Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболизм супероксидных радикалов в опухолевых клетках

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Метаболизм супероксидных радикалов в опухолевых клетках"

АКАДЕШЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕШ НА ИНСТИТУТ ЗИОХИШИ им. А.Н.Баха

На правах рукопиои УДК Б77Л21.7{576.385.б

ПВСКИН Алекоандр Владимирович

МЕТАБОЛИЗМ СУПЕР ОКСИДНЫХ РАД4КАЛОВ В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ (Биологическая химия - 03.00.04)

АВТОРЕФЕРАТ *

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ч

Москва - 1968

Работа выполнена в лаборатория биохимии Института биологии развития им. Н.К.Кольцова АН СССР

Официальные оппоненты; член-корреспондент АМН СССР, профессор

А.И.АРЧАКОВ доктор биологических наук, профессор Б.В.БУДОЩКАЯ-ПЛМОЭД доктор биологических наук, профессор Е.В.БУРЛАКОВА

Ведущая организация - НИИ канцерогенеза ВОНЦ АМН СССР

Защита диссертации состоится "_"_ 1988 г.

в _ час на заседании специализированного совета (Д 002.96.01)

по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биохимии им. А.Н.Баха АН СССР (П7071, Москва, В-71, Ленинский проспект, 33, корпус 2) •

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы АН СССР (Мооква, Ленинский проспект, 33, корпус I).

Автореферат разослан "_" _ 1968 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор химических наук

К.Л.Гладилин

ХАРАКТЕРИСТИКА PAbCM

Актуальность темы. Кислород жизненно необходим всем аэробным организмам, но он же обладает токсическим действием. Основная масса Og подвергается в клетке четьгрехэлектронному восстановлению е образованием HjjO; тем не менее в нормальных условиях 1-0% кислорода восстанавливается по оцнозлектронному пути с образованием супероксидного радикала, который является предшественником и других активных форм кислорода. Образование активных форм кислорода является причиной токсического действия Ogj оно может повышаться при облучении, гипероксии, ишемии, действии ксенобиотиков и на молекулярном уровне проявляется в повреждении ДНК, инактивации ферментов, нарушении проницаемости мембран и др. эффектах. Бперпые предположение о том, что образование кислородных радикалов лежит л основе повреждающего действия радиации и гипероксии, было выдвинуто' а 1У54 г (Oerehman et *l., 1954). В последующие годы били опубликованы гипотезы о связи рака и других заболеваний, а также старения организма с ооразованием свободных радикалов (Эмануэль, Härmen, 1956?

Tappel, 1968), которые в дальнейшем оыли конкретизированы и решающая роль в них отводится образованию активных форм кислорода (Bur-lalcova et al., 1976l Oberley and Oberley, 1984» Cerutti, 1985).

Реальная возможность исследовать образование и роль 0£ в биологических объектах появилась лишь после открытия СОД, катализирующей реакцию цисмутации ( McCord end Frldovlch, 1969). За этим открытием последовал настоягций бум в исследовании роли СОД и активных форм кислорода в биологии и медицине. Открытие СОД по мнению некоторых авторов "по своей значимости может быть сравнено с открытием двойной спирали ДНК" (Micheleon, 1977» Bulfcley, 1983)«

До начала наших исследований в научной литературе практически не было сведений об образовании и активности СОД в опухолевых клетках. В последние годи изучение роли СОД и 0£ в злокачественной трансформации клеток ведется во многих лабораториях (Qa-leotti et al., 19801 Capel and Thomley, 1982 j Harklund et «1., 19821 Fernandea-Pol at al., 19S2; Borek and Troll, 1983 s Renaler •t »1., 1983i Oberley end Spits, 19841 Zimmerman and Cerutti, 1984» Kozumbo et al., 1985( fiuch and Klaunlng, 1986j Bannleter et al., 1986)._

Принятые сокращения: СОД - супероксиддисмутаза; НТО - нитротетра-золиевый синий; СМЧ - субмитохондриальше частицы; НОфи - Н-оксид-2-нонил-4-гидрохинолин.

Цель и задачи работы. В ходе работы мы стремились выяснить вопрос о соотношении между способностью генерировать и активностью антиоксидантных ферментов в опухолевых клетках. В частности, в задачи исследования входило изучение генерации мембранами ядер, микросом и митохондрий опухолевых клеток в сравнении с нормальными; выяснение возможности повреждения внутриклеточной ДНК под действием активных форм кислорода, образуемых мембранами; установление особенностей образования свободных радикалов противоопухолевых антрациклиновых антибиотиков мембранами опухолевых клеток.

Научная новизна работы. Проведено изучение генерации в основных типах внутриклеточных мембран и активности ферментов ан-тиоксидантной защиты в опухолевых клетках; впервые показано, что удельная активность Си,га-СОД и глутатионпероксидазы в опухолевых клетках существенно ниже по сравнению с нормальными; обнаружено, что мембраны ядер способны генерировать в ядерных мембранах опухолевых клеток обнаружена необычная активная редокс-система, способная образовывать по иному механизму, чем в нормальных ядрах; в то же время показано, что механизм генерации 0?> митохондриями сходен в нормальных и опухолевых клетках.

Впервые обнаружено, что образование свободно-радикальных форм антрациклиновых антибиотиков при взаимодействии с мембранами ядер опухолевых клеток характеризуется особыми свойствами: оно происходит в равной мере как в присутствии НЛДОН, так и НАДН, в то время как в мембранах нормальных клеток реакция протекает в присутствии НАДФЯ намного активнее по сравнению с НАДН. Выявлена способность мембран эритроцитов человека образовывать радикалы антрациклиновых антибиотиков. Показано, что во всех типах исследованных мембран выход свободного радикала карминомицина более чем на порядок выше по сравнению с адриамицином.

Впервые продемонстрирована возможность повреждения внутриядерной ДК в результате образования активных форм кислорода редокс-цепями мембран изолированных клеточных ядер.

Впервые показано, что образование макрофагами происходит только- в местах контакта клеточной мембраны с фагоцитируемым материалом.

Научно-практическое значение работы. Полученные в работе сведения о более активном образовании мембранами свободного радикала карминомицина по сравнению с адриамицином имеют важное значение .для работ по поиску новых эффективных противораковых антрацик-

линовых антибиотиков; обнаружение способности мембран эритроцитов человека генерировать свободные радикалы антрациклиновых антибиотиков важно с точки зрения разработки методов введения этих антибиотиков в организм, а также для понимания механизмов побочного действия этих антибиотиков. Обнаружение в мембранах ядер опухолевых клеток новой редокс-системы, осуществляющей окисление-восстановление хинонов и гидрохинонов, может оказать помощь в поиске новых веществ, оказывающих избирательное действие на опухолевые клетки. Данные по активности СОД и глутатионпероксидазы и генерации важны для понимания фундаментальных отличий опухолевых клеток от нормальных и могут найти применение в терапии больных раком. Сведения о локальном образовании 0£ макрофагами полезны для понимания механизма цитолиза раковых клеток фагоцитами и поиска способов активации этого процесса в организме больного.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы обсуждались более чем на 20 всесоюзных и международных конференциях, симпозиумах и семинарах, в частности, на б, 7, 8 и 9 Всесоюзных симпозиумах по структуре и функциям клеточного ядра (Алма-Ата, 1976; Харьков, 1980; Пущино, 1984; Черноголовка, 1987), Ш-У Всесоюзных симпозиумах по медицинской энзимологии (Астрахань, 1979; Алма-Ата, 1903; Махачкала, I98G), Советско-Финляндских симпозиумах по клеточным мембранам (Ленинград, 1979; Хельсинки, 1982; Тбилиси, I9t34), XII Менделеевском съезде (Баку, 1981), Ш съезде международного общества по изучению свободных радикалов (Дюссельдорф, 1986).

Ряд существенных результатов диссертации полностью подтвержден в отечественных и зарубежных лабораториях. Опубликованные статьи более ТОО раз процитированы в работах других авторов.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 38 работ в отечественных и международных изданиях.

Об;.ем работы. Диссертация состоит из введения; обзора литературы, посвященного генерации OJ, его биологическому действию, в том числе роли в повреждении Д1К, СОД и другим антиоксицантным ферментам, роли активных форм кислорода и СОД в канцерогенезе; описания объектов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения; заключения и выводов. Работа изложена на 21Ь страницах машинописного текста, включая 22 таблицы й 42 рисунка. Список цитированной литературы содержит 348 названий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Опыты проводили на клетках печени и других тканей, а также экспериментальных перевивных опухолей белых беспородных и линии Виотар крыс и мышей линий СЗНА, CBAxC57Bi, BALB/c , перитонеалышх макрофагов мышей, эритроцитов крови человека а опухолей мозга человека. Клеточные ядра выделяли по методу dígi-зсоХвл» et al., (1964) или по Pogo et al.(1966), ядерные мембраны - по Bornons (197?), митоховдрии - по Hogeboom (1955),, микросомы - no Jago* et «1. (1965). Для получения СМЧ применяли ультразвуковой дезинтегратор WS 667. При выделении отруктур из асцитных опухолей клетки разрушали по методу Hawtrey and Silk (I960).Потребление кислорода регистрировали амперометрически в закрытой ячейке. Потенциометричеокое определение потенциала полувосотанов-ления цитохрома ядерных мембран проводили по методу Dutton and wileon (1974). Суперокзиддасмутазную активность измеряли по методу Beauchaap and JPridovich (1971), глутатионпероксидаэную - no Paglia end Valentin* (1967), НАДН- и НАДФН-датохром о редуктаа-ную - по Uaetere et al» (1967), перохсидаэную - как описано в руководстве фирмы Boehrlnger (1975), Генерацию 0£ митохондриями и СМЧ измеряли тайроновым методом на ЭДР спектрометре Vari an Е-4 как описано Григолавой и др. (1980). СОД-зависимое окисление адреналина измеряли как описано Aust et al. (1972). Образование радикалов снтрациклиновых антибиотиков измеряли в анаэробных условиях на ЭПР опектрометрах Varían 2-2 или E-109S. Горизонтальный электрофорез нуклеиновых кислот в агарозе проводили как в на-тивных, так и денатурирующих условиях. Появление однонитевых разрывов в ядерной ДНК измеряли по включению радиоактивных предшественников при добавлении экзогенной ДНК-полимеразы (Peekin and Sblyahova, 1986). Изучение транспорта РНК из изолированных яцер проводили в описанной ранее оиотеме (Коен и Збарский, 1978). Генерацию О?) макрофагами определяли при помощи разработанного цитохи-мичеокого метода (Збарокий и др., 198»» Peekin et al., 1984). Спектрофотометрические измерения проводили на спектрофотометрах Uni cam S?-8000 или Aminoo ЕЯТИ , радиоактивность препаратов измеряли на сцинтилляциогаюм счетчике Intertechnique SL-3Û.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Ферменты антиоковдантной защиты в опухолях

Си. го-СОД. Результаты измерений активности цианидчувстви-тельной Си, га-СОД в цитозоле нормальных и опухолевых клеток представлены на рио. I.

Рис. I. Активность СОД в цитозоле нормальных и опухолевых тканей мышей и крыс.

Ж)

Й S

ю

§1 170

tk 100 ff

х а

50

«г

Gü

Го

а

n/1

РЯ5

1. Печень крыс

2. Печень мшей

3. Легкие мшей

4. Сердце мышей

б. Селезенка мышей

6. Мозг мшей

7. Ка^циносаркома Уокера

8. Гепатомы Зайделя

9. Гепатома 27

10. Рак легкого Лыоиоа

11. Саркома 180

12. Аденокарцинома 756

13. Аоцитныи рак Эрлиха

14. Аоцитная гепатома 22а

12 3 4

7 8 9 10 11 12 13 14

6

Супероксиддисмутазная активнооть в препаратах цитозола практически полностью ингибировалась кипячением, а также добавлением I мМ кем. Кроме того, в иоследованных образцах не было заметной НТС-редуктазной активности и не происходило окисления восстановленного НТС.

Наши данные о низкой активности цитоплазматической цианид-чувствительной СОД в опухолях по оравненюо о нормальными клетками и тканями (Пескин и др., 1976;Ре«Юа et al., 1977) подтвер-лщекы в других лабораториях (исключением являются только лейкозы, при которых СОД, наоборот, повышена) (Воsal et al., 1976; Sahu •t al., 1977; Vaa Balgooy and Roberte, 1979; Oberley and Buett-ner, 1979; Galeottl et al., 1980; Bl*# «t al., 1980; Bartoli et al., I960; Woetman and lUrlclund, 1981; Capel and Tbornley,

1982; Fernandoв-Pol et al., 1982; Marklund et al., 1982; Vanella et al., 1983; Bannister et al., 1986).

Mn -СОД. В клетках эукариот, помимо Си,гг*С0Д, присутствует Mn-СОД, нечувствительная к действию цианида и локализованная в матрикое митохондрий. Изучение цианидчувотвительной оупероксид-дисмутазной активности в опухолях было нами проведено на примере митохондрий гепатомы 27 (Poskln et al., 1977), К тому времени уже бшш данные о том, что в опухолях или же вовое отсутствует Mn-СОД, или же активность ее очень низка (Dlonlsi et al.,' 1975).

Измерение активнооти СОД в интактных митохондриях осложнено тем, что и в отсутствие генерации ОJ происходит восстановление НТО в результате взаимодействия о дегидрогеназамк. Поэтому в качеотве исследуемых препаратов мы использовали экстракты митохондрий, лишенные мембран. Для этого митохондрии разрушали ультразвуком и осаждали мембраны при помощи ультрацентрифугирования. Такие препараты восстанавливали НТО незначительно, не оказывая влияние на определение активнооти СОД, и это О^-незавиоимов восстановление НТС могло быть компенсировано добавлением образца в контрольную кювету.

Как видно из табл. I, общая суперокоиддисмутазная активность, выявляемая в отсутствие цианида, меньше в митохондриях гепатомы по сравнению о митохондриями печени приблизительно во столько же раз, как и в случае цитозола (см. рис. I). В присутствии цианида не обнаруживается разница в активности СОД в митохондриях. Таким образом, разница в уровне СОД между митохондриями печени и гепатомы обусловлена глашм образом разностью в активнооти цитоплаз-матичеокой СОД, имевдейоя в межмембранном пространстве митохондрий. В пользу этого свидетельствуют данные о практически одинаковой активности СОД в митохондриях, лишенных наружной мембраны в результате процедуры осмотического шока (табл. I).

Таким образом, наши данные о практически сходной активнооти Mrt-СОД в митохондриях гепатомы и печени находятся в противоречии о данными о том, что в опухолях низка или вовое отсутствует активность Мп-СОД ( Dioniei et al.,I975; Eahu et al., 1977). С точки зрения Оберли и Бетнера (Oberley and Buettner, 1979), несоответствие данных проиотекает из неудовлетворительной очиотки митохондрий в нашей работе, т.к. активнооть СОД в них преимущественно вдтоплазматичеокого происхождения (ом. табл. I), а, кроме того, активнооть СОД цнтоплазматического происхождения не могла быть полностью ингибирована I мМ цианидом (эту концентрацию использовали мы), для чего необходим, по их данным, 5 мМ цианид.

Таблица I

Супероксиддаомутазная активность в митохондриях, изолированных из печени крысы и гепатомы 27

Ткань Удельная активность, ед./мг белка

Без осмотичеокого шока С осмотическим шоком

-CN" +ОГ -СИ" + CN~

Печень 34+8 3,0+1,3 2,9+0,5 1,3+0,1

Гепатома 27 10+2,4 2,0+0,2 2,4+0,9 2,1+0,4

По поводу первой причины следует заметить, что активность цианид-чувствительной и цианиднечувствительной СОД имеет разную зависимость от рН. Так, значения активности первого фермента, измеренные при рН 7,8 и 10,2 отличаются в два раза, а второго - в десять ( Beauchamp and Fridovich, 1973). При соответствующем пероочете наших дшшых, о учетом содержания цитозола и митохондрий в клетках печени, можно видеть, что цианидчувствителькая СОД составляет 6% суммарной активности СОД в печени, что хорошо соответствует литературным данным ( Tyler, 1975). Значительное содержание цианид чувствительной СОД в нал1их препаратах митохощрий говорит о хорошей целостности выделяемых наш органолл. По второму замечанию надо отметить, что эксперименты критиков проводились при рН 7,8, а наши - при рН 10,2; поэтому концентрация циангда в I к:А была достаточна для нао, т.к. ингибитором СОД являетоя ион сн~, а рК^ НОТ равен 9,2. Известна публикация, в которой подробно рассмотрен вопроо об шггибировании СОД цианидом в зависимости от рН ( Taebaert-Vanneste and Vanneste, 1980).

Последующие опыты других авторов подтвердили оправедливооть нашей точки зрения. Так, в работах группы Марклунда на клетках и тканях человека не было обнаружено более низкой активности Мп-СОД В опухолях ( Weatman and Marklun<JJ98I; Marklund et al,, 1982). He было обнаружено разншда в энзиматичоской активности Мп-СОД между раком легкого человека и легкими людей, погибших без заболеваний; болэе того, иммунохимический анализ показал, что при раке содержание фермента выше, что может быть связано о синтезом дефектных в энзиматичоском отношении молекул или же о большей скоростью инактивации фермента ( Ilxuka at al.,I384). Сравнительно недавно Оберли и Спитц, обсуждая вопроо об измерении ССдазной активности в опухолях, отметили, что в их работах дакньо об ак-

тивнооти Mn-СОД являютоя заниженными, т.к. они не учитывали вос-отановленио НТС образцами, и теперь они обнаруживают эту ензима-тичеокую активнооть в препаратах, в которых ранее, по их данным, она отсутствовала (Obarley вд4 Spitz, 1984).

Глутатионпероксидаза. В табл. 2 предотавлены данные об активности в печени и гепатоме 27 глутатионперокоидазы, которая локализуется в цнтозоле и в митохондриях и способна использовать в качестве субстрата не только H^Og, но и перекиси липидов и нуклеиновых кислот (Chrietophereen, 1969), Из приведенных данных видно, что глутатионперокоидазная активнооть в гепатомо на порядок величин ниже как в цитозоле, так и в митохондриях. Эти результаты ( Реskln et al.,1977) получили подтверждение.Так, показано, что в гепатомах Морриоа 3924А и Йошида AH-I30 глутатионперокои-дазная активнооть меньше, чем в печени соответственно в 10 и 14 pas (Rossi et al., 1983), в раке легкого Льюиса меньше, чем в печени в 25 раз и в 2 раза меньше, чем в легком ( Capel end Thor-nley„ 1983), а в гепатоме ЗВ активнооть глутатионперокоидазы ниже пределов чувствительности метода измерения (Bansister et al., 1986), в гепатокарциноме человека в 1,5 pasa ниже по сравнению оо вдоровой печенью ( Corrocher et al., 1986). В митохондриях, изолированных из асцитной гепатомы крыо глутатионпероксвдазная активнооть ооотавляла менее 20/5 от удельной глутатионперокоидаз-ной активности митохондрий иа нормальной печени крыо ( Пакшп and Pease, 1986).

Генерация 0¿¡ мембранами опухолевых клеток

Прямое определение 0| в биологичеоких системах невозможно, ни методом оптической, ни ЭПР опектроркопии из-за малой концентрации и олшком короткого времени спиновой релаксации 0£, что делает невозможным получение ЭПР спектров в биологичеоких образцах при физиологичеокой температуре. Для измерения обравова-1шя 0J в биологичеоких объектах применяются молекулы-ловушки, которые, реагируя о Og, изменяют овое редоко-ооотояние и, соответственно, спектральные овойотва. При изучении образования мембранными препаратами следует помнить, что изменение редоко-состояния молекулы-ловушки может происходить и в результате ее прямого взаимодейотвия о влектрон-транспортной цепью мембран. Кроме того, следует учитывать и возможность дальнейшего изменения редоко-состояния молекулы-ловушки после реакции о 0£.

Таблица 2

Глутатионпероксидазная активность в печени и гепатоме 2?

Ткань Удельная активность, ед./мг белка

Цитозол Митохондрии

С осмотичеоким Без осмотичео-шоком кого шока

Печень Гепатома 27 159+24 15+3 188+42 I0Ö+5 9+2 9+2

Восстановление НТО в формазая, который характеризуется широким максимумом поглощения при 560 нм, может ооущеотвлятъся 0|. Конотанта скорости реакции НТС о 0£ 6хЮ4 М-1 сек-1 ( Bieioki and Richter, 1977) позволяет эту реакцию широко применять для определения активности СОД. Логичным выглядело использование НТС для определения генерации мембранами. Мишиным с ооавт. ( ehia et al^t, 1976) сообщалось, что НАДФН-завиоимая редокс-цепь микрооом печени может восстанавливать НТС двумя путями: I) 0J-незавиоимым путем и 2) О^-завиоимым путем, который, судя по действию СОД, ооотавляет до 255? от общей окорооти восотановления НТС.

В наших опытах удельная НДДФН+НТС-оксидоредуктазная активность микросом печени крысы составляла 31,0+3,5 нмоль.мин~*»мг белка-1. Как видно из табл. 3, СОД вызывает некоторое подавление этой реакции в соответствии о данными работ (Mishln et al., 1976; Auclalr et ad., 1978). Однако, как выяснилось, цианид, ингибитор си,2в-С0Д, не онимал эффект СОД. Более того, СОД, инакти-вированная кипячением, и сывороточный альбумин оказывают такое же ингибирупцее действие на НАДФН+НТС-оксидоредуктазную активность, что и нативная СОД (табл. 3). Вышеизложенные обстоятельства убеждают в непригодности НТС для иооледования образования оупероксидных радикалов мембранами (Беокин и др., 1981).

Окисление адреналина в адренохром о участием широко иопользуетоя в измере!ши образования мембранными электрон-транспортными системами бактерий (Henry et al., 1980), митохондрий высших растений (Rieh et ай., 1978; Aeada et al., 1974), проотейших (Docainpo et al., 1981) и позвоночных животных (Tur-rens and Boveris, 1У80; Bize et al., 1980), а такчсе ядер (Bartoll et al.,1977) я микросом ( Auat et al., 1972).

Таблица 3

Дейотвие ООД я альбумина на НАДФН-аавиоимое вооотановление нитро-тетрааолиевого оинего микрооомами печени

Добавляемый белок Концентрация». Скорооть вооотанов-

ыхг/ыл ления нитротетра-

аолиевого оинего

Беа 'добавок - 100*

СОД 0,2 0 4 2 0 б|о 86* 79§ 81* 75?

СОД + НаСМ , Б »AI 1:8 10,0

СОД, внактивнрованная кипячением ¡•8 Щ wf

10^0

Бычий сывороточный альбумин 0,2 2,0 4,0 86? 80% 80%

В наших вкспериментах, хах в в работах других авторов (A.ust et al.i 1972j Mishin et al., 1976), реакция окиоления адреналина в адронохром микрооомами в приоутотвии НАДФН ингибирова-дась СОД более чем на 90%, а последующее добавление цианида восстанавливало исходную окорооть окиоления адреналина. Результаты такого рода акопэршлентов поаволили нам применить адреналиновый метод как один на тестов на образование 0£ мембранами нормальных в опухолевых клеток, хотя реакция окиоления адреналина в адрено-хром представляет собой олояный, многоступенчатый процесо ( Bors et ab, 1978).

Дащацкя Ра'м9м<?шш mv и митоэд ngwwm и тш-

левых клеток связана о функционированием влактронтранопортных це-цей. Поэтому при сравнительном изучении генерации 0£ интереоно оравнить и активность влектронтранопортных цепей в мембранах нормальной печени и гвпатомы. В табл. 4 оуммированы результаты определения активнооти НАДН- в НАДФН-аависимых реакций восотановлени.. цитохрома о и окиоления адреналина в адренохром в ядерных в микро-оомных мембранах ва нормальной печени и аоцитной гепатомы 22а. Измеренные в наших экспериментах удельные активнооти НАДН- и НАДФН-цитохром о редухтав в обоих типах мембран нормальной печени

согласуются oo значениями, опубликованными другими авторами (ом. обзоры Zbarsky, 1978; Harrla, 1978). Скорость образования Og в микрооомах, измеренная по скорости чувствительного к СОД окисления адреналина в присутствии НАДФН (37 нмоль в I шв на X мг белка), практически совпадает о величиной, полученной а аналогичных условиях другими авторами ( Auet efc al.,1972). При использовании в качеотве оуботрата НАДН, измеряемая скорость окисления адреналина была близка к порогу чувствительности метода. НАДФН-зависимов образование 0J выявлено наш также а г препаратах ядерных мембран иа печени; скорость НАДН-зависамого окисления адреналина мембранами ядер печени, как и в ¿случае макросом( находитоя на граница чувствительности Метода.

Сравнение значений удельной активности, представленных в табл. 4, показывает, что в клетках печени электронтранопортная оиотема мембран ядер разбита значительно меньше по оравнению о микрооомами. Вероятно, концентрация редоко-комплексов в ядерных мембранах ниже; так, например, известно, что концентрация фермента НАДФН-цатохром о редуктазы тем в 3 раза меньше, чем в микрооомах, что было продемонстрировано о помощью антител (ztt-aer-man and Каврвг> 1976).

Интересно отметить, что отношение удельной скорооти НАДФН* зависимого образования 0J к удельной активности НАДФН-цитохроы о редуктазы в ядерных мембранах раза в 3 меньше, чем в микрооомах. Показано, что примерно в такой же отепени падает в тарах печена оодержание цитохрома Р-450, отнесенное к активности НАДФН-цитохром о редуктазы (Jaraach, 1973); как извеотно, в НАДФН-зави-симой редоко-цепи флавопротеид НАДФН-цатохром о редуктазы (Арча-ков и др., 1978; Auat at si., 1972) И цитохроы Р-450 (1уков и Арчаков, 1983; Kuthan et al., 1978) рассматриваются как источники 0£. Можно полагать, что снижение возможности образования кислородных радикалов в мембранах ядер печени по оравнению о микросомами связано с близостью генетического аппарата клетки.

Соотношение активностей изученных окислительно-восстановительных ферментов в мембранах, полученных из клеток гепатомы 22а, резко отличается от такового в нормальной печени. В то время как в микрооомах гепатомы переноо электронов сильно уменьшен по ¿равнению о нормальной печенью, в мембранах ядер гепатомы 22а он значительно выше, чем в печени (табл. 4). В противоположность мембранам ядер из печени, ядерные мембраны гепатомы окисляют адреналин весьма активно, даже более активно, чем микросомы печен*.

Таблица 4

Активность окислительно-восстановительных ферментов в мембранах ядер и макросом печени крысы и гепатомы 22а

Иосле,дуемая реакция Удельная активность,

нмоль*мин""*.мг белка""*

Печень крысы Гепатома 22а

Ядерные мембраны Микрооомы Ядерные мембраны Микросомы

НАДФН-цитохром о редуктаза 27+5 101+19 73+11 «б

НАДН-цитохром о редуктаза 80+16 693+110 180+19 410

НАДФН-зависимая адреналяноксидаза .3+1 37+3 47+7

НАДН-зявисимая одреналиноксидаза <1 <1 26+4 «2

Реакция практически полностью ингибируется СОД (рис. 2), в то время как ни каталаза (0,1 мг/мл), ни "перехватчики" гидроксиль-ного радикала - этанол (0,1 М) или маннит (0,1 М) - не оказывали на реакцию ощутимого действия. Однако цианид, добавленный после СОД, не восстанавливал исходную скорость окисления адреналина в адренохром мембранами ядер гепатомы, как это происходит в случае макросом печени (рио. 2). Оказалось, что цианид является ингибитором ШД(Ф)Н-зависимого окисления адреналина мембранами ядер гепатомы. Подобным, хотя и несколько более слабым ингибирующим дейотвием обладал и.азвд.

Хорошо извеотно, что в участках митоховдриальной дыхательной цепи, а именно, сукцинат- и НАДН-убихинон оксидоредуктазных, происходит образование 0J (Kohl, 1987)1 Так как обычно препараты мембран ядер содержат некоторое количество митохондрий и их фрагментов (Кузьмина и др., 1976; Jarasch and Franke, 1974), то нельзя было исключить » что описанное выше чувствительное к цианиду и азиду окисление адреналина в адренохром ядерными мембранами гепатомы обусловлено примесью митохондриальных мембран. Против такого предположения свидетельствуют следующие наблюдения: I) удельная скорость окисления адреналина в ядерных мембранах ге-

Ядерные немшны геттояы 22 а (ЯМГ)

НААФН _4

ЯМГ, О.й

шн _+

Щ О.Инг/т

Микросомы печени крысы СМПК)

блин

НЩМ

МПК, 0.13 мг/нл

Н№ _I_

МПК, 0.30 иг/т

Рио. 2.НАДН- и НАДФН-зависимое образование ядерными мембранами гепатомы 22а и микросомами печени крысы.

Реакционная смесь содержала 0,15 М К-фэсфатный буфер, рН 8,5, 0,1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ адреналина. Окисление адреналина • инициировалось добавлением 0,4 мМ НАДН или 0,2 ш НАДФН. Концентрация СОД - 1,7 мкг/мл, цианида - I мМ.

патомы (см. табл. 4) значительно выше скорости соответствующего процесса в митохондриях ( < 5 нмольДшн/мг белка) (ВоуегХа вt а!,, 1976; ИоШ., 1987); 2) ингибиторы дыхательной цепи митохондрий протамин, антимицин А, ротенон в наших опытах не влияли на НАД(Ф)Н~зависимое окисление адреналина ядеркыш мембранами гепатомы; 3) добавление в наших экспериментах сукцината в сочетании с антимицином А, т.е. создание условий, максимально благоприятных .

для генерации 0£ оукщшат-убихинон оксидоредуктазой (Григолава и др., 1980; ВоуегАа «1., 1976), не вызывали окисления адреналина препаратами ядерных мембран; 4) не выявлена сколь-либо существенная НАДН-оксидазная активность препаратов ядерных мембран (в отсутствие адреналина). Кроме того, мы провели измерения по СОД-зависимому окислению адреналина изолированными митохондриями гепатомы 22а, и удельная скорость генерации 0£ в присутствии сук-вдшата либо НАД(Ф)Н оказалась в них меньше по оравнению с мембранами ядер из этой опухоли.

Совокупность приведенных данных позволяет сделать вывод, что дыхательная цепь митохондрий не вносит заметного вклада в измеряемое нами чувствительное к цианиду образование 0£ ядерными мембранами гепатомы.

Генерация 0% митохондриями нормальных и опухолевых клеток. В последние годы в изучении кислородных радикалов значительное внимание уделяется методу ЭПР с использованием молекул-ловушек, которые либо образуют аддукт о кислородным радикалом, либо изменяют свое редокс-состояние. Такие молекулы-ловушки после взаимодействия с кислородным радикалом становятся парамагнетиками, обладавшими характерными спектрами ЭПР. Одной из таких ловушек является тайрон (1,2-.дигидроксибенэо-3,5-дисульфонат ) - производное катехола. Хотя многие катехолы образуют семихиноны, регистрация их ЗПР спектров при нейтральных рН - технически трудная задача из-за короткого времени жизни этих радикалов в водной среде. Образование же о-семихинонового радикала тийрона можно регистрировать о помощью ЭПР спектрометра при комнатной температуре и физиологических рН (Miller and Rapp, 1973). Тайроновым методом ио-следовалось образование 0£ электронтранслортными цепями хлоро-пластов растений, хроматофоров бактерий, СМЧ сердца быка (Григо-лава и др., 1980; Верховский И др., 1985; Greenstock and Miller, 1975; Ksenzenko et al., 1983).

Мы применили тайроновый метод для изучения образования митоховдриальными препаратами опухолевых клеток. На рис. 3 представлены типичные спектры ЭПР, полученные в экспериментах по изучению генерации OJ СМЧ гепатомы 22а при помощи тайрона. При добавлении сукцината и антимицина в аэробную пробу, содержащую тайрон и СМЧ, появлялся сильный сигнал радикала тайрона (рис. 3, спектр 4), который ингибировался цианидом (рис. 3, спектр 5). Добавление СОД в значительной степени предотвращало появление сигнала (рис. 3, спектр 6), что является доказательством того, что наблюдаемое нами образование радикала тайрона связано с генерацией Og.

Следует отметить, что небольшой сигнал семихинона тайрона виден и в отсутствие сукцината и антимицина, когда в пробу, содержащую тайрон, добавляли СМЧ гепатомы 22а (рис. 3, спектр 2). . СОД не оказывала влияния на величину' этого сигнала. Такого рода исходный сигнал радикала тайрона, независящий от OJ, был еще более, значителен в экспериментах с митохондриями гепатомы Зайделя. Подобных сигналов не было ввдно, когда к содержащему тайрон раствору добавляли СМЧ сердца быка или печени крысы.

Сукцинат-зависимая генерация 0| дыхательной цепью СМЧ гепатомы наблюдается и в случае, когда вместо антимицина А добавлялся другой ингибитор участка Ьс^ фуникулозин или N-оксид-2-нонил-

g-2,00 I

i л i

Рис. 3.

Генерашя 05 дихательной цепью СМЧ гепатомы 22а.

Представлены ЭПР спектры аликвот реакционной смеси, перенесенные в плоскую кварцевую кювету для ЭПР спектроскопии жидких образцов, общим объемом 0,1 мл.

1 - основная среда, содержащая 0,5 М сахарозу. 50 мМ KCl, 20 мМ НЕ FES, pH 7,5. 3 мкМ ротенон, I мкМ ХФГКЦ и 10 мм тайрон;

2 - после добавления к основной среде 0,4 мг белка/мл СМЧ;

3 - после добавления к основной среде с СМЧ 10 мМ суицината;

4 - после добавления к основной среде с СМЧ и сунци-натом антимицина А (0,5 мкг/мг белка);

5 - после добавления к оснон ной среде с СМЧ, сукцинатом и антимицином 4 ыМ КОТ j

6 - как и спектр 3, но в присутствии 120 миг/мл СОД

2Гс

4-гидрохинолина (НО^го ) (табл. 5), как это было ранее показано Кзеагепко вt а1. (1983) для СМЧ сердца быка. Добавление других ингибиторов переноса электронов между цитохромами ь и с^ -миксотиазола или муцидина - не индущровало генерацию 0% в присутствии сукцината и, более того, ингибировало генерацию 0£, индуцированную Ш1ТКГ.МЦШ10М (табл. 5), т.е. их действие бшо подобно цианиду, как и » случае СМЧ сердца (Каепгепко вt а1., 1983).

Недавно било показано, что скорость генерации 0£ и в участке Ьо^ дихате.пыюМ пот завлсит от редоке-состоянля пере-носсгла по,порода, предположительно убахииона (Кзепгеако еъ а!.,

Таблица 5

Дейотвие ингибиторов переноса электронов в участке ъс^ на генерацию Og СМЧ иа гепатомы 22а в приоутотвии оукцината

Добавленный ингибитор Величина ЭПР сигнала радикала тайрона

Антимицин А 0 100

Фуникулоэин 50

HOQRO 135

Муцидин 0

Муцидин+антимицин 5

Миксотиазол 0

Миксотиазол+антимииин 5

Условия измерений ом. в подписи к рио. 3. Концентрация ингибиторов (мкг на I мг белка): антимицин - 0,5: фуникулоэин -1р. 1IOQNO _ ij муцадин - 0,5; миксотиаэол - 0,5. СМЧ предварительно инкубировали неоколько минут о ингибиторами и затем добавляли оукцинат. Величина сигнала ЭПР в присутствии антимицина+сукцинат была произвольно принята за 100.

1984). Мы также провели эксперименты по выяснению редоко-завиои-мости генерации Og CtH гепатомы, попользовав в качеотве редоко-медиаторов оукцинат и фумарат. Было обнаружено, что генерация 0£ максимальна при соотношении концентраций оукцината и фумарата равном 1:10. При более низких и более высоких значениях редоко-потенциала генерация 0j> уменьшалась. Эти результаты практически не отличались от тех, что были получены в случае СМЧ сердца быка ( Kaenzenko et al., 1984).

В табл. 6 представлены данные, показывающие удельную величину ОЗэ-генерируюцей активности китоховдриальных препаратов равного происхождения.

Генерация в участке Ьс^ нормальных митохондрий может быть описана в рамках гипотезыQ -цикла, предложенной P.Mitcbeii (1976) и дополненной работами А.А.Константинова (1985). Наши данные по генерации Og дыхательной цепью митохондрий гепатом показывают, что,отличаясь более высокой удельной скоростью,этот процесо качественно такой же, как и в митохондриях из нормальных тканей.

Цитохимический метод, позволявший визуализировать генерации? Og мембранами. Генерация 0% мактюФагамя. Чувствительность имеющихся в настоящее время биохимических и биофизических методов позволяет регистрировать образование кислородных радикалов ■ только от значительного числа клеток или субклеточных структур.

Таблица 6

Скорость генерации дыхательной цепью митохондрий, изолированных из разных тканей, в присутствии сукцината и антимицина

Название препарата; диапазон измеренных Удельная скорость гене-концентраций белка ралли (нмоль/мин на

I мг белка)

СМЧ печени крысы (240-940 мкг/мл) 0,25+0,07

СМЧ сердца быка (40-320 мкг/мл) 2,5 +0,5

СМЧ гепатомы Зайделя (82-820 мкг/мл) 4,1 +1,2

СМЧ гепатомы 22а (45-940 мкг/мл) 5,7 ±0,6

Митохондрии гепатомы 22а (45-460 мкг/мл) 3,3 ±0,2

Мы поставили перед собой задачу разработать цитохимический метод с использованием электронной микроскопии, который позволил бы выявить образование конкретной клеткой или органеллой. В качестве модели мы выбрали активированные макрофаги мыши.

- Фагоцитоз, осуществляемый клетками крови, сопровождается генерацией 0J и ^С^, обусловленной активацией локализованной в плазмалемме НАД(Ф)Н-оксидазы ( Dewald et al., 1979). Лизис раковых клеток стимулированными макрофагами, как полагают, в значительной степени обусловлен кислородными радикалами ( Nathan, 1982).

Схема нашего метода такова: активированные макрофаги мыши инкубировали с дрожжевыми клетками, опсонизированными кроличьей антисывороткой в присутствии тетранитротетразолиевого синего (ТНТС), который восстанавливается 0£ о образованием электронно-плотного осадка. После инкубации клетки осаждали и подвергали обработке для последующего просмотра в электронном микроскопе (Збарский и др., 1984 ; Peakin et al., 1984).

На рис. 4 видно, что осадок формаэана образовался на границе между плазмалеммой и фагоцитируемой дрожжевой клеткой, причем образование преципитата произошло только в области прямого контакта между поверхностью макрофага и дрожжевой клетки; в местах, где контакт не произошел, осадок не выпал. Добавление 10 мМ цианида в среду инкубации не влияло на реакцию образования формаза-на, но уменьшало число фагоцитированных клеток. В модельных экспериментах ТНТС не восстанавливался при добавлении 10 мМ ¡у^, но в системе ксантин-ксантиноксидаза подвергался восстановлению, которое кнгибировалось СОД.

Л-

Рис. 4.

При фагоцитировании дрожжевой ¿слетки макрофагом образование злектронноплотного осадка фор-мазана (указано обычной стрелкой) видно только в местах прямого контакта между поверхностью макрофага (М0) и дрожжевой клетки (Сап). В участках, в которых контакт еще не произошел, осадок не выпал (указано "бесхвостой" стрелкой).

Увеличение 5 ООО.

Рис. 5. Макрофаги (М0) были инкубированы о опсонизированными дрожжевыми клетками (Сап), ТНТС и латекс-ными частицами (1). Вокруг фагоцитированных латеконых чаотиц отсутствует цитохимическая реакция, которая видна в месте контакта того же самого макрофага с дрожжевой клеткой.

Увеличение 18 500.

Дополнительное введение неопсонизированных латексных чаотиц в среду инкубации позволило наблюдать следующую ситуацию. Макрофаги интенсивно фагоцитировали латекс, но выпадения осадка формазана не было, хотя при контакте с дрожжевыми клетками тот же самый макрофаг давал интенсивную цитохимическую реакцию (рис. 5). Этот результат снимает возможное возражение, что образование запускается по всей поверхности макрофага, и формазан образуется, но затем отмывается и остается только в местах контактов. В противном случае при фагоцитировании одним и тем же макрофагом опсонизированной дрожжевой клетки и латексной частицы вокруг

последней преципитат тоже должен был бы образовываться, а этого в эксперименте нет (рис. 5).

Соответствующие контрольные эксперименты, проведенные в анаэробных условиях о последующей оксигенацией, позволили заключить, что восстановление ТНТС во время фагоцитоза обусловлено образующимися кислородными радикалами, но не прямым воостановле-. нием мембранной редокс-цепью.

Необычная энзиматическая редокс-активность мембран ядер опухолевых клеток

Характеристика необычной редокс-активности мембран ядер опухолевых клеток. При изучении генерации мембранами ядер ге-патомы 22а мы обнаружили, что она отличается от таковой в микросомах и ядерных мембранах печени двумя важныш свойствами. Во-первых, СОД-чувствительное окисление адреналина в адренохром происходит в присутствии не только НАДФН, но и НАДН (табл. 4, рис. 2).

Концентрации восстановленных нуклеотидов, при которых достигались полумаксимальные скорости окисления адреналина, составляли около 20 мкМ для НАДФН и около 10 мкМ для НАДН при окислении адреналина ядерными мембранами гепатомы 22а (рис. 6). Эти данные исключают возможность артефактов, связанных с: I) неспеидфичеоким окислением НАДН НАДФН-зависшЛой редокс-цепью, равно как и обратно случай; 2) примесью НАДФН в препарате НАДН.

г-

1 Рис. 6.

^ Зависимость скорости

* окисления адреналина в

адренохром ядерными мембранами гепатомы 22а от концентрации НАД(Ф)Н. Реакционная смесь содержала 0,15 М К-фосфатныи буфер, рН 8,5; 0,1 мМ ЭДТА; 0,5 мг белка ядерных мембран.

1 - НАДН-зависимое окисление

2 - НАДФН-зависимое окисление

■=о

100

{ИААШК

Второе важное отличие Оз-образукяцей активности ядерных мембран гепатомы обоувдается ниже.

Мы обнаружили, что, хотя НАД(Ф)Н-зависимое окисление адреналина ядерными мембранами гепатомы практически полностью подавляется СОД, последующее добавление ингибитора СОД цианида не снимает эффект СОД (рис. 2), несмотря на то, что в экспериментах о микросомами печени добавление после СОД цианида восстанавливало близкую к исходной скорость окисления адреналина в присутствии НАДФН (рис. 2). В контрольных экспериментах мы удостоверились, что прокипяченная СОД не тормозит НАД(Ф)Н-зависимое окисление адреналина ядерными мембранами гепатомы.

В последующих экспериментах выяснилось, что цианид сам по себе ингибирует и НАДН- и НАДФН-зависимое окисление адреналина ядерными мембранами гепатомы. Зависимость подавления СОД-зависи-мого окисления адреналина от концентрации ингибитора приведена на рис. 7. Можно видеть, что кривые ингибирования для обеих реакций практически совпадают; 50$-ное ингибирование достигается при 10 мКМ цианида, а полное - приблизительно при I мМ.

^ Рис. 7.

3 [//а//,], »И Ингибирование НАД(Ф)Н-

зависимого окисления адреналина ядерными мембранами гепатомы 22а цианидом и азидом.

О - НАДФН-зависимое окисление, концентрация мембран -50 мкг/мл;

Д-НАДН-зависимое окисление, концентрация мсмбсан -НО мкг/мл.

Открытые значки -действие цианида, заштрихованные значки -действие азида.

*

5

г §

§

8 и

т ,

Наш было также обнаружено, что НАД(Ф)Н-зависимое образование 0£ мембранами гепатомы подавляется азидом - 50$-ное ингибирование при 0,3 мМ азида (рис. 7). Контрольные опыты показали, что активность НАДН- и НАДФН-цитохром с редуктаз ядерных мембран гепа-

том, равно как и все исследованные нами редокс-активности мембран ядер и микросом печени, практически не ингибируются цианидом и азидом. Таким образом, чувствительность к цианиду и азиду является вторым специфическим отличием образования в ядерных мембранах гепатомы 22а от соответствующего НАДФН-зависимого процесса в микросомах и ядерных мембранах печени.

Ферментативная система, катализирующая НАД(Ф)Н-зависимое окисление адреналина в мембранах ядер гепатомы 22а, оказалась довольно лабильной; ее активность заметно снижается при хранении мембран. Падение активности на 5056 происходит при инкубации мембран при 37°С в течение 3 часов, такое же снижение активности при , хранении мембран при температуре тающего льда наблюдается через 14 часов. Прогревание на водяной бане при 60°С в течение I мин вызывает полную инактивацию.

С целью проверить, является ли обнаруженное нами в ядерных мембранах гепатомы 22а СОД-чувствительное ингибируемое цианидом НАД(Ф)Н-зависимое окисление адреналина эффектом, специфичным для этой опухоли, или же характерно и для других опухолевых клеток, мы исследовали ряд экспериментальных перевивных опухолей мышей и крыс, а также опухоли мозга человека.

Результаты измерений в препаратах из перевивных опухолей мышей и крыс представлены в табл. 7. Во всех исследованных случаях НАД(Ф)Н-зависимое окисление адреналина более чем на 90/6 подавлялось СОД, что свидетельствует о сопряжении его с образовать Ор. Приведенные величины показывают, что в присутствии НАД! образование микросомами нормальных и опухолевых клеток практически не выявляется. НАДФН-зависимое окисление адреналина микросомами нечувствительно к цианиду. По абсолютным значениям скорость образования в микросомах всех изученных опухолей ниже, чем в микросомах мозга, и существенно ниже по сравнению с микросомами печени. В то же время в ядерных мембранах из опухолей реакция протекает в присутствии как НАДФН, так и НАДН, причем в обоих случаях подавляется цианидом.

В табл. 8 представлены данные, полученные в совместных экспериментах с А.М.Тараховским на ядерных мембранах, выделенных из тканей опухолей мозга человека, полученных во время операций в Киевском НИИ нейрохирургии. Контрольными препаратами били участки мозга, прилежащие к опухоли , но не пораженные ею, резецированные во время операций, а также ткань мозга людей, погибших от черепнс-мозговой травмы. Из данных табл. 8 видно, что ядерные

Таблица 7

Образование 0?> ядерными мембранами и микросомами нормальных и опухолевых тканей (нмоль адренохрома за I мин на I мг белка препарата)

Наименование ткани Микросомы Ядерные меибраны

НАДФН- НАДН- НАДФН- НАДН-зависимая зависимая зависимая зависимая адреналин- адреналин- адреналин- адреналин-оксидаза оксидаза оксидаза оксидаза

Печень здоровых крыс 39,6+6,0 <1 4,0+1,0 <1

Печень здоровых мышей С5НБпа11 52,0+5,0 <1 9,0+2,0 < I

Печень здоровых мышей ВАЬВ/с 45,0+3,0 <1 7,0+1,0 <1

Мозг здоровых крыс Глиома 35 5,5+0,5 ■1,'7+0;1 <1 <1 1,б70,1 8,0+1,0 0,7+0,1 4,2+0,9

Глиома 223 2,3+0,1 <1 10,1+0,5 4,8+0,2

Эритромиелоз Швеца: солидная Форма асцатная форма 2,7+0,1 2,9+0,2 <1 <1 3,5+0,3 3,6+0,5 1,6+0,2 2,1+0,3

Лимфосаркома Плисса: солидная Форма асцитная форма 2,9+0,3 2,2+0,3 <1 <1 3,2+0,8 2,9+0,1 1,1+0,4 1,4+0,2

Гепатома Зайделя - - 5,3+1,2 3,3+1,2

Источником здоровых тканей и перевивных опухолей были белые беспородные крысы.

мембраны, выделенные из ткани большинства исследованных опухолей, обладали способностью катализировать окисление адреналина, которое ингиблровалось СОД как в присутствии НАДФН, так и в присутствии НАДН. Тэстирбвание препаратов на способность окислять адреналин в присутствии сукцината и антимицина А показало, что лишь в 4 случаях (см. табл. 8) НАДН-зависимое окисление адреналина ядерными мембранами опухолей могло быть обусловлено примесью митохондрий. Во всех случаях НАД(Ф)Н-зависимое окисление адреналина ингибировалось цианидом.

В отличие от ядерных мембран большинства исследованных опухолей мозга ядерные мембраны, выделенные из нормального мозга человека, не обладали способностью окислять адреналин ни в присутствии НАДФН, ни НАДН. Необходимо отметить, что в ряде случаев ядерные мембраны из опухолей также не окисляли адреналин в адре-

Таблица 8

Образование ядерными мембранами, выделенными из ткани мозга и опухолей мозга человека (нмоль адренохрома за I мин на I мг белка препарата)

Л наблюдения Ткань +ШЙФН +КАДН +Сукцинат

+Антими-цин А

1-П степень

злокачественности

I астроцитома 18 3 <1

2 астроцитома 9 <1 <1

3 астроцитома 19 2,5 2

4 невринома <1 <1

5 эпиндиома 10 сI

6 аденома гипофиза <1 3 4

7 менингиома 4 7 3

8 менингиома 12 5 4

Ш-1У степень

злокачественности

9 астроцитома анаплас- 21 16 <1

тическая

10 астроцитома анаплас- 9 4 <1

тическая

II астроцитома анаплао- 14 12 <1

тическая

12 астроцитома ананлас- 20 ' 14 <1

тическая

13 глиобластома 5 с! <1

14 глиобластома <Т ^Г <1

15 глиосаркома 8 2 <1

16 медуллобластома <1 <1 <1

17 саркома полиморфно- 75 20 <1

клеточная

1,4,9,12,16,17 Нормальная мозговая <1 <1

ткань *

Нормальная мозговая <1 <1 <1

ткань **

Степень злокачественности определена по номенклатуре ВОЗ (Авцын и др., 1981), « - мозговая ткань, прилежащая к опухоли, но не пораженная ею (указан порядковый номер соответствующего наблюдения), »• - ткань мозга людей, погибших от черепно-мозговой травмы (3 случая).

нохром (глиобластома, невринома, медуллобластома, аденома гнпофи-за). Обращает на себя внимание факт различий показателей скорости НАД(Ф)Н-эависимого образования в пределах группы опухолей сходного гистогенеза, что свидетельствует о метаболической гетерогенности опухолей мозга человека.

Полученные данные свидетельствуют, что обнаруженные нами в

мембранах ядер гепатомы 22а особенности - способность окислять адреналин в адренохром щганядчувствительным образом в присутствии как НАДФН, так и НАДН - присущи клеткам и других перевивных опухолей, а также злокачественных опухолей мозга человека. Представляет интерес изучение связи меаду степенью злокачественности опухоли и наличием указанных выше свойств ядерных мембран. Сопоставление скорости окисления адреналина, катализируемое ядерными мембранами опухолей мозга человека в присутствии НАД(Ф)Н и инги-бируемое СОД, со степенью их злокачественности, определенной по. номенклатуре ВОЗ (Авцьш и др., 1981), позволяет предположить наличие прямой зависимости меаду этими показателями.

Желая более подробно охарактеризовать особенности НАД(Ф)Н-зависимой редокс-цепи, связанной с ядерной мембраной опухолевых клеток, мы исследовали потребление кислорода ядерными мембранами гепатомы 22а. Типичные полярографические записи приведены на рис. 8. Оказалось, что в отсутствие адреналина скорость восстановления кислорода, наблюдаемая при добавлений НАДФН либо НАДН к ядерным мембранам гепатомы ( 4 4 нмоль 02/мин'мг белка), мала по сравнению с адреналиноксидазной активностью, регистрируемой спектрофотометрически в описанных выше экспериментах. В отсутствие НАД(Ф)Н адреналин сам по себе также не вызывал поглощения кислорода с заметной скоростью (рис. 8, кривая 3). В то же время добавление адреналина после НАДФН или НАДН (либо НАД(Ф)Н после адреналина) приводило к резкой активации потребления кислорода, которая почти полностью снималась как цианцдом, так и СОД (рис. 8). Такое стлмулирупцее действие адреналина на потребление кислорода сильно уменьшалось при уменьшении рН и практически отсутствовало при рН 6,5-7,0. Аналогичная зависимость от рН характеризует скорость НАДФН-зависимого образования адренохрома (Аш^ вt *1»»1972) и ядерными мембранами гепатомы 22а (наши собственные наблюдения), что можно связать с процессом ионизации адреналина (Вога вt аХ., 1978).

Таким образом, в ядерных мембранах гепатомы выявляется отчетливая овязь между измеряемым спектрофотометрически НАД(Ф)Н-завйсимым окислением'адреналина в адренохром: обе реакции идут при щелочных, но не кислых значениях рН, в обоих случаях в присутствии НАДФН скорость реакций приблизительно вдвое больше, чем в присутствии НАДН.

Результаты экспериментов с микросомами из печени крысы показали, как можно видеть из рио. 9, что при добавлении к мембра-

Рис. 8. Поглощение кислорода ядерными мембранами гепатомы 22а.

Среда: 0,15 М К-фосфатный буфер, рН 8,5: 0,1 мМ ЭДТА. Концентрация белка мембран 0,41 мг/мл. Добавки: НАДФН -0,4 мМ; НАЦН - 0,2 мМ; адреналин - 0,5 мМ; СОД -Ю мкг/мл; цианид - 2 мМ.

нам НАДФН в отсутствие адреналина не наблюдается значительного потребления кислорода (и, следовательно, образования 0|). Последующее добавление адреналина, как и в случае ядерных мембран гепатомы, вызывает резкую стимуляцию поглощения кислорода, которая снимается СОД (рис. 9, кривая 2), но нечувствительна к цианиду (рис. 9, кривая I). Е.ли в качестве донора электронов вместо НАДФН брали НАДН, то, как можно видеть, адреналин не вызывал стимуляции поглощения кислорода (рис. 9, кривая 2). Реакция харатсте-ризуется насыщением, достигая полумаксимальной скорости (26 нмоль/ мин/мг белка) при концентрации адреналина 60 мкМ. Как и в случае ядерных мембран гепатомы, вызываемая адреналином стимуляция поглощения кислорода резко падает при уменьшении рН и практически исчезает при рН 6,5.

Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что и в ядерных мембранах гепатомы, .. з микросомах печени НАД(Ф)Н-зависи-мое окисление адреналина коррелирует, по крайней мере качественно, с активацией поглощения кислорода, вызываемого адреналином. Оба процесса характеризуются сходной субстратной специфичностью и чувствительностью к ингибиторам. Скорости обеих реакций также

Адреналин

Л

НШИ

НААМ/Щрешин НААФН _*_|

Рис. 9.

Поглощение кислорода микросомами печени крысы.

Концентрация белка мембран 0,25 мг/мл.

Среда: 0.15 М К-фосфатный б|||р, рН 8,5; 0,1 мМ

Добавки: НАДФН - 0,4 мМ, НАДН - 0,2 мМ, адреналин -0,5 мМ, СОД - 10 м кг Алл, цианид - 2 мМ

достаточно близки. Можно заключить, что обнаруживаемое с помощью адреналина образование 0£ микросомами печени и ядерными мембранами гепатомы не является количественным тестом.

Каков бы ни был механизм ингибируемой СОД НАД(Ф)Н-зависимой адреналиноксвдазной активности, приведенные результаты подтверждают' присутствие в ядерных мембранах опухолевых клеток необычной чувствительной к цианиду и азиду редокс-цепи, способной функционировать в присутствии не только НАДФН, но и НАДН.

Гипотеза о связи обнаруженной необычной редокс-цепи мембран р.пеп опухолевых клоток с десатуразной системой. Обнаруженная нами в ядерных мембранах опухолевых клеток адреналиноксидазная активность по своим свойствам очедь напоминает систему десатурации жирных кислот, присутствующую в микросомах животных тканей (Арча-ков, 1975), дрожжей ( Татига еЪ аХ., 1976) И бактерий ( Уи1с9, 1974). Принято считать, что в микросомной ацил^КоА десатуразе цитохром Ь^, получающий электроны от НАДН- либо НАДФН-специфичной детадрогеназ, восстанавливает терминальную десатуразу, называемую также ". ".шгадчувствительным фактором" (ЦЧФ), которая и осуществляет ак'.ивацто молекулярного кислорода (Арчаков, 1975; шилег ег а1., 1974). Следует отметить, что кагасс-либо данных об электронтранспортной активности терминальной десатуразы и о взаимодействии ее с цианидом не имеется. В составе отого лилопротеи-да не обнаружено г.ростетичеокой группы, для которой было бы характерно взг—модойствие с молекулярным кислородом.

В ядерша мембранах гепатомы 22а мы обнаружили присутствие гдтохрома типа ь^ с максимумами поглощения при 420 и 558 нм, удл-.ыюе содержание которого довольно высоко: 0,1 нмоль/мг белка. Игу.:;! б!:.*. определен потенкиал полувосстановлснпл этого гемопротеи-дн, гс.-.илп'.нп которого мВ не противоречит ссотвотству;;:;:пл

значениям, известным для семейства вдтохромов b^ ( Bertrand et al., 1982).

Мы выдвинули гипотезу ( Реskin et al., 1980), что структура цитохрома Ъ^ может подвергаться in sita модификации за счет взаимодействия с партнерами по соответствующей энзиматической активности. Так, терминальная десатураза может служить аллостери-ческим регулятором цитохрома ь^ , сообщающим этому гемопротеиду чувствительную к цианиду аутооксидабелъностъ,•например, облегчая переход низкоспиковой конформации в высокоспиновую. OJ, образующийся при окислении Ъ^ молекулярным кислородом,'может быть использован на месте терминальной десатуразой для образования двойной связи в молекуле связанного с десатуразой ацил^ КоА. Использование Og, образовавшегося на Ъ^ , кажется более вероятным, чем активация кислорода ЦЧФ. При нарушении строгой координации между собственно десатуразной и активирующей самоокисление Ъ^ функциями "цианидчувствительного фактора" может происходить утечка Og, как это наблюдается в ядерных мембранах гепатомы.

Хорошо известно, что опухолевые клетки резистентны к индукции в них перекисного окисления липидов (ПОЛ) (Пальмина и Бурла-кова, 1985). Существуют разные точки зрения на причины, обусловливающие это явление. Однако достоверно известно, что устойчивость микросом и митохондрий, выделенных из опухолевых клеток,к ПОЛ коррелирует с уменьшением относительного содержания полиено-вых жирных кислот и уменьшением ненасыщенности жирных кислот мембран опухолевых клеток (Utsuai et al., 1965; Beits et al., 1977; Bartoli et al., 1980), что в свою очередь приводит к большей "жесткости" мембран (Бурлакова и Хохлов, 1985; Bartoli et al., 1980; Galeotti et al., 1980).

Таким образом,вполне вероятно, что опухолевая метка "предпочитает" допускать утечку 0£ в участке ЦЧФ, чем образовывать ненасыщенные жирные кислоты, которые легко могут подвергаться пере-кисному окислению, в мембране ядер, т.е. в непосредственной близости от генетического аппарата. Исходя из имеющихся сведений,

кажется для опухолевой клетки менее опасным, чем гидроперекись липида. Хотя опухоли бедны СОД (Пескин и др., 1976; Oberley and

Buettner, 1979), тем не менее способность опухолевых клеток обогащаться антиоксидантами за счет тканей хозяина (Буробина и Ней-фах, 1970; Тарусов, 1976), может обеспечивать в какой-то стопеш! защиту от 0£. Кроме того, опухолевая клетка в большей степени, чем нормальная, обезопасена от прогекания реакции Хабер-Вайса,

т.к. вероятность появления в ней свободных ионов железа меньше. В клетках гепатомы ЗВ, например, содержится в 250 (!) раз больше ферритина, чем в печени (Banalster et al., 1986). Появление же гидроперекиси липидов может оказаться летальным, т.к. опухоли бедны глутатионпероксидазной активностью ( Peeltin et al., 1977; Roesi et al., 1983; Corrocher et al., 1986), а гидроперекиси вызывают разрывы в ДНК (Inouye, 1984) даже будучи добавленными к целым клеткам ( ОсМ. and Ceruttl, 1987).

Образование радикалов антвациклиновых антибиотиков мембранами нормальных и опухолевых клеток. Антрациклиновые антибиотики -наиболее известным среди них является адриамицин - широко применяются в противоопухолевой терапии. Эти хинон-содержание молекулы подвергаются одноэлектронному восстановлению в соответствующий семихинон, катализируемому мембранами различного происхождения. Обнаружив необычную редокс-акгивность, окисляющую адреналин, который по своей структуре является производным ортогидрохинона, в ядерных мембранах опухолей, мы решили исследовать ее редокс-взаимодействие с антрациюшновыми антибиотиками, имеющими в своей структуре парахинон - адриамицином и карминомицином.

При анаэробной инкубации адриамицина и карминомицш а о ядрами, окислявдими ШЛ(Ф)Н, мы наблвдали характерные спектры ЭПР семихинонов антибиотиков, которые приведены на рис. 10. Можно видеть, что в случае карминомицина величина сигнала ЭПР, отражающего образование радикала антибиотика, примерно в 40 раз больше по сравнению с адриамицином. Чтобы проверить, связано ли различив в образовании семихинона антибиотиков с особенностью мембран ядер или же со структурой самих антибиотиков, мы провели эксперименты в разных редокс-системах, результаты которых приведены в табл.9. Можно г -теть, что величина образования семихинона карминомицина значител но выше, чем адриамицина во всех исследованных случаях. Вероятно, семихинон карминомицина более стабилен, чем семихинон адриамицина. Причиной этого может быть присутствие свободной 0Н-группы в положении С-4 молекулы карминомицина, которая может стабилизировать свободный радикал, образуя водородные связи с кислородо", содержащим неспарешшй электрон, в редокс-активном хннонном кольце антибиотика. У адриамицина ОН-группа в положении С-4 замещена, что исключает такого рода стабилизацию свободного

радикала.

Возможность регистрировать сильный сигнал се>яганюна делает кдрмтюмппш значительно более удобным с течки зрения изучения

Рис. 10. Спектры ЭПР свободных радикалов карминомицина (а) и ад-риамицина (б), генерируемкх при инкубации антибиотиков о ядрами гепатомы 22а в анаэробных условиях в присутствии НЛДФН. Реакционная смесь содержала 0,2 М К-фюсфатный буфер, рН 7,0, I мМ антибиотика и ядра (0,12 мг белка/мл). Смесь продували аргоном или гелием. После добавления 5 мМ НАДФН образец переносили в закрывающуюся плоскую кварцевую кювету для ЭПР спектроскопии. Спектры были записаны через 30 мин (а) и 60 мин (б), при достижении стационарного уровня на приборе Varían Е-109Е при следующих условиях: частота модуляции - 100 кГц, амплитуда модуляции - 5 Гс, микроволновая мощность - 12,5 мВт, скорость сканирования - 20 Гс/мин, постоянная времени - 0,064 сек, температура - ЗООС. Усиление для (б) в 25 раз больше, чем для (а).

образования свободного радикала антрацикляновых антибиотиков ре-докс-цепями мембран по сравнению с адриамицином.-

В табл. 10 собраны данные по соотношению максимальной величины сигнала радикала карминомицина при окислении НАДН и НАДФН р едоке-цеп яш мембран различного происхождения. В случае ядер из гепатомы, в присутствии НАДФН наблюдается практически такая же генерация радикала антибиотика, что и в присутствии НАДН. В мембранах нормальных клеток (ядер и микросом печени крысы, плазматической мембране эритроцитов ч ловека) образование семихинона карминомицина происходит примерно в 4 раза активнее при окислении НАДФН по сравнению с НАДН.

Таким образом, окисление адреналина в адренохром и восстановление антрациклиновых антибиотиков в семихинонную форму мемб-

Таблица 9

Соотношение величин образования радикалов карминомицина и адриа-мицина при анаэробном энзиматичеоком восстановлении

Редоко-система (Семихинон карминомишпц]

[Семихинон адриамиодна]

Ядра печени крыс + НАДФН 20

Микросомы печени крысы + НАДФН 19

Ядра гепатомы 22а + НАДФН 44

Ксантиноксидаза + ксантин 50

Условия измерений см. в подписи к рис. 10

Таблица 10

Зависимость генерации радикала карминомицина редокс-цепями мембран различного происхождения от донора электронов

Препарат Соотношение максимальных величин НАДН- и НАДФН-зависимого образования оемихинона карминомицина, %

Микросомы печени крысы 25

Ядра печени крысы 25

Мембраны эритроцитов человека 23

Ядра гепатомы 22а 80

Условия измерений см. в подписи к рис. 10. Концентрация НАДН -5 мМ.

ранами ядер гепатомы характеризуется сходной зависимостью от доноров электронов, что не наблюдается в мембранах нормальных клеток.

Повреждение ДНК кислородными радикалами

т

Образование 0£ может вызывать появление однонитевых разрывов в ДНК, причиной которых, как полагают, является гидроксиль-ный радикал, образующийся в катализируемой ионами железа реакции Хабер-Вйл.са ( Ьевко еЪ а1., 1980), Логично было бы использовать образование однонитевых разрывов в ДНК как тест на генерацию 0^.

0%-заиисимая релаксация кольцевой суперспирализованной При инкубации ДНК рВй 322 в ксантин-ксантиноксидазной системе уменьшается процент суперспирализованной (¡орми и увеличивается содержание открытой кольцевой . Добавление в среду инку-

бации СОД предотвращает этот переход (рис. II).

Рис. II.

Предохранение ДНК плазмиды рВИ 322 супероксиддисмутаэой от однонитевых разрывов, индуцированных О^.

ДИК инкубировали в среде, содержащей 0,15 М К-фосфатный буфер, рН 8,5, 0,1 мМ ЭДТА.

Добавки: ксантин - 0,1 мМ,

ксантиноксидаза - I мг/мл, СОД - 5 мкг/мл. Инкубацию останавливали добавлением додецилсульфата натрия до конечной концентрации 2>.

Электрофорез проб проводили в 1% агарозном геле.

1 - ДНК рВЛ 322

2 - ДНК рВй 322 + ксантин + ксантин-

оксидаза

3 - ДНК рВК 322 + СОД + ксантин +

+ ксантиноксидаза

Такого рода результат показывает принципиальную возможность использовать переход суперспирализоБанной формы кольцевой ДНК в релаксированную как метод регистрации генерации кислородных радикалов мембранами. Однако инкубация микрооом печени крысы с супер-спиралиэованной кольцевой ДНК приводила к появлению релаксирован-ной форми и в отсутствие доноров электронов. Добавление в среду 5 мМ ЭДТА не предотвращало релаксацию ДОК, что делает маловероятным участие обычной нуклеаэной активности. Потеря мембранами структурной целостности (добавление в среду Тритона Х-ЮО) также не предотвращало наблюдаемый переход. Возможным объяснением явления может быть присутствие в препарате мембран топоиэомеразнои активности. При выделении внутриклеточных мембран практически невозможно предотвратить их взаимную контаминацию. В клетках же печени обнаружена высокая топоизомераэная активность, ассоциированная с нерастворимой частью ядер ( NlebJ.ze.wa е-Ь ей., 1984). Таким образом, релаксация кольцевой ДОК как метод регистрации образования 0£ мембранами не может быть использован, по крайней мере в случае мембран клеток печени, из-за присутствия высокой релаксирующей активности, не связанной с генерацией 03>.

Оо-зависимые разрывы в ядерной ДНК при функционировании ре-докс-цепи мембран ядер. Если в результате работы мембранной редокс-цепи ядер обрадуется 0|, вызывающий появление однонитевых разрывов

в ядерной ДНК, то выявление такого рода разрывов могло бы быть тестом на генерацию Исходя из этого логического построения, окисление НАД® электронтранспсртной цепью мембран изолированных ядер должно приводить к стимуляции ДНК-полимеразной активности, что выразится в увеличении радиоактивности кислотонерастворимого материала при добавлении в среду инкубации радиоактивных дезокси-нуклеозидтрифосфатов.

Однако наши попытки зарегистрировать повышение он.догенной ДНК-полимеразной активности в изолированных ядрах клеток печени после инкубации с НАД'Ш потерпели неудачу: наряду с экспериментами, в которых наблюдалось до 30% повышения активности, были такие, где активность не изменялась или понижалась на 20%. В принципе, такого рода результат не удивителен, т.к. наряду с образованием разрывов в ДНК, кислородные радикалы могут ингибировать ферменты, участвующие в репарации. В пользу этого рассуждения свидетельствуют данные об ингибировании ДНК-полимераэ при окислении НАДФН микросомами или ядерными мембранами из печени крыс, которым вну-трибрюшикно вводили бензпирен ( ваХагаг et а1., 1995)•

Другого рода экспериментальный подход, оказавшийся результативным, состоял в использовании экзогенной ДНК-полимеразы из термофильной бактерии В.в-Ьеаго^огторЬИиа ( Реак1п апс! БЫуа-Ьоуа1986) (фермент был нам любезно предоставлен О.К.Кабоевым, ЛИШг). Кратко схема эксперимента: ядра инкубировали с НАДФН, после этого инактивировали эндогенную ДНК-полимеразную активность и О^-генерир.ующую систему мембран прогреванием при 65°С и добавляли экзогенную Д1К-полимеразу и радиоактивные дезоксинуклеозидтрифос-фаты. Перед добавлением ДЖ-полимеразы (после гсрогреиа) добавляли каталазу для элиминации Н2О2. Результаты типичного эксперимента предста -:ены в табл. II. Видно, что без добавления католазы увеличения ечнтеэа ДНК не было. Более того, в присутстъии I мМ НАДФН рациоакт.лчюсть ДНК была меньше. Добавлише каталаэы после остановки генерации перед добавлением полимеразы приводит к увеличению пключения радиоактивности в ДНК (табл. II). Объяснением эффекта каталаэы может быть накопление в РезУльтате спонтанной дисмутаци!' оказывающей подавляющее действие на ДНК-полимеразу. Результата контрольного эксперимента по действию Н2О0 на Д|{К-полимеразную активность представлены в табл. 12. Незначительное •.'.»гигнроилнне ДНК-полнмераэк термофильной бактерии может объяс-тем, что >та полиморязп нечувствительна к действию сульф-чГ'и."!-'!-. ч '«дек 1 КаЬову et а!., ТРй!). Иэнестно, что суль!гид-

Таблица II

Включение радиоактивных предшественников в ДНК по местам однони-тевых разрывов при инкубации ядер с НАД®

Добавки к основной среде Импульсы/мин * "

406 (100%)

+ 0,1 мМ НАДФН 417 (103%)

+ 1,0 мМ НАДФН 318 ( 78%)

+ 0,1 мМ НАДФН + каталаза* 502 (124%)

+ 1,0 мМ НАДФН + каталаза* 611 (150%)

Ядра инкубировали в 100 мкл среды, содержащей 20 мМ трис-HCI, рН 8,0, 20 мМ хлористый магний, 150 мМ хлористый калий, 0,01% альбумин, при 30°С в течение 30 мин. Затем пробы прогревали 10 мин при 65оС и охлаждали. Добавляли дАТЗ, сГТЗ, дДТФ, ТЙ до конечной концентрации каждого дезоксинуклеотидфосфат'а 50 мкМ, ' H ТТФ (22х10э Кю/моль) до конечной концентрации I мкМ. Затем добавляли I ед. активности ДНК-полимеразы В. etearothermophilus и инкубировали пробы при 60°С в течение 30 мин. Реакцию останавливали добавлением 5 мл холодной 5% трихлоруксусной кислоты и переносили содержимое проб на фильтры из стекловолокна марки GF/8

• - катал аза (25 мкг/мл) была добавлена к прогреть« пробам перед ДНК-полимеразой.

•• - за вычетом неспецифического включения радиоактивности в ДНК в отсутствие добавленной ДНК-полимеразы (127 имп./мин). В пробах содержалось 1хЮь ядер.

рильные хруппы реагируют с кислородными радикалами ( Weber and Siée, 1903 ),поэтому полимераэы, чувствительные к сульфгидрильным реагентам должны быть подвержены ингибированию активными формами кислорода в большей степени. Представленные в табл. 12 данные показывают существенно более сильное ингибирование HgOg чувствительной к сульфгидрильным ядам ДНК-полимеразы вируса тутового шелкопряда (фермент был любезно предоставлен В.С.Михайловым, МЕР АН СССР).

В табл. 13 приведены результаты, доказывающие, что образование однонитевых разрывов в ядерной ДНК при окислении НАДВД связано с генерацией активных форм кислорода. Добавление одновременно с НАДОН каталазы и СОД, равно пак и создание анаэробных условий (глюкоза+глюкозоксидаза), предотвращало НАДОН-зависимое увеличение включения радиоактивности в ядерную ДНК в присутствии экзогенной ДКК-полимераэы.

Таблица 12

Ингибирование активности ДНК-полимераз Е^

Импульсы/мин*

ДНК-полимераза B.etearotherniophilufl

-н2о2 2085 (100$)

+100 мкМ Н202 1937 ( 85$)

ДНК-полимераза вируса ядерного

полиэдроза тутового шелкопряда

-н2о2 830 (100$)

+ 10 мкМ Н202 726 ( 84$)

+100 мкМ Н202 382 ( 33$)

ДНК-полимерази инкубировали с Н^ и без нее при 30°С в течение

30 глин и затем добавляли каталазу (10 мкг/мл), активированную ДНК и смесь холодных и радиоактивных дезоксинуклоотидтрифосфатов и инкубировали 30 мин при оптимальных для ферментов температурах 60°С и Зу °С. Далее делали как указано в подписи к табл. II.

• - за вычетом неспецифического включения радиоактивности: 167 и 164 имп/мин соответственно.

Таблица 13

Появление сднонитевых разрывов в ядерной ДНК под действием активных форм кислорода, генерируемых при окислении НАДФН ядрами

Условия эксперимента Радиоактивность ядерной ДНК

Контроль 100$

+ НАДФН + каталаза* 132$

+ СОД + каталаза + НАДФН 102%

+ анаэробиоз + НАДФН + каталаза* 102$

Условш "ля контрольных препаратов см. в подписи к табл. II. Добавки. ¡'ЛДФН - I мМ, СОД - 50 мкг/мл, каталаза - 25 мкг/мл. Анаэроба- з создавался внесением в пробы 5 мМ глюкозы и 0.5 ед. активности на I мл среды глюкозоксидазы (фирма "Берингер категория I)

* - каталаза била добавлена к прогретым образцам перед ДНК-полимеразой.

На пис. 12 представлена электрофореграмма ядерной ДНК после инкубации ядер с НАДФН. Добавление к ядрам, окисляющим НАДФН, комплекса ЭДТА-Ке^* приводило к исчезновению высокомолекулярной .и появлению шюкомолекулярной ДНК. Добавление ЭДТА-Р»^+ без НАДФН но гр'.водило к повреждению ДНК. Сравнение ыезду собой 1-ой и 2-оИ до^с'.ек (лдрп, ншз'бированшге без каких-либо добавок, и я;;ра, к»:.-;;- с }Ц,\П1) не позволяет обнаружить шили гили-

мых различий. Этот результат соответствует данным литературы об отсутствии НАДФН-зависимого образования однонитевых разрывов в ДНК ядер, полученным с применением метода щелочной элюцки на фильтрах (Shires, 1982). Вероятно, число однонитевых разрывов (щело-челабильных участков), образующихся в присутствии только НАДФЖ, слишком мало, чтобы их можно было обнаружить методами, основанными на щелочной обработке, но они могут быть обнаружены при применении ДНК-полимеразы (см. табл. II и 13).

Добавление СОД в среду инкубации к ядрам, окисляющим НАДФН в присутствии комплекса ЭДТА-Р<г + не предотвращало повреждение ДНК (рис. 12, дорожка 8). В значительной степени защита осуществлялась каталазой (рис. 12, дорожка 7) и в некоторой степени ман-нитом (рис. 12, дорожка 10). Отсутствие защитного эффекта СОД и защитное действие каталазы в наших экспериментах говорят о том, что в наблюдаемом в наших экспериментах повреждении ДНК нруциаль-ную роль играет процесс восстановления H^Og железом в комплексе о ЭДТА, которое перед этим было восстановлено редокс-цепью мембран ядер.

Было изучено также действие свободных ионов железа и его комплексов с рядом хелаторов в сроде без ЭДТА и ЭГТА. Как можно видеть из рис. 13 действие ЭДТА-и ДТПА- в присутствии НАД® сходным образом индуцировали повреждение ядерной ДНК. Добавление комплекса десферон- и без хелаторов даже в присутствии НАДФН не приводило к появлению видимых повреждений в ДНК (рис. 13, дорожка 3 и 6), что указывает на то, что в данных случаях не происходит прямого восстановления железа редокс-цепью.

Добавление в среду инкубации гидроперекиси кумола приводило к появлению повреждений ДНК, интенсивность которых зависела от концентрации гидроперекиси и резко усиливалась в присутствии НАДФН.

Замена в наших экспериментах КАДФН на НАДН не меняло качественно результатов; наблюдалось несколько более интенсивное повреждение ДНК. Небольшим отличием являлось немного более слабая защита, обеспечиваемая каталазой.

Таким образом, можно представить следующую картину возникновения повреждений в ДНК при функцимшровании редокс-цепой мембран ядер. При окислении НАДФН образуется который либо сам способен в малой степени повреждать ДНК, либо делает это в результате реакции с ионами двухвалентного железа, адсорбированного на ДНК (реакция образования *0Н). Если в среде присутствует в комплексе с хелатором, в котором оно может восстанавливаться ре-

доко-цепью, то далее железо может окиолятьоя Н202, получающейся в результате спонтанной дисмутации Og (эта реакция о довольно высокой скоростью может протекать и в отсутствие катализаторов) (Bieiekl and Allen, 1977). Образующийся при атом 'ОН может по-врездать ДНК, а также расходоваться в реакции ПОД, продукты которой вносят свой вклад в повреждение ДНК. Меньшая отепень защиты, обеспечиваемая каталазой, в присутствии НАДН по сравнению с НАДФН, вероятно, может быть связана о более интенсивным процессом ПОЛ.

10 11

ездит

Щ

"'ЭД i

23130

- 4 341 -~2 ооо

' iiW'tiivABtX'

Рис. 12.

Электрофорез ядерной ДНК в 0,5% агарозе в щелочных условиях

с

2x10 ядер инкубивовали в 100 мкл основной среды, содержащей 150 мМ ДО^РОл, рН7,4, 5 мМ ЭДТА, I мМ ЭГТА, при 30°С в течение 30 мин. Затем к пробам добавляли 5 мкл 20% раствора додецилсуль-фата натрия и 105 мкл 100 мМ ИаОН с 2 мМ ЭДТА. Электрофорез проб проводили в 0,5/Ь агарозе в денатурирующих условиях, как описано в разделе "Материалы и методы .

Доподг -адьные компоненты, содержавшиеся в пробах:

1 - коычоль

2 - +1 гЛ НАДФН -

3 - +250 ЭДТА- Ге}*

4 - +. мМ НАДФН + 250 мкМ ЭДТА-

б - +1 мМ НАДФН + 250 мкМ ДТПА ~у«3+ ,

6 - +1 мМ НАДФН + 250 мкМ Десферои- 1-е3*

7 - +1 мМ НАДФН + 250 мкМ ЭДТА- + 25 мкг/мл каталазы

8 - +1 V" НАДФН + 250 мкМ ЭДТА-

9 - +1 мМ НАДФН + 250 мкМ ЭДТА-Ув3+

+ 50 мкг/мл СОД

10 - +1 мМ НАДФН + 250 мкМ ЭДТА-

+ 50 мкг/мл СОД + 25 мкг/мл каталазы +

100 мМ маниит

II - маркер М1кв»«;'г''ш $ирмы "Фармация" (смесь ДНК фага А ,

обработанной рестриктазой Н1паШ, ж ДНК фага 0-174, обработанной рестряктазой Нав Ш), Указаны размеры фрагментов (число вар оснований).

Pao. 13. Электрофорез ядерной ДНК в 0,5% агарозе в денатурирующих условиях.

Ядра инкубировали в 100 мкл среда, содержащей 150 мМ KHgPO^ рН

7,4, при 30°С в течение 30 мин. Дальнейшая процедура описана в подписи к рис. 32. i 1+

I - ядра; 2 - ядра+I мМ НАДФН; 3 - ядра+250 мкМ Уег +1 мМ НАДФН: 4 - ядра+250 мкМЭДТА- Pe5+ +1 мМ НАДФН; 5 - ядра+250 мкМ ДТПА- FeV

+1 мМ НАДФН; 6 - ядра+250 мЖДесферон-ТеЗ+ +1 Л! ВДФН: 7 - маркер (характеристика маркера описана в подписи к рис. 12).

Действие СОД на транспорт ШК из изолированных ядер

Нами было обнаружено, что добавление возрастающих концентраций СОД тормозит выход РНК из изолированных ядер (рис. 14). Контрольные эксперименты no-язали, что эффект СОД не связан о деградацией РНК. Было показано, что в присутствии СОД основная мао-оа выходящей из ядер ШК седиментирует в градиенте концентрации оахарозы медленнее, чем при инкубации в отсутствие СОД (рис. 15).

Цианид полностью снимает тормозящее действие СОД на выход РНК, вместе о тем, прогревание препарата СОД в течение 30 мин на кипящей водяной бане лшь на 30-40% снижало его способность тормозить выход РНК (рис: 14). Контрольные эксперименты показали, что действие инактивированной <Х)Д не связано с неспецифическим действием белка, т.к. добавление в инкубационную среду других белков: каталаза в концентрации до 300 мкг/мл или бычьего сывороточного альбумина в концентрации 5 мг/ыл, - не оказывало влияния на освобождение ШК из ядер.

за

Рис. 14.

Влияние оупероксиддиомутазы (СОД) на выход новообразованной РНК из изолированных ядер.

Ядра, изолированные Из печени крыо через 40 мин после внутрибрюшинного введения 14С-оротовой кислоты, инкубировали при 30° в среде, содержащей: 2 мМ АТФ, 5 мМ креатинфоо-фат, I ед. креатинкиназы, 5 мм и$Асг, 50 мм К31, 0,4 М сахарозу,

10 мМ трио-НС1, рН 7,6. После 15 мин инкубации ядра оседали центрифугированием. В осадке и надосадоч-ной жидкости определяли количество киолотонераотворимой метки (сумма соответствовала содержанию ее в ядрах до инкубации). Выход РНК из ядер в этих условиях составлял около 7/5.

т - выход РНК в присутствии различных концентраций СОД. СОД добавляли непосредственно перед инкубацией.

2 - выход РНК в присутствии СОД и 5 мм кем

3 - выход ГНК в присутствии СОД, инактивированной кипячением

Представлены результаты типичного опыта

Рио. 15.

Влияние супероксиддисмутазы (СОД) на седиментационный проешь освобождающейся из ядер РНК.

Условия инкубации изолированных ядер указаны в подпиои к рио. 14.

1 - контроль (инкубация в отсут-

ствие СОД)

2 - инкубащш в приоутотвии СОД

(20 мкг/мл)

Предотакпены результаты типичного опыта

Наше геикции

Д"льг:>эйшие исследования показали, что природа ингибирую-щего дейотвия СОД на выход РНК обусловлена простетической группой. Оказалось, что добавление сернокислой меди, либо комплекса медь-тирозин вызывало торможение выхода РНК, которое полностью предотвра1 лось цианидом. Седиментационный анализ показал, что, как и в случае с СОД, торможение выхода РНК в этих случаях связано в первую очередь о выоокополимерными РНК. Следует отметить, что дойстпущие концентрации этих низкомолекуляршхх соединений (в пересчете на содержание меди) на порядок превышают концентрации меди, дооав.глемой в инкубационную среду в составе СОД.

Сравнительно низкая эффективность свободной меди и комплекса

меди о тирозином может быть обусловлена связыванием ее белками ядер, поскольку известно, что многие болкн и полипептиды прочно овлзывают медь ( ?*4оговак at al., 1977; Iyer at al.» 1978). Действительно, мы обнаружили, что при добавлении в инкубационную смесь сывороточного альбумина (5 мг/мл) ингибируиадй эффект меди либо комплекса меди о тирозином полностью предотвращался. В то же время, альбумин не оказывал влияния на аффект СОД. По всей видимости, особенность связывания меди в активном центре фермента такова, что не лишает ее способности угнетать выход РНК из ядра и вместе о тем защищает от взаимодействия о другими белками и прочими высокомолекулярными комплекоонами, которое может приводить, как в случае о альбумином, х потере ингибирувдей активности.

Хорошо нэвеотна опоообность меди катализировать многочисленные реакции окиоления, протекающие при участии радикалов и других активных форм киолорода. Можно предположить, что влияние СОД и низкомолекулярных соединений меди на выход РНК, по крайней мере частично, обусловлено действием меди на тиоловые группы ферментов, участвующих в транспорте РНК. Мы провели исследование дей-отвия оульфгидрильных ядов: этилмалеимида, п-хлормеркурибензоата, п-хлормеркурибензоатсульфоната, мерсалила, флюоресцинмеркуриаце-тата, ионов кадмия - вое эти агенты оказывали ингибирупцее действие на выход РНК, Нам удалось показать, что восстановленный глу-татион полностью снимает эффект как СОД, так и медь-тирозинового комплекса на выход РНК из ядра в соответствии о предположением о действии меди на оульфгидрильные группы белков. Создание в среде инкубации анаэробных условий обратимо ингибировало выход РНК.

Наш было изучено влшшие функционирования редоко-цепи мембран яаер на транспорт РНК. Добавление НАДФН к ядрам увеличивало выход ШК, а добавление НАДФ+ ингибировало и, кроме того, снимало стимулирующий эффект НАДФН, будучи добавленным вмеоте о ним (рио. 16).

Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что медь, находясь в овободном состоянии или будучи связанной о СОД, споообна подавлять транспорт РНК из ядра in vitro. Наиболее вероятным объяснением этого эффекта нам представляется прямое или опосредованное радикалами кислорода влияние меди на БН-содержащие белки, участвующие в транспорте РНК. В ядерной оболочке присутствуют полипептиды, являющиеся, в ней превалирующими, и при окислении их оульфгидрильных групп образующие поли-

Меры (SheIton and Cochran, 1978), которые могут тормозить транспорт РНК. Кислород, функционирование редоко-ферментов, зависящее от соотношения НАДФН/НАДФ"1", коны переходных металлов, соотношение окиоленного и восстановленного глутатиона обеспечивают тонкую редокс-регуляшш транспорта РНК из ядра путем окислительно-вооотановительного перехода сульфгидрильных групп белков. Наши данные и рассуждения (Коен и др., 1978;, Peakin at al., 1981), нашли подтверждение в работе из другой лаборатории, в которой было показано, что транспорт бета-глобиновой РНК из изолированных ядер подавлялоя окисляющим сульфгидрильным реагентом и восстанавливался дитиотреитолом (Kindae-Hugge and Sauermann, 1985).

Рйо. 16.

Зависимость выхода РНК из изолированных leg от концентрации

I

«э о

* +2«М ШФ-"

.« НААФ+

[МАЛФН], .«

Л - гдновроменно о НАДФН добавлен 2 мМ НЩ>1 © - одновременно о НАДОН добавлен 5 М НАДО1" Условия инкубации см. в подписи к рио. 14.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При изучении ферментной антаоксидантной системы опухолевых клеток нам удалось показать, что в них удельная активность Си,гп-СОД и глутатионпероксидазы существенно ниже, чем в нормальных.

Изучение способности внутриклеточных мембран генерировать (>2 позволило установить, что удельная скорость генерации митохондриями опухолевых клеток выше, а микросомами ниже в сравнении с митоховдрияш и микросомами нормальных клеток. Обнаружено, что мембраны ядер могут образовывать 0^. и способность к этому процессу выше в опухолевых клетках. Механизм генерации митохондриями опухолей, судя по результатам ингибиторного анализа и ре-до КС-титрования, такой же как и у митохондрий нормальных тканей, по крайней мере в участке Ьс1% В мембранах ядер опухолей обнаружена необычная редокс-активность; в них обнаружено чувствительное к СОД и ингибируемое цианидом и азидом окисление адреналина в адренохром, которое происходит при использовании в качестве донора электронов как НАДФН, так и НАДИ.

Исследование взаимодействия противораковых антибиотиков ад-риамицина и карминомицина с мембранами позволило обнаружить, что в независимости от редокс-систеш образование свободных радикалов карминомицина происходит более чем на порядок величин активнее по сравнении с адриамицином. В мембранах ядер опухолевых клеток образование радикала антибиотика происходит с равной эффективностью при окислении НАДФН и НАДН, в то время как в мембранах ядер, микрооом к эритроцитов нормальных клеток уровень образования радикала антибиотика в присутствии НАДФН происходит в 4 раза активнее, чем в присутствии НАДН.

Нами было показано, что при окислении НАД(Ф)Н редокс-цепью мембран ядер в ядерной ДНК появляются однонитевыв разрывы, возникновение которых связано с образованием активных форм кислорода. Этот процесс сильно потенцируется комплексами ЭДТА- Ге'* и ДТПА- ге3\

Применение разработанного цитохимического метода к изучению генерации 03> макрофагами, которая, как полагают, необходима для осуществления этими клетками цитолиза раковых клеток, позволило обнаружить, что генераци,; происходит только в участках непосредственного контакта плазмалеммы макрофага с фагоцитируемым материалом. Генерация 02 обнаруживалась при фагоцитозе дрожжевых клеток, опсонизированных антителами, в то время как фагоцитоз не-

опоонизированных датсксных частиц не сопровождалоя генерацией

При кзуче.сш транспорта РНК из ядер - важного этапа генной экспрессии, который, как полагают, нарушается при опухолевом росте, - наш было обнаружено, что добавление СОД оказывает ингиби-рующео действие на этот процесс. Подобным действием обладали и ионы меда, а та.оао создание анаэробных условий. Добавление НАДФН стимулировало в:*ход РНК, а НАДФ* - янгабировало. Подавляющим действием обладсши и сульфгидрилыша яды, причем более гидрофобные были болоо шстивны в ингибировакии транспорта РНК.

ВЫВОДЫ

1. Проведено исследование энзиматической антиоксидантной защиты в опухолевых метках. Показано, что во всех исследованных оппсолях удельная активность си.гп-СОД в несколько раз ниже по сравнению с нормальными тканями. Напротив, не «удалено существенных различий в активности Ып -СОД в митохондриях печени здоровых крыс и гепатомы 2?. Удельная активность глутатионперокевдазы как в цитоплазме, тек и в митохондриях гепатомы на порядок величин ниже, чем в печиш.

2. 0бнар>~1 на способность СОД подавлять выход РНК из ядер. Высказано предположение о существовании редокс-регуляши транспорта РНК из ядер путем окислительно-восстановительных переходов оульфгвдрилышх групп белков ядра.

3. Подробно изучена генерация 0£ внутриклеточными мембранами опухолевых клоток. Удольная скорость генерации митохондриями опухолевых клеток выше, но механизм генерации в основном такой же как и в митохондриях нормальных клеток. Способность микросом опухолевых клеток генерировать 0£ меньше по сравнению о нормальными. Обнп.уяона способность мембран ядер образовывать 0?>; ядерные мембгшш опухолевых клеток способны генерировать значительно более активно по сравнению о мембранами нормальных ядер

и дате активнее, чем микросомы нормальных клеток.

4. С помощью разработанного цитохимического метода показано, что геиирация активированными макрофагами происходит исключительно локально, в учаотках контакта плазматической мембраны о фагоцитируемым материалом. Генерации 0£ макрофагом не происходит, если фагоцитируемый материал не опсонизирован антителами.

5» В мембранах ядер экспериментальных опухолей и опухолей мозга человека обнаружена новая цианид чувствительная, НАД(0)Н-аавиоикая редокс-активнооть, катализирующая окислительно-восотановительные реакции гвдрохинонов и хинонов, отличающаяся по своим свойствам от аналогичной активности, присутствующей в мембранах нормальных клеток.

6. Обнаружено, что при функционировании редокс-цепи мембран ядер могут появляться разрывы в ядерной ДНК, причиной которых является генерация активных форм кислорода.

7. Проведено детальное изучение взаимодействия противораковых антрациклиновых антибиотиков адриамиирна и карминомицина

о мембранами. Выявлена особенность в редокс-активации этих антибиотиков мембранами ядер опухолевых клеток: образование радикалов антибиотиков в них происходит о равной эффективностью при окислении НАДФН и НАДН, в то время как во всех исследованных мембранах нормальных клеток при использовании в качестве донора электронов НАДФН этот процесс протекает в 4 раза более активно по сравнению с НАДН. Обнаружена способность мембран эритроцитов человека образовывать радикал антраликлинового антибиотика. Во всех исследованных системах генерация свободного радикала карми-номицина происходит в 20 и более раз активнее по сравнению о адриамицкном.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Пескин A.B., Збарский И.Б. и Константинов A.A. Исследование оупероксиддисмутазной активности в опухолевых тканях // Докл. АН СССР. - 1976. - Т. 229, - Л 3. - С. 751-754.

2. Коен Я.М., Пескин .В., Збарскпй Й.Б. Изучение транспорта РНК из ядер печени // Тез. докл. У1 Всесоюзного симпозиума

по структуре и функциям клеточного ядра, Алма-Ата, 1976. - С. 127-128.

3. Peekin А.V., Koen Y.M., Ztareky I.B. and Konstantinov A.A. Superoxide diamut&ae and glutathione peroxidase activities in tumors // .FEBS Lett. - 1977. - 7.78. - N 1. - P. 41-45.

4. Коен Я.М., Пескин A.B., Бару В.А., Федорченко В.В., Збарский И.Б. и Константинов л.А. Транспорт РНК из ядер клеток печени in vitro. Влияние суяероксиддисмутазы на выход быстро-метящейся РНК из изолированных ядер // Биохимия. - 1978. - Т. 43. - М 12. - С. 2124-2129.

b. Zbarsk-V I.В., Koen Y,M. and Poskin A.V. Studies on RNA. transport from isolated cell nucleii The effects of some protein and non-protein factors // Poater abstracts. Leopoldlna aimpo-eiuni on cell ccspartBentation and metabolic channeling. Reinhards brunn, GDR. - 1979. - P. Illb.

6. Пескин А.В., Збарский И.Б. и Константинов А.Л. Образование супероксидных радикалов НАДФН-эависимыми редокс-цепями мембран микросом и ядер » норме и при опухолевом росте // Тез. докл. Ш Всесоюзного симпозиума по медицинской энзимологии. Астрахань. -1979. - С. II4-II5.

7. Збарский И.В., Перевощикова К.А., Коен Е.М., Пескин А.В. Некоторые ферменты ядерной оболочки и механизмы ядерно-цитоплаз-матического транспорта РНК // Тез. докл. Ш Всесоюзного симпозиума по медицинской энзимологии. Астрахань. - 1979. - С. 56.

В. Peskin A.V., Zbarsky Х.В. and Konstantinov А. А. к novel tjpe of superoxide generating system in nuclear membranes from hepatoma 22a ascites cells // FEBS Lett. - 19SO.-V.117.-N 1. -P. 44-48.

9. Peekin A.V., Koen Y.U. and Zbarsky l.B. Some features of nucleo-cytoplasmic RNA transport from isolated nuclei //Abstracts Fourth Arolla Workshop, Switzerland.- 1900.- P. 125.

10. Пескин А.В., Коен Я.М. и Збарский И.Б. Некоторые особенности ядерно-цитоплаоматического транспорта РНК из изолированных клеточных ядер // Тез. докл. П симпозиума СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке". Пущино. - 1980. - С. 68-69.

11. Пескин А.В., Збарский И.Б. и Константинов А.А. Образование супероксидных радикалов мембранами ядер и микросом // Тез. докл. УИ Всесоюзного симпозиума по структуре и функциям клеточного ядра, л рьков. - I960. - С. 134.

12. eakin A.v., Koen Y.M. and Zbarsky I.В. Some features of nuclij-cy-oplasaic RNA transport from isolated nuclei // liolec.Biol.Rep. - 1981. - V. 7. - И 1. - P. 25-30.

13. Пескин А.В., Збарский И.Б. и Константинов А.А. Особенности образования 0£ в ядерных мембранах опухоли// Рефераты докладов и со^щенн!» ХП Менделеевского съезда. М., Наука. - 19(31. -С. 143-Мб.

Ы. ЗбарскиЛ И.Б. и Пескин А.В. Супероксиддисмутазная активность и образование мембранами супероксидннх радикалов з опухолевых и нормальных тканях // Тез. докл. выездной научней сесии ОМШ А!^ СССР. Ереван. - 1901. - С. 12-16.

15. Пескин А.В., Збарский И.В. и Константинов А.А. Исследование электронтранспортных систем в мембранах макросом и ядер печени крысы и гепатомы 22а П Биохимия. 1981. - Т. 46. - № 4. -

С. 579-589.

16. Пескин А.В., Тараховский A.M., Шляховенко В.А. и Збарский И.Б. Окисление адреналина ядерными мембранами опухолей, опосредованное супероксидными радикалами // Докл. АН СССР. -1982. - Т. 263. - № 5. - С. 1270-1273.

17. Збарский И.В. и Пескин А.В. Супероксиддисмутазная активность и образование мембранами супероксидных радикалов в опухолевых и нормальных тканях П Вестник АМН СССР. - 1982. - № 9. -

С. 24-28.

18. Peakin А.V., Koen Y.U. and Zbareky I.В. Some features of nucleo-cytoplaemio RHA transport from isolated nuclei // Macromoleoulea in the functioning cell. Nauka. Moscow. - 1982.-V. 2. - P. 163-164.

19. Пескин А.В. и Збарский И.Б. Качественные и количественные особенности ферментативной генерации супероксидних радикалов внутриклеточными мембранами опухолей // Теэ. докл. 1У Всесоюзного симпозиума по медицинской энзимолсгии. Алма-Ата. - 1983. - С. 206-207.

20. Храмцов А.В., Пескин А.В., Морозов И.А., Земсков В.М. и Збарский И.Б. Демонстрация образования кислородных радикалов фагоцитирующими макрофагами с помощью цитохимического метода // Докл. АН СССР. - 1983. - Т. 269. - № 5. - С. 1272-1274.

21. Пескин А.В., Збарский И.Б. и Константинов А.А. НАД(Ф)Н-зависимое окисление адреналина ядерными мембранами гепатомы 22а // Биолог, мембраны. - 1984. - Т. I. - № 7. - С. 721-727.

22. Пескин А.В. и Збарский И.Б. Качественные и количественные особенности ферментативной генерация супероксидных радикалов внутриклеточными мембранами опухолей // Вестник АМН СССР. - 1984. »8. - С. 32-35.

23. Peskin A.Y., Khranteov A.V., Zemskov V.M. and Zbareky I.B. Visualisation of reactive oxygen epeciea formation by pha-gocytiaing macrophages // Exp.Cell Нее. - 1984. - V. 154. -

И 1. - P. 247-251.

24. Feskin A.V., Zbarsky X.B. and Konetantinor A.A. Superoxide dismutase-eenaitive, HAD(P)H-dependent reduction of oxygen by the membrane-bound redox chains of liver microsome» and hepatosia nuclei in the presence of adrenaline // Bioche». International - 1984. - T. 8. - S 5> - 733-738.

25. Збарский И.В., Эемсков В.М., Морозов И.А., Пескин А.В. и Храмцов А.В. Способ определения кислородных радикалов, образуемых фагоцитами // Авторское свидетельство № 1091070. - 198-1.

26. Пескин А.В. Образование супероксидных радикалов мембранами ядер и особенности его в опухолях // Теэ. докл. УШ Всесоюзного симпозиума "Структура и функции клеточного ядра". Пудино. - 1984. -С. 234-235.

27. Пескин А.В., Константинов А.А. и Збарский И.Б. Образование супероксидных радикалов мембранами // Tea. докл. Советско-Финляндского симпозиума. Онтогенез. - 1984. - Т. 15. - № 4. -

С. 431.

28. Тараховский A.M., Шляховенко В.А., Шмарева Е.Н., Бродская И.А., Пескин А.В. и Збарский И.Б. Образование сулороксидных радикалов ядершми мембранами мозга человека П Бюлл. Эксп. Биол. Мед. - 1985. - Т. 99. - № I. - С. 88-90.

29. Peskln A.V. and Shlyabova L. Cell nuclei generate ША-ni eking superoxide radicala // FEBS Lett. - 1986, - V. 194 -К 2. - P.317-i ' l.

' 30. Пескин А.В. и Збарский И.Б. Энзиматическая активация кислорода и ее роль в повреждении ДНК // Тез. докл. У Всесоюзного симпозиума по медицинской янзимологии. Махачкала. - 1986. - С. 2425.

31. Пескин А.В., Шляхова JI.H. и Збарский И.Б. Разрывы в ядерной ДНК при активации кислорода // Теэ. докл. У Всесоюзного симпозиума по медицинской энэимологии. Махачкала. - I90G. - С, 214.

32. Леденев А.Н., Пескин А.В., Константинов А.А. и Руугв Э.К. Образование свободных радикалов при взаимодействии ацриамицина и карминокицина с ксантиноксидазой // Биофизика . - 1986. - Т. 31.* 3. - С. 519-520.

Зл. Feekln A.V., Konetantinov A.A. and Zbareky I.В. An unuau*.. NAIi(P)H-dependent O^j-generating redox chain in Hepatoma nuclear юевЬгапеа // Society for free radical reaearch. Third blonnial meeting. Dllseeldorf, West Germany. - 1986. - P. 81.

** Konetantinov A.A., Peskin A.V., Popova E.Y., Khomutov G.B. and Ruuge E.K. Superoxide generation by the respiratory

chain of tuaor nitochondria // Biochlm.Biophye.Acta - 1987. -V. 89*. - P. 1-10.

30. Paekin A.V. and Bartoez G. One-electron reduction

of an anthracycline antibiotic carminomycin by a human erythrocyte redox chain // F£BS Lett. - 1987. - V. 219. - К 1,- P.212-

36. Пескин A.B. и Шляхова Л.Н. Повреждение ядерной ДНК при активации кислорода редокс-цепями мембран // Тез. докл. IX Всесоюзного симпозиума "Структура и функции клеточного ядра". Черноголовка. - I9B7. - С. 123.

27« Pesicin A.V., Konatantinov A.A., Zbereícy I.B., Ledenev

A.H. and Huuge S.K. NAD(P)H-dependent Og-generating redox system in Hepatoma 22a nuclei // Free Rad.Ree.Comma. - 1967. - V. J. -Я 1. - P.47-55.

38. Konatantinov A.A., Pea kin A.V., Popov a E.Y., Ruuge

B.K. and Kbomutov ß.B. O^-generation by tumor mitochondria // Abstracta of the Fourth Biennial General Meeting oí the Society for Txea Radical Research. Kyoto, Japan. - 1968.

ПЕСКИ>1 АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ

ПОДПИСАНО В ПЕЧАТЬ 31.08.88 г. ФОРМАТ 60*84/16 УСЛ.КР.ОТТ. 3,0

ПЛОСКАЯ ПЕЧАТЬ УЧ.-ИЗД. Л. 2,9

ТИРАЖ 100 ЭКЗ.

Т - 02697 БУМАГА ОБЕРТОЧНАЯ УСЛ.ПЛ. 3,0 ЗАКАЗ № 94Т

ОТПЕЧАТАНО В ПОДРАЗДЕЛЕНИИ ОПЕРАТИВНОЙ ПОЛИГРАФИИ МОССТАНКИНА, 103056 , МОСКВА , К — 68 , ТИХВИНСКАЯ УЛ., Д. 13