Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Реактивность клеток врожденного иммунитета при инфекции, вызванной разными плазмидными вариантами Yersinia pseudotuberculosis

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Реактивность клеток врожденного иммунитета при инфекции, вызванной разными плазмидными вариантами Yersinia pseudotuberculosis"



На правах рукописи

ДРОБОТ Елена Игоревна

РЕАКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ РАЗНЫМИ ПЛАЗМИДНЫМИ ВАРИАНТАМИ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005559121

19 VLB 2015

Владивосток - 2014

005559121

Работа выполнена в лаборатории клеточной биологии и гистопатологии ФГБУ «Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» СО РАМН.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Сомова Лариса Михайловна Официальные оппоненты:

Храмова Ирина Афанасьевна, доктор медицинских наук, доцент кафедры акушерства и гинекологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Денисенко Юлия Константиновна, доктор биологических наук, заведующая лабораторией биомедицинских исследований Владивостокского филиала Федерального государственного бюджетного учреждения «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» -Научно-исследовательского института медицинской климатологии и восстановительного лечения

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится «12» марта 2015 г. в « 10°° » часов на заседании диссертационного совета Д 208.007.01 при ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Минздрава России (690002, г. Владивосток, Острякова, 2.). Тел.: (423) 242-97-78; Факс: (423) 245-17-19, электронный адрес: mail@vgmu.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» по адресу: 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2.

Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссертационного со-~~" А доктор медицинских наук, доцент

Н.Ю. Матвеева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Еще во второй половине XX столетия получил всеобщее признание постулат о том, что становление инфекции возможно при нарушении естественной защиты организма или встрече его с особыми патогенами, способными преодолевать эту защиту (Войно-Ясенецкий М.В., 1981). В этом контексте детерминанты вирулентности возбудителей инфекционных болезней обеспечивают их способность к выживанию, размножению и распространению в клетках и тканях организма хозяина.

В последнее 20-летие молекулярно-генетические исследования Yersinia pseudotuberculosis дали реальную возможность углубленного изучения биологических свойств возбудителя, оказывающих влияние на факторы иммунологической защиты и гистопатологию этой инфекции. К pseudotuberculosis относится к факультативным паразитам, и стратегия выживания бактерий в организме хозяина основана на их способности преодолевать механизмы врожденного иммунитета (Philip N. Н., Brodsky I.

E., 2012). Установлено, что возбудитель псевдотуберкулеза обладает большим набором факторов патогенности, часть из которых кодируется хромосомными генами, а часть - генами плазмид (внехромосомных генетических элементов) (Сомов Г.П. и др., 2001; Шурыгина И.А. и др., 2003).

Известно, что вирулентность бактерий рода Yersinia ассоциируется с наличием плазмиды молекулярной массой 42-48 MDa, которая кодирует 7 разновидностей токсических белков наружной мембраны бактерий - Yop-s (Brodsky I. Е., 2008; Brodsky I. E. et al, 2010; Peters K.N. et al., 2013). С плазмидным спектром иерсиний также связана их резистентность к фагоцитозу (Плехова Н.Г. соавт., 1999; Тимченко Н.Ф., 2011; Cornelis G R. 2006; Cornell's G R, 2010; Groves E.l.et al., 2010). В последнее время появились сообщения о способности штаммов Y. pseudotuberculosis, несущих плазмиду pVM 82 MDa, оказывать иммуносупрессивное действие (Набережных Г. А. и др., 2006; Коновалова Ж.А., 2002), однако в доступной литературе нами обнаружены лишь единичные попытки связать наличие данной плазмиды в бактериальной клетке с морфологическими и клиническими особенностями течения псевдотуберкулеза.

Накопленные к настоящему времени данные о патогенности бактерий рода Yersinia свидетельствуют о том, что этот признак находится под контролем регуляторных систем, которые ответственны за синтез макромолекул, принимающих участие в развитии генерализованного инфекционного процесса (Ценева Г.Я., 2002; Сомов Г.П. и др. 2001; Uliczka

F. et al., 2009). С другой стороны, характер инфекционного процесса, зависит от течения иммунных реакций и эффективности бактерицидных систем макроорганнзма, в том числе антимикробной активности клеток врожденного иммунитета - нейтрофилов и моноцитов/макрофагов (Хаитов Р.М, 2006; Silva М.Т, 2010). По данным литературы, освобождению организма от

возбудителя псевдотуберкулеза способствует, с одной стороны, фагоцитарная реакция макрофагов (Беседнова Н.Н., 1980), а с другой, — гибель нейтрофилов с освобождением ядерных гистонов в очагах воспаления и внеклеточным уничтожением бактерий и формированием нефагоцитарного типа местной резистентности (Мазинг Ю.А., 1995).

Несмотря на большое количество работ, посвященных вопросу взаимодействия клеток врожденного иммунитета с Y. pseudotuberculosis, высказываются противоречивые данные о роли нейтрофилов и макрофагов в патологическом процессе. Впервые результаты исследований по фагоцитозу разных плазмидных вариантов возбудителя псевдотуберкулеза приведены в работе J1.M. Исачковой и соавт. (1994). Однако морфофункциональное состояние и закономерности бактерицидных реакций фагоцитов при их взаимодействии с разными плазмидными вариантами Y. pseudotuberculosis остаются детально не исследованными. Причем, данные о реактивности фагоцитов в ответ на заражение штаммом, содержащим плазмиду pVM82, практически отсутствуют. Спорным остается утверждение Ж. А. Коноваловой (2002) о завершенности фагоцитоза разных плазмидных вариантов К. pseudotuberculosis в нейтрофилах. В то же время, вирулентные штаммы Y. pseudotuberculosis вызывают обильный приток лейкоцитов в очаги воспаления, но почти не фагоцитируются нейтрофилами (Плехова Н.Г. и др., 1999).

В органопатологии псевдотуберкулеза значительное место занимают деструктивно-воспалительные изменения с формированием типичных гранулем, подвергающихся центральному некрозу (Исачкова J1.M. и др., 1994; Шурыгина И. А. и др., 2003). Изучение роли апоптоза в органопатологии различных инфекционных болезней находится на начальном этапе своего развития. Баланс между про- и антиапоптотическими сигнальными механизмами, их активация или подавление при генерации реактивных продуктов кислорода и азота определяют либо защитное действие этих агентов на клетки, либо инициируемый ими переход клеток в состояние некроза или апоптоза (Ruckdeschel К. et al., 2004, Zheng Y. et al., 2005; Peters K.N. et al., 2013). Сведения об изучении типов программированной клеточной гибели, в частности апоптоза фагоцитов, при взаимодействии с разными плазмидными вариантами Y. pseudotuberculosis нами не обнаружены.

Цель исследования. Дать характеристику морфофункционального состояния клеток врожденного иммунитета при псевдотуберкулезной инфекции, вызванной разными плазмидными вариантами Y.pseudotuberculosis в системах in vivo и in vitro, провести сравнительный анализ ферментативной активности и типов повреждения этих клеток.

Задачи исследования: 1. Исследовать морфофункциональное состояние клеток врожденного иммунитета, зараженных разными плазмидными вариантами Y. pseudotuberculosis в системе in vitro.

2. В системе in vivo охарактеризовать морфофункциональное состояние эффекторных клеток воспаления (клетки перитонеального экссудата) при взаимодействии с разными плазмидными вариантами Y. pseudotuberculosis

3. Провести сравнительный анализ ферментативной активности нейтрофилов и макрофагов при инфицировании разными плазмидными вариантами Y. pseudotuberculosis.

4. Охарактеризовать клеточные повреждения в гистопатологии псевдотуберкулезной инфекции, вызванной разными плазмидными вариантами Y. pseudotuberculosis.

Научная новизна. Впервые в сравнительном аспекте дана комплексная морфофункциональная характеристика реактивности клеток врожденного иммунитета, включая кислородзависимые,

кислороднезависимые и нитроксидзависимые механизмы бактерицидное™, при экспериментальной инфекции, вызванной плазмидными вариантами pYV45: pVM82 MDa и pVM82 MDa Y. pseudotuberculosis.

На моделях in vivo и in vitro установлена вариабельность повреждений клеток врожденного иммунитета при инфицировании разными плазмидными вариантами Y. pseudotuberculosis. Обнаружено, что соотношение некроза и апоптоза эффекторных клеток воспаления (нейтрофилов и макрофагов) зависит от плазмидной характеристики бактерий Y. pseudotuberculosis и срока инфекции.

С помощью электронной микроскопии обнаружено формирование нового типа гибели клеток - нейтрофильной внеклеточной ловушки - при инфицировании клеток in vitro вирулентным двухплазмидным вариантом pYV 48: pVM 82 MDa Y. pseudotuberculosis.

Выявлено, что способность различающихся по плазмид-ассоциированной вирулентности вариантов Y. pseudotuberculosis индуцировать гибель (как по типу апоптоза, так и некроза) нейтрофилов и макрофагов сопровождается определенной ферментативной активностью фагоцитов. Индуцированный Y. pseudotuberculosis некроз клеток ассоциировался с повышением уровня продуцируемых ими метаболитов оксида азота, а апоптоз - с повышением активности ферментов кислородзависимого метаболизма клеток (сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и миелопероксидазы (МПО)).

Теоретическое п практическое значение работы. Полученные в работе новые данные расширяют представления о бактерицидных механизмах (кислородзависимые, кислороднезависимые,

нитроксидзависимые антимикробные системы) клеток врожденного иммунитета (нейтрофилов и макрофагов) в отношении разных плазмидных вариантов Y. pseudotuberculosis, а также способствуют пониманию ранее нераскрытых эффектов факторов патогенности возбудителя

псевдотуберкулеза.

Практическое значение результатов работы определяется тем, что они обосновывают целесообразность детального исследования ферментативной

активности фагоцитов для прогнозирования характера клеточно-тканевых повреждений и тяжести течения заболеваний, учитывая полиморфизм клинико-морфологических проявлений псевдотуберкулеза.

Положения, выносимые на защиту:

1. Морфофункциональная характеристика клеток врожденного иммунитета имеет качественные и количественные различия при инфицировании разными плазмидными вариантами Y. pseudotuberculosis.

2. В ответ на заражение слабовирулентным вариантом pVM82 MDa Y.pseudotuberculosis более активно реализуется бактерицидный потенциал и нитроксидобразующая активность фагоцитов, а также защитная реакция миелопероксидазы нейтрофилов, по сравнению с вирулентным вариантом pYV 48: pVM 82 MDa бактерий.

3. В ранние сроки после заражения вирулентным вариантом pYV 45: pVM82 MDa Y. pseudotuberculosis уровень активности ферментов кислородзависимой системы нейтрофилов превышает таковой после инфицирования слабовирулентным вариантом pVM 82 MDa.

4. Выявлено более выраженное апоптоз-индуцирующее действие бактерий слабовирулентного варианта pVM 82MDa Y. pseudotuberculosis на нейтрофилы и макрофаги по сравнению с вирулентным вариантом pYV 48: pVM 82 MDa, который преимущественно вызывал некроз фагоцитов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены и доложены на: VIII Дальневосточной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (МЭС ТИБОХ, 2004); VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010); Первых научных чтениях, посвященных памяти академика РАМН Г.П. Сомова "Будущее науки за молодыми учеными" (Владивосток, 2012); Первой Всероссийской конференции «Гетерогенность популяций бактерий и ее отражение в эпидемиологии и клинике инфекционных болезней» (Владивосток, 2013); Yersinia 11: 11 International Symposium on Yersinia (Suzhou, Chine, June 2013); XXV Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2014).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 20 печатных работ, включая 14 статей в журналах из списка, рекомендованного ВАК «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, который включает 64 работы отечественных и 185 работ иностранных авторов. Диссертация проиллюстрирована 35 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. В качестве инфекционных агентов для моделирования экспериментального псевдотуберкулеза и как объектов фагоцитоза использовали бактерии Y. pseudotuberculosis: 1) штамм 3260, серотип lb, выделенный от больного и содержащий две плазмиды -плазмиду вирулентности pYV48 MDa и плазмиду pVM82 MDa (вирулентный вариант pYV48: pVM82 MDa), LD50 составляла 5X104 м.к./мышь; 2) изогенный вариант штамма 3260, содержащий только плазмиду pVM 82 MDa (слабовирулентный вариант pVM82 MDa), LD50 составляла 108 м.к./мышь. Культуры бактерий были получены в лаборатории молекулярной эпидемиологии и микробиологии ФГБУ «НИИЭМ имени Г.П.Сомова» СО РАМН и любезно предоставлены руководителем лаборатории - д.м.н. профессором Ф.Н. Шубиным.

Экспериментальные исследования выполнены на 800 неинбредных мышах - самцах массой 20-25 г. и 40 морских свинках - самцах массой 200250 г., находившихся на стандартной диете в боксированных помещениях вивария ФГБУ «НИИЭМ им. Г.П. Сомова» СО РАМН. Животные контрольных и опытных групп одного возраста были получены одновременно.

Содержание животных и протоколы моделированных патологических процессов соответствовали правилам и принципам международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах. По завершению научных исследований животных выводили из экспериментов в соответствии с принципами биологической этики, изложенными в международных и российских нормативных документах. Работа одобрена этическим комитетом ФГБУ «НИИЭМ им. Г.П. Сомова» СО РАМН (протокол № 4 от 24 марта 2010 г.).

Для экспериментов in vitro первичную культуру нейтрофилов и макрофагов получали, вызывая внутрибрюшинное воспаление путем введения стерильной 1 % пептонной воды в количестве 5 мл на морскую свинку и 0,2 мл на мышь (Васильева Г.И. и др., 2005). Качество культуры нейтрофилов и макрофагов оценивалось методом прижизненного наблюдения клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии (Simonet М., 1985).

Для экспериментов in vivo популяцию фагоцитирующих клеток перитонеального экссудата у зараженных животных собирали аналогичным образом.

Фагоцитарную активность фагоцитов определяли через 30 мин и 120 мин контакта с Y. pseudotubercidosis в соотношении 10 бактерий на 1 фагоцит. Вычисляли следующие показатели фагоцитоза: фагоцитарный показатель (ФП) - процент клеток, фагоцитировавших бактерии, и

фагоцитарное число (ФЧ) - среднее количество бактерий, поглощенных одним фагоцитом (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989).

Определение внутриклеточной бактерицидной активности макрофагов проводилось по методу Р. Garlinski et al. (1987) путем посева поглощенных ими бактерий на питательный агар спустя 30 мин и 4 ч контакта, выражали в виде индекса бактерицидности (ИБ) в процентах.

Оценка функциональной активности фагоцитов проводилась в динамике через 0,25; 0,75; 1,5; 2; 3; 4; 5; 6; 7 ч и 1, 3, 5, 7 сут. после заражения в экспериментах in vitro. При исследованиях в системе in vivo сроки наблюдения продлевались до 10, 14 и 21 сут.

Спектрофотометрические исследования

Тест с нитро-синим тетразолием (НСТ-тест) проводился по методу A.A. Бутакова (1991).

Содержание метаболитов оксида азота (N0) - нитритов (NO2) определяли с использованием Griess реактива (Schulz К. et al., 1999).

Определение активности АТФ-азы и 5'-нуклеотидазы (АМФ-азы) осуществляли по методу Г.Б. Кирилличевой с соавт.(1988).

Определение активности сукцинат- и лактатдегидрогеназы (СДГ, ЛДГ) проводили по методу 3. Лойда в собственной модификации (1982), используя в качестве субстрата для СДГ - метилтиазолил тетразолия бромид («ICN»)h для ЛДГ- йоднитротетразолий («ICN»),

Определение активности миелопероксидазы (МПО) проводилось по методу 3. Лойда (1982).

Определение активности цитохромоксидазы (ЦХО) проводили по методу A.B. Novikoff и S.Goldfischer (1969) в собственной модификации с использованием в качестве субстрата диаминобензидина.

Активность катионных белков (КБ) определяли по методу A.A. Бутакова (1991).

Результаты спектрофотометрического анализа активности ферментов в фагоцитах выражали в виде показателя - индекса стимуляции (Т), который вычисляли по формуле, в процентах: NO-Nk

Т =-X 100,

Nk

Nk - средний показатель оптической плотности исследуемого субстрата в нестимулированных фагоцитах;

No - средний показатель оптической плотности исследуемого субстрата в стимулированных фагоцитах.

Гистологические исследования

Кусочки внутренних органов фиксировали в 10% формалине, забуференному по методу Р. Лилли (1969). Проводка и заливка материала в парафин-воск и приготовление срезов выполнялись по схеме Меркулова с применением ксилола (Саркисов Д.С., 1996). Приготовление,

депарафинирование и окрашивание парафиновых срезов гематоксилином-эозином проводилось согласно общепринятым методам (Саркисов, 1996).

Иммуногистохимические исследования

Для иммуноморфологической идентификации апоптоза применяли TUNEL-метод согласно протоколам методических рекомендаций Эллипиди В.Н. с соавт. (2002).

Непрямой метод флюоресцирующих антител (нМФА) проводили по стандартной методике (Кармышева В.Я., 1979). Препараты исследовали в люминесцентном микроскопе с возбуждающими фильтрами ФС, СС, ЭС и запирающим фильтром типа ЖС=18 + ЖС=19 под иммерсионным водным объективом.

Методы микроскопии

Метод лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Для лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (JICKM) использовали установку LSM510META (Carl Zeiss, Германия) на основе инвертированного микроскопа Axiovert 200М и блока лазеров (Аг+ - лазер с генерацией на длинах волн 458, 477, 488 и 514 им, HeNe - лазер с генерацией на длине волны 543,5 им и HeNe - лазер с генерацией на длине волны 633 нм). Для измерений использовали ЮОхмасляно-иммерсиоппый объектив С - Plan-Apochromat (числовая апертура 1,4), обеспечивающий разрешение около 0,3 мкм в плоскости объектива и около 0,6 мкм вдоль оптической оси объектива при сканирующем возбуждении. Размер конфокальных изображений, как правило, составлял 1024x1024 вокселей, а время измерения одного изображения - около 25 с. Для регистрации в клетках меченного антигена У. pseudotuberculosis использовали возбуждение 543 нм (-20 мкВт на образце, 100 %). Световое излучение клеток проходило через одно из дпхроичных зеркал: NT 80/20, HFT 545; после чего, с помощью дихроичного зеркала NFT 545 и узкополосного фильтра BP 560-615, выделяли спектральный диапазон 560-615 нм, соответствующий эмиссии Alexa Fluor 546.

Метод трансмиссионной электронной микроскопии. Культуру клеток после инкубации в течение различных временных промежутков фиксировали комплексным фиксатором, предложенным Ито с соавт. (Уикли Б., 1975). Фиксатор готовился на основе 0,2 M какодилатного буфера рН=7,4, включал 3 % параформальдегида и 0,02 % пикриновой кислоты. Через 18 ч проводили дофиксацию в 1% растворе 0s04 (Serva) — 1,5 ч, затем дегидратацию в этаноле с возрастающей концентрацией и заключали в White Resin (Sigma). Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме LKB -V (Швеция). Образцы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по стандартной методике (Уикли Б., 1975) и просматривали в просвечивающем электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Япония) при увеличении от 4 000 до 15 000 и ускоряющем напряжении 80 кВ.

Метод люминесцентной микроскопии. Для определения формы гибели фагоцитов перитонеального экссудата применяли методы витального окрашивания культуры клеток (макрофагов и нейтрофилов). Для выявления

некротически поврежденных клеток использовали краситель акридиновый оранжевый (Serva, США). Для выявления апоптотически измененных клеток применяли метод окрашивания красителем Hoechst 33342 (Sigma). Препараты исследовали под люминесцентным микроскопом, с помощью фазового контраста подсчитывали 100 клеток и из них, по наличию специфического свечения, определяли процент нкротически измененных (ИН) или апоптотически измененных (ИА) клеток.

Методы статистической обработки данных

Статистический анализ результатов проводили с использованием пакетов программ Instat 3, SPSS 11.0 и Excell—4.1. Данные количественного анализа представляли в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего значения, полученных от каждого объекта. Для оценки значимости цифровых данных применяли t-критерий Стьюдента. Значение доверительного интервала р<0,05 считалось статистически достоверным.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Морфофункциональные изменения клеток врожденного иммунитета при заражении разными плазмиднымн вариантами Yersinia pseudotuberculosis в системе in vitro

В настоящей работе впервые проведено сравнительное комплексное исследование морфофункциональной активности фагоцитов, инфицированных Y, pseudotuberculosis, с учетом значимости плазмидной характеристики возбудителя в реализации антиинфекционной защиты организма. В экспериментах были использованы вирулентный вариант Y. pseudotuberculosis, содержащий две плазмиды pYV 45 MDa: pVM 82 MDa, и слабовирулентный вариант, содержащий единственную плазмиду pVM 82 MDa.

б)

Рисунок I - Фагоцитарная активность резидентных макрофагов и нейтрофилов при контакте с вирулентным и слабовирулентным штаммами )'. а)

фагоцитарное число; б) фагоцитарный показатель.

При исследовании морфофункциональных изменений клеток врожденного иммунитета, зараженных разными плазмидными вариантами Y.pseudotuberculosis в системе in vitro, при одинаковой физиологичной бактериальной нагрузке 10 микробных клеток (м.к.) на один фагоцит

установлено, что фагоцитарные показатели (рис. 1) у макрофагов были выше, чем у нейтрофилов (р<0,05). При этом ими активнее поглощался и обезвреживался одноплазмидный штамм рУМ 82 МОа, тогда как двухплазмидный штамм рУУ45: рУМ82 МБа оказывал цитотоксическое действие на макрофаги. На фоне низкой фагоцитарной активности у нейтрофилов определялась ферментативная стимуляция, более выраженная в отношении вирулентного двухплазмидного штамма У. рзеис/ошЬегсШо.Ч!.?.

При светооптическом и электронно-микроскопическом изучении взаимодействия макрофагов и нейтрофилов с У. р$еийо1иЬегси\(тн (рис. 2) было отмечено, что в отношении вирулентного рУУ45: рУМ82 МЭа варианта отмечался незавершенный фагоцитоз, что подтверждалось большим количеством делящихся бактерий во внеклеточном пространстве на

протяжении всего срока наблюдения. Отмечалась экскреция нейтрофилами

&

Ж

м

#1

шг Л' б

- |

1

И ¡НЯ ■ „

Рисунок 2 — Культура фагоцитов через 24 ч контакта с )'. pseudotuberculosis', а) макрофаг в процессе некроза, отек цитоплазмы и дезорганизации клеточных органелл, разрушение клеточной мембраны; б) бактерии, расположенные внеклеточно, в фаголизосомах и лизированные в цитоплазме; в) признаки апоптоза в виде фрагментации ядра и пузыреобразования на поверхности клетки: г) разделение клетки на несколько апоптозных тел. Трансмиссионная электронная микроскопия.

биологически активного компонента во внеклеточное пространство. С увеличением срока наблюдения часть бактерий претерпевала ультраструктурные изменения клеточной стенки, свидетельствующие об их L-трансформации по сферопластному типу.

Одним из методов исследования уровня генерации активных метаболитов кислорода является реакция восстановления нитросинего тетразолия — НСТ-тест (рис.3). Установлено, что НСТ - показатели были выше при контакте клеток со слабовирулентным pVM 82 MDa плазмидным вариантом У. pseudotuberculosis (р<0,05). Причем, по сравнению с макрофагами, у нейтрофилов эти показатели повышались в более ранние

0,5 0,?5 т, \,ь г 3 6

■Ъ I о

Врамя инкубации, ч анф w мф Время инкубации, ч

а) «нф мм® б)

Рисунок 3 - Суммарная активность ферментов дыхательной цепи (НСТ-тест) фагоцитов, зараженных: а) У. pseudotuberculosis pVM 82 MDa; б) У. pseudotuberculosis pYV48: pVM 82 MDa

сроки после заражения.

При контакте фагоцитов с вышеуказанными плазмидными вариантами Y. pseudotuberculosis также отмечалось повышение активности эктофермента плазмалеммы АМФ, что свидетельствовало о стимуляции клеток в ответ на заражение патогеном. Причем, в нейтрофилах активация фермента наблюдалась в первые (0,5-6) часы после заражения (р<0,05), тогда как в макрофагах в эти же сроки активность АМФ достоверно не отличалась от контроля (р>0,05).

Наряду с этим, отмечалось аналогичное повышение активности фермента кислородзависимой системы - сукцинатдегидрогеназы в клетках, зараженных Y. pseudotuberculosis. Известно, что этот фермент является компонентом дыхательной цепи митохондрий. Так, в нейтрофилах в начальные сроки (0,5-2 ч) наблюдения обнаруживалась более высокая активность СДГ (р<0,05) при заражении вирулентным плазмидным вариантом бактерий pYV48:pVM82 MDa. Напротив, в макрофагах, зараженных Y. pseudotuberculosis, наблюдалось снижение активности как сукцинатдегидрогеназы (р<0,05), так и другого митохондриального фермента - цитохромоксидазы, независимо от плазмидной характеристики бактерий (р<0,05).

Миелопероксидаза, присутствующая в азурофильных гранулах нейтрофилов, принимает участие в преобразовании супероксидного аниона кислорода в гипохлорную кислоту, осуществляя, таким образом, защиту клетки от избыточного количества реактивных посредников кислорода. Показатели активности этого фермента были высокими на протяжении всего периода наблюдения при контакте нейтрофилов со слабовирулентным pVM82 MDa вариантом и в более поздние сроки (2-4 ч) при заражении вирулентным вариантом pYV45: pVM82 MDa Y. pseudotuberculosis. Эти данные указывают на различия динамики защитной реакции нейтрофилов в зависимости от вирулентных свойств бактерий.

При стимуляции нейтрофила в секреторных гранулах происходит повышение синтеза антимикробных белков, относящихся к кислороднезависимой системе. Эти протеины способны играть роль медиатора воспаления и являются специфическим маркером нейтрофилов (Witko-Sarsat V. et al., 2000, Lehrer R.I., 1999). При заражении слабовирулентным вариантом pVM82 MDa Y. pseudotuberculosis в нейтрофилах выявлялся экзоцитоз катионных белков во внеклеточное пространство до 1,5 - 2 ч контакта. В культуре нейтрофилов, контактировавших с вирулентным вариантом pYV48: pVM82 MDa. значения индекса стимуляции находились в пределах контроля (р<0,05).

В литературе последних лет особое значение в бактерицидной функции нейтрофилов и макрофагов придается нитроксидным радикалам. В отличие от активности исследованных ферментов кислородзависимого метаболизма в фагоцитах, зараженных бактериями Y. pseudotuberculosis, динамика наработки метаболитов N0 была иной. Уровень нитритов значительно нарастал к концу срока наблюдения (6 ч в нейтрофилах и после 24 ч в макрофагах). Это указывало на экскрецию нитритов во внеклеточное пространство в начальные сроки после инфицирования и интенсивное накопление их к концу срока наблюдения.

В целом, результаты исследований на модели in vitro указывают на дифференцированную активацию метаболизма клеток врожденного иммунитета в ответ на инфицирование разными по вирулентности плазмидными вариантами Y. pseudotuberculosis. Если макрофаги в основном проявляют себя в качестве фагоцитов, то нейтрофилы осуществляют внеклеточное бактерицидное воздействие, что было подтверждено образованием внеклеточных ловушек (рис. 4).

Рисунок 4 - Изменение нейтрофилов по типу ЕТоз (extracellular traps) через б ч после заражения У. pseudotuberculosis: а - сканирующая электронная микроскопия, х2000; б -лазерная конфокальная сканирующая микроскопия. Hoechst 33342, х800.

В ряде работ сообщалось об апоптоз-индуцирующем действии бактерий рода Yersinia на макрофаги (Monack D.M. et al., 1997, 1998; Zhang Y. et al., 2003, 2005; Zauberman A. et al., 2006). В наших исследованиях определена зависимость типа гибели клеток от плазмидной характеристики Y. pseudotuberculosis. Более выраженное апоптоз-индуцирующее действие на

клетки врожденного иммунитета оказывали бактерии слабовнрулентного одноплазмидного варианта pVM 82MDa, а бактерии вирулентного двухплазмидного варианта pYV45 MDa: pVM 82 MDa в основном вызывали некроз как нейтрофилов, так и макрофагов.

Морфофункциональная характеристика эффекторных клеток воспаления при псевдотуберкулезной инфекции

Общеизвестно, что при заражении различными видами бактерий фагоцитирующие клетки в опытах in vitro проявляют функциональную активность, отличающуюся от таковой в клетках зараженного организма. Морфофункциональное состояние клеток - эффекторов воспаления - при псевдотуберкулезной инфекции нами было изучено в системе in vivo на модели внутрибрюшинного заражения животных разными плазмидными вариантами У. pseudotuberculosis, с учетом как показателей фагоцитоза, так и активности ферментов бактерицидных систем нейтрофилов и макрофагов.

Результаты, полученные с помощью непрямого МФА, показали, что в клетках очага воспаления (перитонеальный экссудат) размножение бактерий вирулентного pYV48: pVM82 MDa штамма Y. pseudotuberculosis наступает в более ранние сроки, чем слабовирулентного штамма pVM82 MDa.

Известно, что при хемотаксисе плазматическая мембрана фагоцитов пространственно преобразуется, и данный процесс находится в прямой зависимости от активности ее эктоферментов - АТФ-азы и АМФ-азы (Кирилличева Г.Б.,1988; Yoshida S. et al., 2009). В системе in vivo нами была выявлена зависимость реакции клеток очага воспаления от вирулентных свойств У. pseudotuberculosis (рис.5). В ответ на заражение слабовирулентным вариантом pVM82 MDa реакция клеток была более выраженной, на что указывали высокие значения индекса стимуляции АТФ-азы, чем при инфицировании животных вирулентным вариантом pYV48: pVM82 MDa.

'Л4

в

Нут

Длительность инфекции

• pVM Ю MDa 0 pYV48: pVM82 MDa

a)

0.5 ч 1ч 2 ч Зч Длительность инфекиии

ч 1 сут 3 суг 7 сут 10 3.4 сут сут . pVM 8 ' MDa 8 pvv 48: pVM H.

б)

Рисунок 5 - Активность эктоферментов плазмалеммы в клетках очага воспаления у животных, зараженных разными плазмидными вариантами Y. pseudotuberculosis: а) АТФ-аза, б) АМФ-аза.

Фермент АМФ-аза локализуется в основном в плазматической мембране клеток и является регулятором уровня циклического аденозинмонофосфата, который обеспечивает передачу сигналов от плазмалеммы внутрь клетки. При исследовании активности АМФ-азы у животных, зараженных )'. pseudotuberculosis с плазмидой pVM 82 MDa, наблюдался максимальный индекс стимуляции через 1 ч и 3 сут, тогда как у животных, инфицированных бактериями с плазмидами pYV48: pVM82 МДа, через 0,5 ч и 4 сут инфекции. Эти результаты указывают на зависимость реакции эффекторных клеток воспаления от вирулентных, плазмид-ассоциированных свойств микроорганизма.

В реакции преобразования активных форм кислорода принимают участие сукцинат- и лактатдегидрогеназы, которые активируются на последнем этапе гликолиза. У животных, зараженных Y. pseudotuberculosis, в ранние сроки инфекции (0,5 ч-З сут.) обнаружена невысокая активность этих ферментов. Значительное повышение индекса стимуляции для ЛДГ и СДГ выявлялось на 7 и 10 сут после заражения, что можно расценивать как увеличение энергетического потенциала лейкоцитов очага воспаления и проявление адаптивной реакции клеток в ответ на внедрение инфекта.

Цитохромоксидазы локализуются на внутренней и внешней мембране митохондрий и на мембранах эндоплазматической сети. Нами достоверное (р<0,05) повышение активности этого фермента в эффекторных клетках воспаления отмечалось после заражения животных вирулентным вариантом pYV48: pVM82 MDa К pseudotuberculosis, как в начальные сроки - через 2 и 3 ч, так и в поздние - через 7 и 14 сут инфекции. Напротив, в отношении клеток животных, зараженных слабовирулентным вариантом pVM82 MDa Y. pseudotuberculosis, была обнаружена низкая активность этого фермента.

Установлено, что в клетках перитонеального экссудата у животных, инфицированных слабовпрулентным вариантом pVM82 MDa Y.pseudotuberculosis, активность миелопероксидазы была высокой до 3 сут, после чего понижалась к концу срока наблюдения. В фагоцитах животных, зараженных вирулентным вариантом pYV48: pVM82 MDa Y.pseudotuberculosis, повышение активности этого фермента отмечалось только в ранние сроки - от 1 до 3 ч после инфицирования, а в поздние сроки инфекции активность МПО была ниже, чем в клетках интактных животных, что указывало на снижение защитной реакции лейкоцитов.

Катионные белки, обладающие бактерицидным действием, являются специфическим маркером нейтрофилов. На протяжении всего срока наблюдения после заражения животных одноплазмидным вариантом pVM82 MDa }'. pseudotuberculosis в клетках воспалительного экссудата динамика изменений активности КБ носила волнообразный характер, что, вероятно, могло отражать периодичность притока нейтрофилов в очаг воспаления. При использовании в качестве инфекционного агента двухплазмидного варианта pYV48: pVM82 MDa Y. pseudotuberculosis показатели активности катионных белков в клетках очага воспаления были ниже или в пределах уровня

контроля, что указывало на несостоятельность защитной системы клеток в ответ на заражение данным плазмидным вариантом )'. pseudotuberculosis.

Исследования недавних лет показали, что в стимулированных бактериями и провоспалительными цитокинами фагоцитах, наряду с продукцией активных метаболитов кислорода, выявляется образование оксида азота, который имеет определенное значение в патогенезе различных инфекций (Webb J.L. et. al., 2001; Fang F.С., Vazquez-Torres A., 2002), в том числе при инфицировании )'. pseudotuberculosis (Охотина C.B., 2007). Нами при исследовании нитроксидобразующей активности фагоцитов выявлено, что уровень продуцируемых клетками метаболитов оксида азота был выше в случае заражения животных двухплазмидным вариантом pYV48: pVM82 MDa (р<0.05), тогда как при заражении слабовирулентным вариантом pVM82 M Da Y. pseudotuberculosis наблюдалась более раннее выделение нитритов во внеклеточное пространство.

Клеточные повреждения в гистопатологии псевдотуберкулеза, вызванного разпымп плазмпднымп вариантами Yersinia pseudotuberculosis

Общепризнано, что ключевая роль в развитии органопатологии инфекционных заболеваний принадлежит повреждению клеток, которое зависит от степени вирулентности инфицирующих агентов. Вместе с тем, поддержание гомеостаза организма связано с программированной клеточной гибелью, обеспечивающей нормальную функцию клеток иммунной системы (Park J.M. et al., 2005). В 2000-х годах был достигнут значительный прогресс в области изучения механизмов гибели клетки, дифференциации и классификации новых видов ее гибели (Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю., 2001: Fink S.L., Cookson В.T., 2005). Показано, что наряду с некрозом существует другая, программированная форма гибели клетки, названная апоптозом, которая рассматривается как физиологический процесс «суицида» клеток, ответственный за поддержание постоянства численности клеток, удаление клеток, прошедших свой жизненный цикл, и выбраковку дефектных клеток.

На настоящий момент ряд бактериальных и вирусных патогенов идентифицированы как медиаторы апоптоза in vitro. По меньшей мере, три патогенетические стратегии включает в себя программированная клеточная гибель в системе паразит-хозяин (Moss J.E. et al., 1999; Papayannopoulos V., Zychlinsky A.. 2009): 1) апоптоз как механизм уничтожения клеток хозяина; 2) апоптоз как пусковой механизм (trigger) воспаления; 3) апоптоз как защитный механизм хозяина. Иерсинин экспресспруют два эффекторные белка - YopP (К entericolitica) и YopJ (Y.pestis и Y. pseudotuberculosis), ответственные за индукцию апоптоза макрофагов, а также запускают апоптоз эукариотических клеток в результате блокирования антиапоптозных

факторов и активации проапоптозных путей (Зигангирова Н.А., Гинцбург А.Л., 2004; Zauberman A. et al., 2006; Peters K.N. et al„ 2013).

Наши исследования показали, что патоморфологический процесс у животных, зараженных внутрибрюшинно двухплазмидным (pYV45: pVM82 MDa) вирулентным вариантом Y. pseudotuberculosis (рис. 6), протекает с более выраженными изменениями в органах-мишенях, по сравнению с таковым при заражении слабовирулентным одноплазмидным вариантом pVM82 MDa (рис.7).

В ответ на заражение как вирулентным, так и слабовирулентным штаммами в органах-мишенях развиваются клеточные повреждения как по типу некроза, так и апоптоза (рис. 8, 9)с преобладанием последнего в ответ на заражение одноплазмидным штаммом pVM82 MDa. Причем в ранние сроки после заражения вирулентным pYV48: pVM82 MDa вариантом Y'.pseudotuberculosis гибель нейтрофилов и макрофагов в очаге воспаления (перитонеальный экссудат) осуществлялась в основном по пути некроза, тогда как при инфицировании слабовирулентным вариантом pVM82 MDa -по пути апоптоза.

Рисунок б - Патогистологические изменения, вызванные вирулентным вариантом pYV48: pVM82 MDa Y.pseudotuberculosis через 10 сут. после заражения: а) распад клеток в корковом слое, оголение ретикулярной стромы брыжеечного лимфатического узла, х200; б) печень, картина гепатита с наличием околососудистых периваскулярных инфильтратов и диффузной реакции купферовских клеток, х200. Окраска гематоксилином - эозином;

В связи с установленным нами сочетанным участием некроза и апоптоза в развитии клеточных повреждений при псевдотуберкулезной инфекции в системе in vitro и in vivo, заслуживает внимание сообщение о том, что макрофагальная активация перенацеливает гибель Yersinia-инфицированных клеток хозяина от невоспалительного апоптоза к каспаза-1 -зависимому воспалительному пироптозу, тождественному некрозу (Bergsbaken Т., Cookson В.Т, 2009). Относительно иерсиниозных инфекций высказан постулат (Philip N.H., Brodsky I.E., 2012), что от пути гибели эукариотической клетки зависит локальное микроокружение в ткани и последующий системный ответ. Предполагают, что при помощи апоптоза, вызванного Yersinia, в течение инфекционного процесса могут

ш

. . /

i?»

г »

Рисунок 7 - Патогистологические изменения, вызванные слабовирулентным вариантом pVM82 MDa Y. pseudotuberculosis, через 3 сут. после заражения: а) полнокровие сосудов и лейкоцитоз в подкожной клетчатке места заражения, х400; б) гранулемы с распадом части клеток в печени, х200. Окраска гематоксилином - эозином.

Рисунок 8 - Макрофаг брызжеечного лимфоузла с фагосомами, содержащими бактерии (стрелка) и апоптозные тельца (двойная стрелка). Электронограмма, х 10000.

элиминироваться макрофаги из очага воспаления, однако в пределах гранулем могут создаваться благоприятные условия для размножения бактерий в лимфоидной ткани (Cornelis G.R., 2006; Zheng Y. et al., 2012). Вероятно, что при псевдотуберкулезной инфекции вариабельность тканевых повреждений в органах-мишенях зависит от выраженности некротических или апоптотических изменений клеток врожденного иммунитета при инфицировании соответственно вирулентным pYV48: pVM82 MDa вариантом или слабовирулентным pVM82 MDa вариантом Y.pseudotuberculosis.

Представленные результаты диссертационной работы, в целом, характеризуют функциональное партнерство между нейтрофилами и макрофагами в процессе инфицирования разными по плазмид-ассоциированной вирулентности вариантами Y. pseudotuberculosis. Выявленные качественные и количественные морфофункциональные различия реактивности этих двух профессиональных фагоцитов в ответ на воздействие указанных патогенов лежат в основе одновременной реализации

Рисунок 9 - Патогистологические изменения, вызванные вирулентным вариантом рYV48: pVM82 МДа У'.pseudotuberculosis: а) апоптоз гематогенных клеток в периваскулярном пространстве в печени через 14 сут. после заражения, х400; б) апоптоз клеток в печени через 10 сут. после заражения, х200, TUNEL метод; в - специфическое свечение Hoechst-положительных фагоцитов в отпечатке печени, х400, люминесцентная микроскопия.

разных механизмов антиинфекционной защиты при псевдотуберкулезной инфекции.

Полученные новые данные о механизмах действия Y. pseudotuberculosis на клетки врожденного имуунитета позволяют в будущем продолжить эти исследования, направив усилия на выявление продуктов экспрессии генов плазмиды pVM82 MDa и их роли в клеточных аспектах патогенеза.

ВЫВОДЫ

1. При экспериментальной инфекции, вызванной плазмидными вариантами pYV48: pVM82 MDa и pVM82 MDa Y. pseudotuberculosis, установлены качественные и количественные различия реагирования клеток врожденного иммунитета (нейтрофилов и макрофагов), включая кислородзависимые, кислороднезависимые и нитроксидзависимые механизмы бактерицидности.

2. На модели in vitro установлено, что при одинаковом соотношении клеток к бактериям (1:10) фагоцитарная активность нейтрофилов была ниже, чем макрофагов. При этом активнее поглощался и обезвреживался слабовирулентный вариант pVM82 MDa Y.pseudotuberculosis, тогда как вирулентный вариант pYV48: pVM82 MDa оказывал цитотоксическое действие на клетки.

3. На модели in vitro установлена дифференцированная реакция клеток врожденного иммунитета в ответ на инфицирование вирулентным вариантом pYV48: pVM82 MDa Y. pseudotuberculosis. Показано, что макрофаги в основном проявляют себя в качестве фагоцитов, а нейтрофилы осуществляют внеклеточное бактерицидное воздействие, которое было подтверждено образованием внеклеточных ловушек.

4. Определена зависимость морфофункциональной активности нейтрофилов от вирулентных свойств Y. pseudotuberculosis. В ранние сроки после заражения бактериями вирулентного варианта pYV48:

pVM82 MDa обнаруживалась более высокая активность ферментов кислородзависимой системы, по сравнению с нейтрофилами, зараженными слабовирулентным вариантом pVM82 MDa. Активность фермента миелопероксидазы, принимающего участие в защитной реакции нейтрофилов, была выше в отношении слабовирулентного pVM82 MDa варианта Y. pseudotuberculosis.

5. На моделях in vivo и in vitro установлена вариабельность повреждений клеток врожденного иммунитета при инфицировании разными плазмидными вариантами Y. pseudotuberculosis. Выявлено более выраженное апоптоз-индуцирующее действие бактерий слабовирулентного pVM 82MDa варианта Y. pseudotuberculosis на нейтрофилы и макрофаги по сравнению с бактериями вирулентного варианта pYV48: pVM82 MDa, которые преимущественно вызывали некроз фагоцитов.

6. Выявлено, что способность различающихся по плазмид-ассоциированной • вирулентности вариантов Y. pseudotuberculosis индуцировать гибель (как по типу апоптоза, так и некроза) нейтрофилов и макрофагов сопровождается определенной ферментативной активностью фагоцитов. Индуцированный Y.pseudotuberculosis некроз клеток сочетался с повышением уровня продуцируемых ими метаболитов оксида азота, а апоптоз - с повышением активности ферментов кислородзависимого метаболизма клеток (сукцинатдегидрогеназы и миелопероксидазы).

СПИСОК ОСНОВНЫХ НАУЧНЫХ РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ:

1. Плехова Н.Г, Исачкова Л.М., Шубин Ф.Н, Дробот Е.И. Функциональная активность макрофагов в отношении различных плазмидных вариантов Yersinia pseudotuberculosis II Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1999. Том 128, № 10. С.429-432.

2. Гончарук Ю.В., Плехова Н.Г., Сомова Л.М., Бузолева Л.С., Зайцева Е.А., Дробот Е.И. Функциональная активность резидентных макрофагов, зараженных грамположительными бактериями // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. № 1. С. 6472.

3. Сомова Л.М., Плехова Н.Г., Гончарук Ю.Н., Дробот Е.И., Охотина С.В., Бузолева Л.С., Зайцева Е.А., Сомов Г.П. Кислородзависимая и нитроксидзависимая бактерицидные системы макрофагов при стафилококковой и листериозной инфекциях // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. № 3. С.39-43.

4. Сомова JI.M., Беседнова H.H., Пушкарева Т.В., Дробот Е.И., Эпштейн Л.М. Применение тинростима при экспериментальной псевдотуберкулезной инфекции // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, приложение. 2006. №3. С. 51-53.

5. Плехова Н.Г., Сомова Л.М., Охотина C.B., Дробот Е.И., Гончарук Ю.Н. Метаболическая активность нейтрофилов при' псевдотуберкулезной инфекции // Журнал микробиологии, ' эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. № 3. С.43-47.

6. Плехова Н.Г., Охотина C.B., Дробот Е.И., Сомова Л.М. Нитроксидобразующая активность нейтрофилов при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях // Тихоокеанский мед. журн. 2007. № 4. С. 47-50.

7. Сомова Л.М., Плехова Н.Г., Гончарук Ю.Н., Дробот Е.И. Сравнительная характеристика кислородзависимой и нитроксидобразующей ферментных систем макрофагов при стафилококковой и листериозной инфекциях // Биомедицинская химия. 2010. Т. 56, №3. С. 372-380.

8. Сомова Л.М., Плехова Н.Г., Дробот Е.И., Тимченко Н.Ф., Недашковская Е.П. Патоморфологические изменения при экспериментальной токсинемии, вызванной термолабильным токсином Y .pseudotuberculosis. II Тихоокеанский мед. журн. 2010. № 3. С. 67-72.

9. Кузнецова Т.А., Сомова Л.М., Плехова Н.Г., Дробот Е.И. Патогенетическое значение эндотоксина Yersinia pseudotuberculosis в нарушениях системы гемостаза и микроциркуляции // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010. Т. 150, № 11. С. 550554.

10. Плехова Н.Г., Сомова Л.М., Пуздаев В.И., Дробот Е.И. Метаболическая активность нейтрофилов и моноцитов как модель для исследования биосовместимости организма с инородными материалами // Биомедицинская химия. 2011. Т. 57, № 1. С.85-94.

11. Сомова Л.М., Плехова Н.Г., Дробот Е.И. Реактивность фагоцитирующих клеток при инициации инфекционно-воспалительных процессов // Успехи современной биологии. 2011. Т. 131, № 1. С. 37-49.

12. Сомова Л.М., Плехова Н.Г., Дробот Е.И. Новые аспекты патологии псевдотуберкулеза // Архив патологии. 2012. Т. 74, № 3. С. 60-64.

13. Плехова Н.Г., Дробот Е.И., Тимченко Н.Ф., Сомова Л.М., Персиянова E.H. Влияние термолабильного токсина Yersinia pseudotuberculosis на функции клеток врожденного иммунитета // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2014. Т. 157, № 4. С. 483487.

14. Plekhova N. G., Somova L. M., Drobot E. I. Metabolism of Innate Immune Cells in Bacterial Infections // Biomedical Chemistry. 2014. V. 8, № 2. P. 155-163.

Работы, опублпкованпые в научных журналах, сборниках трудов п материалах конференции:

15. Дробот Е.И. Активность ферментных систем макрофагов при их взаимодействии с грамположительными бактериями / Е.И. Дробот, Ю.Н. Марущак, Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова // Сб. трудов VIII Дальневосточной школы-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (сентябрь 2004). Россия, МЭС ТИБОХ. Владивосток. С 17.

16. Сомова Л.М. Повреждение фагоцитирующих клеток при псевдотуберкулезной инфекции // Л.М. Сомова, Е.И. Дробот, Н.Г. Плехова // Мат. VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (11-12 ноября 2010).Россия. Москва. С. 68-71.

17. Сомова Л.М. Морфофункциональная характеристика псевдотуберкулезной инфекции, вызванной разными плазмидными вариантами возбудителя / Л.М. Сомова, Н.Г. Плехова, Е.И. Дробот, Ф.Н. Шубин // Первая Всеросс. конф. «Гетерогенность популяций бактерий и ее отражение в эпидемиологии и клинике инфекционных болезней» (октябрь 2011). Россия. Владивосток. С. 91-93.

18. Drobot ЕЛ. The effect of Yersinia pseudotuberculosis heat-labile toxin on the function on innate immunity cells / E.I. Drobot, N.G. Plekhova, N.F. Timchenko, L.M. Somova // Gold Spring Harbor Conferences Asia «Yersinia 11: The 11 International Symposium on Yersinia» (June 2013). Chine, Suzhou. C. 37.

19. Plekhova N.G. The functional feature of innate immunity cells infected by Yersinia pseudotuberculosis / N.G. Plekhova, L.M. Somova, E.I. Drobot, F.N. Shubin // Gold Spring Harbor Conferences Asia « Yersinia 11: The 11 International Symposium on Yersinia» (June 2013). Chine, Suzhou. C.38.

20. Дробот Е.И. Ультраструктурные изменения клеток врожденного иммунитета под воздействием Yersinia pseudotuberculosis / Е.И. Дробот, Л.М. Сомова, Н.Г. Плехова, И.Н. Ляпун, Е.В. Пустовалов // XXV Российская конференция по электронной микроскопии (2-6 июня 2014). Россия. Черноголовка. Т. 2. С. 570-571.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФа за - аденозинтрифосфатаза АМФаза - аденозннмопофосфатаза ИД - индекс апоптоза ИБ — индекс бактерицидное™ ИИ - индекс некроза КБ - катионные белки ЛДГ - лактатдегидрогеназа МПО - миелонероксидаза

нМФА - непрямой метод флуоресцирующих антител ИСТ - иитросинии тстразолий СДГ — сукципатде! идрогеиаза ЦХО — цитохромоксидаза ФИ — фагоцитарный показатель ФЧ - фагоцитарное число М1)а — мегадальтон

ДРОБОТ

Елена Игоревна

РЕАКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ РАЗНЫМИ ПЛАЗМИДНЫМИ ВАРИАНТАМИ

YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уч. изд. л. 1,0 Формат 60 х 84/16

Тираж 100 экз. Заказ №547

Подписано в печать 10.12.2014

Отпечатано в типографии ИП Юрченко Лариса Викторовна 690078, г. Владивосток, ул. Комсомольская, д. 3, офис 305 тел. 8 902 48 900 30