидных вариантов Yersinia ¡udotuberculosis. /■' Т?" же. - С. 77-83.

14. Исполь?эв2н:те гелий-неонового лазера для воздействия на муниую систему ттр" гипотермии. // Сб. науч1шх трудов "Лазерная )апкя па Далыс г с стоке". - Владивосток, 1993. - С. 154-160 ( соав-эы: Н.Н.Беседнс^л, "\С.Запорожец, Л.М.Исачкова, В.М.Чуднов-гй).

15. Динамит ферментативной активности и количественных сазателей моно- по.тшуклеарных фагоцитов при воспалительных эцсссах различной этиологии \ // Научн.-практ. ког :сренция нфекцис:тлая патология в Приморском крае": Тес. докл.-здивосток, 1994. - С.162-164 (соавтор Л.М. Кпчкова).