Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментальное обоснование клинического применения фторхинолонов при лечении псевдотуберкулезной инфекции

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальное обоснование клинического применения фторхинолонов при лечении псевдотуберкулезной инфекции"

/

На правах рукописи

ЗАЙЦЕВА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ ФТОРХИНОЛОНОВ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ

( 03. 00. 07 - микробиология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Владивосток - 1998

Диссертация выполнена в Научно-исследовательском институт! эпидемиологии и микробиологии СО РАМН г. Владивостока.

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, лауреат Государственной премии

доктор медицинских наук, лауреат Государственной премии

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

кандидат медицинских наук, ;/доцент

Н. Н. Беседнова Ф.Н.Шубин

Н. Ф. Тимченко Е. А. Шимчик

Ведущая организация, дающая внешний отзыв о научно-практическо! ценности работы: Государственный научный центр по антибиотикам МЗ России ской Федерации.

Защита диссертации состоится " 1998 г. на заседаниг

диссертационного Совета К 084. 24. 01 при Владивостокском Государственно\ медицинском университете по адресу: 690600 ГСП, г. Владивосток, пр. Острякова 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского Государственного медицинского университета.

Автореферат разослан 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат медицинских наук , ^ Н- Диго-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема лечения псевдотуберкулезной инфекции продолжает привлекать большое внимание исследователей и клиницистов в связи с тем, что в настоящее время отмечается снижение эффективности ранее применявшихся при данном заболевании антибиотиков (аминогликозидов, тетрациклинов, хлорамфеникола), связанное с их низкой способностью проникать внутрь клеток и оказывать действие на внутриклеточно расположенные иерсинии псевдотуберкулеза. Поэтому на данном этапе остается актуальным поиск новых лекарственных средств эффективных при лечении инфекций с внутриклеточной локализацией возбудителя.

На сегодняшний день одно из ведущих мест среди новых антимикробных средств в лечении различных заболеваний завоевывают синтетические антибактериальные препараты - фторхинолоны (ципрофлоксацин, пефлоксацин, офлоксацин и др.), прототипом которых послужила налидиксовая кислота. Эта группа химиопрепаратов характеризуется высокой антимикробной активностью в отношении многих грамотрицательных, ряда грамположительных микроорганизмов (стафилококков, стрептококков), оптимальной фармакокинетикой и хорошей переносимостью (Е. Н. Падейская, В. П. Яковлев, 1995; В. Буш и соавт., 1993). Фторхинолоны хорошо проникают в различные ткани и клетки макроорганизма, кроме того отмечается высокая степень накопления их в фагоцитирующих клетках (макрофагах и лейкоцитах), что обосновывает их применение в лечении инфекций с внутриклеточной локализацией возбудителя. Большинство фторхинолонов можно вводить не только парентерально, но и внутрь, что позволяет завершить курс лечения одним и тем же антибактериальным препаратом (сначала внутривенно, а затем внутрь). За очень небольшой срок фторированные хинолоны привлекли большое внимание исследователей, а в клинической практике оказались в числе' важнейших препаратов для лечения бактериальных инфекций различной этиологии

и локализации, особенно в случаях, вызванных полирезистентными штаммами. В настоящее -к время фторхинолоны выпускаются многочисленными фармацевтическими фирмами в различных , странах, отечественных официнальных препаратов группы фторхинолонов пока нет. В то же время единичные сообщения о применен™ препаратов этой группы в лечении больных псевдотуберкулезом диктует необходимость углубленного изучения антибактериальной активности отечественных фторхинолонов (ципрофлоксацина, пефлоксацина и норфлоксацина) в отношении штаммов Yersinia pseudotuberculosis.

Целй' работы - оценить чувствительность штаммов Y. pseudotuberculosis к отечественным фторхинолонам (ципрофлоксацину, пефлоксацину, норфлоксацину), исследовать некоторые механизмы действия данных препаратов в отношении микроба' (элиминация плазмиды вирулентности, влияние на адгезию) и экспериментально обосновать применение их в лечении псевдотуберкулеза.

Основные задачи исследования:

¡.Изучить чувствительность штаммов Y. pseudotuberculosis различного происхождения, различного плазмидного профиля и относящихся к разным популяциям к изучаемым химиопрепаратам.

2.Изучить чувствительность антибиотикорезистентных штаммов Y. pseudotuberculosis с различным спектром плазмид к отечественным фторхинолонам (ципрофлоксацину, лефлоксацицу и норфлоксацину).

3.Исследовать элиминирующий эффект фторхинолонов на плазмиду вирулентности у штаммов псевдотуберкулезного микроба.

4.Изучить действие фторхинолонов на адгезию Y. pseudotuberculosis к клеткам организма.

5.Исследовать терапевтический эффект пефлоксацина при экспериментальной псевдотуберкулсзной, инфекции. ,

Научная новизна .и .теоретическая значимость работы.

•Впервые проведено сравнительное экспериментальное изучение действия новых отечественных фторхинолонов на штаммы Y. pseudotuberculosis различного

происхождения, различного плазмидного спектра, относящихся к разным популяциям микроба.

•Установлено, что чувствительность псевдотуберкулезного микроба к изучаемым фторхинолонам значительно выше, чем к антибиотикам, широко применяющимся в настоящее время для лечения псевдотуберкулеза.

•Обнаружено, что штаммы Y. pseudotuberculosis, характеризующиеся множественной антибиотикорезистентностыо, также являются

высокочувствительными к данным препаратам, что указывает на отсутствие детерминант резистентности к изучаемым химиопрепаратам в структуре выявленных R-плазмид.

•Впервые установлено, что элиминирующее влияние трех отечественных фторхинолонов (ципрофлоксацина, пефлоксацина и норфлоксацина) на плазмиду вирулентности у штаммов псевдотуберкулезного микроба неоднозначно и, возможно, зависит от особенностей самого штамма и плазмидной ДНК, и может быть одним из механизмов обезвреживающего действия изучаемых химиопрепаратов.

•Впервые установлено, что отечественные препараты группы фторхинолонов влияют на адгезивные свойства псевдогуберкулезного микроба по разному (от снижения до увеличения).

•Впервые на модели экспериментальной псевдотуберкулезной инфекции показана химиотерапевтическая эффективность пефлоксацина.

Практическая значимость.

Полученные данные обосновывают возможность применения новых отечественных препаратов группы фторхинолонов (ципрофлоксацина, пефлоксацина и норфлоксацина) в лечении больных псевдотуберкулезной инфекцией.

Результаты исследований вошли в состав материалов, представленных в Фармакологический комитет МЗ и медицинской промышленности для получения разрешения на клиническое изучение и применение пефлоксацина. В настоящее время

получено разрешение на клиническое применение пефлоксацина при инфекционных болезнях, в том числе при особо опасных инфекциях.

Апробация материалов диссертации. . .

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (Владивосток, 1998).

Материалы диссертации представлены на III Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, :1996), на выездной сессии общего,, собрания Сибирского1 отделения Российской Академии медицинских наук, (Владивосток, 1996).

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объем и структура работы.

Диссертация состоит' из введения, главы обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов и - библиографии. Указатель литературы содержит 195 источника, в том числе 95 на русском языке. Материалы работы иллюстрированы 22 таблицами и 6 рисунками.

Основные положения, выносимые на защиту.

,;1. Ципрофлоксацин, пефлоксацин, норфлоксацин - отечественные препараты группы фторхинолонов - обладают значительным антимикробным действием не только в отношении чувствительных, но и антибиотикорезистентных штаммов Y. pseudotuberculosis. " .

2. Ципрофлоксацин, пефлоксацин и норфлоксацин - вызывают элиминацию плазмиды вирулентности, а также влияют на адгезивные свойства (снижают или повышают) ряда штаммов иерсиний псевдотуберкулеза.

В. Пефлоксацин оказывает хороший терапевтический эффект, при экспериментальном псевдотуберкулезе. ..... . ,

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

В работе использованы бактериальные штаммы Y. pseudotuberculosis серологических вариантов 1,3 и 4, выделенные от больных людей, животных и из объектов внешней среды (почва, овощи) в различных регионах Российской Федерации - Магаданской и Кемеровской областях, Красноярском и Приморском краях и г. Москве. Все штаммы получены из музея НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН.

Основным объектом экспериментального изучения были препараты группы фторхинолонов: ципрофлоксацин, пефлоксацин, норфлоксацин. Все препараты получены в Уральском политехническом университете.

Экспериментальные исследования выполнены на 540 неинбредных белых мышах, массой 14-20 г. При работе с животными были использованы внутрибрюшинный и подкожный методы введения инфицирующего материала и изучаемых веществ.

Объем исследований, выполненных в работе, приведен в таблице 1.

Изучение чувствительности штаммов Y. pseudotuberculosis к фторхинолонам и определение минимальных подавляющих концентраций (МПК) препаратов проводили методом серийных разведений в пробирках с LB-бульоном в соответствии с методическими указаниями "Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам" (Е. А. Ведьмина, И. В. Власова, Н. И. Гивенталь, 1979). '

Определение антибиотикорезистентности у изучаемых штаммов осуществляли с помощью дисков методом диффузии в агаре в соответствии с вышеназванными методическими рекомендациями. В качестве питательной среды использовали питательный агар производства Махачкалинского НИИ питательных сред.

Присутствие в бактериальных клетках Y. pseudotuberculosis плазмиды вирулентности оценивали по выявлению различных по морфологии колоний (Т+ и Т") путем высева исследуемых штаммов бактерий из LB-бульона с концентрациями фторхинолонов 0,004-8,0 мкг/мл на питательный агар из расчёта 1000-5000 микробных клеток на чашку (Ф. Н. Шубин и соавт., 1986).

Таблица 1.

Объем исследований, выполненных в работе.

N п/п Направление исследований Методы исследований Объем работы

1. Определение чувствительности Y. pseudotuberculosis к фтор-хинолонам и МПК препаратов. , Метод серийных разведений в ЬВ-бульоне [18]. 88 штаммов 264 реакции

2. Определение антибиотикоре-зистентности Y. pseudotuberculosis. Метод дисков [18]. 75 реакций

3. Исследование элиминации плазмиды вирулентности у штаммов Y. pseudotuberculosis. Метод Ф. Н. Шубина [84]. 192 пробы

4. Исследование терапевтического эффекта пефлоксацина при экспериментальном псевдотуберкулезе. 1 .Определение ЬЭзо и 2 .Бактериологическое исследование органов. 3.Изучение выживаемости мышей. 540 животных

5. Изучение действия ципрофлоксацина, пефлоксацина и норфлоксацина на адгезивный процесс Y. pseudotuberculosis Методика В. И. Брилис с соавт. [12]. 238 проб

6. Статистическая обработка материалов. Методы вариационной статистики с учетом критерия Стьюдента [4]. Все результаты

Последовательные пассажи псевдотуберкулезного микроба определяли на неинбредных мышах весом 14-20 г при внутрибрюшинном заражении суточной культурой штамма в инфицирующей дозе 104 микробных клеток. !

Вирулентность штамма псевдотуберкулезного микроба определяли на неинбредных белых мышах (самцах) с массой тела 14-20 г при заражении десятикратно возрастающими дозами (от 10 до 109 микробных клеток). LD50 рассчитывали по Керберу (И. П. Ашмарин, А. А. Воробьев, 1962).

Исследование терапевтического эффекта пефлоксацина проводили на модели экспериментальной псевдотуберкулезной инфекции, вызванной введением вирулентного штамма Y: pseudotuberculosis (Н-3900, серовар lb, спектр плазмид 82:48:2,7 МД) в инфицирующей дозе 1LD50 и леченных различными концентрациями препарата. Эффект химиопрепарата оценивали по бактериологическому исследованию органов (печень, селезенка) с подсчетом числа выросших колоний псевдотуберкулеза в 1 г печени и селезенки. Животных вскрывали через 24 часа, 3, 7,10,14,21 суток после заражения.

Изучение выживаемости мышей, зараженных разными инфицирующими дозами Y. pseudotuberculosis (lLDioo и 10LDi00) и леченных различными концентрациями пефлоксацина, осуществляли на неинбредных мышах. Эффект препарата оценивали по проценту выживших животных в опытных и контрольной группах. ЕД50 определяли по методу Кербера (И.П. Ашмарин, А. А. Воробьев, 1962).

Исследование влияния фторхинолонов на адгезивный процесс псевдотуберкулезного микроба проводили по методике, предложенной В. И. Брилис и соавт. (1986).

Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики (И. П. Ашмарин, А. А. Воробьев, 1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Чувствительность к фторхинолонам штаммов Y. pseudotuberculosis различного плазмидного спектра.

В экспериментах in vitro установлено, что все изученные штаммы Y. pseudotuberculosis чувствительны к изучаемым препаратам. Для каждого штамма

псевдотуберкулезрого микроба определена минимальная подавляющая концентрация (мкг/мл) химиопрепарата. Наиболее выраженный антибактериальный эффект в отношении Y. pseudotuberculosis из фторхинолонов оказывает ципрофлоксацин, диапазоны колебания МПК которого составили 0,0156-0,125 мкг/мл. Практически одинаковая активность отмечена у пефлоксацина и норфлоксацина, диапазоны колебания МПК которых составляют 0,0625-2,0 мкг/мл и 0,0312-2,0 мкг/мл соответственно. Полученные результаты подтверждают данные Е. Н. Падейской (1995) о том, что ципрофлоксацин относится к числу наиболее активных фторхинолонов по действию на большинство грамотрицательных бактерий.

. Вместе с тем, необходимо отметить. что, по чувствительности к ципрофлоксацину около 8% штаммов псевдотуберкулезного микроба выделены в группу наиболее высокочувствительных (МПК не превышает 0,02 мкг/мл), у большинства же изученных культур (92%) минимальная подавляющая концентрация ципрофлоксацина составляет 0,03-0,125 мкг/мл.

Изучение чувствительности Y. pseudotuberculosis, изолированных в , различных регионах Российской Федерации к трем отечественным фторхинолонам, также показало высокую антимикробную активность ципрофлоксацина в отношении всех изучаемых культур микроба (табл. 2). Активность пефлоксацина и норфлоксацина в отношении псевдотуберкулезного микроба несколько, ниже, по сравнению с ципрофлоксацином, во всех изучаемых регионах страны.

Принимая во взимание тот факт, что антибактериальная , активность препаратов в отношении микробов, выделенных из различных источников (внешняя среда, животные, больные люди) может быть неодинаковой, мы в сравнительном аспекте проанализировали активность фторхинолонов в отношении бактерий псевдотуберкулеза в зависимости от источника, места и времени выделения микроорганизмов. Установлено, что чувствительность штаммов Y. pseudotuberculosis к ципрофлоксацину, пефлоксацину и норфлоксацину сохраняется в течение ...длительного периода времени (1975-1993 г.г.) и не зависит от места выделения

микроба. Более выраженная антимикробная активность в отношении штаммов иерсиний псевдотуберкулеза, изолированных от животных и больных людей, вновь отмечена у ципрофлоксацина.

Таблица 2.

Определение чувствительности к фторхинолонам штаммов псевдотуберкулезного микроба в зависимости от региональной приуроченности.

Популяция, Кол-во Диапазоны колебания МПК ( мкг/мл)

спектр плазмид штаммов химиопрепарата

ЦФЛ ПФЛ НФЛ

Дальневосточная

82:48 МД 10 0,0312-0,0625 0,125-1,0 0,0625-1,0

Западно-сибирская

82:48:2,7 МД

48:4,4 МД 11 0,0625-0,125 0,25-0,5 0,25-0,5

10 0,0156-0,125 0,25-0,5 0,0625-2,0

Московская

82:48:3,5 МД 8 0,0156-0,0625 0,125-0,25 0,0312-1,0

82:48:3,5:2,7МД 11 0,0156-0,125 0,0625-0,125 0,0625-2,0

Примечание: ЦФЛ - ципрофлоксацин, ПФЛ - пефлоксацин, НФЛ - норфлоксацин,

МПК - минимальная подавляющая концентрация.

Чувствительность к фторхинолонам штаммов Y. pseudotuberculosis различного плазмидного спектра.

Известно, что штаммы Y. pseudotuberculosis характеризуются наличием значительного количества плазмид с различной молекулярной массой, а серовар 1 отличается от других вариабельным спектром плазмид (Л. К. Казаченко и соавт.,

1985, А. В. Ракин и соавт., 1984, Ф. Н. Шубин и соавт., 1985, В. М. Китаев, 1993). Кроме того, исследованиями Ф. Н. Шубина (1993) установлено, что популяциям Y. pseudotuberculosis серовара 1 свойственна региональная приуроченность и автор выделил три различные популяции микроба (дальневосточную, западно-сибирскую, московскую) с указанием плазмидного спектра клонов. Поэтому в ходе дальнейших исследований мы сочли для себя важным изучить чувствительность к фторхинолонам штаммов бактерий псевдотуберкулеза с различным спектром плазмид, в том числе штаммов, отличающихся по чувствительности к широко применяемым в настоящее время антибиотикам, и в зависимости от их принадлежности к трем выявленным популяциям микроба. Было установлено, что все изученные штаммы Y. pseudotuberculosis являются высокочувствительными к ципрофлоксацину, независимо от принадлежности к серовару и спектра плазмид, а диапазон колебания минимальных подавляющих концентраций препарата находится в пределах 0,0156-0,125 мкг/мл (табл. 3).

По отношению к пефлоксацину и норфлоксацину бактерии псевдотуберкулеза, относящиеся к различным сероварам и имеющие разнообразный спектр плазмид, также являются чувствительными, но у них отмечены более широкие диапазоны колебания минимальных подавляющих концентраций препаратов. Данные литературы подтверждают возможность существования таких колебаний степени чувствительности в пределах чувствительных видов микроба и чувствительность зависит от свойств самого штамма, структуры и физико-химических характеристик фторхинолона (Е. Н. Падейская, 1995).

Кроме того, установленная нами чувствительность псевдотуберкулезного микроба к отечественным фторхинолонам (ципрофлоксацину, пефлоксацину и норфлоксацину) значительно выше, чем к другим антибактериальным препаратам, которые широко применяются в настоящее время для лечения псевдотуберкулеза (В. М. Китаев, 1993);.

Таблица 3.

Диапазоны колебаний МПК (мкг/мл) изучаемых фторхинолонов в отношении штаммов Y. pseudotuberculosis с различным составом плазмид.

Серо-вар Спектр плазмид (МД) Кол-во штаммов Диапазоны колебаний МПК (мкг/мл) химиопрепаратов

ЦФЛ ПФЛ НФЛ

1а 45 4 , 0,0312-0,0625 0,0625-0,125 0,125-0,25

lb 82:48 10 0,0312-0,0625 0,125-1,0 0,0625-1,0

82:48;2,7 11 0,0625-0,125 0,25-0,5 0,25-0,5

48:4,4 10 0,0156-0,125 0,25-0,5 0,0625-2,0

82:48:3,5:2,7 11 0,0156-0,125 0,0625-0,125 0,0625.-2,0

82:48:3,5 8 0,0156-0,0625 0,125-0,25 0,0312-1,0

3 . ; 45. И ; . 0,0312-0,125; . . 0,25-2,0 0,0625-1,0

4а ■ ' 45' ю. 0,0312-0,125 0,0625-2,0 0,0625-2,0

4Ь 45 9 0,0625-0,125 0,125-0,5 0,125-1,0

Примечание: ЦФЛ - ципрофлоксацин, ПФЛ - пефлоксацин,

НФЛ - норфлоксацин

В ходе экспериментов была. установлена. высокая антибактериальная активность ципрофлоксацина, пефлоксацина и норфлоксацина в отношении четырех антибиотикорезистентных штаммов, Y. pseudotuberculosis, несущих дополнительные, конъюгативные R-плазмиды с молекулярной массой 35 и 38 МД, с которыми связана устойчивость бактерий к ампициллину, тетрациклину, хлорамфениколу, стрептомицину, полимиксину, (В. М. Китаев, 1993) (табл. 4).

. Необходимо отметить, что диапазоны колебания МПК ципрофлоксацина в отношении данных штаммов составили 0,0312т0,125 мкг/мл, у пефлоксацина - 0,250,5 мкг/мл и норфлоксацина-0,125-0,5 мкг/мл,. ,

Таким образом, можно считать, что у данных штаммов Y. pseudotuberculosis в структуре выявленных R-плазмид отсутствуют детерминанты резистентности к изучаемым отечественным фторхинолонам.

Таблица 4.

Характеристика ангибиотикорезистентных штаммов Y. pseudotuberculosis и их чувствительность к исследуемым препаратам.

Номер штамма Состав плазмид (МД) Детерминанты резистентности МПК химиопрепарата в мкг/мл

ЦФЛ ПФЛ НФЛ

Н-335 82:48:39:35:2,3 Ар, Cm, Тс, Sm, Pm 0,0312 0,5 0,125

Н-224 82:48:38:25 Ар, Cm, Тс, Sm, Pm 0,0312 0,5 0,5

Н-3179 82:48:38 Ар, Тс, Sm, Рш 0,125 0,25 0,5

Н-1266 82:48:42:38 Ар, Cm, Тс, Sm, Pm 0,0312 0,25 0,125

Примечание: ПФЛ - пефлоксацин, ЦФЛ - ципрофлоксацин, НФЛ - норфлоксацин, Ар - ампициллин, Ст - хлорамфеникол, Бш - стрептомицин, Тс - тетрациклин, Рш - полимиксин.

Ципрофлоксацин, пефлоксацин и норфлоксацин одинаково активны как в отношении антибиотикорезистентных, так и антибиотикочувствительных штаммов иерсиний псевдотуберкулеза.

При сравнении чувствительности бактерий псевдотуберкулеза к фторхинолонам в зависимости от принадлежности к одной из трех популяций микроба, особых различий в чувствительности к пефлоксацину и норфлоксацину не отмечается, тогда как по отношению к ципрофлоксацину изученные штаммы относятся к группе высокочувствительных (рис. 1).

В ходе исследований было отмечено, что среди плазмидоваров разных популяций имеется ряд особенностей по чувствительности к данному химиопрепарату. Например, штаммы Y. pseudotuberculosis с очень высокой чувствительностью к ципрофлоксацину (МПК составляла 0,0156 мкг/мл) встречались в 8% случаев от общего числа изученных штаммов. Среди них преобладали бактерии псевдотуберкулезного микроба московской популяции.

При минимальной подавляющей концентрации препарата равной 0,0312 мкг/мл подавление роста Y. pseudotuberculosis в большей степени отмечалось в дальневосточной популяции (50% изученных штаммов из данной популяции), меньше - в московской (47,4% штаммов из популяции). В западно-сибирской популяции при данной концентрации препарата ингибирование роста бактерий

80 70 60 50 40 30 20

Ю М

о

fs'jlt Ь'-Ч

ш

т

□ Московская

0 Западно-сибирская

□ Дальневосточная

0,0156 0,0312 0,0625

0,125

Рис. 1. МПК ципрофлоксацина у штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных в различных регионах России (в процентах). По оси ординат - проценты, по оси абцисс - доза препарата (мкг/мл).

псевдотуберкулеза не наблюдалось.

В то же время доза препарата равная 0,0612 мкг/мл, приводила к подавлению роста псевдотуберкулезных бактерий у 71,4% штаммов из западно-сибирской популяции и у 50% штаммов дальневосточной популяции, тогда как в московской популяции микроба данный эффект отмечался реже (у 31,5% штаммов Y. pseudotuberculosis).

При концентрации ципрофлоксацина равной 0,125 мкг/мл ингибирование роста иерсиний псевдотуберкулеза в большей степени (23,8% штаммов) наблюдалось в западно-сибирской популяции микроба, а в московской данный эффект встречался лишь у 5,3% штаммов.

Полученные данные позволили нам сделать заключение, что для штаммов московской популяции минимальные подавляющие концентрации ципрофлоксацина несколько ниже, чем для других популяций микроба (западносибирской, дальневосточной).

; , Элиминация плазмиды вирулентности Y. pseudotuberculosis под влиянием фторхинолонов.

В настоящее время установлено наличие у Y. pseudotuberculosis двух плазмщ вирулентности, причем, наиболее изученной является плазмида вирулентности pCad, молекулярная масса которой колеблется от 42 до 48 МД. Получены данные с большой значимости плазмид вирулентности в проявлении и течение экспериментального инфекционного процесса, обусловленногс

псевдотуберкулезным микробом (JI. М. Исачкова и соавт., 1991). Кроме тог( известно, что некоторые лекарственные средства (в ,.т, ч. и фторхинолоны' вызывают элиминацию R-плазмид и плазмид вирулентности у ряда представителе! семейства Enterobacteriaciae; тем самым бактерии становятся авирулентными шн слабовирулентными для организма хозяина (J. Weisser с соавт., Y. Michel-Briand i соавт., 1986). Поэтому следующий вопрос, который мы осветили в своей работе затрагивал изучение одного из механизмов обезвреживающего действа

фторхинолонов - элиминацию плазмиды вирулентности у бактерий псевдотуберкулеза.

Было установлено, ципрофлоксацин и пефлоксацин практически в равной степени оказывали элиминирующее действие на плазмиду вирулентности Y. pseudotuberculosis (31,03% и 32,7% соответственно), норфлоксацин - в меньшей (18,5%). Пефлоксацин в дозе 1/2 и 1/4 МПК оказывал элиминирующее влияние чаще всего у штаммов псевдотуберкулезного микроба серовара 1Ь, реже - у серовара 4а (табл. 5).

Таблица 5.

Влияние пефлоксацина на элиминирующий эффект штаммов псепдотуберкулезного микроба.

Серовар Спектр плазмид (МД) Кол-во исследованных штаммов Число штаммов, где отмечается элиминирующий эффект Число штаммов, у которых плазмида вирулентности не элиминирует

Абс. % Абс. %

lb 82:48 7 2 28,6 5 71,4

82:48:3,5:2,7 8 5 62,5 3 37,5

82:48:3,5 5 1 20 4 80

48:4,4 9 5 55,6 4 44,4

82:48:2,7 11 3 27,3 8 72,7

4а 45 3 1 33,3 2 66,7

3 45 9 0 0 9 100

Всего 52 17 32,7 35 67,:з

Данный эффект совсем не отмечался у серовара 3. Элиминирующее влияние .ипрофлоксацина на плазмиду вирулентности бактерий псевдотуберкулеза также аблюдалось в дозах 1/2 и 1/4 МПК.

Норфлоксацин, в отличие от пефлоксацина и ципрофлоксацина, вызывал элиминацию плазмиды вирулентности не только при 1/2 и 1/4 МПК, но и более низких концентрациях препарата (1/8 МПК).

Таким образом, элиминирующее действие отечественных химиопрепаратов группы фторхинолонов - ципрофлоксацина, пефлоксацина и норфлоксацина на плазмиду вирулентности Y. pseudotuberculosis неоднозначно (у одних - он более выражен, у других - менее или отсутствует). Возможно, это определяете* особенностями самих штаммов и содержащейся в них плазмидной ДНК. Кроме того, мы высказали предположение, что механизм действия ципрофлоксацина и норфлоксацина на плазмиду вирулентности у штаммов псевдотуберкулезногс микроба неодинаков. Однако это положение требует дальнейшего изучения.

Действие отечественных фторхинолонов на адгезивные свойстве псевдотуберкулезного микроба.

Известно, что адгезия является одним из необходимых факторен существования патогенных бактерий в организме человека, так как обеспечивает начальные этапы, характер и течение инфекционного процесса (Ю. В. Езепчук 1985, Н. Н. Костюкова, 1989, В. Ю. Литвин и соавт., 1994). В настоящее врем; известно много работ по адгезии и адгезинам различных микроорганизмов. Междз тем, появились сообщения, в которых изложены результаты изучения процессе) прерывания адгезии у микроорганизмов. Поэтому, следующая серия эксперименте] была направлена на изучение возможности влияния фторхинолонов на прерывани! адгезии у Y. pseudotuberculosis. Использование методики изучения адгезивяоп процесса микроорганизмов, предложенной В. И. Брилис с соавт. (1986), позволил! изучить влияние ципрофлоксацина, пефлоксацина и норфлоксацина в доз* препарата 1 мг/мл на процесс адгезии у штаммов Y. pseudotuberculosis.

Установлено, что изучаемые препараты неоднозначно влияют на процео адгезии псевдотуберкулезного микроба к эритроцитам человека О (I) группы. Tai например, ингибирующий эффект на адгезивный процесс Y. pseudotuberculosis ;

ципрофлоксацина и норфлоксацина более выражен и меньше - у пефлоксацина (рис. 2). . . ..

Однако действие данных препаратов неоднозначно для изученных бактерий псевдотуберкулеза. Наше внимание привлек следующий интересный факт. Снижение средних показателей адгезии под влиянием ципрофлоксацина,

100 80 60 40-20-

0-I-—-Ц-—Ч-—Ч-1

Контроль ЦФЛ ПФЛ НФЛ

Рис. 2. Процент снижения адгезии штаммов Y. pseudotuberculosis под действием фторхинолонов (п=34):

К - контроль, ЦФЛ - ципрофлоксацин, ПФЛ - пефлоксацин, НФЛ - норфлоксацин

тефлоксацина и норфлоксацина обнаружено у 19 штаммов. Вместе с тем, для 8 лтаммов было установлено повышение средних показателей адгезии, а для 7 лтаммов - снижение или повышение адгезивных свойств под влиянием одного из грех фторхинолонов. Объяснить полученные результаты, позволил анализ работ Ф. 3. Шубина (1993, 1997). Автор установил, что популяции Y. pseudotuberculosis

100

63,95

73,64

65,5

сероварианта 1Ь имеют клональную структуру. В большинстве регионов России от поликлональны. Кроме того, Ф. Н. Шубин впервые показал существовав® доминирующих клонов в поликлональной популяции псевдотуберкулезноп микроба.

Мы сопоставили наши результаты по ингибированию адгезии У. рэеисЫиЬег си1оз1з под действием ципрофлоксацина, пефлоксацина и норфлоксацина ] соответствии с тем, является ли тот или иной штамм доминирующим шп недоминирующим в популяции микроба. В результате изучения определились дв группы бактерий псевдотуберкулеза (табл. 6).

Таблица 6

Средние показатели адгезйвности штаммов псевдотуберкулезного микроба под влиянием фторхинолонов в зависимости от доминирования клона.

Показатели СПА у недоминирующих штаммов У. рэеи«1о1иЬегси1оз1з : (п=16) СПА у доминирующих штаммов У. рзеиёо1иЬегси1оз1з (№=18)

Контроль ЦФЛ ПФЛ НФЛ Контроль ЦФЛ ПФЛ НФЛ

М 3,0 1,42 1,44 1,085 1,49 2,4 2,61 2,85

±ш 0,3 0,28 0,31 0,19 0,19 0,16 0,39 0,23

Р <0,01 <0,05 <0,01 <0,01 <0,05 <0,01

Примечание: СПА - средний показатель адгезии,

ЦФЛ - ципрофлоксацин, ПФЛ-лефлоксацин, НФЛ - норфлоксацин.

В первой группе (16 штаммов) оказались штаммы, недоминирующие поликлональной популяции микроба, тогда как во вторую группу попали 1 штаммов, которые доминировали в изучаемой популяции бактерий. Штамм] недоминировавшие в популяции, под действием фторхинолонов, как правил

снижали адгезивную активность. В большей степени снижение адгезивных свойств у штаммов Y. pseudotuberculosis отмечалось под действием норфлоксацина, средний показатель адгезии (СПА) которого был равен 1,085±0,19 и почти одинаковые СПА у ципрофлоксацина и пефлоксацина (1,42±0,28 и 1,44±0,31 соответственно). В то же время у штаммов, доминировавших в поликлональной популяции, средний показатель адгезии к эритроцитам, наоборот, повышался. Это характерно для действия всех трех отечественных фторхинолонов - ципрофлоксацина (СПА = 2,4±0,16), пефлоксацина (СПА = 2,61±0,39), норфлоксацина (СПА = 2,85±0,23).

Полученные данные позволяют сделать вывод, что отечественные препараты группы фторхинолонов (ципрофлоксацин, пефлоксацин и норфлоксацин) влияют на адгезивные свойства псевдотуберкулезного микроба по разному (от снижения до увеличения).

Следовательно, зная клоновую характеристику возбудителя в регионе, оцениваемую по его принадлежности к определенным плазмидоварам, а также характеристику доминирующего клона возбудителя, можно будет, используя в лечении больных псевдотуберкулезом препараты из группы фторхинолонов, влиять на течение инфекционного процесса.

Терапевтический эфсЬект фторхинолонов ("пефлоксацина') при экспериментальной псевдотуберкулезной инфекции.

В связи с тем, что отечественные фторхинолоны являются высокоактивными in vitro в отношении различных штаммов Y. pseudotuberculosis, была проведена оценка эффективности данной группы препаратов в опытах in vivo на модели экспериментальной псевдотуберкулезной инфекции у белых мышей. Исследовали выживаемость и динамику очищения органов от возбудителя в организме животных. В качестве объекта исследования был взят пефлоксацин. В ходе экспериментов был установлен высокий процент защиты.,.- животных тефлоксацином на модели псевдотуберкулеза у мышей в лечебной дозе 2 иг/мышь три заражении животных 1 LDioo и 101ЛЗюо(табл. 7).

Кроме того, отмечено, что при повышении заражающей дозы (до 10 LDk»' эффективность пефлоксацина в дозе 4 мг/мышь резко снижается. Мы высказал! предположение, что данное проявление может быть связано с действием большой количества токсина Y. pseudotuberculosis и возникающих на этом фоне побочны; эффектов больших доз препарата. Все это требует дальнейшего исследования.

Таблица 7.

Эффективность пефлоксацина в зависимости от величины заражающей дозы при

,экспериментальном псевдотуберкулезе.

Доза препа- Заражающая доза равная 1 LD юс Заражающая доза равна 10 LD loo

рата, мг/

мышь

п Погибло Средняя про- % п По- Средняя %

живот- должитель- защиты гибло продолжи- защиты

ных ность жизни павших животных тельность жизни , павших

4 18 - 0 100 6 6 2,2 0

2 18 3 6 83,3 6 2 6 66,7

1 18 6 6,3 66,7 6 4 7,2 33,3

0,5 6 6 5,6 0 6 5 2,2 16,6

0,25 6 6 4 0 6 6 4,2 0

0,125 6 6 4,3 0 6 6 2,7 0

0,062 6 6 4,5 0 6 6 2,5 0

0,031 6 6 3,8 0 - - - -

Конт- 6 6 4,5 0 6 6 2,3 0

роль

Примечание: п - число животных в групп.

Изучение высеваемости Y. pseudotuberculosis из печени и селезенки у мыше леченных пефлоксацином в течение 10 дней, показало, что дозы препарата 2 -мг/мышь приводят к полному очищению органов через 14 дней от начала заражеш и проведенного лечения (рис.3).

6 -г

5-

ЧГз24ч.

Контроль

1 мг/мьиь

2 MrfMMllb мг/мьшь

20сут.

Ч/з 24 ч.

Зсут.

7 сут.

Юсут.

Контроль

1 мг/мышь

2 мг/мышь 4 мг/мышь

14 сут.

20 суг.

В) Селезенка

Рис. 3. Логарифм микробного числа на 1 г органа в различные сроки зскрытия животных после заражения Y. pseudotuberculosis и лечения тефлоксацином.

Резкое снижение выделения возбудителя из печени и селезенки отмечено уже через трое суток от начала лечения пефлоксацином.

Таким образом, результаты наших исследований подтверждают хорошук химиотерапевтическую эффективность пефлоксацина и позволяют использовать егс в качестве лечебного средства при псевдотуберкулезной инфекции. Однако, дай более полных выводов необходимы дальнейшие исследования по сравнительное оценке санирующего действия других фторхинолонов на данной модели.

Оценивая полученные данные в ходе проведенных исследований, мы считаем что отечественные фторхинолоны - ципрофлоксацин, пефлоксацин и норфлоксацш могут быть рекомендованы в ' качестве средств этиотропной терапш псевдотуберкулезной инфекции в клинике инфекционных болезней.

ВЫВОДЫ

1. Новые отечественные препараты группы фторхинолонов ципрофлоксацин, пефлоксацин, норфлоксацин обладают выраженно] антимикробной активностью в отношении штаммов Y. pseudotuberculosis. МГП исследованных препаратов значительно ниже, чем у широко применяющихс антибиотиков.

2. При сравнительной оценке активности изучаемых химиопрепаратов отношении иерсиний псевдотуберкулеза отмечена более высокая чувствительност микроба к ципрофлоксацину, по сравнению с пефлоксацином и норфлоксацинои независимо от серовара, плазмидовара и источника выделения. .

3. Высокая чувствительность штаммов Y. pseudotuberculosis к изучаемы химиопрепаратам сохраняется в течение длительного периода времени (19 ле наблюдения) и не зависит от региона выделения микробов.

4. Антибиотикорезистентные штаммы Y. pseudotuberculosis являютс высокочувствительными к ципрофлоксацину, пефлоксацину, норфлоксацину, m

:видетельствует об отсутствии детерминант резистентности к изучаемым шмиопрепаратам в структуре выявленных R-плазмид.

5. Ципрофлоксацин оказывает более выраженное антибактериальное действие ia штаммы бактерий псевдотуберкулеза московской популяции (МПК дапрофлоксацина у 63,2% штаммов составляет 0,0156-0,0312 мкг/мл), чем на шкробы западно-сибирской популяций (МПК ципрофлоксацина у 95,2% штаммов ¡оставляет 0,0625-0,125 мкг/мл).

6. Элиминирующий эффект отечественных фторхинолонов на плазмиду «рулентности Y. pseudotuberculosis отмечается у 18,5 - 32,7% исследованных итаммов. Ципрофлоксацин и пефлоксацин практически в равной степени вызывают лиминацию плазмиды вирулентности у псевдотуберкулезных бактерий (31,03%: и 2,7% соответственно), норфлоксацин - в меньшей степени (18,5%). Выявленный ффект может быть одним из механизмов обезвреживающего действия изучаемых имиопрепаратов на возбудитель псевдотуберкулеза.

7. Ципрофлоксацин, пефлоксацин и норфлоксацин влияют на адгезивные войства Y. pseudotuberculosis по разному (от снижения до увеличения). У штаммов з группы недоминирующих в поликлональной популяции клонов севдотуберкулезного микроба отмечено снижение адгезивных свойств под ействием фторхинолонов. У штаммов, относящихся к группе доминирующих лонов бактерий псевдотуберкулеза выявлено увеличение адгезивных "Свойств икроба под влиянием изучаемых препаратов. ' •;

8. Пефлоксацин оказывает выраженный терапевтический эффект на модели кспериментальной псевдотуберкулезной инфекции, что открывает перспективы спользования препаратов данной группы в клинике инфекционных болезней у ольных псевдотуберкулезом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зайцева Е. А., Шубин Ф. Н., Беседнова Н. Н. - Чувствительность Yersinii pseudotuberculosis к пефлоксацину. // Антибиотики и химиотерапия. - 1995. - Т. 40 №7.-С. 22-24.

2. Зайцева Е. А., Шубин Ф. Н., Беседнова Н. Н. - Сравнительное изучен» антимикробной активности пефлоксацина, ципрофлоксацина, норфлоксацина i азитромицина в отношении штаммов Yersinia pseudotuberculosis.// Антибиотики i химиотерапия. - 1996. - Т. 41, № 1. - С. 19-21.

3. Зайцева Е. А. - Влияние фторхинолонов на элиминацию плазмидь вирулентности у псевдотуберкулезных микробов. // III Росийский национальны] конгресс "Человек и лекарство": Тезисы докл. Москва, 16-20 апреля 1996 г. - С. 120

4. Зайцева Е. А. - Чувствительность Yersinia pseudotuberculosis фторхинолонам. // Проблемы инфекционной патологии в Сибири, на Дальни Востоке и Крайнем Севере. Материалы выездной сессии общего собрат Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук : Тезисы дою Владивосток, 16-17 мая 1996 г. - С. 6-7.

5. Зайцева Е. А., Шубин Ф. Н., Беседнова Н. Н. - Элиминация плазми вирулентности Yersinia pseudotuberculosis под влиянием фторхинолонов. , Антибиотики и химиотерапия. - 1996. - Т. 41, № 6. - С. 34-38.

6. Зайцева Е. А. - Сравнительное изучение элиминирующего действи фторхинолонов на штаммы Yersinia pseudotuberculosis. // Клинические экспериментальные исследования молодых ученых Сибирского отделения РАМЬ Тезисы докл. Новосибирск, 1996. - С. 43.

7. Зайцева Е. А., Шубин Ф. Н., Беседнова Н. Н. - Изучение чувствительност Yersinia pseudotuberculosis к фторхинолонам и эффективности пефлоксацина пр экспериментальном псевдотуберкулезе. II Журн. микробиол. - 1997. - № 5. - С. 4! 52.