Свободные радикалы кислорода и антиоксиданты в митохондриях сердца и модельных системах

Свиряева, Ирина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Свободные радикалы кислорода и антиоксиданты в митохондриях сердца и модельных системах
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Свободные радикалы кислорода и антиоксиданты в митохондриях сердца и модельных системах"

На правах рукописи

Свиряева Ирина Владимировна

СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ КИСЛОРОДА И АНТИОКСИДАНТЫ В МИТОХОНДРИЯХ СЕРДЦА И МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ

Специальность 03 00 02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

003166В03

Москва - 2008

Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета Московского государственного университета им М В Ломоносова и в НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук, профессор Рууге Энно Куставич

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Петрусевич Юрий Михайлович доктор биологических наук, профессор Панасенко Олег Михайлович

Ведущая организация:

Институт химической физики им H H Семенова РАН

¿ииЬ,

2008 г в /У

Защита состоится «_

на заседании диссертационного совета Д 501 002 11 при Московском государственном университете им М В Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ им М В Ломоносова, физический факультет, аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им М В Ломоносова

Автореферат разослан «_ M _» _2008 г

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 501 002 11 доктор физико-математических наук

Г Б Хомутов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В настоящее время можно считать доказанным, что вклад митохондрий в функции клеток сердечной мышцы значительно шире, чем только роль в энергетическом метаболизме кардиомиоцитов в качестве основного поставщика АТР Митохондрии сердца имеют ключевое значение в регуляторных и сигнальных процессах, являющихся ответом на физиологические стрессы, такие как гипоксия и реоксигенация, нарушение баланса между прооксидантными и антиоксидантными процессами в клетках, действие различных гормонов и фармакологических препаратов В связи с крайне важной ролью митохондрий в жизнедеятельности клеток, в последнее десятилетие огромное внимание уделяется исследованию тн митохондриальных болезней, которые включают нарушения, тем или иным образом влияющие на митохондриальные функции и/или вызваны повреждениями митохондриальной ДНК В случае митохондриальных болезней, клетки подвержены окислительному дисбалансу Основное воздействие при этом испытывают органы с интенсивным окислительным метаболизмом и высокой энергетической потребностью сердце, скелетные мышцы, почки и печень

клеточного компонента (мембранных липидов, белков и нуклеиновых кислот) становится термодинамически выгодным процессом В обычных условиях, когда скорость образования активных форм кислорода и азота относительно невысока, антиоксидантные системы клетки в состоянии не допускать возникновения окислительного стресса Однако, в условиях пониженного энергетического метаболизма клеток миокарда, при существенном увеличении внутриклеточной концентрации кислорода, могут происходить значительные сдвиги в редокс-потенциалах переносчиков дыхательной цепи, способствующие резкому возрастанию скорости генерации митохондриями свободных радикалов кислорода Применение ингибиторов электронного транспорта, обладающих специфичностью по отношению к различным участкам дыхательной цепи, позволяет установить расположение центров, наиболее активно генерирующих супероксидные радикалы, а также оценить относительный вклад каждого из этих центров в суммарную величину скорости образования активных форм кислорода в митохондриях

Хорошо известно, что активные формы кислорода и азота участвуют в развитии патологических состояний сердечной мышцы, возникающих после длительной ишемии Ишемия характеризуется недостаточным снабжением ткани кислородом и необходимыми метаболитами и обусловлена нарушениями в системе кровообращения Вследствие энергетической недостаточности во время ишемии происходит активация анаэробного гликолиза, направленного на синтез АТР, тем не менее, гликолиза оказывается недостаточно для обеспечения потребностей клеток миокарда Как результат, в клетках возникают множественные нарушения ионного гомеостаза, следствием которых является невозможность нормального функционирования сердечной мышцы Следующая за длительной ишемией реоксигенация миокарда сопровождается значительными тканевыми повреждениями и нарушениями сократительной функции - появлением аритмий и временной механической дисфункции Это явление, получившее название "кислородный парадокс", обусловлено резким увеличением образования активных форм кислорода при восстановлении нормального уровня внутриклеточного кислорода

Адриамицин (доксорубицин) - антибиотик, являющийся одним из наиболее часто применяемых лекарственных препаратов при химиотерапии злокачественных опухолей человека В то же время хорошо известно, что адриамицин характеризуется рядом нежелательных побочных эффектов, в первую очередь, значительной кардиотоксичностью Опубликовано множество работ, авторами которых были предложены разнообразные молекулярные механизмы, объясняющие вызываемую адриамицином кардиотоксичность В настоящее время считается, что терапевтическое и кардиотоксическое действия адриамицина представляют собою единый мультифакторный процесс, инициированный окислительным стрессом и приводящий в конечном счете к апоптозу - процессу запрограммированной гибели клеток Важным фактором, который может опосредовать токсическое действие адриамицина на клетки сердечной мышцы, является высокое сродство адриамицина к кардиолипину -анионному фосфолипиду, специфичному для внутренней мембраны митохондрий Кардиолипин важен не только для структуры и функций митохондрий, но также для общего энергетического метаболизма и выживания клетки Связывание адриамицина с митохондриальной мембраной ведет к изменению ее свойств, при этом изменяется функционирование электронных переносчиков в мембране Таким образом, накопление редокс активного адриамицина в митохондриях сердца должно усиливать генерацию активных форм кислорода и азота этими органеллами

В связи с тем, что митохондрии являются главным источником активных форм кислорода в клетке, эти органеллы нуждаются в постоянной защите от повреждений, вызываемых окислительным стрессом Такая защита обеспечивается ферментативными системами, а также различными низкомолекулярными антиоксидантами Наиболее важными среди антиоксидантов оказались коэнзим и витамин Е. Однако, их использование недостаточно эффективно Одной из причин этого, возможно, является то, что только очень малые количества таких антиоксидантов могут проникнуть сквозь клеточные мембраны и достигнуть митохондрий Поэтому решением этой проблемы было изобретение антиоксидантов, избирательно накапливающихся в митохондриях

Такие митохондриально-направленные антиоксиданты получили, присоединив трифенилфосфоний - липофильный катион к убихинону (тйо<2) или а-токоферолу (тйоУмЕ) Полученные антиоксиданты легко проходят через биологические мембраны и в несколько сот раз лучше накапливаются внутри митохондрий, обеспечивая эффективную защиту от окислительного стресса Оказалось, что при незначительном увеличении дозы тио(2 он может вести себя как прооксидант, что ограничивает его применение в медицине Поэтому были предприняты попытки создать другой возобновляющийся антиоксидант, не обладающий подобным побочным действием Этого удалось добиться, заменив убихинон на пластохинон (8к(21) В одинаковых условиях для ттО^ концентрации, вызывающие анти- и прооксидантное действие, различались меньше, чем в два раза, а для SkQl это различие возросло до тридцати раз Цель работы

Целью работы являлось выяснение закономерностей регуляции процессов образования и гибели активных форм кислорода и азота в клетках сердечной мышцы и модельных системах в условиях, моделирующих окислительный стресс и защитное действие антиоксидантных систем клетки

Задачи работы

Исходя из поставленной цели, в диссертации решались следующие задачи

1 Изучение влияния длительности гипоксии и реоксигенации на генерацию активных форм кислорода митохондриями сердца и функциональные характеристики дыхательной цепи митохондрий

2 Изучение воздействия адриамицина - противоопухолевого препарата широкого спектра действия - на генерацию супероксидных радикалов митохондриями сердца

3 Выяснение взаимосвязи между генерацией активных форм кислорода митохондриями сердца и образованием и деструкцией динитрозильных комплексов железа

4 Определение спектральных и кинетических характеристик семихинонов митохондриально-направленных антиоксидантов - производных убихинона и пластохинона - и их аналогов

Научная новизна

Основными новыми результатами и положениями, которые составляют

предмет диссертации, являются

1 С помощью спектроскопии ЭПР спиновых ловушек впервые изучена кинетика образования и гибели активных форм кислорода в изолированных митохондриях сердца в условиях небольшого парциального давления кислорода в среде инкубации

2 Впервые показано, что гипоксия и последующая реоксигенация изолированных митохондрий сердца приводят к увеличению скорости генерации супероксидных радикалов, однако, в отличие от митохондрий, выделенных после ишемии-реперфузии миокарда, эффект не зависит от длительности периода гипоксии

3 Впервые продемонстрировано, что адриамицин - противоопухолевый препарат широкого спектра действия - вызывает изменения в митохондриях сердца, приводящие к значительному увеличению скорости генерации супероксидных радикалов, обусловленному взаимодействием с молекулярным кислородом электронных переносчиков комплекса III и свободнорадикальных интермедиатов редокс-цикла адриамицина

4 Впервые обнаружено, что динитрозильные комплексы железа могут являться перехватчиками активных форм кислорода в системах, моделирующих окислительный стресс в клетках сердечной мышцы

5 Проведено исследование спектральных и кинетических характеристик семихинонных свободных радикалов митохондриально-направленных антиоксидантов - производных убихинона и пластохинона - и их аналогов Впервые показано, что анион-радикалы mitoQ, SkQl, SkQ3 и их коротко-цепочечные аналоги отличаются существенным образом распределением плотности неспаренного электрона по атомам хиноидного кольца

6 Впервые установлено, что митохондриально-направленные антиоксиданты mitoQ и SkQl могут действовать также как прооксиданты и образовывать в модельных системах супероксидные радикалы в процессе одноэлектронного окисления молекулярным кислородом

Научно-практическая ценность диссертации

Представленные в диссертации экспериментальные данные могут быть использованы для выяснения молекулярных механизмов процессов, влияющих на энергетический метаболизм сердечной мышцы в условиях ишемии миокарда, а также для разработки методов лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы с помощью митохондриально-направленных антиоксидантов Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на 9 всероссийских и международных конференциях, в том числе, на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов 2004» (Москва, 2004), III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), 6th Workshop on EPR Applications in Biology and Medicine (Krakow, 2004), 4-ой национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2005), II Евразийском конгрессе по медицинской физике «Медицинская физика - 2005» (Москва, 2005), Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2006), Научной конференции МГУ «Ломоносовские чтения», секция физики (Москва, 2006), 5-ой национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2007), Vllth International Workshop on EPR (ESR) m Biology and Medicine (Krakow, 2007) Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 17 печатных работ, в числе которых 4 статьи в реферируемых журналах Структура и объём работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), методической части (глава 2), описания собственных экспериментальных результатов и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка

цитированной литературы Объем работы составляет 117 страниц, включая 32 рисунка и библиографию из 163 наименований

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении дана общая характеристика диссертационной работы Обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, изложены научная новизна и практическая ценность полученных результатов

Первая глава содержит литературный обзор, посвященный физико-химическим характеристикам активных форм кислорода и азота, их источникам в организме и роли в процессах жизнедеятельности Существенное внимание уделено вопросам участия свободных радикалов кислорода и токсичных метаболитов оксида азота в возникновении и развитии повреждений клеток сердечной мышцы при патологическом стрессе, обусловленным нарушениями кислородного обмена в условиях гипоксии и ишемии Изложены современные представления о механизмах действия адриамицина (доксорубицина) - одного из наиболее часто применяемых лекарственных препаратов при химиотерапии злокачественных опухолей человека Показано, что терапевтическое и кардиотоксическое воздействия адриамицина представляют собою единый мультифакторный процесс, обусловленный окислительным стрессом Проведен анализ современных тенденций способов защиты организма от последствий окислительного стресса, обоснована целесообразность поиска и исследования характеристик митохондриально-направленных антиоксидантов, в молекулах которых сочетались бы положительно заряженные гидрофобные группы и редокс-активные хиноны, такие как убихинон или пластохинон

Во второй главе представлены методы и материалы исследования В разделе 2.1. описано получение изолированных митохондрий из сердец крыс линии Wistar по (Hogeboom, 1955), в разделе 2.2. - измерение их дыхательной активности с помощью электрода Кларка на полярографе YSI 53 фирмы Yellow Spring Instruments, Inc (США), а также с помощью нитроксильного радикала TEMPONE-D-sN (4-оксо-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-£16-1-оксил-15Л0 на спектрометре ЭПР Для этого суспензию митохондрий помещали в герметично

закрытый стеклянный капилляр при температуре образца ~25°С В разделах 2.3. и 2.4. описываются методики регистрации и обработки спектров ЭПР Спектры ЭПР регистрировали на спектрометре Е-109Е фирмы Vanan (США) при комнатной температуре (~25°С) Образцы помещали в газопроницаемые капилляры PTFE 22 (внутренний диаметр 0 635 мм, толщина стенок 0 051 мм) фирмы Zeus Industrial Products, Inc (США), а запись спектров проводили либо при непрерывной аэрации образца (газовая среда - воздух), либо в условиях варьируемого парциального давления кислорода Содержание кислорода в инкубационной смеси определяли по ширине компонент спектра ЭПР а также по ширине синглетного сигнала ЭПР фталоцианина лития (LiPc) Для измерения скорости генерации супероксидных радикалов в митохондриях или в модельных системах в реакционную смесь вводили спиновую ловушку TIRON (4,5-диоксибензол-1,3-дисульфонат натрия) Абсолютные значения скорости образования О-Г вычисляли с помощью супероксид-генерирующей системы ксантиноксидаза-ксантин, кинетические характеристики которой определяли по скорости восстановления цитохрома с супероксидными радикалами Раздел 2.5 посвящен описанию методов получения препаратов динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ), используемых в экспериментах по изучению метаболизма оксида азота и баланса прооксидантных и антиоксидантных процессов в клетках миокарда Концентрацию ДНКЖ в образцах также определяли с помощью спектроскопии ЭПР Для этого используемую димерную форму ДНКЖ, не обнаруживаемую методом ЭПР, переводили в мономерную ЭПР-детектируемую форму В разделе 2.6. описаны методики получения и изучения характеристик семихинонных свободных радикалов - промежуточных продуктов в окислительно-восстановительных реакциях биологически значимых хиноидных соединений -производных убихинона или пластохинона Семихиноны mitoQ (2,3-диметокси-5-метил-6-децилтрифенилфосфоний-1,4-бензохинон), SkQl (2,3-диметил-6-децилтрифенилфосфоний-1,4-бензохинон), SkQ3 (2,3,5-триметил-6-децилтри-фенилфосфоний-1,4-бензохинон) и их аналогов образовались в процессе автоокисления соответствующих хинолов в этаноле или в смеси этанол-водный

буфер (pH 7,8-8,5). Все экспериментальные спектры свободнорадикальных интермедиатов были симулированы с помощью программы WinEPR SimFonia фирмы Bruker (ФРГ).

Статистическую обработку полученных результатов производили по t-тесту и тесту ANOVA. Результаты представлены как среднее значение ± средняя ошибка (М±т). Различия между экспериментальными данными считали достоверными, если Р < 0,05.

В третьей главе представлены полученные результаты и их обсуждение. В разделе 3.1. представлены результаты определения функциональной активности митохондрий. Для этого измеряли скорости потребления кислорода в третьем и четвертом состояниях дыхательной цепи с помощью электрода Кларка, а также с помощью

нитроксильного

радикала ТЕМРОМЕ-О- N на спектрометре ЭПР, ширина линий дублетного спектра которого определяется концентрацией кислорода в реакционной смеси (рис. 1). В наших опытах изолированные митохондрии сердца крысы характеризовались в состояниях 3 и 4 скоростями дыхания 77±9 и 26±5 нмоль 02/ мин/мг белка, соответственно (при 25°С), т.е. имели дыхательный контроль по АИР, равный по значению четырем.

В разделе 3.2. представлены результаты по измерению скоростей генерации супероксидных радикалов изолированными митохондриями

Ь 22 S

х£2°

-я

18 16 14

TEMPONE-D-sN

_ ♦ (3) (m=+1)

♦ ♦

- • • ♦ ♦ (2) • • ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦

- • •

- ■ ■ . 1 . ■ ■ ■ № , I , I , I , I . I . 1

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Время инкубации, мин

Рис. 1. Зависимость ширины низкопольной компоненты спектра ЭПР нитроксильного радикала ТЕМР0ИЕ-0-,3И в суспензии митохондрий сердца крысы от времени инкубации. Суспензия митохондрий находилась в закупоренном стеклянном капилляре при температуре образца ~25°С. Добавки в инкубационную смесь: сукцинат, ротенон и ЛОР (1, 4), сукцинат и ротенон (2), без добавок (3). Концентрация белка: 0.5 мг/мл (1-3); 5 мг/мл (4).

сердца Было показано, что регистрация с помощью спектроскопии ЭПР кинетики супероксид-зависимого окисления TIRON в свободные радикалы (семихиноны) TIRON"' является удобным и достаточно чувствительным методом измерения скорости образования супероксида электронными переносчиками митохондрий в условиях контролируемой оксигенации образца В отсутствии ингибиторов скорость сукцинат-зависимого образования супероксидных радикалов в комплексе III (Ъсх сегменте) была мала (~0 01 нмоль 02""/мин/мг белка при 25°С), однако, в присутствии антимицина А, блокирующего перенос электронов от цитохромов b на окисленный коэнзим Q, сильно возросла (до 0 81 2 нмоль О^/мин/мг белка) В то же время, генерация 0{~ в комплексе III полностью подавлялась миксотиазолом и стигмателлином - ингибиторами Q-цикла, блокирующими перенос электронов на Fe-S центр Риске При использовании глутамата и малата (субстратов комплекса I) добавление антимицина А в среду инкубации также сопровождалось усиленной генерацией 02" в комплексе III дыхательной цепи В то же время, добавление ротенона, блокирующего в комплексе I как обратный, так и прямой перенос электронов, не приводило при использовании глутамата и малата к возникновению сигнала ЭПР семихинона TIRON

Раздел 3.3. посвящен

исследованию влияния гипоксии разной длительности и последующей реоксигенации на скорость образования супероксидных радикалов в

Магнитное поле, мТл

Рис. 2. Спектры ЭПР спиновой ловушки TIRON в суспензии митохондрий сердца крысы Добавки в инкубационную смесь сукцинат и антимицин А Газовая среда в резонаторе воздух (1, 4, 5), азот (2, 3) Спектры записаны в следующих условиях 8 мин в воздухе (1), 10 мин в воздухе, 10 с (2) и 4 мин (3) в азоте, 10 мин в воздухе, 10 мин в азоте, 10 с (4) и 4 мин (4) в воздухе

изолированных митохондриях сердца. Представлены спектры ЭПР TIRON в суспензии митохондрий, генерирующих супероксид в присутствии субстратов для комплексов I или II (малат-глутамат или сукцинат) и антимицина Л. Переход из аэробных условий в условия гипоксии (смена газовой среды с воздуха на азот) сопровождался падением интенсивности сигнала семихинонов TIRON, образовавшихся в результате окисления спиновой ловушки TIRON супероксидными радикалами. Реоксигенация, в свою очередь, приводит к быстрому возрастанию сигнала TIRONF, причем скорость образования супероксидных радикалов окажется больше, чем до гипоксии (рис. 2).

На рис. 3 показана зависимость скорости генерации супероксидных радикалов изолированными митохондриями от длительности гипоксии при использовании субстратов дыхания комплексов I и II. Длительность гипоксии была в обоих случаях 10 мин и 30 мин. Скорость образования О-Г возрастала, по сравнению с контрольным уровнем, уже после 10-минутной гипоксии, однако, увеличение длительности

гипоксии не приводило к существенным изменениям.

Интенсивность сигнала ЭПР от TIRON после 30 или 45 мин гипоксии была практически такой же, как и после 10-минутной гипоксии.

Таким образом, гипоксия и последующая реоксигенация

сопровождается определенными

5 з.о ю

1 2.5

I 2.0

О X

- 1-5

см

1 1.0 X

CÜ

° 0.5 то а >о

° 0.0

изменениями изолированных

мембранах митохондрий

сердца, вызывающими увеличение

Рис. 3. Зависимость скорости образования супероксида в суспензии митохондрий сердца крысы от субстратов окисления и длительности гипоксии. Добавки в инкубационную смесь: сукцинат и антимицин А (светлосерые столбики); глутамат, малат, и антимицин А (темносерые столбики). Условия инкубации: 10 мин в воздухе (1); 10 мин в воздухе, 10 мин в азоте, 10 мин в воздухе (2); 10 мин в воздухе, 30 мин в азоте, 10 мин в воздухе (3). Температура образца: ~25°С.

скорости образования 02"~ электронными переносчиками (семихинонами коэнзима Q) комплекса III дыхательной цепи. Однако, в отличие от митохондрий, выделенных из сердец после ишемии-реперфузии, величина эффекта не зависела от длительности гипоксии. Полученные данные позволяют заключить, что изолированные митохондрии сердца, находящиеся в среде инкубации, характеризуются большей невосприимчивостью к гипоксии, чем митохондрии в клетках сердечной мышцы, подвергнутой ишемии.

В разделе 3.4. приведены результаты исследования зависимости скорости генерации супероксидных радикалов изолированными митохондриями сердца крысы от присутствия в среде инкубации адриамицина (доксорубицина) -эффективного противоопухолевого препарата, обладающего, однако, значительной кардиотоксичностью.

Добавление адриамицина в среду инкубации приводило к увеличению интенсивности сигнала ЭПР от TIRON, т.е. к заметному росту скорости образования супероксидных радикалов. Рост скорости образования 0{~ наблюдался во всем исследованном нами интервале концентрации адриамицина (10-150 мкМ). В то же время, генерация доступных спиновым ловушкам супероксидных радикалов вблизи границы внутренней мембраны с

межмембранным пространством в митохондриях, модифицированных адриамицином, почти полностью подавлялась стигмателлином -

1 2 3 4 1 2 3 4

Инкубация:

10 мин 20 мин

Рис. 4. Зависимость скорости образования супероксида в митохондриях сердца крысы от добавок в реакционную смесь. Добавки в среду инкубации: сукцинат и антимицин А (1), сукцинат, антимицин А и адриамицин (2), сукцинат, антимицин А, адриамицин и стигмателлин (3), сукцинат и адриамицин (4). Условия инкубации: 10 мин или 20 мин, температура ~25°С, концентрация адриамицина 50 мкМ. Кроме 3-4 (при 10-минутной инкубации), различия между образцами статистически достоверны (Р < 0.05).

ингибитором g-цикла, блокирующим перенос электронов на Fe-S центр Риске В отличие от стигмателлина, ротенон, блокирующий в комплексе I как обратный, так и прямой перенос электронов, не приводил в присутствии субстратов этого комплекса (глутамата и малата) и адриамицина к полному исчезновению сигнала ЭПР от TIRON

Показаны зависимости скорости генерации супероксидных радикалов в изолированных митохондриях сердца от присутствия адриамицина и ингибиторов дыхательной цепи в среде инкубации при использовании сукцината (субстрата окисления для комплекса II) (рис 4) или при использовании глутамата и малата (субстратов окисления для комплекса I) Длительность инкубации митохондрий в условиях непрерывной аэрации была в обоих случаях равна 10 мин и 20 мин Скорость образования 02" возрастала, по сравнению с исходным уровнем, уже после десятиминутной инкубации в присутствии адриамицина Увеличение длительности инкубации до 20 мин вызывало некоторый рост скорости образования супероксида во всех образцах, однако, не приводило к изменению общих закономерностей действия адриамицина В митохондриях, модифицированных адриамицином, скорость генерации супероксидных радикалов всегда была выше, чем в митохондриях, в среде инкубации которых отсутствовал адриамицин Эффект адриамицина наблюдался также в опытах с митохондриями, выделенными либо после серии уколов адриамицина животным, либо после перфузии изолированного сердца в присутствии адриамицина в среде для перфузии

В наших опытах т vitro на изолированных митохондриях сердца адриамицин находился в среде инкубации и, благодаря специфическому взаимодействию с кардиолипином, включался во внутренние мембраны этих органелл Находясь в митохондриях, редокс-активный адриамицин способен либо непосредственно принимать электроны с переносчиков электрон-транспортной цепи и передавать их молекулярному кислороду с образованием супероксидных радикалов, либо вызывать наблюдаемый в наших опытах значительный рост скорости образования 0{~ за счет изменения физико-

химических характеристик липидного окружения компонентов дыхательной цепи.

В разделе 3.5. представлены данные изучения взаимодействия цистеиновых ДНКЖ с супероксидом, генерируемым митохондриями сердца крысы. Представлены кинетики деструкции цистеиновых ДНКЖ (в мономерной парамагнитной форме) в условиях образования супероксида комплексом III дыхательной цепи митохондрий (рис. 5). Деструкция ДНКЖ в присутствии митохондрий, субстрата комплекса II сукцината и ингибитора антимицина А происходит существенно быстрее, чем в контроле.

При добавление супероксиддисмутазы (СОД) скорость распада ДНКЖ практически совпадает со скоростью в контроле. Этот факт доказывает, что супероксидный радикал влияет на распад ДНКЖ. Следует отметить, что зависимая от супероксида деструкция ДНКЖ наблюдалась в присутствии избытка цистеина, также являющегося антиоксидантом. Таким образом, ДНКЖ были более эффективным «скавенджером» супероксида, чем цистеин. Можно предположить, что ДНКЖ является достаточно эффективным

протектором, защищающим клетку от спероксидных радикалов, источником которого являются митохондрии.

Также приведены данные экспериментов, где в присутствии цистеина, донора нитроксильного аниона соли Ангели и ферритина происходит образование ДНКЖ. В присутствие митохондрий и

Время, мин

Рис. 5. Деструкция цистеиновых ДНКЖ в условиях генерации супероксида. (1) митохондрии сердца крысы, цистеиновые ДНКЖ; (2) митохондрии сердца крысы, цистеиновые ДНКЖ, сукцинат, антимицин А; (3) митохондрии сердца крысы, цистеиновые ДНКЖ, сукцинат, антимицин А, СОД. Инкубационная смесь в фосфатном буфере (рН=7,5), температура ~25°С.

сукцината, выход ДНКЖ, образующихся под действием иитроксильного аниона, существенно возрастал.

Раздел 3.6. посвящен изучению характеристик семихинонных свободных радикалов - промежуточных продуктов в окислительно-восстановительных реакциях митохондриально-направленных антиоксидантов тНо(2, SkQl и SkQЗ, а также ряда их короткоцепочечных аналогов: Со£>; (2,3-диметокси-5-метил-6-(3-метил-2-бутенил)-1,4-бензохинона), Со<20 (2,3-диметокси-5-метил-1,4-бензо-хинона), с!есу1 Р<2 (2,3-диметил-6-децил-1,4-бензохинона), PQ0 (2,3-диметил-1,4-бензохинона) и ТМ(Э (2,3,5-триметил-1,4-бензохинона). Свободнорадикальные интермедиаты образовались в процессе автоокисления соответствующих хинолов в слабо-щелочной среде (рН 7,8-8,5), спектры ЭПР регистрировали в условиях варьируемой оксигенации образца.

Спектры ЭПР тио<2 и Со£'/ (рис. 6) имеют 9 компонент сверхтонкой структуры и практически идентичны, в обоих случаях неспаренный электрон взаимодействует с тремя протонами метальной группы при С5 и двумя протонами метиленовой группы при С6 хиноидного кольца. Однако, протоны -СНз группы при С5 вызывают почти в два раза большее расщепление в спектре, чем протоны -СНт- группы при С6: а(ЗН) = 0,19 мТл, а(2Н) ~ 0,099 мТл. Это означает, что плотность неспаренного электрона у атомов С5 и С6 также отличается в два раза. Переход к Со<2о, т.е. замена

-СНг- фрагмента на -Я приводит к Рис. 6. Экспериментальные спектры

тИоО и Со<2/. Условия регистрации значительному перераспределению спектров ЭПР: СВЧ мощность 0,5 мВт,

электронной плотности у атомов амплитуда ВЧ модуляции 0,05 мТл.

_!_!-!_I-1_I_I-1-1—

326.0 326,2 326,4 326,6 326,8 327.0 Магнитное поле, мТл

хиноидного кольца: в спектре ЭПР теперь 8 компонент, при этом а(ЗН) ~ 0,236 мТл, а(1Н)~0,\91 мТл.

Спектры ЭПР SkQl и с1есу1 PQ (рис. 7) характеризуются взаимодействием неспаренного электрона с девятью магнитно практически эквивалентными протонами (-СН3 группы при С2 и СЗ, -СН2~ группа при Сб и -Я группа при С5) хиноидного кольца. В спектрах ЭПР семихинонов обоих соединений 10 компонент, а(9Н) = 0,18 мТл. Таким образом, в молекулах SkQl и ¿есу1 PQ электронная плотность одинакова у атомов углерода С1-С6 хиноидного кольца. Однако, переход к Р£>о, т.е. замена -СН;- фрагмента алифатической цепи на -Н

325,6

326,0 326,4 326,6 327,2 Магнитное поле, мТл

325,6

326,0 326,4 326,8 Магнитное поле, мТл

Рис. 7. Экспериментальные спектры 8к01 и с!есу1РО. Условия регистрации спектров ЭПР: СВЧ мощность 0,5 мВт, амплитуда ВЧ модуляции 0,05 мТл.

Рис. 8. Экспериментальные спектры ЖЯ? и TMQ. Условия регистрации спектров ЭПР: СВЧ мощность 0,5 мВт, амплитуда ВЧ модуляции 0,05 мТл.

приводит к значительному перераспределению электронная плотности у атомов хиноидного кольца: в спектре ЭПР теперь 17 компонент, при этом а (6Н) = 0,18 мТл, а (1Н) ~ 0,27 мТл.

Спектр ЭПР анион-радикала 8к<23 (рис 8) (в хиноидном кольце протон у С5 заменен на метальную группу) значительно сложнее, чем анион-радикала Бк()1 В отличие от неспаренный электрон в 8к()3 распределен

неоднородно по углеродам хиноидного кольца Протоны -СН3 групп при С2, СЗ и С5 вызывают в два раза большее расщепление в спектре, чем протоны -С#г-группы при Сб В случае Бк()3 в спектре ЭПР 21 линия (из них 4 крайние очень малой интенсивности), а(9Н) ~ 0,18 мТл, а(2Н) ~ 0,9 мТл Таким образом, параметры сверхтонкой структуры спектров ЭПР mltoQ, SkQl, SkQЗ и их короткоцепочечных аналогов и Р0,о) четко показывают, что семихиноны всех указанных соединений существуют преимущественно в форме анион-радикалов, которые могут быть стабилизированы при наличии подходящего окружения благодаря образованию водородных связей

Проведено исследование влияния среды инкубации с другой полярностью — ОМЗО (диметилсульфоксида) - на спектры ЭПР семихинонов, возникающих при окислении 8к()1ь тйо(), Р(?0 и <2о Общие характеристики спектров ЭПР анион-радикалов всех исследованных соединений в ВМБО сохраняются, при этом происходит небольшое изменение среднего значения §-фактора Несколько изменяется и распределение электронной плотности по углеродным атомам (С2, СЗ, С5 и Сб) хиноидного кольца, что приводит к дополнительному расщеплению линий сверхтонкой структуры спектров ЭПР Следует отметить, что использование ПМБО в качестве растворителя приводит к стабилизации свободнорадикальных интермедиатов 8к()1 и гпйо<2, однако практически не влияет на кинетику образования и гибели свободных радикалов их аналогов Р<20 и во

Приведены результаты исследования зависимости кинетики образования и гибели свободнорадикальных форм 8к()1, и ()0, образовавшихся при

автоокислении их восстановленных форм, от парциального давления кислорода в среде инкубации (этанол-вода) В этих опытах реакционная смесь находилась в резонаторе спектрометра ЭПР в газопроницаемых капиллярах, а содержание кислорода в газовой среде варьировалась от 2% до 21% (атмосферный воздух) Семихиноны БкЦ!, тПо(2 и образовывались при всех использованных

концентрациях кислорода в среде инкубации, однако квазистационарная концентрация их свободнорадикальных форм зависела существенным образом от содержания кислорода в среде. При 21% содержании кислорода свободные радикалы Зк<21 и тио£) исчезли после 4-5 мин инкубации. В случае Q0 -короткоцепочечного аналога тио<2 - сигнал ЭПР анион-радикалов исчез полностью через 4 мин уже при 14% содержании кислорода.

Проведено исследование кинетики образования и стабильности семихинонных форм 5к<21 и тИо(), образовавшихся в присутствии в среде инкубации липосом из кардиолипина и фосфатидилхолина. В случае липосом из кардиолипина и фосфатидилхолина с арахидоновой кислотой суммарный спектр ЭПР SkQl состоял из двух спектров - спектра анион-радикала Бк()1'~ в среде инкубации с хорошо разрешенной сверхтонкой структурой и синглетного сигнала с шириной 0,8 мТл анион-радикала SkQГ~> локализованного в липосомах (рис. 9). При использовании фосфатидилхолина с линолевой кислотой такой картины не наблюдалось. Так же, в случае тио(), синглетного сигнала ЭПР от анион-радикалов в липосомах не удалось регистрировать. Таким образом, только в случае 8к()1 и липосом из кардиолипина и фосфатидилхолина с арахидоновой кислотой наблюдается накопление и стабилизация семихинонов в липосомах.

г.

324.8

325.6 326.4 327.2 Магнитное поле. мТл

328.0

Рис. 9. Спектр ЭПР SkQl в присутствии липосом, состоящих из кардиолипина и фосфатидилхолина с арахидоновой кислотой. Условия регистрации спектров ЭПР: СВЧ мощность 0,5 мВт(1) и 5 мВт (2), амплитуда ВЧ модуляции 0,05 мТл. Температура ~25°С

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что квантово-химические характеристики свободных радикалов митохондриально-направленных производных убихинона и пластохинона могут существенно влиять на их участие в антиоксидантных и прооксидантных процессах в кардиомиоцитах

В заключении подведены основные итоги диссертационной работы и сформулированы выводы

выводы

1 Гипоксия и последующая реоксигенация приводит к увеличению скорости генерации супероксидных радикалов изолированными митохондриями сердца В отличие от митохондрий, выделенных после ишемии-реперфузии миокарда, эффект не зависит от длительности гипоксии

2 Адриамицин (доксорубицин) - противоопухолевый препарат широкого спектра действия - вызывает изменения в митохондриях сердца, приводящие к значительному увеличению скорости генерации супероксидных радикалов, что частично может быть связано с образованием свободных радикалов (семихинонов) адриамицина и их взаимодействием с молекулярным кислородом

3 Нитрозильные комплексы железа являются перехватчиками активных форм кислорода в системах, моделирующих окислительный стресс в клетках сердечной мышцы

4 Свободные анион-радикалы mltoQ, Бк(}1 и их аналогов, являющиеся промежуточными продуктами в окислительно-восстановительных реакциях хиноидных соединений, существенным образом отличаются по распределению плотности неспаренного электрона по углеродным атомам хиноидного кольца

5 Митохондриально-направленные антиоксиданты mltoQ и 8к()1 могут действовать как прооксиданты - образовывать супероксидные радикалы при одноэлекгронном окислении молекулярным кислородом

Результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1 Ruuge Е К , Zabbarova IV . Svirvaeva IV. Shumaev К В Redox status of cardiac cells Ferritin, reactive oxygen and nitrogen species // Current Topics in Biophysics 2005 V 29 (2-1) P 37-45

2 Свиряева И В. Рууге Э К Генерация свободных радикалов кислорода в митохондриях сердца эффект гипоксии-реоксигенации // Биофизика 2006 Т 51 (3) С 478-484

3 Шумаев К Б , Губкин А А, Губкина С А, Гудков JIJI. Свиряева И В , Тимошин А А , Топунов А Ф , Ванин А Ф , Рууге Э К Взаимодействие динитрозильных комплексов железа с интермедиатами окислительного стресса //Биофизика 2006 Т 51 (3) С 472-477

4 Свиряева И В . Рууге Э К , Шумаев К Б Образование супероксидных радикалов в изолированных в митохондриях сердца эффект адриамицина // Биофизика 2007 Т 52(6) С 1054-1059

5 Свиряева И В Генерация свободных радикалов кислорода в митохондриях сердца эффект гипоксии-реоксигенации Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов 2004» (МГУ, апрель 2004) Сборник тезисов С 217

6 Рууге Э К, Заббарова И В , Свиряева И В . Шумаев К Б Редокс-состояние клеток миокарда и гомеостаз железа Ферритин, активные формы кислорода и азота III съезд биофизиков России (Воронеж, 24-29 июня 2004) Тезисы докладов ТИС 568-569

7 Ruuge Е К , Zabbarova IV, Svirvaeva IV. Shumaev К В Redox status of cardiac cells Ferritin, reactive oxygen and nitrogen species 6th Workshop on EPR Applications in Biology and Medicine (Krakow, 5-10 October 2004) Abstracts P 58-59

8 Свиряева И В , Рууге Э К Влияние гипоксии-реоксигенации на генерацию свободных радикалов кислорода митохондриями сердца 4-я национальная научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 26-30 сентября 2005) Сборник трудов С 153-155

9 Рууге Э К . Свиряева И В . Губкина С А , Шумаев К Б Митохондриальные болезни современные концепции 4-я национальная научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 26-30 сентября 2005) Сборник трудов С 150-151

10 Свиряева И В . Рууге Э К Действие гипоксии-реоксигенации на образование активных форм кислорода митохондриями сердца II Евразийский конгресс по медицинской физике «Медицинская физика - 2005» (Москва, 21-24 июня

2005) Сборник материалов С 292-293

11 Свиряева И В . Рууге Э К, Губкина С А, Шумаев К Б Ответ митохондрий сердца на патологический стресс Международная научная конференция «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 21-23 июня 2006) Сборник статей ТИС 239-241

12 Рууге Э К, Шумаев К Б , Губкин А А , Губкина С А, Гудков JIJI. Свиряева ИВ . Топунов А Ф Влияние ионов железа и железосодержащих белков на взаимодействие метаболитов оксида азота с активными формами кислорода Международная научная конференция «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 21-23 июня 2006) Сборник статей Т II С 236-238

13 Рууге Э К, Свиряева И В Митохондриальные болезни и окислительный стресс Международная научная конференция «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 21-23 июня

2006) Сборник статей Т I С 19

14 Рууге Э К, Свиряева И В . Губкина С А, Шумаев К Б Митохондрии сердца ответ на патологический стресс Научная конференция МГУ «Ломоносовские чтения», секция физики (Москва, 17-27 апреля 2006) С 107-108

15 Шумаев К Б, Свиряева И В . Кривова Т С , Рууге Э К, Гудков Л Л, Ланкин В 3, Топунов А Ф Действие оксида азота на дыхательную цепь митохондрий сердца 5-я национальная научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота,

антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 18-22 сентября 2007) Сборник трудов С 197-199

16 Sviryaeva I V . Ruuge ЕК Cardiac mitochondna and pathological stress a spin trapping study VTIth International Workshop on EPR (ESR) in Biology and Medicine (Krakow, 3-6 October 2007) Abstracts P 56

17 Ruuge EK, Sviryaeva IV. Shumaev KB Semiquinone free radicals of mitochondria-targeted antioxidants - ubiquinone and plastoquinone derivatives Vllth International Workshop on EPR (ESR) in Biology and Medicine (Krakow, 3-6 October 2007) Abstracts P 54

Подписано к печати // £>3 Тираж <¥ О Заказ JS

Отпечатано в отделе оперативной печати физического факультета МГУ

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Свиряева, Ирина Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Активные формы кислорода и метаболиты оксида азота в прооксидантных и антиоксидантных процессах в клетках миокарда.

1.1.1. Активные формы кислорода и некоторые их свойства.

1.1.2. Образование активных форм кислорода митохондриями сердца.

1.1.3. Нарушения метаболизма кардиомиоцитов, вызванные ишемией.

1.1.4. Нарушения метаболизма кардиомиоцитов, вызванные адриамицином

1.1.5. Активные формы азота и их свойства.

1.1.6. Активные формы азота в митохондриях.

1.1.7. Динитрозильные комплексы железа с тшоловыми лигандсши.

1.2. Антиоксиданты.

1.2.1. Коэнзим Q — переносчик электронов митохондриальной дыхательной цепи и антиоксидант.

1.2.2. Митохондриально-направленные антиоксиданты.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Получение изолированных митохондрий.

2.2. Определение функциональной активности митохондрий.

2.3. Регистрация спектров ЭПР.

2.4. Определение абсолютных значений скоростей генерации супероксидных радикалов.

2.5. Получение динитрозильных комплексов железа и запись спектров ЭПР.;.

2.6. Исследование свободнорадикальных форм производных убихинона и пластохинона.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Функциональная активность митохондрий сердца.

3.2. генерация супероксидных радикалов в митохондриях сердца в комплексе iii дыхательной цепи.

3.3. генерация супероксидных радикалов в изолированных митохондриях сердца: эффект гипоксии-реоксигенации.

3.4. Образование супероксидных радикалов в изолированных митохондриях сердца: эффект адриамицина (доксорубицина).

3.5. Взаимодействие N0 и ДНКЖ с митохондриями, генерирующими супероксид.

3.6. Свободнорадикальные интермедиа ты (семихиноны) митохондриально-направленныхантиоксидантов и их аналогов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Свободные радикалы кислорода и антиоксиданты в митохондриях сердца и модельных системах"

В настоящее время можно считать доказанным, что вклад митохондрий в функции клеток сердечной мышцы значительно шире, чем только роль в энергетическом метаболизме кардиомиоцитов в качестве основного поставщика АТР. Митохондрии сердца имеют ключевое значение в регуляторных и сигнальных процессах, являющихся ответом на физиологические стрессы, такие как гипоксия и реоксигенация, нарушение баланса между прооксидантными и антиоксидантпыми процессами в клетках, действие различных гормонов и фармакологических препаратов. В связи с крайне важной ролью митохондрий в жизнедеятельности клеток, в последнее десятилетие огромное внимание уделяется исследованию т.н. митохондриальных болезней, которые включают нарушения, тем или иным образом влияющие на митохондриальные функции и/или вызваны повреждениями митохондриальной ДНК. В случае митохондриальиых болезней, клетки подвержены окислительному дисбалансу. Основное воздействие при этом испытывают органы с интенсивным окислительным метаболизмом и высокой энергетической потребностью: сердце, скелетные мышцы, почки и печень.

Необратимые повреждения компонентов клеток миокарда, являющиеся, в конечном счете, причиной их гибели в результате апоптоза и/или некроза, в первую очередь, обусловлены избыточным образованием активных форм кислорода и токсичных метаболитов оксида азота в условиях окислительного стресса. Образование свободных радикалов кислорода в биологических системах происходит постоянно и является как прямым результатом функционирования специальных ферментативных систем, так и следствием побочного процесса множества окислительно-восстановительных реакций. Значительный интерес в отношении короткоживущих свободных радикалов кислорода (время жизни супероксида ~10'6 с, гидроксильного радикала ~10~9 с) обусловлен, прежде всего, их высокой химической активностью. Наличие неспаренного электрона на л*2р-орбитали кислорода приводит к тому, что окисление практически любого клеточного компонента (мембранных липидов, белков и нуклеиновых кислот) становится термодинамически выгодным процессом. В обычных условиях, когда скорость образования активных форм кислорода и азота относительно невысока, антиоксидантные системы клетки в состоянии не допускать возникновения окислительного стресса. Однако, в условиях пониженного энергетического метаболизма клеток миокарда, при существенном увеличении внутриклеточной концентрации кислорода, могут происходить значительные сдвиги в редокс-потенциалах переносчиков дыхательной цепи, способствующие резкому возрастанию скорости генерации митохондриями свободных радикалов кислорода. Применение ингибиторов электронного транспорта, обладающих специфичностью по отношению к различным участкам дыхательной цепи, позволяет установить расположение центров, наиболее активно генерирующих супероксидные радикалы, а также оценить относительный вклад каждого из этих центров в суммарную величину скорости образования активных форм кислорода в митохондриях.

Хорошо известно, что активные формы кислорода и азота участвуют в развитии патологических состояний сердечной мышцы, возникающих после длительной ишемии. Ишемия характеризуется недостаточным снабжением ткани кислородом и необходимыми метаболитами и обусловлена нарушениями в системе кровообращения. Вследствие энергетической недостаточности во время ишемии происходит активация анаэробного гликолиза, направленного на синтез АТР, тем не менее, гликолиза оказывается недостаточно для обеспечения потребностей клеток миокарда. Как результат, в клетках возникают множественные нарушения ионного гомеостаза, следствием которых является невозможность нормального функционирования сердечной мышцы. Следующая за длительной ишемией реоксигенация миокарда сопровождается значительными тканевыми повреждениями и нарушениями сократительной функции - появлением аритмий и временной механической дисфункции. Это явление, получившее название "кислородный парадокс", обусловлено резким увеличением образования активных форм кислорода при восстановлении нормального уровня внутриклеточного кислорода.

Адриамицин (доксорубицин) - антибиотик, являющийся одним из наиболее часто применяемых лекарственных препаратов при химиотерапии злокачественных опухолей человека. В то же время хорошо известно, что адриамицин характеризуется рядом нежелательных побочных эффектов, в первую очередь, значительной кардиотоксичностью. Опубликовано множество работ, авторами которых были предложены разнообразные молекулярные механизмы, объясняющие вызываемую адриамицином кардиотоксичность. В настоящее время считается, что терапевтическое и кардиотоксическое действия адриамицина представляют собою единый мультифакторный процесс, инициированный окислительным стрессом и приводящий, в конечном счете, к апоптозу — процессу запрограммированной гибели клеток. Важным фактором, который может опосредовать токсическое действие адриамицина на клетки сердечной мышцы, является высокое сродство адриамицина к кардиолипину — анионному фосфолипиду, специфичному для внутренней мембраны митохондрий. Кардиолипин важен не только для структуры и функций митохондрий, по также для общего энергетического метаболизма и выживания клетки. Связывание адриамицина с митохондриальной мембраной ведет к изменению ее свойств, при этом изменяется функционирование электронных переносчиков в мембране. Таким образом, накопление редокс активного адриамицина в митохондриях сердца должно усиливать генерацию активных форм кислорода и азота этими органеллами.

В связи с тем, что митохондрии являются главным источником активных форм кислорода в клетке, эти оргапеллы нуждаются в постоянной защите от повреждений, вызываемых окислительным стрессом. Такая защита обеспечивается ферментативными системами, а также различными низкомолекулярными антиоксидантами. Наиболее важными среди антиоксидантов оказались коэнзим Q и витамин Е. Однако, их использование недостаточно эффективно. Одной из причин этого, возможно, является то, что только очень малые количества таких антиоксидантов могут проникнуть сквозь клеточные мембраны и достигнуть митохондрий. Поэтому решением этой проблемы было изобретение антиоксидантов, избирательно накапливающихся в митохондриях.

Такие митохондриально-направленные антиоксиданты получили, присоединив трифенилфосфоний - липофильиый катион к убихинону (mitoQ) или «-токоферолу (mitoVitE). Полученные антиоксиданты легко проходят через биологические мембраны и в несколько сот раз лучше накапливаются внутри митохондрий, обеспечивая эффективную защиту от окислительного стресса. Оказалось, что при незначительном увеличении дозы mitoQ он может вести себя как прооксидант, что ограничивает его применение в медицине. Поэтому были предприняты попытки создать другой возобновляющийся ангиоксидант, не обладающий подобным побочным действием. Этого удалось добиться, заменив убихиноп на пластохинон (SkQl). В одинаковых условиях для miloQ концентрации, вызывающие анги- и прооксидапгное действие, различались меньше, чем в два раза, а для SkQl это различие возросло до тридцати раз.

Диссертация посвящена исследованию механизмов образования и превращения свободных радикалов кислорода и метаболитов оксида азота в организме и изучению характеристик свободнорадикальных интермедиатов митохондриально направленных антиоксидантов — производных убихинона и пластохинона.

Цель работы

Задачи работы

Исходя из поставленной цели, в диссертации решались следующие задачи: 1. Изучение влияния длительности гипоксии и реоксигенации на генерацию активных форм кислорода митохондриями сердца и функциональные характеристики дыхательной цепи митохондрий.

2. Изучение воздействия адриамицина — противоопухолевого препарата широкого спектра действия — на генерацию супсроксидных радикалов митохондриями сердца.

3. Выяснение взаимосвязи между генерацией активных форм кислорода митохондриями сердца и образованием и деструкцией динитрозильных комплексов железа.

4. Определение спектральных и кинетических характеристик ссмихинопов митохондриально-направленных антиоксидантов - производных убихинопа и пластохинона - и их аналогов.

Научная новизна

Основными новыми результатами и положениями, которые составляют предмет диссертации, являются:

1. С помощью спектроскопии ЭПР спиновых ловушек впервые изучена кинетика образования и гибели активных форм кислорода в изолированных митохондриях сердца в условиях небольшого парциального давления кислорода в среде инкубации.

2. Впервые показано, что гипоксия и последующая реоксигенация изолированных митохондрий сердца приводят к увеличению скорости генерации супероксидных радикалов, однако, в отличие от митохондрий, выделенных после ишемии-реперфузии миокарда, эффект не зависит от длительности периода гипоксии.

3. Впервые продемонстрировано, что адриамицин - противоопухолевый препарат широкого спектра действия — вызывает изменения в митохондриях сердца, приводящие к значительному увеличению скорости генерации супероксидпых радикалов, обусловленному взаимодействием с молекулярным кислородом электронных переносчиков комплекса III и свободнорадикальпых интермедиатов редокс-цикла адриамицина.

4. Впервые обнаружено, что дипитрозильные комплексы железа могут являться перехватчиками активных форм кислорода в системах, моделирующих окислительный стресс в клетках сердечной мышцы.

5. Проведено исследование спектральных и кинетических характеристик семихинонных свободных радикалов митохондриально-направленных антиоксидантов - производных убихинона и пластохинона — и их аналогов. Впервые показано, что анион-радикалы mitoQ, SkQl, SkQ3 и их коротко-цепочечные аналоги отличаются существенным образом распределением плотности неспаренного электрона по атомам хиноидиого кольца.

6. Впервые установлено, что митохондриально-направленные антиоксиданты mitoQ и SkQl могут действовать также как прооксидаиты и образовывать в модельных системах супероксидные радикалы в процессе одноэлектронного окисления молекулярным кислородом.

Научно-практическая ценность диссертации

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Свиряева, Ирина Владимировна

выводы

1. Гипоксия и последующая реоксигенация приводит к увеличению скорости генерации супероксидных радикалов изолированными митохондриями сердца. В отличие от митохондрий, выделенных после ишемии-реперфузии миокарда, эффект не зависит от длительности гипоксии.

2. Адриамицин (доксорубицин) - противоопухолевый препарат широкого спектра действия — вызывает изменения в митохондриях сердца, приводящие к значительному увеличению скорости генерации супероксидных радикалов, что частично может быть связано с образованием свободных радикалов (семихинонов) адриамицина и их взаимодействием с молекулярным кислородом.

3. Нитрозильные комплексы железа являются перехватчиками активных форм кислорода в системах, моделирующих окислительный стресс в клетках сердечной мышцы.

4. Свободные анион-радикалы mitoQ, SkQl и их аналогов, являющиеся промежуточными продуктами в окислительно-восстановительных реакциях хиноидных соединений, существенным образом отличаются по распределению плотности неспаренного электрона по углеродным атомам хиноидного кольца.

5. Митохондриально направленные антиоксиданты mitoQ и SkQl могут действовать как прооксиданты — образовывать супероксидные радикалы при одноэлектронном окислении молекулярным кислородом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При патологических процессах скорость образования свободных радикалов кислорода, а также токсичных метаболитов оксида азота может возрастать настолько, что антиоксидантные системы клеток миокарда не смогут их нейтрализовать и возникает окислительный стресс. В наиболее острой форме он возникает в начальной стадии реперфузии и является одной из основных причин повреждения ткани сердечной мышцы. В нашей работе изучены некоторые аспекты возможных последствий окислительного стресса, приводящего к нарушениям функций и структуры митохондрий сердца. Проведен анализ возможных путей защиты митохондриальных мембран от воздействия активных форм кислорода и азота.

Проведенное нами исследование продемонстрировало возможности спектроскопии ЭПР как удобного и чувствительного метода для изучения закономерностей образования активных форм кислорода и метаболитов оксида азота в митохондриях клеток сердечной мышцы и модельных системах. В качестве спиновой ловушки использовался TIRON -проникающий в клетки эффективный антиоксидант. Нами показано, что скорость генерации супероксидных радикалов на границе внутренней мембраны митохондрий с межмембранным пространством определяется функциональным состоянием дыхательной цепи и проявляет отчетливо выраженную субстратную зависимость. На основании ингибиторного анализа можно выделить два участка дыхательной цепи, принимающие активное участие в образовании супероксидных радикалов: NADH-CoQ редуктазное звено (комплекс I) и Ьсх сегмент (комплекс III).

Ранее нами было показано, что скорость образования супероксидных радикалов в митохондриях, выделенных из сердечной мышцы после длительной ишемии, была значительно выше, чем в митохондриях из сердец контрольной группы. В данной работе нами продемонстрировано, что в случае изолированных митохондрий сердца, чередование циклов гипоксияреоксигенация также сопровождается увеличением скорости генерации супероксидных радикалов. Однако, в отличие от митохондрий, выделенных после ишемии миокарда, скорость генерации супероксида изолированными митохондриями практически не зависела от длительности периода гипоксии.

Адриамицин (доксорубицин) - антибиотик тетрациклинового ряда -является в настоящее время одним из наиболее используемых в клинической практике противоопухолевых лекарственных препаратов. Как лекарственный препарат, адриамицин весьма эффективен, однако, характеризуется значительной кардиотоксичностью. Известно, что кардиотоксичность адриамицина обусловлена в значительной степени его воздействием на митохондрии. Нами показано, что увеличение скорости генерации активных форм кислорода митохондриями при воздействии адриамицина, может происходить как вследствие модификации липидного окружения электронных переносчиков, так и вследствие прямого взаимодействия свободнорадикальных интермедиатов адриамицина с молекулярным кислородом.

Необходимо отметить, что наиболее благоприятные условия для образования гидроксильного радикала имеются в митохондриях. Возможно, что образование ДНКЖ может быть способом спасения от окислительного дисбаланса митохондрий, так как позволяет связать в этих комплексах одновременно NO и ионы «свободного» железа. В связи с этим, мы исследовали взаимодействие цистеиновых ДНКЖ с супероксидными радикалами, генерируемыми изолированными митохондриями сердца. Оказалось, что появление супероксидных радикалов в среде инкубации ускоряет распад ДНКЖ. Следовательно, ДНКЖ являются достаточно эффективными протекторами, способными защищать клетки миокарда от активных форм кислорода.

В настоящее время во многих лабораториях мира ведутся интенсивные исследования митохондриально-направленных антиоксидангов. Нами проведено исследование кинетических характеристик и спектральных параметров свободнорадикальных интермедиатов ряда производных убихинона и пластохинона и их короткоцепочечных аналогов. Показано, что кинетика образования и гибели свободных радикалов mitoQ, SkQl и их аналогов, а также параметры сверхтонкой структуры их спектров ЭПР существенным образом зависят как от структуры хиноидного кольца, так и от боковых групп.

Полученные данные показывают, что равновесие между прооксидантными и антиоксидантными процессами в клетках сердечной мышцы может зависеть от соотношения между супероксидными радикалами, оксидом азота и динитрозильными комплексами железа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Свиряева, Ирина Владимировна, Москва

1. Владимиров Ю.А., Азизова О.А. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. Биофизика. 1991. Т. 29. С. 252.

2. Kellogg E.W., Fridovich I. Superoxide, hydrogen peroxide, and singlet oxygen in lipid peroxidation by a xanthine oxidase system. // J. Biol. Chem. 1975. V. 250 (22). P. 8812-8817.

3. Chance В., Sies H., Boveris A., Hydroperoxide metabolism in mammalian organs. // Physiological Reviews. 1979. V. 59 (3). P. 527-605.

4. Fridovich 1. Biological Effect of the Superoxide Radical. // Arch. Biochem. Biophys. 1986. V.247 (1). P. 1-11.

5. Hayakawa M., Ogava Т., Sigiyama S., Ozava T. Hydroxyl Radical and Leucotoxin biosinthesis in neutrophyl plasma membrane. // Biochem. Biophys. Res. Comraun. 1989. V. 161 (3).P. 1077-1085.

6. Schubert J. Wilmer J.W. Does Hydrogen peroxide exist "Free" in biological systems?//Free Rad. Biol. Med. 1991. V. 11 (6). P. 545-555.

7. Pryor W.A. Oxy-Radicals and Related Species: Their Formation, Lifetimes and Reactions. // Ann. Rev. Physiol. 1986. V. 48. P. 657-667.

8. Кулинский В.И. Лекционные таблицы по биохимии. 1994.

9. Farre A.L., Casado S. Heart Failure, Redox Alterations, and Endothelial Dysfunction. //Hypertension. 2001. V. 38 (6). P. 1400-1405.

10. Lenaz G. Role of mitochondria in oxidative stress and ageing. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1366. P. 53-67.

11. Benzie I.F. Evolution of antioxidant defence mechanisms. // Eur. J. Nutr. 2000. V. 39 (2). P. 53-61.

12. Lankin V. The enzymatic systems in the regulation of free radical lipid peroxidation. // Free Radicals, Nitric Oxide, and Inflammation: Molecular, Biochemical, and Clinical Aspects. Amsterdam etc.: IOS Press. NATO Science Series. 2003. V. 344. P.8-23.

13. Зенков Н.К., Кандалинцева Н.В., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б., Просенко А.Е. Фенольные антиоксиданты. // Новосибирск.: Изд-во СО РАМН. 2003. С. 328.

14. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс. Биохимические и патофизиологические аспекты. // Москва. МАИК «Наука/Интерпериодика». 2001. С. 343.

15. Duranteau J., Chandel N.S., Kulisz A., Shao Z., Schumacker T. Intracellular Signaling by Reactive Oxygen Species during Hypoxia in Cardiomyocytes. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273 (19). P. 11619-11624.

16. Cadenas E., Davies K.J.A. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. // Free Rad. Biol. Med. 2000. V. 29 (3/4). P. 222-230.

17. Liu S. Generation, Partitioning, Targetion and Functioning of Superoxide in Mitochondria. //Bioscience Reports. 1997. V. 17 (3). P. 259-271.

18. DhallaN.S., Temsah R.M., Netticadan T. Role of oxidative stress in cardiovascular diseases. // J. Hypertens. 2000. V. 18 (6). P. 655-673.

19. Singh N., Dhalla A.K., Seneviratne C., Signal P.K. Oxidative stress and heart failure. // Mol. Cell Biochem. 1995. V. 147 (1-2). P. 77-81.

20. Korshunov S.S., Skulachev V.P., Starkov A.A. High protonic potential actuates a mechanism of production of rcactive oxygen species in mitochondria. // FEBS Lett. 1997. V. 416 (1).P. 15-18.

21. McLennan H.R., Esposti M.D. The Contribution of Mitochondrial Respiratory Complexes to the Production of Reactive Oxygen Species. // J. Bioenerg. Biomembr. 2000. V. 32 (2). P. 153-162.

22. St-Pierre J., Buckingham J.A., Roebuck S.J., Brand M.D. Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277 (47). P. 44784-44790.

23. Trumpower B.L. The protonmotive Q cycle. Energy transduction by coupling of proton translocation to electron transfer by the cytochrome bcl complex. // J. Biol. Chem. 1990. V. 265 (20). P. 11409-11412.

24. Demin O.V., Kholodenko B.N., Skulachev V.P. A model of 0'{ generation in the complex III of the electron transport chain. // Mol. Cell. Biochem. 1998. V. 184 (1-4). P. 21-33.

25. Chen Q., Vazquez E.J., Moghaddas S., Hoppel C.L. Production of Reactive Oxygen Species by Mitochondria. Central role of complex III. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278 (38). P. 36027-36031.

26. Gille L., Nohl H. The ubiquinol/bcl redox couple regulates mitochondrial oxygen radical formation. // Arch. Biochem. Biophys. 2001. V. 388 (1). P. 34-38.

27. Han D., Antunes F., Canali R., Rettori D., Cadenas E. Voltage-dependent Anion Channels Control the Release of the Superoxide Anion from Mitochondria to Cytosol. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278 (8). P. 5557-5563.

28. Das D.K., George A. Liu X.K., Rao P.S. Detection of hydroxyl radical in the mitochondria of ischemic-reperfused myocardium by trapping with salicylate. // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989. V. 165 (3). P. 1004-1009.

29. Леденев A.H., Рууге Э.К. Генерация супероксидных радикалов митохондриями сердца в условиях ишемии. // Бюлл. экспер. биол. мед. 1985. Т. 100 (9). С. 303-305.

30. McRae D.G, Baker J.E., Thompson J.E. // Plant Cell Physiol. 1982. V. 23. P. 375.

31. Григолава И.В., Ксензенко М.Ю. Тайрон как спиновая ловушка для супероксидных радикалов, образуемых дыхательной цепью субмитохондриальных частиц. // Биохимия. 1980. Т. 45 (1). С. 75-82.

32. Леденев А.Н., Попова Е.Ю., Константинов А.А., Рууге Э.К. Регистрация образования супероксидных радикалов интактными митохондриями сердца с помощью спиновой ловушки. // Биофизика. 1985. Т. 30 (4). С. 708-709.

33. Леденев А.Н., Пучпина Е.А., Музыкантов В.Р., Рууге Э.К. Метод измерения скорости образования супероксидных радикалов нейтрофилами человека спомощью спиновой ловушки тайрона. // Журнал физической химии. 1990. Т. 64 (11). С. 3087-3093.

34. Chandra J., Samali A., Orrenius S. Triggering and modulation of apoptosis by oxidative stress. // Free Rad. Biol. Med. 2000. V. 29 (3-4). P. 323-333.

35. Skulachev V.P. Mitochondria in the programmed death phenomena; a principle of biology: "it is better to die than to be wrong" // IUBMB Life. 2000. V. 49 (5). P. 365373.

36. Liu Z., Li Z., Liu X. Effect of ginsenoside Re on cardiomyocyte apoptosis and expression of BCL-2/Bax gene after ischemia and reperfusion in rats. // J. Huazhong. Univ. Sci Technolog. Med. Sci. 2002. V. 22 (4). P. 305-309.

37. Eefting F., Rensing В., Wigman J., Pannekoek W.J., Liu W.M., Cramer M.J., Lips D.J., Doevendans P.A. Role of apoptosis in reperfusion injury. // Cardiovasc. Res. 2004. V. 61 (3), P. 414-426.

38. Cook S.A., Poole-Wilson P.A. Cardiac myocyte apoptosis. // Eur. Heart J. 1999. V. 20 (22). P. 1619-1629.

39. Green P.S., Leeuwenburgh C. Mitochondrial dysfunction is an early indicator of doxorubicin-induced apoptosis. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. .1588 (1). P. 94101.

40. Ambrosio G., Zweier J.L., Becker L.C. Apoptosis is prevented by administration of superoxide dismutase in dogs with reperfused myocardial infarction. // Basic Res. Cardiol. 1998. V. 93 (2). P. 94-96.

41. Piot C.A., Padmanaban D., Ursell P.C., Sievers R.E., Wolfe C.L. Ischemic preconditioning decreases apoptosis in rat hearts in vivo. // Circulation. 1997. V. 96 (5). P. 1598-1604.

42. Hearse D.J. Reperfusion of the ischemic myocardium. // J. Moll. Cell. Cardiol. 1977. V. 9(8). P. 605-616.

43. Minotti G., Menna P., Salvatorelli E., Cairo G., Gianni L. Anthracyclines: molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity. // Pharmacol Rev. 2004. V. 56. P. 185-229.

44. Majno G., Joris I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. // Am. J. Pathol. 1995. V. 146. P. 3-15.

45. Schlame M., Rua D., Greenberg M.L. The biosynthesis and functional role of cardiolipin. // Prog Lipid Res. 2000. V. 39. P. 257-288.

46. Das Т.К., Mazumdar S. Effect of adriamycin on the boundary lipid structure of cytochrom с oxidase: pico-second time-resolved fluorescence depolarization studies. // Biophys. Chem. 2000. V. 86 P. 15-28.

47. Cheneval D., Muller M., Carafoli E. The mitochondrial phosphate carrier reconstituted in liposomes is inhibited by doxorubicin. // FEBS Lett. 1983. V. 159. P. 123-126.

48. Minotti G., Menna P., Salvatorelli E., Cairo G., Gianni L. Anthracyclines: molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity. // Pharmacol. Rev. 2004. V. 56. P. 185-229.

49. Gewirtz D.A. A critical evaluation of the mechanisms of action proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin. // Biochem. Pharmacol. 1999. V. 57. P. 727-741.

50. Fogli S., Nieri P., Breschi M.C. The role of nitric oxide in anthracycline toxicity and prospects for pharmacologic prevention of cardiac damage. // Faseb. J. 2004. V. 18. P. 664-675.

51. Minotti G., Recalcati S., Menna P., Salvatorelli E., Corna G., Cairo G. Doxorubicin cardiotoxicity and the control of iron metabolism: quinonedependent and independent mechanisms. // Methods Enzymol. 2004. V. 378. P. 340-361.

52. Wallace K.B. Doxorubicin-induced cardiac mitochondrionopathy. // Pharmacol. Toxicol. 2003. V. 93. P. 105-115.

53. Pacher P., Schulz R., Liaudet L., Szabo C. Nitrosative stress and pharmacological modulation of heart failure. // Trends Pharmacol. Sci. 2005. V. 26. P. 302-310.

54. Wallace K.B. Adriamycin-induced interference with cardiac mitochondrial calcium homeostasis. // Cardiovasc. Toxicol. 2007. V. 7. P. 101-107.

55. Feng W., Liu G., Xia R., Abramson J.J., Pessah I.N. Site-selective modification of hyperreactive cysteines of ryanodine receptor complex by quinones. // Mol. Pharmacol. 1999. V. 55. P. 821-831.

56. Papadopoulou L.C., Tsiftsoglou A.S. Mitochondrial cytochrome с oxidase as a target site for daunomycin in K-562 cells and heart tissue. // Cancer Res. 1993. V. 53. P. 1072-1078.

57. Jain D. Cardiotoxicity of doxorubicin and other anthracycline derivatives. // J. Nucl. Cardiol. 2000. V. 7. P. 53-62.

58. Abe K., Hayashi N., Terada H. Effect of endogenous nitric oxide on energy metabolism of rat heart mitochondria during ischemia and reperfiision. // Free Rad. Biol. Med. 1999. V. 26 (3/4). P. 379-387.

59. Stuehr D.J., Marietta M.A. Induction of nitrite/nitrate synthesis in murine macrophages by BCG infection, lymphokines, or interferon-gamma. // J. Immunol. 1987. V. 139(2). P. 518-525.

60. Bredt D.S., Snyder S.H. Isolation of nitric oxide synthase, a calmodulin-requiring enzyme. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87 (2). P. 682-685.

61. Moncada S., Higgs A. L-Arginine-nitric oxide pathway. // N. Engl. J. Med. 1993. V. 329(27). P. 2002-2012.

62. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин В.Е., Косицын Н.С. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих. Москва. Наука. 1998. С. 37-41.

63. Ignarro L.J., Kadowitz P.J. The pharmacological and physiological role of cyclic GMP in vascular smooth muscle relaxation. // Ann. Pharmacol. Toxicol. 1985. V. 25. P. 171-191.

64. Radomski M.W., Palmer R.M.J., Moncada S. The anti-aggregating properties of vascular endothelium: interactions between prostacyclin and nitric oxide. // Br. J. Pharmacol. 1987. V. 92 (3). P. 639-646.

65. HoogN. //Free Rad. Biol. Med. 2000. V. 28. P. 1478-1486.

66. Patel R.P., McAndrew J., Sellak H„ White C.R., Jo II., Freeman B.A., Darley-Usmar V.M. Biological aspects of reactive nitrogen species. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1411 (2-3). P. 385-400.

67. Butler A.R., Rhodes P. Chemistry, analysis and biological roles of S-nitrosothiols. //Anal. Biochem. 1997. V. 249 (1). P. 1-9.

68. Vanin A.F., Stukan R.A., Manukhina E.B. Physical properties of dinitrosyl-iron complexes with thiol-containing ligands in relation with their vasodilator activity. // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1295 (1). P. 5-12.

69. Albina J.E., Reichner J.S. Role of nitric oxide in mediation of macrophage cytotoxity and apoptosis. // Cancer Metastasis Rev 1998. V. 17 (1). P. 39-53.

70. Borutaite V., Brown G.C. Nitric oxide induced apoptosis via hydrogen peroxide, but necrosis via energy and thiol depletion. // Free Rad. Biol. Med. 2003. V. 35 (11). P. 1457-1468.

71. Ushmorov A., Ratter F., Lehmann V., Droge W., Schirrmaher V., Umansky V. Nitric oxide-induced apoptosis in human leukemic lines requires mitochondrial lipid degradation and cytochrome с release. // Blood. 1999. V. 93 (7). P. 2342-2352.

72. Li J., Billiar T.R., Talanian R.V., Kim Y.M. Nitric oxide reversibility inhibits seven members of the caspase family via S-nitrosylation. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. V. 240 (2). P. 419-424.

73. Umansky V., Rocha M., Breitkreutz R., Hehner S., Bucur M., Erbe N., Droge W., Ushmorov A. Glutathione is a factor of resistance of Jurkat leukemia cells to nitric oxide-mediated apoptosis. // J. Cell Biochem. 2000. V. 78 (4). P. 578-587.

74. Kanai A., Peterson J. Function and regulation of mitochondrially produced nitric oxide in cardiomyocytes. // Am. J. Physiol. 2004. V. 286 (1). P. HI 1-PI12.

75. Giulivi C. Characterization and function of mitochondrial nitric-oxide synthase. // Free Rad. Biol. Med. 2003. V. 34 (4). P. 397-408.

76. Brudvig G.W., Stevens Т.Н., Chan S.I. Reactions of nitric oxide with cytochrome с oxidase. // Biochemistry. 1980. V. 19 (23). P. 5275-5285.

77. Cooper C.E. Nitric oxide and cytochrome oxidase: substrate, inhibitor or effector? // TRENDS in Biochem. Sci. 2002. V. 27 (1). P. 33-39.

78. Cooper C.E., Davies N.A. Effects of nitric oxide and peroxinitrite on the cytochrome oxidase Km for oxygen: implications for mitochondrial pathology. // Biochem. Biophys. Acta. 2000. V. 1459 (2-3). P. 390-396.

79. Murray J., Taylor S.W., Zhang В., Ghosh S.S., Capaldi R.A. Oxidative Damage to Mitochondrial Complex I Due to Peroxynitrite. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278 (39). P. 37223-37230.

80. Valdez L.B., Alvarez S., Arnaiz S.L., Schopfer F., Carreras M.C., Poderoso J.J., Boveris A. Reactions of peroxynitrite in the mitochondrial matrix. // Free Rad. Biol Med. 2000. V. 29 (3/4). P. 349-356.

81. Bringold U., Ghafourifar P., Richter C. Peroxynitrite formed by mitochondrial NO synthase promotes mitochondrial Ca2+ release. // Free Rad. Biol. Med. 2000. V. 29 (34). P. 343-348.

82. Poderoso J.J., Lisdero C., Schopfer F., Riobo N., Carreras M.C., Cadenas E., Boveris A. The Regulation of Mitochondrial Oxygen Uptake by Redox Reactions Involving Nitric Oxide and Ubiquinol. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274 (53). P. 3770937716.

83. Ma X.L., Gao F„ Liu G.-L., Lopez B.L., Christopher T.A., Fukuto J.M., Wink D.A., Feelisch M. Opposite effects of nitric oxide and nitroxyl on postischemic myocardial injury. // PNAS. 1999. V. 96 (25). P. 14617-14622.

84. Radi R., Beckman J.S., Bush K.M., Freeman B.A. Peroxinitrite induced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide. // Arch. Biochem. Biophys. 1991. V. 288 (2). P. 481-487.

85. Ischiropoulos H., al-Mehdi A.B. Peroxynitrite-mediated oxidative protein modifications. //FEBS Lett. 1995. V. 364 (3). P. 279-282.

86. Brookes P.S., Levonen A.-L., Shiva S., Sarti P., Darley-Usmar V.M. Mitochondria: regulators of signal transduction by reactive oxygen and nitrogen species. // Free Rad. Biol. Med. 2002. V. 33 (6). P. 755-764.

87. Borutaite V., Budriunaite A., Brown G.C. Reversal of nitric oxide-, peroxinitrite-and S-nitrosothyol-induced inhibition of mitochondrial respiration or complex I activity by light and thiols. // Biochem. Biophys. Acta. 2000. V. 1459 (2-3). P. 405412.

88. Chamulitrat W. Nitric oxide inhibited peroxyl and alkoxyl radical formation with concomitant protection against oxidant injury in intestinal epithelial cells. // Arch. Biochem. Biophys. 1998. V. 355 (2). P. 206-214.

89. Joshi M.S., Ponthier J.L., Lancaster J.R. Cellular antioxidant and pro-oxidant actions of nitric oxide. // Free Rad. Biol. Med. 1999. V. 27 (11-12). P. 1357-1366.

90. Shafer F.Q., Wang P.H., Kelley, Cueno K.L., Martin S.M., Buetter G.R. Comparing beta carotene, vitamin E and nitric oxide as membrane antioxidants. // J. Biol. Chem. 2002. V. 383 (3-4). P. 671-681.

91. Padmaja S., Huie R.E. The reaction of nitric oxide with organic peroxyl radicals. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. V. 195 (2). P. 539-544.

92. Kanner J., Harel S., Granit R. Nitric oxide as an antioxidant. // Arch. Biochem. Biophys. 1991. V. 289 (1). P. 130-136.

93. Oberle S., Schroder H. Ferritin May Mediate SIN-1-Induced Protection against Oxidative Stress. //Nitric Oxide. 1997. V. 1 (4). P. 308-314.

94. Juckett M.B., Weber M., Balla J., Jacob H.S., Vercellotti G.M. Nitric oxide donors modulate ferritin and protect endothelium from oxidative injury. // Free Rad. Biol. Med. 1996. V. 20 (1). P. 63-73.

95. Puntarulo S., Cederbaum A.I. Inhibition of ferritin stimulated microsomal production of reactive oxygen intermediates by nitric oxide. // Arch. Biochem. Biophys. 1997. V. 340 (1). P. 19-26.

96. Picard V., Epsztejn S., Santambrogio P., Cabantchik Z.I., Beaumont C. Role of ferritin in the control of the labile iron pool in murine erythroleukemia cells. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273 (25). P. 15382-15386.

97. Gutteridge J.M.C., Halliwell B. Free radicals and antioxidants in the year 2000. A historical look to the future. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2000. V. 899. P. 136-147.

98. Stadtman E.R., Levine R.L. Protein oxidation. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2000. V. 899. P. 191-208.

99. ReifD.W., Samokyszyn V.M., Miller D.M., Aust S.D. Alloxan- and glutathione-dependent ferritin iron release and lipid peroxidation. // Arch. Biochem. Biophys. 1989. V. 269 (2). P. 407-414.

100. Boyer R.F., Grabill T.W., Petrovich R.M. Reductive release of ferritin iron: a kinetic assay. //Anal. Biochem. 1988. V. 174 (1). P. 17-22.

101. Herold S., Rehmann F.-J. K. Kinetics of the reactions of nitrogen monoxide and nitrite with ferryl hemoglobin. // Free Rad. Biol. Med. 2003. V. 34 (5). P. 531-545.

102. McLeod L.L., Alayach A.I. Detection of a ferrylhemoglobin intermediate in an endothelial cell model after hypoxia-rcoxygenation. // Am. J. Physiol. 1999. V. 277 (1 Pt. 2). P. H92-H99.

103. Ванин А.Ф., Блюменфельд J1.A., Четвериков А.Г. Исследование комплексов негемового железа в клетках и тканях методом ЭПР. // Биофизика. 1967. Т. 12. С. 829-841.

104. Woolum J.C., Tiezzi Е., Commoner В. Electron spin resonance study of iron-nitric oxide complexes with amino acids, peptides and proteins. // Biochim. Biophys. Acta. 1968. V. 160. P. 311-320.

105. Woolum J.C., Commoner B. Isolation and identification of a paramagnetic complex from livers of carcinogen-treated rats. // Biochim. Biophys. Acta. 1970. V. 201. P. 131140.

106. Vanin A.F., Malenkova I.V., Serezhcnkov V.A. Iron catalyzes both decomposition and synthesis of S-nitrosothiols: optical and electron paramagnetic studies. //NitricOxide: Biol. Chem. 1997. V. 1. P. 191-203.

107. Vedernikov Yu.P., Mordvintcev P.I., Vanin A.F. Similarity between the vasorelaxing activity of dinitrosyl iron cysteine complexes and endothelium-delivered relaxing factor. //Eur. J. Pharmacol. 1992. V. 211. P. 313-317.

108. McDonald C.C., Philips W.D., Mower H.F. An electron spin resonance study of some complexes of iron, nitric oxide and anionic ligands. // J. Am. Chem. Soc. 1965. V. 87. P. 33193326.

109. Vanin A.F., Sanina N.A., Serezhenkov V.A., Burbaev D.Sh., Losinsky V.I., Aldoshin S.M. Dinitrosyl-iron complexes with thiol-containing ligands: Spatial and electronic structures. //Nitric Oxide: Biol. Chem. 2007. V. 16. P. 82-93.

110. Bonner F.T., Stedman G. The chemistry of nitric oxide and redox-relatcd species. In Methods of Nitric Oxide Research (Feelisch M and Stamler J.S., eds.) // John Wiley & Sons Ltd. New-York, 1996. P.3-18.

111. Reddy D., Lancaster J.R., Conworth D.P. Nitrite inhibition of Clostridium botulinum: Electron spin resonance detection of iron-nitric oxide complexes. // Science (Washington). 1983. V. 21. P. 769-770.

112. Aleryani S., Milo E., Rose Y., Kostka P. Superoxide-mediatcd decomposition of biological S-nitrosothiols. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 6041-6045.

113. Шумаев К.Б., Рууге Э.К., Панкин B.3., Вапин А.Ф., Гомбоева С.Б. Беленков Ю.Н. Механизм ингибирования свободнорадикального окисления (3-каротина S-нитрозоглутатионом и динитрозильными комплексами железа. // Докл. РАН. 2001. Т. 379 (6). С. 702-704.

114. Smeitink J., van den Heuvel L., DiMauro S. The genetics and pathology of oxidative phosphorylation. //Nat. Rev. Genet. 2001. V. 2. P. 342-352.

115. Taylor R.W., Turnbull D.M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. // Nat. Rev. Genet. 2005. V. 6. P. 389^02.

116. Finkel T. Radical medicine: treating ageing to cure disease. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. V. 6. P. 971-976.

117. Murphy M.P., Smith R.A.J. Drug delivery to mitochondria: the key to mitochondrial medicine. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2000. V. 41. P. 235-250.

118. Ланкин B.3., Тихазе A.K., Беленков Ю.Н. // Кардиология. 2000. Т. 40 (7). С. 48-61.

119. Зенков Н.К., Панкин В.З., Мепыцикова Е.Б. Окислительный стресс. Биохимические и патофизиологические аспекты. // Москва. МАИК «Наука/Интерпериодика». 2001. С. 343.

120. Landi L., Cabrini L., Sechi A.M., Pasquali P. Antioxidative effect of ubiquinones on mitochondrial membranes. // Biochem J. 1984. V. 222 (2). P. 463-466.

121. Sugiyama S., Takasawa M., Hayakawa M., Ozawa T. Changes in skeletal muscle, heart and liver mitochondria electron transport activities in rats and dogs of various ages. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1993. V. 30 (5). P. 937-944.

122. Langsjoen P.H., Langsjoen A.M. Overview of the use of CoQIO in cardiovascular disease. // Biofactors. 1999. V. 9 (2-4). P. 273-284.

123. Tran M.T., Mitchell T.M., Kennedy D.T., Giles J.T. Role of CoQIO in chronic heart failure, angina, and hypertension. // Pharmacotherapy. 2001. V. 21 (7). P. 797806.

124. Schriner S.E., Linford N.J., Martin G.M., Treuting P., Ogburn C.E., et al. Extension of murine life span by overexpression of catalase targeted to mitochondria. // Science 2005. V. 308. P. 1909-1911.

125. Murphy M.P. Development of lipophilic cations as therapies for disorders due to mitochondrial dysfunction. // Exp. Opin. Biol. Therapy. 2001. V. 1. P. 753-764.

126. Andersson C.M., Hallberg A., Hogbberg T. Advances in the development of pharmaceutical antioxidants. // Adv. Drug Res. 1996. V. 28. P. 65-180.

127. Smith- R.A.J., Kelso G.F., James A.M., Murphy M.P. Targeting coenzyme Q derivatives to mitochondria. // Meth. Enzymol. 2004. V. 382. P. 45-67.

128. Ross M.F., Kelso G.F., Blaikie F.FI., James A.M., Cocheme H.M., et al. Lipophilic triphenylphosphonium cations as tools in mitochondrial bioenergctics and free radical biology. // Biochemistry. 2005. V. 70. P. 222-230.

129. Liberman E.A., Topali V.P., Tsofina L.M., Jasaitis A.A., Skulachev V.P. Mechanism of coupling of oxidative phosphorylation and the membrane potential of mitochondria. //Nature 1969. V. 222. P. 1076-1078.

130. Flewelling R.F., Hubbell W.L. Hydrophobic ion interactions with membranes. // Biophys. J. 1986. V. 49. P. 531-540.

131. Honig B.H., Hubbell W.L., Flewelling R.F. Electrostatic interactions in membranes and proteins. // Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1986. V. 15. P. 163— 193.

132. Ono A., Miyauchi S., Demura M., Asakura Т., Kamo N. Activation energy for permeation of phosphonium cations through phospholipid bilayer membrane. // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 4312^1318.

133. Azzone G.F., Pietrobon D., Zoratti M. Determination of the proton electrochemical gradient across biological membranes. // Curr.Topics Bioenerg. 1984. V. 13. P. 1-77.

134. Liberman E.A., Skulachev V.P. Conversion of biomembrane-produced energy into electric form. IV. General discussion. // Biochim. Biophys. Acta. 1970. V. 216. P. 30—42.

135. Flewelling R.F., Hubbell W.L. The membrane dipole potential in a total membrane potential model. Applications to hydrophobic ion interactions with membranes. // Biophys. J. 1986. V. 49. P. 541-552.

136. Smith R.A.J., Porteous C.M., Coulter C.V., Murphy M.P. Targeting an antioxidant to mitochondria. // Eur. J. Biochem. 1999. V. 263. P. 709-716.

137. Kelso G.F., Porteous C.M., Coulter C.V., Hughes G., Porteous W.K., et al. Selective targeting of a redox-active ubiquinone to mitochondria within cells. // J.

138. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 4588^596.

139. Murphy M.P., Smith R.A.J. Targeting antioxidants to mitochondria by conjugation to lipophilic cations. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2007. V. 47. P. 629-656.

140. Muratovska A., Lightowlers R.N., Taylor R.W., Wilce J.A., Murphy M.P. Targeting large molecules to mitochondria. // Adv. Drug Delivery Rev. 2001. V. 49. P. 189- 198.

Информация о работе

Свиряева, Ирина Владимировна
кандидата физико-математических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.02

Диссертация

Свободные радикалы кислорода и антиоксиданты в митохондриях сердца и модельных системах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы