Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Про- и антиоксидантные системы крови и асцита при развитии гепатомы Зайделя и способы их коррекции

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Про- и антиоксидантные системы крови и асцита при развитии гепатомы Зайделя и способы их коррекции"

На правах рукописи

ООЗ165228

Шаталин Юрий Викторович

ПРО- И АНТИОКСИДАНТНЫЕ СИСТЕМЫ КРОВИ И АСЦИТА ПРИ РАЗВИТИИ ГЕПАТОМЫ ЗАЙДЕЛЯ И СПОСОБЫ ИХ КОРРЕКЦИИ

Биофизика 03 00 02

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г Пущино 2008

003165228

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущинском государственном университете

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук, Поцелуева М М

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук, Акатов В С Доктор биологических наук, Новоселова Е Н

Ведущая организация: Институт физико-химической биологии им А Н Белозерского МГУ им М В. Ломоносова, г. Москва

Защита состоится «19» марта 2008 г в _ часов на заседании

Диссертационного совета Д 002 093 01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу 142290, г. Пущино Московской области, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН Автореферат разослан «__»_2008 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 002 093 01 Кандидат физико-математических наук

Ланина Н Ф.

Общая характеристика работы Актуальность темы

Система естественной резистентности или врожденно;» иммунитета представляет собой иммунологическую реакцию распознавания, подавления размножения и отторжения биологических агентов, имеющихся в организме или проникающих в него извне Действию такого типа иммуншета подвержены бактерии, вирусы, а также поврежденные, мутантные, стареющие и опухолевые клетки Особенностью этой системы организма в борьбе с опухолью является иммунологически неспецифический характер распознавания опухолевых клеток и готовность к немедленной реакции, не требующей предварительной иммунизации (спонтанная цитотоксичность) Арсенал средств защиты, используемых организмом, включает в себя как клеточные, так и гуморальные факторы Так в первоочередную реакцию на опухолевые клетки помимо нагуральных кнллерных клеток вовлекаются, главным образом, макрофаги, моноциты и нейтрофилы, обладающие цитотоксической и иммуносупрессорной активностью (Swann J В, 2007) Непременным условием проявления этих типов активности является их активация, которая связана с так называемым «респираторным в ¡рывом», тес быстрой продукцией этими оффекторными клетками активных форм кислорода (АФК) Свою разрушительную функцию АФК осуществляют во внеклеточной среде - в плазме крови, в асцитной жидкости (асцит) и межтканевом пространстве При нормальном функционировании системы врожденного иммунитета на локальном уровне трансформированные клетки не имеют перспективы выжить благо тар я накоплению АФК (гидроксил радикал, супероксид анион, пероксид водорода) и действию лизосомальных ферментов Однако в определенных условиях опухолевая клетка начинает размножаться, и в настоящее время вопрос о механизмах взаимоотношений эффекторных и опухолевых клеток на всех фазах опухолевого роста остается открытым Чтобы вьивить причины, по которым опухоль уходит от надзора иммунитета, необходимо охарактертзоватъ изменяющиеся условия, которые возникают при взаимодействии между клетками врожденного иммунитета и опухолевыми клетками В связи с этим является актуальным детальное иссчедование уровня окислительного стресса и его последствий в зоне контакта эффекторных и опухолевых клеток, а также в плазме крови опухоленосителя

В то же время продукция АФК является обязательным атрибутом функционирования и развития клеток в кислородсодержащем окружении, что не было бы возможпым без существования специализированных защитных систем Образование АФК в плазме крови уравновешивается действием антиоксидантов Среди них различают как пизкомолекулярные (аскорбат, а-токоферол, мочевая кислота и др ), так и высокомолекулярные (альбумин, трансферрнн, церулоплазмин, ферритин, гаптогаобин и др) Нарушения в продукции и дезактивации АФК сопровождаются накоплением окислительных повреждений и развитием различных патологических состояний, начиная от старения до канцерогенеза С ранних работ Поллинга (Cameron, 1978, 1979) до настоящего времени (Laviano А, 2007) антиоксиданты используются для профилактики и

терапии злокачественных новообразований Однако клинические данные по эффективности антиокислительной терапии не всегда однозначны (Огат^папо О й а!, 2006) В связи с выше сказанным является акгуальным детальное исследование клеточной и гуморальной составляющих врожденного иммунитета в ходе развития опухоли, динамики поведения компонентов антиоксидантной защиты в плазме крови и в зоне контакта эффекторных и опухолевых клеток, а также исследование возможности использования новых синтетических антиоксидантов в качестве модуляторов уровня АФК

Цель работы

Цель работы заключалась в исследовании состояния баланса между компонентами про- и антиокеидантных систем крови и асцита при развитии асцитных опухолей в организме животного и попытки коррекции с помощью антиоксидантов Задачи исследования

1 Исследовать изменение популяций лейкоцитов, уровень активных форм кислорода и метаболитов окислительного стресса (малоновый диальдегид, диеновые конъюгаты) в крови и в асците при развитии гепатомы Зайделя

2 Исследовать динамику компонентов антиоксидантной системы плазмы крови и асцита в процессе развития гепатомы Зайделя (а-токоферол, мочевая кислота, соединения, содержащие ЯН-группы и белки, умствующие в антиоксидантной защите)

3 Исследовать антиоксидантнью и цитотоксические свойства ряда низкомолекулярных антиоксидантов (дигидрокверцитина (ДГК), пентаацетилсалицилат дигидрокверцетина (ПАСДГК), пентаацетат дигидрокверцетина (ПАДГК), пентабензоат дигидрокверцетина (ПБДГК), пентаникотинат дигидрокверцетина (ПНДГК), фосфат дигидрокверцетина (ФДГК), дурохинона и гипоксена) в опытах на биохимической и клеточной моделях с целью выявления наиболее эффективного соединения для коррекции уровня АФК ш угуо

4 Изучить действие экзогенных антиоксидантов на параметры окислительною стресса в плазме крови и асците при развитии гепатомы Зайделя и на продолжительность жизни опухоленосителя

Научная новизна

Впервые проведено одновременное исследование динамических параметров, характеризующих уровень окислительного стресса и компонентов антиоксидантной защиты в плазме крови и в асците при развитии асцитной гепатомы Зайделя Установлено, что в зоне роста опухоли уровень АФК многократно снижен, концентрация макрофагов и мастоцитов посте первого иммунологического ответа падает, тогда как в плазме крови наблюдается развитие окислительного стресса с глубокими последствиями, которые ведут к разрушению эритроцитов и появлению свободного гемоглобина в плазме Впервые проведена сравнительная характеристика антиокеидантных и цитотоксических свойств новых производных ДГК пентаацетилсалицилат (ПАСДГК), пентаацетат (ПАДГК), пентабензоат (ПБДГК), пентаникотинат (ПНДГК), фосфат (ФДГК) дигидрокверцетина Показано, что ДГК и его пентаацетилсалицилатное производное (ПАСДГК) являются

самыми эффектишыми цитостатиками при концентрации 1 10 МО"7 М по отношению к клеткам АКЭ и нетоксичными к клеткам крови Фосфопроизводпое ДГК (ФДГК) оказывала токсическое действие как на клетки АКЭ, так и на фагоциты крови при исследуемых концентрациях Впервые показано, что максимально эффективная антиоксидацтная реабилитация с помощью ДГК, приводящая к увеличению продолжительности жизни опухоленосителя, наблюдается при соотношении (Цп/Гф), не превышающем 2-2,5-кратного и при концентрации свободного гемоглобина не более ОД г/л в плазме крови Научно-практическая ценность

В результате исследований установлено, что новые производные ДГК (ПАСДГК, ПНДГК, ПАДГК), являясь антиоксидаптами, обладают цитотоксическим действием по отношению к опухолевым клетка« т vilro и ш vivo, не проявляя при этом токсического действия к клеткам крови, что способствовало увеличению продолжительности жизни опухоленосителя В связи с этим ДГК и ПАСДГК могут рассматриваться как перспективные агенты в антиоксидантной терапии

Показано, что увеличение соотношения [Цп]/[Тф] более, чем в 2-2,5 раза соответствует обострению окислительного стресса и снижению эффективности действия ДГК Динамика этих параметров может быть использована при разработке протоколов терапии опухоли Апробации работы

По результатам исследований опубликовано 14 работ, из них 3 статьи Материалы диссертации были долоясны на

Ш Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), 8-ой Международной Путинской школе-конференции молодых ученых (Пуцщно, 2004), 9-ой Международной Путинской школе-конференции молодых ученых (Пушино, 2005), V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005), XXXI симпозиуме "Hormones and Regulation Cancer Cell Signaltag" (SamteOdile, France, 2006), 10-ой Международной Путинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2006), VII Международной Конференции "БИОА1ГГИОКСИДАНТ" (Москва, 2006), Девятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2006), Десятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2007), 11-ой Международной П> щинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2007), Третьей всероссийской Научно-Практической Конференции "Фундаментальные аспекты комненсаторно-приспособнтельных процессов" (Новосибирск, 2007) Структура и объем днссдугации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов

и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы Работа содержит_

рисунков и_таблиц Диссертация изложена на __страницах

Список сокращений.

АФК - активные формы кислорода, ФМА - форбол-12-меристат-13-ацетаг, ДГК -дигидрокверцетин, ПАСДГК - пентаацетилсалицилат дигидрокверцетина, ПАДГК -

пентаацетат дигидрокверцетина, ПНДГК - пентаникотинат дигидрокверцетина, ПБДГК -пентабензоат дигидрокверцетина, ФДГК - фосфат дигидрокверцетина, ДТНБ -дитионитробензойная кислота, ТБК - тиобарбитуровая кислота, МДА - малоновый диальдегид, ДК - диеновые коньюгаты, АХ - аскорбиновая кислота, МК - мочевая кислота, Тф - трансферрин, Цп - церулоплазмин, TR - трансферриновый рецептор, PBS -фосфатный раствор Материалы и методы Материалы

ß-глнжоза, люминол, ФМА (форбол-12-миристат-13-ацетат), RPMI-1640, HEPES, Percoll, ДТНБ, TRIS HCl, нитросиний тетразсший, фикол, кумасси R250, акриламид, бисакрилаивд, дурохинон (Sigma, США), гемоглобин, верографин ("Агат-Мед", Россия), гепарин (Спофа, Прага), Na2HPC>4. NaH2P04, NaCl, гентамииин, персульфат аммония (РеаХим, Россия), краска Романовского, набор для определения мочевой кислоты, трипановый синий (ДиаКон, Россия), эмбриональная сыворотка ("БиотоТ", Россия), иммуноферментные наборы для определения трансферрина и церулоплазмина (АРТЕС, Германия), гипоксен ("Олифен", Россия), ДГК (ИБП РАН, Россия), эфирные производные ДГК предоставлены лабораторией органического синтеза Московского педагогического государственного университета Объект исследования

В качестве объекта исследования выбрана модель развития асцитной гепатомы Зайделя Эксперименты m vitro проводили на переживающей к>льтуре асцитной карциномы Эрлиха Модель развития асцитных опухолей удобна для исследования взаимодействия клеток неспецифического иммунитета и развивающейся опухоли Министерством здравоохранения РФ и фармакологическим государственным комитетом рекомендовано изучение противоопухолевого действия фармакологических препаратов на перевиваемых культурах асцитной гепатомы Зайделя и карциномы Эрлиха [Руководство по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ, 2001] Животные

В экспериментах ш vivo использовали крыс-самцов линии Вистар весом 200-220 г Клетки гепатомы Зайделя (АГЗ) трансплантировали в брюшную полость животного путем введения 1 мл ресуспендированых в солевом буфере клеток в концентрации 1 107 кл/мл Продолжительность жизни животного с трансплантированной опухолью составляла 12-14 суток При исследовании соотношения параметров про- и антиоксидантных систем плазмы крови и асцита ежесуточно производили декапитацию животных с целью забора образце®

В экспериментах ш vitro использовали белых беспородных мышей весом 20-22 г Клетки асцитной карциномы Эрлиха трансплантировали в брюшную полость животного путем введения 0,2 мл ресуспендированых в солевом буфере клеток в концентрации 2 106 кл/мл Для исследования циготоксического действия изучаемых антиоксидангов на выживаемость клеток АКЭ отбирали животных с 5-и дневной опухолью В опытах in vivo

использовали крыс линии Вистар с трансплантированной в брюшную полость АГЗ в концентрации 1 107 кл/мл Антиоксиданты вводили внутрибрюшинш ежедневно, начиная с 7-х суток развития опухоти в дозе 0,01 мкмоль/кг (для ДГК, ПАСДГК, ПНДГК, ПАДГК) и 0,1 мкмоль/кг веса (для витаминов С, Е, дурохинона, цистеина и ацстилцистеипа) Выделение клеток и анализ клеточных юпуляций

Нейтрофилы из циркулирующей крови крыс выделяли по методу Лобашевского A JI (1983) в градиенте плотности фикол/верографин Макрофаги и клетки генатомы Зайделя из асцитной жидкости выделяли в градиенте плотности Percoll/ NaCl на границе плотности 1,116 г/мл и 1,07 г/мл соответственно Содержание макрофагов во фракции -90-95%

Состав клеточных популяций в крови определяли по мазкам, окрашенным Азур П-Эозином по методу Романовского (Меньшиков, 1987) и па гематологическом анализаторе крови (Coulter А Т8, Beckman) Состав клеточной популяции в асцитной жидкости определяли по мазкам (окраска по Паппенгейму) и цитомеггрическим методом по светорассеиванию (Partee PAS III, Germany) Анализ популяций клеток lio размерам, гранулярности, фазам клеточного цикла проводили методом проточной питометрии на проточном цигофлуориметре Partee PAS III (Partee, Германия)

Содержание внутриклеточной ДНК определяли по Lakhanpal S et dl (1987) Для этого 106 клеток асцитной гепатомы Зайделя три раза отмывали от питательной среды центрифугированием (450 g, 5 мин) в 3 мл охлажденного 0,15 M фосфатного буфера (PBS) с pH 7,2 Осадок клеток фиксировали 70%-ным этанолом в течение 3 ч при температуре 4°С, затем трижды отмывали от фиксатора центрифугированием (450 g, 5 мин) в 3 мл PBS при 4°С Осадок клеток ресуспендировали в 0,5 мл PBS, содержащим 5 мкг/мл Hoechst 33342 и выдерживали 60 мин при 37°С Цитометрический аналш клеток проводили измерением флуоресценции окрашенных клеток на лазерном проточном цитофлуориметре Partee PAS III (Partee, Германия)

Количество клеток, находящихся в состоянии спонтанного апопгоза, оценивали в логарифмическом канале флуоресценции Клетки, содержащие ДНК меньше, чем 2п считали апоптотическими [В M Колышкин, и др 2004] Этот показатель отражает состояние клеточной популяции в период исследования Цитотоксическое действие аптиоксидантов на клетки крови исследовали на нейтрофилах, свежевыделишых из кровеносного русла беспородных мышей, и иа клетках асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) Процент выживших клеток крови и АКЭ в присутствии антиоксидантов определяли через каждые 4 часа в течение 24 часов подсчетом в камере Горяева по окрашиванию витальным красителаи - трипановым синим и по НСТ-тесту Исследование антиоксидантных свойств соединений

Антиокисидантные свойства препаратов определяли по ингибированию люминол-зависимого хемилюминесцснтного ответа в АФК-генерирующей системе Биохимическая бесклеточная АФК-генерирующая система содержала Н2О2 (30 мкМ), пероксидазу хрена (4ед/мл) h люминал (250 мкМ) В клеточной АФК-генерирующей системе использовали

лейкоциты, выделенные из кровеносного русла крысы, стимулированные ФМА (0,56 мкМ) в присутствии люминола (250 мкМ) Данные хемичюминесцентного ответа обрабатывали по стандартному методу (Теселкин Ю О и др , 1998) В качестве критерия антиокислительной активности (АОА) выбрана концентрация антиоксиданта, при которой интенсивность хемилюминесцентного ответа снижалась на 50% при введении АО в модельную систему до добавления пероксида водорода Антирадикальная активность (АРА) определяли таким же способом но антиоксидант вводился при достижении максимальной интенсивности хемилюминесценции

Определение концентраций низкомоченулярных и бечковых антиоксиданпюв в плазме крови и в асцитной жидкости опухолеюсителя

Бесклеточную асцитную жидкость и плазму крови получали путем дифференциального центрифугирования асцитной жидкости и крови при 500 об/мин в течение 10 мин и затем при 14000 об/мин в течение 10 мин Далее образцы замораживали при -20°С для последующего анализа

а-Токоферол и диеновые коньюгаты экстрагировали из плазмы крови и асцитной жидкости гептаном с последующим спекгрофотометрическим анализом (Архипова О Г, 1988, Esterbauer Н, et al, 1989)

Содержание тиоюв (белкового и небелкового происхождения) определяли стандартным спекгрофотометрическим методом по измерению уровня продукта, окрашиваемого ДТНБ Концентрацию мочевой кислоты в плазме крови и асцитной жидкости определяли уриказным методом (Ramesh С Tnvedi, et al, 1978)

Концентрацию альбумина определяли денситометрическим анализом электрофореграмм белков плазмы крови и асцита, окрашенных кумасси R250

Концентрации трансферрина и церулоплазмина определяли с помощью иммуноферментного анализа с использованием стандартных наборов (АРТЕС, Германия) Определение параметров окислительного стресса в крови и асците Уровень АФК в асцитной жидкости определяли хемилюминесцентным методом Для этого в кювету, с добавкой люминола (0,125 мкмоль), помещали 0,5 мл свежеотобрапной асцитной жидкости и регистрировали уровень хемилюминесцентного сигнала в течение 10 минут Для построения калибровочной кривой к образцу асцитной жидкости (0,5 мл) вносили 100 мкл 4% глутарового альдегида с целью ингибирования АФК-генерирующей активности фагоцитов Через 10 минут к образцу добавляли люминол (250 мкМ) и регистрировали ХЛ-ответ Затем к асцитной жидкости добавляли раствор Н2О2 до концентрации 1 нМ - 1 мкМ и регистрировали ХЛ-отвег для сопоставления с экспериментальными значениями

Уровень АФК в крови определяли флуоресцентным методом с использованием в качестве зонда AmplexRed Образец крови объемом 1 мл с добавленным зондом (10 мкМ) инкубировали при 37°С в течение 1 и 2-х часов Флуоресценцию образцов плазмы крови регистрировали при 570 нм (Zhou М, et al, 1997)

Концентрацию свободного гемоглобина в плазме крови определяли спектрофотометрическим цианметгемоглобииовым методом (Козловская, 1985).

Результаты исследования и их обсуждение

Для описания процессов, протекающих в крови и в асците, период развития опухоли удобно разделить на 3 фазы: начальная (или первая) фаза (1-4 сутки), вторая фаза (5-8 сутки) и третья (или терминальная) фаза (9-12 сутки) развития опухоли В дальнейшем эти термины будут использованы в работе.

Изменение клеточных популяций лейкоцитов в крови опухоленосипеля

Развитие опухолевого процесса в организме сопровождается реакцией неспецифического

иммунного ответа, включающего, в частности, изменение активности, численности и

локализации эффекторных клеток. В связи с этим была исследована динамика

численности лейкоцитов крови и асцита в процессе развития опухоли.

Как видно из рис.1 развитие опухоли сопровождается повышением в крови уровня

нейтрофигов (в 6-7 раз) и моноцитов (в 4-5 раз), в то время как концентрация базофилов и

Подобное изменение числа лейкоцитов в крови говорит об усилении иммунной реакции в процессе развития опухоли, что согласуется с данными, полученными рядом авторов при исследовании других видов опухолей (Enblad G. et.al., 2007). Изменение состава клеточных популяций асцита в ходе роста опухоли

Рис. 1. Изменение концентрации лейкоцитов в крови В литературе описано усиление животного в процессе развития опухоли. (М±т, миграции макрофагов (Knowles n=W. р<0.05) HJ, Harris AJL, 2007), лимфоцитов

(Yamaki Г, et.al., 1990) и тучных клеток (Ch'ng S., 2006) в зону роста солидных опухолей. Однако исследований, посвященных изучению динамических изменений численности клеточных популяций в асците, в научной литературе не обнаружено. Знание соотношения между эффекториыми и опухолевыми клетками в асците необходимо для оценки интенсивности иммунной реакции нарост опухоли в организме. Динамика изменения концентрации опухолевых клеток в асците (рис. 2а) имеет обычный вид кривой с насыщением с максимальной скоростью роста во второй фазе развития опухоли. Процесс возрастания числа опухолевых клеток сопровождается увеличением объема асцитной жидкости, который может достигать 100-11 Омл. Макрофаги и тучные клетки мигрируют в зону роста опухоли из близлежащих тканей. Накопление макрофагов

эозинофилов практичгски не изменяется.

45000 40000 3500030000 25000 20000 15000 100005000 О-

моноциты - нейтрофилы эозинофипы ■ базофилы

Г

л

А

2 4 6 3 10 День развития олухопи

в асците (Рис. 26) начинается практически одновременно с увеличением количества опухолевых клеток, достигая максимума в первой фазе развития опухоли (-500 тыс. кл/мл), а затем монотонно снижается. Концентрация тучных клеток в асците возрастает, достигая максимального значения (-100 тыс. кл/мл) к середине второй фазы, т.е. к тому времени, когда концентрация макрофагов возвращается к исходному уровню, а, именно, к тому моменту, когда начинается увеличение объема асцита. С ростом ко!щентрации тучных клеток, увеличивается степень их дегрануляции, что ведет к возрастанию концентрации гистамина в зоне роста опухоли (рис. 26). Гистамин - это медиатор, способствующий росту капилляров и увеличению их проницаемости, что ведет к увеличению объема асцита.

Рис. 2. Изменение объема асцита и концентрации (а) опухолевых клеток, лимфоцитов и (б) макрофагов, тучных теток и гистамина в процессе развития опухоли. (М±т, п-10, р<0,05) Изучение уровня активных форм кислорода и метаболитов окислительного стресса (диеновые коньюгаты, малоновый диальдегид) в плазме крови и ищите Уровень АФК является результатом как минимум двух разнонаправленных процессов, а именно, наработки АФК фагоцитами и деградации этих соединений антиоксидантами плазмы крови и асцита.

На рис. За показано, что к середине 2-ой фазы уровень АФК в нтазме повышается более, чем в 2,5 раза (рис. За). Этот результат согласуется с увеличением удельной АФК-генериругощей активности ПМЯЛ крови в 4-5 раз (Поцелеува и др. 1999) и с увеличением концентрации лейкоцитов в 6-7 раз.

В асците наблюдается возрастание уровня АФК до .максимальных значений (до 400 нМ Н2О2) в первой фазе роста опухоли с последующим экспоненциальным снижением до значений, эквимсвшрныхЗ-5 нМ Н202(рис. 35).

День развития опухоли

День развития опухоли

а

б

0 «с < 5

m

О X

а © > с

День развития опухоли

День развития опухоли

Рис. 3. Изменение уровня активных форм кислорода в плазме крови (а) и асците (б) в процессе развития опухоли. (М±т, п=7, р<0,05)

Развитие окислительного стресса сопровождается накоплением малонового диальдегида, который является одним из продуктов окислительного воздействия АФК на компоненты мембран меток и внеклеточные липонротеиды. На рис. 4а и 46 представлена динамика концен трации малонового диальдегида в плазме крови и в асците соответственно.

5 й

0 s &&

Q> g

2 et

1 ^ m ¥

g'S

s а ш х

s.

из 5 t- о

День развития опухоли

День развития опухоли

Рис. 4. Динамика изменения концентрации малонового диальдегида в крови (а) и асците (б) входе развития опухоли. (М±т, п=7, р<0,05)

Аналогичным образом изменяется другой метаболит окислительного стресса - диеновые копыогаты (данные не приведены), образующееся в процессе окисления липопрогеидов и липидов.

Динамика компонентов антиоксидангнон системы плазмы крови и асцита в процессе развития гепатомы Завделн.

В плазме крови образование АФК уравновешивается действием внеклеточных ан гиоксидантов Среди них различают как иизкомолекулярные (аскорбат, а-токоферол, мочевая кислота и др.), так и высокомолекулярные (альбумин, трансферрин, церулоилазмин, ферритин, гаптоглобин и др.). Как было показано ранее нами, развитие асцитной опухоли в организме ведет к повышению уровня АФК в плазме крови и к его снижению в асците. Возникает вопрос: «Как эти процессы влияют на концентрацию низко- и высокомолекулярных внеклеточных антиоксидантов?» а) иизкомолекулярные антиоксидантм

При развитии опухоли наблюдается снижение концентраций а-токоферола и мочевой кислоты в плазме крови на 40,7±0,1% и 54±12% соответственно (таблица 1). Подобные

изменения зарегистрированы при заболеваниях, сопровождающихся окислительным стрессом (Уига! Р, ег а!, 1999, ЗсЬлиск Я, е1 а1, 2004) С другой стороны, в зоне роста опухоли на фоне снижающегося уровня а-токоферола (на 50±10%), обнаружено накопление мочевой кислоты на 600±40% Данный факт может быть обусловлен как распадом опухолевых клеток и активацией работы ксантиноксидазы (1е(1(11 Я, е1 а1, 2007, ИагпреНо Е, е1 а1, 2006), так и повышенным синтезом и деградацией пуриновых оснований в опухолевых клеток (Штап В, е1 а1, 1982,1сте5 О Р, е1 а1,1990)

Таблица 1 Изменение концентраций (мкМ) ангиоксидантных компонентов плазмы крови и асцита в процессе развития опухоли (М±т п=5, р<0,05)

Антиоксиданты Локализация Фазы роста опухоли

Здоровое животное/ I фаза 11 фаза (6 сутки) III фаза (12 сутки)

а-токоферол плазма 11,3±0,8 9,2±0,6 6,7±0,7

асцит - 10,9±0,4 8,2±0,6

мочевая кислота плазма 50±5 39±7 23±6

асцит (17±5,2 сутки) 56±12 112±7

низкомолекулярные БН-группы плазма 2,5±0,6 2,7±0,8 2,6±0,5

асцит (2,3±0,2, 2 сутки) 2,5±0,5 2,2±0,4

альбумин плазма 39±2 30±2,4 сутки 35±1

асцит (38Й, 1 сутки) 47±2,4 сутки 40±1

белковые ЗН-группы плазма 35±3 13,6±1,6 4,7±2

асцит (12±3,2 сутки) 12±3 72=Ь4

Эксперименты показали, что концентрация ЭН-содержащих низкомолекулярных соединений (глутатион, цистеин и др) практически не изменяется в процессе роста опухоли, постоянно оставаясь на низком уровне - 2,6±0,8 мкМ как в плазме крови, так и в асците

Ь) белковые антиоксиданты (трансферрин, церулоплазмин, альбумин), ЭН-группы белков

По мере уменьшения концентрации низкомолекулярных антиоксидантов в крови и в асците главную рать приобретают белковые компоненты антиоксиантной системы Антиоксиданты белковой природы можно подразделить т две группы

1) белки, непосредственно реагирующие с АФК,

2) регуляторные белки, которые, например, связывают или окисляют ионы свободного (хелатированного) железа и других металлов переменной валентности Первая группа белковых антиоксидантов, реагирующих непосредственно с АФК, разнообразна (СОД, каталаза, пероксидазы, пероксиредоксины), хотя внеклеточных белков данного типа довольно мало (эСОД, ЗН-группы белков) Основную роль в защите

от АФК во внеклеточной среде отдают альбумину, точнее, его SH-группам (Янковский О Ю , 2000г) При исследовании динамики поведения альбумина было установлено, что в начальной фазе развития опухоли наблюдается существенное снижение его концентрации (~23±5%) в плазме крови, частично восстанавливающейся к терминальной фазе (таблица 1) В асците же, напротив, концентрация альбумина увеличивается с 1-х суток развития опухоли, достигая максимального значения во второй фазе (прирост ~24±5%), которая в дальнейшем незначительно снижается Изменение содержания альбумина в плазме и асците, по-видимому, связано с процессом ангцогенеза и с увеличением проницаемости сосудов в околоопухолевом окружении

Изменение концентрации белковых SH-групп может являться мерой окисленности-восстановлениости альбумина и среды в целом (Van der Vliet A, etal, 1994), что было подтверждаю в экспериментах по изучению действия перекиси водорода на состояние цистеиновых остатков альбумина плазмы крови (Radi R, et al, 1991) Снижение в плазме крови (таб 1) бечковых SH-групп на 87±9% к терминальной фазе развития опухоли подтверждает высокий уровень окислительного стресса в крови В асците первая фаза характеризуется высоким уровнем активных форм кислорода, что приводит к уменьшению белковых SH-групп в этот период (29% от значений, соответствующих плазме крови здорового животного) Дальнейшее развитие опухоли сопровождается гипоксией, низким уровнем АФК и соответственно 6-кратным возрастанием концентрации белковых SH-групп в асците

Во вторую группу входят такие белки, как церулоплазмин, трансферрин, ферритин, гаптоглобин, гемопексин и некоторые другие Считается, что в плазме крови церулоплазмин (Цп) совместно с трансферршюм (Тф) образуют антиоксидантную систему, регулирующую концентрацию восстановленных ионов железа (Ю А Владимиров 1999) Суммарная антаокислительная активность сыворотки в отношении Fe2+-индуцированного перекиснот окисления компонентов плазмы и клеточных мембран, в основном, определяется содержанием в ней этих белков Основная роль Тф и Цп в антиоксиданпюй защите организма - торможение Fe-индуцированпого перекисного окисления компонентов внеклеточного окружения, которое осуществляется благодаря оксидазной активности Цп и железо-связывающей способности Тф

На рис 5а показано, что уровень Тф в плазме крови животных в процессе развития опухоли снижается в 2,5-3 раза (от 5,0 до 1,6 г/л)), тогда как в асцитпой жидкости наблюдается рост уровня Тф от 1,5 г/л до 2,7 г/л (рис 56) Необходимо отметтъ что ко гпгчество Тф в асците к концу второй фазы развития опухоли составляет примерно 250 мг, тогда как в крови его количество не превышает 100 мг

День развития опухоли

День развития опухоли

б

а

Рис. 5. Изменение концентрации трансферрина в плазме крови (а) и в асците (б) в процессе роста опухоли.

Снижение концентрации Тф в крови обусловлено двумя факторами. Вследствие того, что основной рост асцитной жидкости наблюдается во второй фазе развития опухоли, то резкий спад Тф в плазме может быть обусловлен его перераспределением между плазмой и асцитной жидкостью. Другой причиной может быть активация захвата трансферрина клетками крови посредством трансферриновых рецепторов - TR (Toshie Kanayasu-Toyoda, et.al.. 1999). Увеличение уровня экспрессии TR может приводить к снижению концентрации Тф в плазме крови, например, при созревании моноцитов в макрофаги (Ugo Testa, et.al., 1989).

Обнаруженное в настоящей работе возрастание концентрации Тф (рис. 56) в асците напрямую коррелирует (р=0,871) с изменением концентрации опухолевых клеток и, по-видимому, отражает равновесный процесс захвата Тф.

Динамика изменения концентрации другого белка, функционирующего совместно с трансферрином! - церулоплазмина (Цп) имеет противоположные тенденции. Так в плазме крови концентрация Цп (Рис. 6а) возрастает в 1,5-2 раза (от 0,55 до 1,1 г/л), в то время как в асците (рис. 66) она снижается с 0,55 г/л до 0,35 г/л. Увеличение концентрации Цп в плазме крови, возможно, является следствием активации его экспрессии интерлейкином IL-6 (Laurie Conley, et.al., 2005).

Рис. 6. Изменение концентрации церулоплазмина в плазме крови (а) и в асците (б). Снижение концентрации Цп в асците, по-видимому, является результатом увеличения

День развития опухоли

а

День развития опухоли

б

объема асцита, а так же результатом захвата Цп из внеклеточного окружения опухолевыми клетками (Folkman J., 1972), которым для нормального функционирования необходимы ионы меди.

Необходимо отметить, что количество Цп к концу второй фазы развития опухоли возрастает до 40 мг в асцитной жидкости и до 30 мг в крови. Таким образом, исходя из того, что плазменный Цп содержит примерно 5% всей меди в организме (Linder М.С., Hazegh-Azam М, 1996), а в процессе развития опухоли наблюдается увеличение суммарного количества ЦП в 4,6 раза, то этот факт может приводить к дефициту меди в других тканях и вызывать пейродегенеративные растройства (Vassiliev V., 2005), развитие сердечной недостаточности (Elsherif L., et.al., 2003) и ослабление антиоксидантпой защиты клеток (Urin-Adams J.Y., Keen K.L., 2005).

Развитие гепатомы Зайделя сопровождается двумя процессами, предположительно, связанными друг с другом.

Во-первых, в терминальной фазе развития опухоли наблюдается многократное увеличение потенциальной способности полиморфноядерных лейкоцитов генерировать реактивные формы кислорода (Поцелуева М.М. и др, 1999), что может способствовать повышению уровня пероксидов в плазме крови. Во-вторых, примерно в этот же период наблюдается появление на мазках крови "теней" эритроцитов (Поцелуева М.М., и др., 2005).

Как было установлено, увеличение уровня АФК сопровождается не только разрушением эритроцитов, но и появлением свободного гемоглобина (рис. 7), который усиливает свободно-радикальные процессы в плазме крови.

Возможно, недостающим звеном в объяснении эффекта повреждения мембраны эритроцитов являются нарушения во внеклеточном гомеостазе железа, вызванного изменениями уровней Цп и Тф.

Общепризнано, что соотношение

концентраций [Тф]/[Цп] является мерой изменения антиоксидантного статуса крови (Владимиров Ю.А.; и др., 1991), и его рост свидетельствует о возрастании

антиоксидантной защиты внеклеточной жидкости. В таком случае обратная величина ([Цп]/[Тф]) может отражать развитие окислительного стресса.

Действительно, увеличение соотношение [Цп]/[Тф] более, чем в 2 раза соответствует условиям внеклеточного окружения, характеризующихся высоким уровнем АФК и низким уровнем SH-групп белков во второй-третьей фазах развития опухоли в плазме крови (рис. 8а), и в первой фазе развития опухоли в асците (рис. 86).

1.0

О s

о о 0.8

et О о.

<1) 0.6

с

о 3

к м с; 0.4

гт аз

а. (0 X 0.2

гг о 0.0

X с;

о о ^ С)

«

День развития опухоли Рис. 7. Изменение концентрации свободного гемоглобина в плазме крови при развитии опухоли.

День развитая опухоли День развития опухоли g

Рис.8. Изменение соотношения концентраций [церулотазмин]/[трансферрин] в плазме крови (а) и в асците (а) входе развития асципной опухти (ггпатома Зайделя) 3. Действие экзогенных антиоксндантов на развитие опухоли in vitro и in vivo. Установлено, что в процессе роста асцитной гепатомы Зайделя в организме животного в плазме крови развивается окислительный стресс, ведущий к негативным последствиям. Компоненты аятиоксидантной защиты крови не справляются с ситуацией и как результат повреждение здоровых клеток и гибель опухоленосителя. Для коррекции антиокеидантиого баланса плазмы крови опухоленосителя было предложено скорректировать негативные последствия АФК с помощью экзогенных антиоксндантов. Однако среди антиоксндантов есть такие соединения, которые обладают еще и противоопухолевой активностью. К таким АО, в частности, относятся некоторые флавоноиды (Fotsis Т, et.al., 1997; Caltagirone S., et.al., 2000), хиноны (Moreira L.C., et.al., 1973; Fogel F.S., et.al., 1975), полифенолы (Chihak A., 1975; Das G.G., et.al., 1974) и ряд других классов соединений. В результате в качестве исследуемых соединений были выбраны:

1. флавоноиды - новые синтетические производные дигидрокверцитина (ДГК): пентаацетилсалицилат дягидроквещетина (ПАСДГК), пентаацетат дигидрокверцетина (ПАДГК), пентабензоат дигидрокверцетина (ПБДГК), пентаникотинат дигидрокверцетина (ПНДГК) и фосфат дигидрокверцетина (ФДГК) и самдигидрокверцегин (ДГК).

2. хиноны и полифенолы (дурохинон и гипокссн) - синтетические соединения, способные образовывать стабильные анион радикалы и переносить электроны, что является необходимым как в условиях окислительного стресса в плазме, так и в условиях гипоксии в асците.

Антиокскдангные свойства исследуемых соединений

Была поставлена задача исследовать антиоксидантные свойства выбранных соединений в биохимических и клеточных модельных системах, модулирующих окислительный стресс. Антиокисидантные свойства соединений синтетического (дурохинон, гипоксен, ФДГК, ПАДГК, ПАСДГК, ППДГК, ПБДГК) и природного (ДГК, витамин С, витамин Е) происхождения проводили по их антиокислитедьным и антирадикальиым [Клебанов, 1999] свойствам на модельных системах - биохимической и фагоцитсодержатцей (таб. 2).

Как видно из таблицы 2, высокой антирадикальной активностью в биохимической модельной системе обладают ДГК и ФДГК, которые по своим свойствам сравнимы с аскорбиновой кислотой Таблица 2 Антиоксидантные свойства исследуемых соединений в "биохимической" и

"клеточной" системах Сара - концентрация, соответствующая антирадикальной актившсти соединения, Саоа - концентрация, соответствующая антиокислительной активности соединения, БХС - биохимическая модельная система (пероксидаза хрена - люминол - Н2О2), ФС - фагоцитсодерясащая модечьная система (лейкоциты крови здорового животного -люминол - ФМА)

Антиоксиданты Сара в БХС Саоа в БХС Сара в ФС Саоа в ФС

ПАСДГК 7,9x105 2,8x1а' 2,5x10' 2,0x10°

ПБДГК 6,4x10' 2,3x10т4 3,8xia6 3,5x10'

а-токоферол 2,24x1 а5 3,41x1а5 2,43x1o4 3,14x10'

ПАДГК 1,6x1 а5 5,4x10т4 6,3x1а" 5,5x10'

дурохинон 1,1x1а' 1,0x10' 0,8x10т4 9,2x10'

ПНДГК 5,8x1 а6 3,2xia' 2,5x10" 3,5x10"'

гипоксен 4,3x10" 5,8xia' 1,2хШ' 7,1x1а'

ДГК 2,0x1а' 1,7x10"" 3,3x1 а5 5,0x10"

АК 1,8x1а' 5,2x1 а7 i,ixia' 1,7x10"

ФДГК 0,7xlff' 2,5x10"' 2,8xia' l,5xias

Антиоксилительные свойства исследуемых соединений в ФС системе увеличиваются в следующем ряду дурохинон < а-токоферол < ДГК < ПАСДГК < АК < гипоксен < ПАДГК < ПБДГК = ПНДГК <ФДГК В фашцитсодержащей модельной системе производные ДГК (за исключением ПАСДГК) обладают более сильными антиоксилительными свойствами, чем АК и а-токоферол Это может быть связано не только с их антиоксидантными свойствами, но и с их токсичностью по отношению к клеткам крови

Влнянне антиоксидантов на выживаемость клеток асцитной карциномы Эрлиха и на выживаемость нейтрофплов крови

Следующей задачей являлось исследование действия антиоксидантов на выживаемость опухолевых и фагоцитирующих клеток крови Установжно, что дурохинон, ДГК и 5 его производных оказывают в зависимости от действующей концентрации цитостатическое или цитотоксическое действие на выживаемость клеток асцитной карциномы Эрлиха и нейтрофилы (таб 3) В результате экспериментов показано дозазависичое ингибирование роста клеток асцитной карциномы Эрлиха (Ю'Мо^М), а для высоких концентраций (10 5М и более) наблюдается цитотоксическое действие данной группы препаратов Следует отметить, что ДГК и его производное ПАСДГК селективно подавляли рост опухолевых клеток, практически не повреждая при этом клетки крови Именно эти соединения были использованы в опытах ш vivo для коррекции соотношения про- антиоксидантов в организме опухоленосителя

Таблица 3. Выживаемость клеток АКЭ и лейкоцитов при культивировании в присутствии

возрастающих концентраций исследуемых антиоксидантов (в течение 24 часов в среде

ЯРМ! с 10%-БСА). (М±т, п= 5)

концентрация меток АКЭ, % от концентрация лейкоцитов, % от

контроля контроля

10"' 10"° 10° 10°

ДГК 70±4% 53±7% 24±7% 94±5%

ФДГК 57±5% 51 ±5% 28±5% 29±7%

ПАСДГК 40±5% 28±5% б±5% 89±7%

ПНДГК 60±5% 48±5% 31 ±5% 60±5%

ПБДГК 60±5% 54±5% 30±8% 43±5%

ПАДГК 63±10% 51±5% 28±5% 34±3%

дурохинон 85±10% , 74±15% 57±20% 85±10%

гштоксен 94±10% 91±10% 97±15% 95±5%

Абсолютное изменение концентрации клеток при культивировании через 24 часа без

добавления антиоксвдаигов составило 176±7% и 40±5% дая клеток АКЭ и лейкоцитов

соответственно.

Влияние экзогенных антиоксвдаигов на продолжительность жизни опухоленоеителя

Дальнейшим этаном стало исследование влияния антиоксидантов на продолжительность жизни крыс с аортной гепатомой Зайделя.

Рис. 9. Влияние различных антиоксидантов и времени введения на продолжительность жизни опухоленоеителя.

а - исследование эффективности действия препаратДГК от времени введения в дозе 0,01 мкМ/кг веса животного.

б - препараты водились внутрибрюшинно (ежедневно, начиная с 7-х суток развития опухоли) в дозе 0,01 мкМ/кг (для ДГК, ПАСДГК, ПНДГК, ПАДГК) и 0,1 мкМ/кг веса (для витаминов С, Е, дурохинона, цистеина и ацетилцистеина).

Продолжительность жизни опухоленосшпеля без применения антиоксиданта составляло 11-14 суток. (М+т, п=10,р<0,05)

При определении эффективного периода введения препарата было установлено, что ДГК вызывает максимальное увеличения продолжительности жизни при его введении, не позднее середины 2-й фазы развития опухоли, что представлено на рис. 9а. На рис. 96 показано влияние различных антиоксидантов на продолжительность жизни опухоленосителя. Установлено, что ДГК и пентаацетилсалицилат ДГК способствуют максимальному увеличению продолжительности жюни опухоленосителя. Действие ДГК in vivo на про- и антиоксидантные системы плазмы крови и асцита опухоленосителя

После определения оптимального времени введения аитиоксиданта, приводящего к увеличению продолжительности жизни опухоленосителя, интересно было выяснить, как экзогенный антиоксидант влияет на уровень окислительного стресса и на состояние компонентов антиоксидантной системы. Из всего спектра антиоксидантов был выбран ДГК, как обладающий высокой антиоксидантной активностью, не проявляющий токсического действия по отношению к клеткам крови и имеющий специфическую активность к опухолевым клеткам

На рис. 10 представлены изменения концентраций клеток крови на 3-й и 5-е сутки после введении ДГК в брюшную шлость опухоленосителя.

В эксперимент 10 сутки g3 контроль 10 сутки И эксперимент 12 сутки □ контроль 12-сутки

¥ 1500

ж t

нейгрофил,!

Н эксперимент 10 сутки Е] контроль 10 сутки ¡2 эксперимент 12 сутки □ контроль 12 сутки

Рис. 10. Состояние показателей крови опухоленосителя после 3-х и 5-кратного введения ДГК в дозе 4мкг/кг ежедневно. (М±т, п-10, р<0,05)

Наблюдается снижение числа моноцитов на 20-40%, нейтрофилов на 70-75% и тромбоцитов на 50-60%, а так же достоверное увеличение числа эритроцитов (30%) и гемоглобина (25-35%) в них.

В асците дигидрокверцетин не вызывал существенных отклонений в численности популяции макрофагов и лимфоцитов. Однако цитометрические исследования выявили уменьшение концентрации опухолевых клеток в асците (Рис.11). После 5 дней введения дигидрокверцетина процент погибших опухолевых клеток составил 15±5% (рис. 12). Число опухолевых клеток в 02-фазе снизилось в 2 раза (с 23±5% до 10±5% от контроля), а в 01-фазе осталось на уровне 73±5%.

Я контроль

введение животному

то ДГК

Gl-фаза

*0Hip0rib 12 сугкн • эксперимент 12 сугии (ДГК)

С2-фэза

10 80 150 220 290

I 430 500 570 640 710 780 850 920 990

10 12 День развития опухоли

Рис. 11. Изменение кощентращи клеток гепатомы Зайделя в асците в контроле и при действии ДГК. (М±т, п=8, р<0,05)

Рис. 12. Распределение опухолевых клеток по фазам клеточного цикла, локализованных в асците в контроле и при действии ДГК.

В асцитной жидкости, при действии ДГК (рис. 13а), наблюдается восстановление уровгы АФК до 220 нМ-экв-НгОг и прекращение роста АФК в крови (Рис. 136).

контроль введение ДГК

! Ом • з:™

ш 2 < 5

<и ьг m сс

§■1

3 о о * & 6

i S

X S

а> о

ш о

о зе

CL Ф

>. с;

350 300 250 200 150 100 50 0

— « — контроль —а— введение ДГК

День развития опухоли

День развития опухоли

Рис. 13. Изменение уровня активных форм кислорода в асците (а) и крови (б) в контроле и при действии ДГК Введение ДГК проводили ежедневно в дозе 0,01 мкМ/кг веса животного (M±tn, п—7, р<0,05)

Повышение уровня АФК в асците при действии ДГК, предположительно, связано с его цитотоксическим потенциалом по отношению к опухолевым клеткам. Вследствие снижения доли пролиферирующих клеток, потребление кислорода снижается и нормализуется насыщаемость асцита кислородом.

Применение ДГК in vivo сказывается и на изменении метаболитов окислительного стресса. Так в плазме крови уровень малонового диальдегида падает (рис. 14а), а в асците - расгет (рис. 146).

—• — контроль о— введение ДГК

k/Hv

SSr

/IM/!

V

г,

День развития опухоли

День развития опухоли

Рис. 14. Изменение концентращи малонового диалъдегида (ТБК-активный продукт) в асците (а) и крови (б). Стрелочкой отображено начапо введения ДГК. проводимое ежедневно в дозе 0,0 [ мкМ/кг веса животного. (Mim, п—7, р<0,05)

В процессе развитая опухоли одним из обнаруженных негативных симптомов являлось повреждение эритроцитов вследствие усиления окислительного стресса. Данный процесс нивелируется после введения ДГК (рис. 15).

_ 08, Рис. 15. Изменение концентрации

свободного гемоглобина, регистрируемого в плазме крови опухоленосителя в контроле и при действии ДГК. Контроль - (круглые маркеры) и эксперимент после введения ДГК - (треугольные маркеры). Стрелочкой §. __отображено начало введения ДГК.

ю а

О 5 СП сч

2 День развития опухоли

Снижение гемоглобина напрямую отражается на изменении концентрации свободного железа в плазме крови, что, в свою очередь, влияет на содержание железо-регулирующих белков плазмы. Следовательно, представляло интерес исследование действия ДГК на соотношение белковых антиоксидантов, в частности, трансферрина, церулоплазмина и БН-групп белков в плазме крови и асците.

Как показали эксперименты, снижение окислительного стресса в крови при действии ДГК приводит к увеличению концентрации вН-групп белков (рис. 16а). Тогда как в асците зарегистрировано их снижение, что подтверждает развитие окислительного стресса в зоне патологии (рис. 166).

В контроль 0 введение ДГК

10 12 День развития опухоли

День развития опухоли

Рис. 16. Изменение концентрации ЗН-групп белков в плазме крови (а) и асците (б) опухоленосителя на 10 и 12 сутки развитая опухоли. ДГК вводили в дозе 0,01 мкМ/кг, начиная с 7-х суток (М±т, п=10, р<0.05)

Как видно на рис. 17а отсутствуют изменения концентрации церулоплазмина в крови при введении ДГК, но наблюдается его увеличение на 40-50% в асцигной жидкости (рис. 176).

О контроль Взведение ДГК

Декь развития опухал«

День развития опухоли

Ш контр ель В ааедение ДГК

День развития опухсши

День развития опухоли

Рис. 17. Изменение концентрагрги пгрансферринаи церулоплазмина в плазме крови (а, в) и асците (б,г). Введения ДГК в дозе 0,01 мкМ/кг, «ачиная с 7-х суток (М±пг, п—8, р<0,05) По-видимому, последний факт связан с ингибированием ДГК пролиферативгой

активности опухолевых клеток, что снижает интенсивность захвата ими Цп (Ро1кшап 1972; МаЪппе Н., е[.а1., 1999).

Увеличение концентрации Тф в плазме крови (рис. 17в) при введении ДГК может быть обусловлено несколькими процессами. Это может быть результатом снижения повреждаюивго действия АФК на эритроциты, что ведет к уменьшению уровня свободного гемоглобина в плазме и к снижению захвата трансферрина рецепторным аппаратом лейкоцитов. Другим процессом, так же оказывающим влияние на содержание Тф в плазме крови, является снижение числа лейкоцитов при действии ДГК. В асците же при этом наблюдается стабилизация концентрации трансферрина на уровне 2 мг/мл (рис. 17г).

В ходе работы было установлено, что соотношение белков [Цп]/[Тф] является критерием развитая окислителшого стресса. При действии ДГК наблюдается нормализация этого параметра в кровеносном русле (рис. 18а) и увеличение его в зоне роста опухоли (рис. 186).

□ контроль И введение ДГК

ю 12 ^

День развития опухоли

£

Г 0,4

й контроль а введение ДГК,

10 12

День развития опухоли

Рис. 18. Изменение соотношения белков [ЦП]/[ТФ] в плазме крови (а) и в асците (б) при введении ДГК. В качестве "нормального соотно1иения"[ЦП]/[ТФ] приведены значения, соответствующие плазме здорового животного. (М±пг, п=10, р<0,05) Итак, ДГК частично восстанавливает соотношение компонентов про- и антиоксндантных систем плазмы крови и асцита, способствуя увеличению продолжительности жизни опухоленосителя.

Выводы

1 Установлено, что в процессе развития асцитной опухоли в плазме крови опухолеиосителя наблюдается высокий уровень окислительного стресса, что подтверждено увеличением числа фагоцитов (3-3,5 раза), их гиперакгавностью (3-5 раз) и высоким уровпем активных форм кислорода Последствия этих процессов в плазме проявились в увеличении концентрации продуктов перекисного окисления липидов (малонового диальдегида и диеновых конъюгатов), в снижении (в 7 раз) концентрации SH-групп белков и в возрастании уровня свободного гемоглобина до 0,8г/л

2 Показано, что в асците концентрация макрофагов посте миграции в зону патологии монотонно падает, уровень АФК многократно снижаегся (с 390 до 4-5 нМ-экв Н2О2), что создает благоприятные условия для интенсивного роста опухоли

3 Антиоксидантвая система плазмы крови в процессе роста опухоли угнетена, что проявляется в понижении концентрации как низкомолекучярных антиоксидантов (а-токоферола и мочевой кислоты в 2 5-3 раза), так и в изменении соотношения белков-антиоксидантов (Цп/Тф), участвующих в регуляции гомеостаза внеклеточного железа В асците концентрация мочевой кислоты, белковых SH- групп, наоборот, увеличивается, а соотношение (Цп/Гф), падает

4 Установлено, что максимальное цитостатическое действие в отношении опухолевых клеток при концентрациях 1 10'ь-10"7 М проявляют ДГК и его пентаацетилсалицилатное производное (ПАСДГК) При концентрации 1 10'5 М данные соединения являются токсичными к АКЭ и инертными по отношению к лейкоцитам крови

5 Показано, что в экспериментах m vivo ДГК тормозит развитие окислительного стресса и его последствий в плазме крови, тогда как в асците наблюдается повышение уровня АФК и регистрируется снижение концентрации опухолевых клеток, что приводит к увеличению продолжитеяьпост и жизни опухолеиосителя в 2-2,5 раза.

6 Установлено, что использование ДПС в качестве цитотоксического агента и регулятора баланса про- и антиоксидантных систем плазмы крови и асцита опухолеиосителя, эффекгивно при соотношении [Цп]/[Тф], не превышающего 2-2,5 -кратного значения и при уровне гемоглобина в плазме крови не более 0,2 г/л.

Статьи

1 Поцелуева М М , Пустовидко А В , Ковалева Е В , Шаталин Ю В , Евтодиенко Ю В Цитотоксическое действие полиморфноядерных лейкоцитов на опухолевые и нормальные клетки m vitro и m vivo Цитология 2005 Т 47, №1,с57-63

2 Шаталин Ю В , Наумов А А, Поцелуева М М Исследование антиоксидантных свойств гипоксена и дурохинона методом хемилюминесценции Биофизика 2008 № 1 с 100-106

3 Шаталин Ю В , Наумов А А , Сухомлин Т К, Поцелуева М М Разнонаправленное изменение концентраций церулоплазмина и трансферрина в плазме крови и асцитной жидкости опухоленосителя Сибирский консилиум 2008 №2, с 59-65

4 Shatalin Yu V, Sukhomhn Т К, Naumov А А, Potselueva М М Differential regulation of ceruloplasrran and transferring in plasma and ascetic fluid of rats with trasplated tumor FEBS Lett in press

Тезисы

1 Шаталин Ю В, Парнышкова Е Ю Наумов А А, Изменение концентрации церулоплазмина и трансферрина в плазме крови и асцитной жидкости опухоленосителя Десятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей Санкт-Петербург, 2007, сборник телсов

2 Шаталин Ю В, Шубина В С, Наумов А А, Поцелуева М М Изменение концентрации антиоксидантов в плазме крови и асцитной жидкости в ходе развития опухоли Биология - наука XXI века. 10-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых Сборник тезисов Пушино, 2006 г

3 Шаталин Ю В , Овчинникова К Н , Наумов А А , Шубина В С , Поцелуева М М Исследование антиоксидантных свойств производных дигидрокверцетина VII Международная Конференция "БИОАНТИОКСИДАН1" Москва, 25 - 26 октября 2006 (принято к печати)

4 Шаталин Ю В , Шубина В С , Наумов А А Расщепление эфиров дигидрокверцетина в организме животного при комплексной терапии асцитной гепатомы зайделя Девятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей Санкт-Петербург, 2006 С 396-397

5 Shatalin Yu V , Naumov А А, Shubina V S , Potselueva M M There is research of cytotoxic action of dihydroquercetine on Ehrlich's carcinoma cells and polymorphonuclear leukocytes XXXIst Symposium on Hormones and Regulation Cancer Cell Signalling Hostellene du Mont Sainte-Odile, France Abstract book, 14-17 September 2006

6 Шаталин ЮВ, Наумов AA, Рыжков I1A, Шубина ВС, Поцелуева ММ Изменение уровня реактивных форм кислорода в асцитной жидкости опухоленосителя Биология — наука XXI века 9-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых Сборник тезисов Пущино, 2005 г, с 128

7 Шаталин Ю В , Наумов А А , Шубина В С , Рыжков П А , Поцелуева М М Изменение хемилюминесценции фагоцитов опухоленосителя в присутствии

гтрооксидантов V Сибирский физиологический съезд Томск, 2005 Бюллетень сибирской медицины т 4, приложение 1, с 41

8 Шаталин Ю В, Шубина В С, Наумов А А, Ермяченков А А, Поцелуева М М Антиоксидантньв свойства производных дигидрокверцетина Сборник тезисов Вторая Международная конференция "Наука-Бизнес-Образованж", Пущино, 2005 с 113-114

9 Шаталин Ю В, Григорьева Е Е, Ковалева Е В , Наумов А А, Рыжков П А Поцелуева М М Сравнение антирадикальных свойств витамина С, аскорбата натрия, а-токоферола, гипоксена и дурахинона методом хемишоминесценции Биология -наука XXI века 8-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. 17-21 мая 2004 г Сборник тезисов Пущино, 2004 с 80

10 Шаталин ЮВ, Григорьева ЕЕ. Ковалева ЕВ, Наумов А А., Рыжков ПА Поцелуева ММ. Влияние энхансоров на интенсивность хемшпомшесцентного ответа в модельной и фагоцит-содержащих системах Биология — наука XXI века 8-я Международная Пущинская школа-копференция молодых ученых 17-21 мая 2004 г Сборник тезисов Пущино, 2004 с 99

11 Поцелуева М М, Пустовидко А В , Ковалева Е В , Шаталин Ю В , Григорьева Е Е, Ягужинский Л С Влияние дурсхипона на цитотоксическую активность полиморфноядерных лейкоцитов Ш УГЛЮ Ш Съезд биофизиков России Воронеж 24-29 июня 2004 г Тезисы докладов Т 2 с 562-563

Подписано в печать 18 02 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 79 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495)975-78-56, (499)788-78-56 www autorefemt ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шаталин, Юрий Викторович

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Различные концепции развития канцерогенеза.

Эффекторные клетки неспецифического иммунитета при патологических состояниях. I Регуляторные связи между воспалительным процессом, иммунитетом и канцерогенезом.

Влияние ядерного фактора транскрипции на пролиферативный потенциал опухолевой клетки.

Окислительно-восстановительная регуляция ЫЕ-кВ.

Роль различных типов эффекторных клеток в развитии опухоли. цитотоксическое действие активных форм кислорода.

Цитотоксическое действие пероксида водорода и гидроксил радикала.

Активные формы азота и хлора. антиоксидантные системы внеклеточной защиты.

Антиоксиданты белкового происхождения.

Каталаза.:.

Супероксиддисмутаза (СОД).

Глутатионпероксидаза.

Альбумин.

Церулоплазмин.

Трансферрин и другие железо-связывающие белки.

Витамины и низкомолекулярные антиоксиданты.

Мочевая кислота (МК).

Аскорбиновая кислота (АК). а-Токоферол. флавоноиды.

Флавоноиды как иммунные модуляторы.

Антиоксидантные свойства флавоноидов.

Противоопухолевая активность флавоноидов.

Использование антиоксидантов для терапии заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом.

ЧАСТЬ П. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ.

Материалы и методы исследования.

ЧАСТЬ Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Изменение клеточных популяций лейкоцитов в крови опухоленосителя.

Изменение состава клеточных популяций асцита в ходе роста опухоли.

Изучение уровня активных форм кислорода и метаболитов окислительного стресса в плазме крови и асците.

Динамика компонентов антиоксидантной системы плазмы крови и асцита в процессе развития гепатомы Зайделя. a) низкомолекулярные антиоксиданты. b) белковые антиоксиданты (трансферрин, церулоплазмин, альбумин), SH-группы белков.

Действие экзогенных антиоксидантов на развитие опухоли in vitro и in vivo.

Антиоксидантные свойства исследуемых соединений.

Влияние антиоксидантов на выживаемость клеток асцитной карциномы Эрлиха и на выживаемость нейтрофилов крови.

Влияние экзогенных антиоксидантов на продолжительность жизни опухоленосителя.90?

Действие ДГК in vivo на про- и антиоксидантные системы плазмы крови и асцита опухоленосителя.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Шаталин, Юрий Викторович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые проведено одновременное исследование динамических параметров, характеризующих уровень окислительного стресса и компонентов антиоксидантной защиты плазмы крови и асцита при развитии асцитной гепатомы Зайделя. Установлено, что в зоне роста опухоли уровень АФК многократно снижен, концентрация макрофагов и мастоцитов после первого иммунологического ответа падает, тогда как в плазме крови наблюдается развитие окислительного стресса с глубокими последствиями, которые ведут к частичному разрушению эритроцитов и появлению свободного гемоглобина. Впервые проведена сравнительная характеристика антиоксидантных и цитотоксических свойств новых производных ДГК: пентаацетилсалицилат (ПАСДГК), пентаацетат (ПАДГК), пентабензоат (ПБДГК), пентаникотинат (ПНДГК), фосфат (ФДГК) дигидрокверцетина. Показано, что ДГК и его пентаацетилсалицилатное производное (ПАСДГК) являются самыми эффективными цитостатиками при концентрации 1 -10"5 -10"7 М по отношению к клеткам АКЭ и нетоксичными к клеткам крови. Фосфопроизводное ДГК (ФДГК) оказывало токсическое действие как на клетки АКЭ, так и на фагоциты крови при исследуемых концентрациях. Впервые показано, что антиоксидантная реабилитация с помощью ДГК, приводящая к увеличению продолжительности жизни опухоленосителя максимально эффективна при соотношении (Цп/Тф), не более 2-2,5 и при концентрации свободного гемоглобина не более 0,2г/л в£ плазме крови. Динамика этих параметров может быть использована при разработке протоколов антиоксидантной терапии. В результате исследований установлено, что новые производные ДГК (ПАСДГК, ПНДГК, ПАДГК), являясь антиоксидантами, обладают селективным- цитотоксическим действием по отношению к опухолевым клеткам in vitro и in vivo, не проявляя токсичности к клеткам крови, что способствовало увеличению продолжительности жизни опухоленосителя. В связи с этим ДГК и ПАСДГК могут рассматриваться как перспективные агенты в антиоксидантной терапии.