Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимосвязь перекисного окисления липидов и окислительного фосфорилирования в мотохондриях печени

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимосвязь перекисного окисления липидов и окислительного фосфорилирования в мотохондриях печени"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДША ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАЫ.ТИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи .УДК 577.352.38

ИВАНОВА Марина Валентиновна

ВЗАИМОСВЯЗЬ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИ1Щ0В И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ

03.00.02 - биофизика

Автореферат . диссертации на соискание у .еной степени кандидата биологических наук

Москва - 1990

Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического факультета Московского государственного университета им.

М.В.Ломоносова

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор И.И.Иванов

Научный консультант - кандидат биологических наук Л.Ф.Дмитриев

. Официальные оппоненты - доктор физико-математических

наук, профессор В.А.Твердислов - доктор биологических наук А.Я.Потапенко

Ведущее учеревдение - Институт биологической физики АН СССР / Пущино /

Защита диссертации, состоится "_" _ 1990 года

в __ часов на заседании Специализированного Совета V

К.053.05.68 по присуждению ученой степени кандидата наук по специальности "биофизика" в Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 117234, Москва, В-234, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_" 1990 г.

Ученый секретарь

Специализированного Совета К.053.05.68

кадщщат биологических наук Б.А.Гуляев

ОБЩАЯ'ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Перекисное окисление липвдов и участие в этом процессе кислородных радикалов при нормальных и патологических состояниях клеток животных уже в течении двух десятилетий привлекает пристальное вю*мание исследователей. Протекание свободно-радикальных процессов характерно для всех живых организмов. Во многих исследованиях показаны множественность и большое разнообразие процессов, приводящих к генерации активных форм кислорода в различных компартментах клетки и перекисному окислению липидов мембранных структур. Однако, до сих пор остается неясным какова роль перекисного окисления липидов в. нормальном метаболизме.

Начиная с работ МаЫег и МсХшдМ/хъы/ были получены многочисленные данные о влиянии липоперокевдацки на функционирование ферментных систем митохондрий, на структуру и такие свойства митохондриаяьных мембран как проницаемость и устойчивость белок-липидных комплексов, гя функциональную активность митохондрий в целом /обзор ИтйоШ, 1988/.

В большинстве этих работ перекисное окисление липидов инициировалось тем или иным способом. Исследованию перекисного окисления липидов, протекающего в мембранах митохондрий в отсутствии инициатора, т.е. целиком зависимого от электронного транспорта посьлцены лишь отдельные работы /Ситковский и Г '., 1973/.;

.. При исследовании окислительного фосфорилирования необходимо учитывать,, что липидное окружение мембранных ферментов является не только матрицей, но и средой, определяютей их специфическую конфигурацию, подвижность. Липидный состав, уровень окисленности и вязкость мембраны тесно взаимосвязаны и влияют на активность мембранных ф рментов /Бурлакова, 1978; Хепаг, 197.4/. В связи с эт;...1 очень важны исследования окислительного фосфорилирования в митохондриях при том или ином воздействии на липидную фазу: в частности, при воздействии тро- и антиоксидантов.

Проблема вза;_.гасвязн двух процессов, перекисного окисле-1ия липидов и окислительного фосфорнчирования в митохондриях гечени начата детально исследоваться лишь в последнее время %штриев и др., 1985/ в связи, с проблемой регуляции синтеза

АТФ. йнтэгес предсташшет и возможное участие в процессе фос-форилирования активных п* эдуктов перекисного окисления липидов. Необходимость некоего продукта перекисного окисления липидов в условиях анаэробиоза /транспорт электронов на ферри-цианвд/ для осуществления окислительного фосфорилнрования била показана в работе Кондрашовой и-Мироновой /1971/. В последние годы собираются доказательсьва и появляются новые факты, которые позволяют предположить, что наличие д^м'гГ1" является необходимым, но не достаточным условием синтеза АТФ /Soye-z, 197?; Vfeoiezhott and Слеп, 1985; SEalez, 1937/; вновь получают распространение представления об участии интеркеди-ата во внугркмембранном переносе энергии, и поэтому весьма актуально выяснения природы кнтергледиата. В связи с этим представляет интерес изучение взаимосвязи двух процессов: гэрекис-ного окисления липидов и мембранного фосфорилнрования и иссле-д заниэ влияния антиоксидантоз на оба процесса.

Цачь к зяттачк исследования. Настоящая работа посвящена изучению перекисного окисления липидов и роли липидов в регуляции синтеза АТФ в митохондриях печени. В число задач работы входило:

- Изучение перэкисного окисления китохокдриатьных липидов, зависимого от электронного транспорта /окисления субстрата/, т.е. в отсутствие ионов Fe^+ и других инициаторов.

- Исследование влияния ингибиторов электронного транспорта и разобщителей окислительного фосфорилировакия на пе-рекисное окисление липидов гд:тохокдркальных мембран.

- Изучение влияния ионов Ге +, пропилгатлата и других факторов, которые стимулируют или ингибпруют образование ли-г.идных радикалов, на окислительное фосфорилиг.азание.

Такие соединения как прояиягаляат к гонол являются ловуз-ка\ш лигоганых радикалов, обладают антиоксЕяатгваыхя функциями; валко было изучить влияние на окислительное фосфорили-рование к классифицировать их действие. Такое изучение позволяет судить о взаимосвязи двух процессов: перекисного обеления липидов и окислительного фосфосхг.фозааая в ¡митохондриях.

Научная новизна работы. Проведено исследование зависимости интенсивности перекисного окисления о: фунш:она.тького сос-

тояния митохондрий: впервые показано, что переход митохондрий в фосфорилирующее состояние сопровождается ингибированием пере-кисного окисления липидов.

Исследованы дыхание и синтез АТФ в митохондриях при действии факторов, регулирующих концентрацию радикалов: пропил -галлата - ловушки липидных радикалов; Ре2+, НАИН, УФ-облучения, ионизирующего излучения, которые стимулируют образование липидннх радикалов. Устаноатено, что на процесс фосфорилированкя влияют не только разобщители - протонофоры, но и разобщители другого типа - соединения, снижающие концентрацию липидннх радикалов. Впервые показано существование гибкой регуляции синтеза АТФ за счет поддержания соответствующего уровня липидннх радикалов.

В дополнение представлениям о перекисном окислении липидов как о повреждачзцем факторе в работе впервые показано существование равновесия между образованием и утилизацией лкпидних радикалов необходимого для функционирования механизма преобразования энергии. Обнаруженные закономерности указывают на тесную взаимосвязь двух процессов - перекисиого окисления липидов и окислительного фосфорилировалия в митохондриях печени. Полученные данные свидетельствуют в пользу предположения об участии свободнорадккального лкпидного кнтермедиата в преобразовании энергии. Работа являемся необходимы;.! этапом в изучении механизм" трансформации энергии в мембранах митохондрии, одной из важных проблем биоэнергетики.

Практическая значимость работы. Полученные результаты вносят определенный вклад в изучение процессов перекисного окисления липидоз и механизмов екз регуляции ь мембранах митохондрий, а такке в исследовании механизма регуляции синтеза АТФ з митохондриях.

Знание механизма ре гуля :и синтеза АТФ валю для целенап-зазленного воздействия на систему окислительного фосфорилиро-зания в клетках при интенсивной работе и развитии патслогичос-сих состояний. Поскольку исследованная ^пгуляция реализуется ; :рез липидную фас/, то воздействие на состав липвдои и пкрещеное окисление, в частности, воздействие ачтиокендачтамн, южет оказаться хорошим инструментом управления системой син-еза АТФ. Результаты работы могут бить использованы в дальноЙ-кх теоретичес!сих и лршел одних исследованиях энергетических

процессов в митохондриях при различных патологических.состо- . яниях.

Апробация работы. Материалы, изложенные в диссертации, . докладывались на научных семинарах кафедры биофизики Биологического факультета и кафедры биофизики Физического факультета МГУ /1990/, Института биологической физики АН СССР /Дущино/, на Всесоюзной конференции "Перекисное окисление липидов и стресс /Ереван, 1990/.

Публикации. По теме диссертации опубликовано три печатных работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсудце-ния, заключения, выводов и списка цитированной литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 'ИССЛЕДОВАНИЯ ; : .

В качестве объекта исследования были использованы митохондрии, выделенные из печени беспородных белых крыс - самцов ; . традиционным методом дифференциального центрифугирования. /Сот-токаза Дя., 1979/. Среда выделения:;0.25 М сахароза, 0.25 ЭДТА, 5 мМНереэ, рН 7.2. Качество .выделенных митохондрий . . . /прочность сопряжения/ определяли по величине дыхательного ■•'.'"■'; контроля используя полярографический метод.' Работали с митохондриями, дыхательный контроль которых был 3.5-6.0.

Измерение поглощения кислорода суспензии митохондрий проводили на полярографе Ьр-7е /Чехословакия/ с использованием термостатируемой ячейки, объединенной с..комбинированным закрыты;»': электродом Кларка. Ооъем ячейки составляет 1г/л, инкубационная смесь перемешивалась магнитной мешалкой. Среда инку--.; бации обычно содержала: сахароза 0.25 1.1 /или глаккит/, фосфатный буфер 30 :мМ /или Нерея 10 Ш/, КС1 15 Ш, М§С<.2 2.5 иМ, ' ЭДТА 0.2 - 1 ротекон 2 мкМ, 125°С или 37°С, рН 7.4. .: Митохондрии инкубировали в присутствии еукцкната /10 ¡¿V./ в ■■ качестве субстрата.;: ■

Концентрацию белка в суспензии катохокдрий определяли V микробиуретовым методом Бейли /Бейли. 1965/. Оптическую ; плотность определяли при длине волны Л =320 нк с использованием калибровочной кривой по бычьему сывороточному альбумину,

Тр}и-:смембранный пстенщгзд измеряли с елективнш электродом

по распределению проникающего катиона тетрафенилфосфония между матриксом митохондрий и средой инкубации /состав среды инкубации тот го, {25°С/. В среду инкубации добавляли 20 мкМ ТФФ+. Регистрировали потенциал на селективном для ТФ£+ электроде /Либерман, 1982/, объем ячейки - '. мл.

Эффективность фосфорилирозания оценивали несколькими способам. 1 - определяя содержание АТФ с помощью гексокиназы, глюкозы, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и НДЦФ по пику поглощения НАД,® в области 340 нм / Сгок е1 д/. , 1974/, спектрофотометр IтаФи/Ялопия/. 2 - определяли соотношение ДЦФ/0 с помощью кислородного электрода, рассчитывая отношение числа молей добавленного АДФ к числу молей кислорода, поглощенного во время фосфорилкрования /Николе, 1985/. 3 - контролируя мембранный потенциал измеряли длительность /г/ процесса фосфорилкрования в митохондриях. Добавление АДФ приводило к снижению веявчаи-: трансмембранного потенциала, который после фосфорилирования всего добавленного АДФ вновь достига. значения 150 мв.

Степень восстановленное™ Кой в митохондриях оценивали по методу Крогера, Клингенберга /Т^годег , "КСШдспЬечд, 1966/.

Интенсивность перекисного окисления липидов митохондрий оценивали яо накоплению матонового диальд"?ида ДЩА/. Содержание ЬЩА определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой /Владимиров, Арчаков, 1972/. ЬЩА образуются в митохондриях в небольших количествах, а присутствие сахарозы затрудняет его определение, поэтому в опытах использовали маннит и в среде выделения и в среде инкубации. Спектры поглощения триметико-вого комплекса, образующегося при реакци" тиобарбитуровой кислоты с ЭДА.регистрировали на спектрофотометре "$ресо?с1 2//-Ш" в области 535 нм. В качестве сравнения использовали образец, содержащий все компоненты стэеды инкубации кроме митохондрий.

Образование липидных радикалов стимулировали различными способами. Использовали ионы Ге2+.ддя генерации О^, который может проникать в мембраны в форме НО^ и взаимодействовать с кирными кислотами. ИспользоЕа I фотоди^.амический метод гзне-радил уперокс1"*а; к образованию приводит облучение растворов, содержащих НДЦ'Ш или К.УЩ, светом 360 нм /Сипт.пд/гтп с/ аС. ,'1985/. В среду инкубации митохондрий добавляли НАИЙ 1 * 2 мМ, УФ-сблучени проводили при помощи ртутной лампы при интенсивном перемеяга. таи, лепемгьзуя светсфильтг УФС-З.

Г'ТЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ " :

1. Перекисное окисление липидов в различных функциональных состояниях митохондрий.

Принято считать, что свободные радикалы в биологических системах представляют значительную опасность и их появление ассоциируется с начатом разрушительных процессов в мембране. В частности, показано, что инициирование перекисного окисления липидов ионами Ге приводит к ингибированию синтеза АТФ в митохондриях /ТЯсКшдМ е{ а?., 1966/. Однако, это наблюдение относится к инициированию перекисного окисления извне, но не к образовании и утилизации лишщннх радикалов в ходе электронного транспорта.

Следует отметить, что регистрируемое в присутствии экзогенного Ге перекисное окисление в мембранах митохондрий ■ имь.т мало общего с процессом пере окисления липидов, зависимого от функционирования дыхательной цепи. В последнем случае обнаружить продукты переокислекия липидов в митохондриях удается лишь с большим трудом. Гак в работах Ситковского с соавт. /1973, 1975/, посвященных колличественному изучению перекисного окисления липидов митохондрий в различных функциональных состояниях, показано, что достоверное накопление перекисей липидов обнаруживается лишь в З-м и 4-к состояниях, т.е. в условиях, характеризующихся транспортом электронов и фосфори-лкрованием АДФ.

На первом этапе работы нами было изучено образование одного из продуктов перекисного окисления липидов малонового ди-альдегида АЩА/ в фосфорилирущих и нефосфорилируицих митохондриях. Из данных, приведенных на рис. 1, видно, что в присутствен сахарозы регистрировать образование -комплекса ЭДДА с . тиобарбитуровой кислотой /Лтау=535 км/ не удается. Однако, при замене сахарозы маннитом мошо, используя молярный коэф- ' фициэкт поглощения этого комплекса/довольно точно определить-' концентрацию ?.ЩА / <1 кмоль в пробе/, образовавшегося'в интак-тных митохондриях, когда процесс перекисного окисления зависит лишь от работы дыхательной цепи.

Накопление '/ДА в присутствии конов в зависимости от. содержания в суспензии митохондрий ингибитора цитохрококскда-зы КСМ показано на рис. 1 Е. Добавление к кефосфорглардаязг -

митохондриям цианида калия в концен рациях /0.05 - 0.15 мМ/ последовательно снижает интенсивность индуцированного переокисления липидов. Это может быть обусловлено прежде всего тем, что при ингибировании транспорта электронов на кислород возрастает степень восстановленности эндогенного анти-оксиданта митохондрий КоО. Действительно, отношение 0Н2/аН2+О) в этом случае возрастает с 0.5 до 0.9.

|

< 1.0

У .

<о

1; 0.75

0.5 :

■О § •

1 .*•• 0.25

1

5тМ

гГ~

\0 50^100 150; КСИ миМ

нн 500 800 А

в

35

Рис.1. Лер.екисное окисление липидов митохондрий в присутствии /Б/.-и в "отсутствие /В/ 5 мкМ Ре2+. Вверху /А/: регистрация образования комплбксаВДА с тиобарбитуровой кислотой в митохондриях," инкубируемых в среде с сахарозой /1/ и маннитом /2/. Состав "среды инкубации см. в разделе "материалы и методы исследования".

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что для ин-тшетных митохондрий печени фыс характерна способность к образованию определенного количества продуктов порекксного окисления при инкубации их {п в различных функциональ-

ных состояниях, прй этом в фосфорилиручцих ипохондриях /сосг. V накопление ЩГ значительно снижено /рис.1 В/.

. Дыее изуч^ га образование ВДА в митохондриях в услопиях изменения продолжительности фосфорнлирувдсго окисления. В ото:.; случае в митохондрии добавляли различное количество А&5. Ка рис.2 предстаЕлени кинетика накопления ШЬ в митохондриях,

инкубируемых с различными концентрация;,и АдФ.

£

■а

о у

ч; §

Рис.2. Образование ВДА в мембранах нефосфорилирую-щих и фосфорилирующих митохондрий. Кривая 1 - без т>, 2 - 0.5 мМ АДФ,. 3-1 мМ АЛ®, 4-2 мМ МФ. Концентрация белка 2 кг/т, •¿25°С.

Из рис.2 видно, что в кефосфорклкруиашс матохснярийг вде? чакопленке гДЦА /кривая 1/, а в фосфорнякрущих мзтохощгряях перакисное окисление липидов практически отсутствует /кривая 4/. Для кривых, отражающих накопление продуктов перекпсного окисления характерен сзоэго рода лаг-период; его длительность определяется концентрацией АиФ /кривые 2 и 3/. Окончание лаг-периода совпадает с моментом, когда ¡ДЦф]~0. При исчерпании АЦФ /при переходе в нефосфорклирувщее состояние 4/ в митохондриях возобновляется лерекисное окисление липидов и идет с той хе интенсивностью что и з контроле /кривая 1/.

1.0

1

^ 0.75 I 0.5

Щ 0.25

се-сср

2

Рис.3. Образование малонового диатьдегида в мембрана- митохондрий'в присутствии /1/ и в отсутствие /2/ 5 мк.7| Ге2+; в присутствии 5 йА'АДФ /3/. Кривая 4 - добавление к. фосфорялиоузгаим лштохон-- 'Дрилм 10""'М С1-ССР посла . - . шести минут инкубации. Ютн Концентрация белка 2 мг/мл

На рис.З такхе представлена кинетика накопления '!£А з ми-

тохондриях в присутствии субстратоь и влияние на его образование АИФ, ионов Ре и разобщителя окислительного фосфори-лирования. Как и следовало ожидать, в состоянии 4 в присутствии ионов Те^* /кривая 1/ скорость перекисного окисления липидов значительно выше, чем без Ге2+" /кривая 2/. ДЦФ оказывает ингибирующий эффект на перекисное окисление липидов в митохондриях /кривая 3/. Эффект, вызываемый АДФ связан тленно о;фосфорилированием, т.е. с переходом митохондрий в состояние 3:,, поскольку разобщитель /С1-ССР/ снимает ингибирунцее действие АДФ на перекисное окисление липидов /кривая 4/. В присутствии 10" М С1-ССР ВДА образуется с той же скоростью, что и в состоянии 4 /кривая 2/. Следует отметить, что накопление продуктов перекисного окисления липидов в митохондриях может контролироваться убихиноном, поэтому в ряде экспериментов определяли степень восстановленности Ко5. Оказалось, что б митохондриях, инкубирует.шх с АДФ без С1-ССР и инкубируемых с АДФ в присутствии С1-ССР отношения ОД2/(0Н2+0)раз."ччаются незначительно /0.5 и 0.55/, и, следовательно, наблюдаемое различие в накоплении "ДкА зависит от процесса фосфоршшрования.

2.-Влияние про- и антиокоидантов на окислительное ЗюсФо-рилирование в митохондриях печени.

На следующем этапе работы нами бьшо исследовано дыхание, фоофорилирование митохондрий и электрический потенциал при действии одного из антиоксидалтов, пропилгаллата.

Механизм антиокислительного действия антиокоидантов в настоящее время изучен довольно хорошо /Кулакова, 1975/, /Ро-гинский, 1989/. Помимо взаимодействия с перекисными радикалами они осуществляют перехват аллильных /или алккльных/ ради- • калов препятствуя их взаимодействик. с кислородом к предотвращая тем.'самым "образование иврекисных радикалов. Антиокислительная активность зависит не только от констант скорости взаимодействия с радикалами, но и от распределения антиоксиданта между водной и лгашдной фаза!' . Для щ. лнлгачлата коэффициент распр'деления еоо-гавляет ~10', значат, в основном он будет находиться в лшщдной фазе /Хео е1 а£., 1971/.

Влияние пропилг.аллат-а на фосфорилирование и перекисное окисление липидов митохондрий представлено на рис.Л.

Рис.4. Синтез АТФ и образование ВДА в митохондриях печени при различных концентрациях пропклгаллата. Кривая 1 - ВДА, 2 - АТФ. При измерении МДА в среде инкубации отсутствовал АДФ.

50 100 150 200 мкМ

ПРОПИПГЙПШ

Как видно из рис.4 "ловушка" литщных радикалов про**члгал-"•ат эффективно ингибирует оба процесса: перекисное окисление лиь/щов и окислительное фосфорилирование. Попутно отметим, что существует заметная разница в концентрациях пропклгаллата, необходимых для полного ингибирования этих двух процессов.

Возникает вопрос, с чем связано действие пропилгаллата: не является ли он пртонофором, ингибитором электронного транспорта или ингибитором АТФ-азы? Мы установили, что "ловушка" ли— пидных радикалов, пропилгашат, в зависимости от концентрации полностью или частично ингабирует синтез АТФ, но не влияет на величину электрического потенциала /дТ/. Значения дУ остается неизменными в присутствии пропилгаллата вплоть до концентрации 250 мкМ /дачные не приведены/, значит он не является протонофором. Снижение же интенсивности фосфорилкрования прямо зависит от концентрации антиоксиданта.

На рис.5 показано дыхание митохондрий в 3-м и 4-м состоя- , Н1ШХ в присутствии пропилгаллата. В дачном диапазоне концентраций пропилгаллат не изменяет скорость поглощения кислорода ; в состоянии 3 /кривая 2/, хотя в то же время приводит к падению эффективности фоофорилирования: дыхательны?* контроль падает с 5 до 1. Таким образок, пропилгаллат не является ингибитором электронного транспорта. Кроме того, эксперименты на разобщенных гатохондрглх показали, что аропилгачлат не влиял на скорость гидролиза АТФ /данные не приведены/. Зто говорит о том, что он, по-видимому, не является ингибитором АТФ-азы..

50 100 150 лропилгдппяг

¿00 тМ

Рис.5. Влияние пропилгалла-та т интенсивность электронного транспорта и синтез АТФ в митохондриях: 1 - ды-

п

хание в присутствии 10 И С1-ССР, 2 и 3 - дыхание в состояниях 3 и 4 соответственно , 4 - фосфорилирова-ние.

Эффективность синтеза АТФ можно контролировать различные способами, например, измеряя концентрацию АТФ или регистрируя мембранный потенциат /рис.6 А/.

СУКЦИИЙТ 10 —1 "10

200

40мнМ[Ге2>}

Рис.6. А - влияние пропилгаллата на длительность /г/ процесса фосфорилирования в митохондриях- 1 - контроль, без ПГ; 2 - 100 мкМ ПГ; 3 - 200 м"'4 ПГ. Стрелками показано добавление 0.5 мМ АДФ и 5 г£А сукцината. Б - зависимость эффективности фосфорилирования 1/е в митохондриях, инкубируемых с ЯГ /10^ мкГЛ/ от концентра

Испог. зованке «вух независимых методов позпатяет ис'-г^ч.-; аденилаткиназную реакцию. Изменение величины потыщкпла ш. внутренней мембране митохондрий пома добавления АДФ яочазшо на рис.6 А, где ; ительность фосфорилкровамая т определятся концентрацией ДО 'при неизменной концентрах*. л мигохондри&пь-

ного белка/. Видно, что в контрольных митохондриях /ДК = 4/ при концентрации АДФ 0.5 ыМ время фосфорилирования составляет 4 минут-. В митохондриях, инкубируемых о пропилгаллатом /100 мкМ/, при исходной концентрации ДДФ 0.5 мМ синтез АТФ продолжается 7 минут, т.е. идет с меньшей скоростью.

Ватао было выяснить, не является ли эффект пропилгаллата обратимым и можно ли вновь стимулировать синтез АТФ, если одновременно с антиоксидантом использовать соединения обладающие ооратным действием. Учитывая это, в следующем эксперименте в среду инкубации наряду с "ловушкой" радикалов добавляли ионы Ре2+. Ионы Ге2+ стимулируют образование супероксида /Ге2+РР + 02 —Ре3+РР + 0^/.-Помимо этого, взаимодействие ионов Ре2+ с перекисью водорода или липидной гидроперекисью приводит к образованию ОН" радикала, который как z НО^ монет взаимодействовать с ненасыщенными нирными кислотами фосфоли-пидов. Полученные данные представлены на рис(,6 Б. Как видно и? рисунка, увеличение концентрации ионов приводит к росту эффективности фосфорилирования почти до исходного уровня /с 60 до 80%/; степень возврата к исходному уровню зависит от тщательности подбора концентрации Ге2+. Концентрация Ге2+= = 20 мкМ близка к оптимальной. При-дальнейшем увеличении концентрации эффективность фосфорилирования снижается. Причиной этого скорее всего является создание избытка радикалов I/ и их взаимодействие с кислородом, т.е. активация перекис-ного окисления липидов, которое ведет к значительным нарупе-ниям в мембране. Накопление ЮОН, образование продуктов пере-кисного окисления липидов ведет к нарушению работы АТФ-скн-тетазного комплекса /возмокяо за счет утечки протонов из протонного качала Р0/ /тагспали^'ёаС, 1933/.

3. Влияние УФ-облучекия на окислительное ФосФорилигювачие.

Стимулирование пзрекисного окисления липидов часто обусловлено наличием супероксцда /ЙО^/ и это относится как к гомогенной так и к гетерогенной системе в/ в/.., .1983;

УоА£ , ХедпЕГ , 1978/. При этом следует иметь в виду, что локализованные в митохондриях редокс-комдлексы способны восстанавливать кислород по одяоалектронному механизму, т.е. генерировать супероксид в мембрана иШ%£едпег , 1973/. Ины-!.".:: словами при окислении субстрата и переносе электронов

имеет место не только четырех-электронное восстановление молекулы кислорода с образованием молекулы воды. Какая-то часть восстановительных эквивалентов 12-%%/ участвует в одноэлект-ронном восстановлении кислорода. Вопрос в том, является ли образование 02 обязательным в процессе сопряжения окисления и фосфорилирования и какова при этом роль взаимодействия 02 с ненаскщенными жирными кислотами.

Среди способов инициирования перекясного окисления в биологических мембранах, содержащих ненасыщенные жирные кислоты следует отметить и фотодинамические методы. Так присутствие в среде инкуЗации НАДФН или НАДЯ а облучение суспензии светом 360 нм приводит к генерация супероксида /Сипшпдпатп е{ а(., 1235/. Важно отметить, что во всех случаях, когда инициирование перекисного окисления липидов вызвано генерацией 02 в ра-ьгворе, перекисное окисление эффективно ингибируется супер-оксидцисмутазой. Очевидно, что указанные способы генерации 02 могут быть использованы и на митохондриях. При этом следует иметь в виду, что редокс-комплексы митохондрий способны восстанавливать кислород по одноэлектронному механизм /Вар-танян и др., 1989/. Затем супероксид /в форме Н02/ может взаимодействовать с жирными кислотами фосфолипидов, вызывая образование- липидных радикалов.

В данной главе изучали синтез АТФ и перекксноэ окисление липидов в митохондриях печени в условиях генерации 02 с помощью УФ-облучения. На рисунке 7 показаны кинетические кривые образования ЬЩА в митохондриях при различных условиях инкубации. п 4 ■ ' '

Рис.7. УФ-зависимое образование ЬЩА в митохондриях печени. Кривая 1 - без АДФ, кривая 4 - с АДФ, без НАД®, кривая 2-е АДФ, НАДФЯ 1 мМ, кривая 3-е АДФ, НАДФН 2 мМ. Концентрация белка 2 мг/гдл, ¿25°С.

I ... ■ I_I_I , '_

1 г 3 А § МИН.

Из рисунка видно, что в нефосфорилирухвдих митохондриях вдет накопление ВДА /кривая 1/, а в фосфорилирунцих митохондриях перекисное окисление липидов практически отсутствует /кривая 4/. Но оно появляется при добавлении НАДН в условиях УФ-об-лучения /кривые 2 и 3/, интенсивность перекисного окисления липидов в этом случае зависит от концентрации НАДФН и процесс ингибируется суперокоиддисмутазой. В условиях УФ-облу-чения в мембранах митохондрий, по-видимому, существуют два пути генерации радикалов: и Ь': Н+

+ 1Л1 - и + Н202 за счет работы редокс-цепи

НАДФН Ж~ШШ* НАДФН*+ 02 -НАДФ+ ■*• о2 /Н02/

Н02 + ЬН -с + Н202 за счет УФ-облучения НАДФН

Можно думать, что возникающий за счет второй реакции избыток, сунероксида приводит к суперпродукции радикалов С. Это приводят к появлению перекисных радикалов Ь02, что означает усиление перекисного окисления липидов.

Следствием перекисного лкисления липидов, как известно, является повреждение мембран, что не может не отразиться на синтезе АТФ. Образование АТФ в митохондриях и влияние на него УФ-облучения показано на рисунке 8.*

СГ 600

I4» 500

Г Л т

Л

1 300

г

& 200

щ

5 СОд Рис.8. Влияние УФ-облучения на синтез АТФ в митохондриях печени. Кривая 4-с АРФ, без НАДОД, кривая 3-е АДФ, НАДФН 2 мМ, кривая 2-е АДФ, НАДФН 1 мМ, кривая 5-е АДФ, НАДФН и СОД.

12 3 4 5 мин

В результате УФ-облучения /т.е. в результате черезмерной генерации и создания избытка 0J /происходит ингибирование синтеза АТФ /кривые 2 и 3/. Добавление в среду инкубации супор-оксшщисмутазы снимает эффект УФ-облучения /кривая 5/. Степень ингибирувдего действия УФ зависит от концентрации НАДФН. В целом э""и дшные подтверждают представление о том, что перв-кисное окисление липидов влияет на процесс окислительного фосфорнлироваяия.

Ранее обнаружили, что пропилгаъяат эффективно ингибирует синтез АТФ l митохондриях, не влияя на величину дм!!1". В данном случае также использовали проаилгаллат, как ловушку лшш-дных радикалов Ц / LOO'/. Изменения интенсивности синтеза АТФ в митохондриях в присутствии пропилгаллата показаны на рисуя-

Рис.Э. УФ-зависимое стимулирование синтеза АТФ в митохондриях печени. Кривая 4 - с АДФ, без НАДФН, кривая 2 - с АДФ, НАДФН 1 мМ, кривая 3 -с АДФ, НАДФН 2 мМ, кривая 5 - с АДФ, НАДФН и

сод.

мин.

Если эффект пропилгаллата можно объяснить созданием дефицита радикалов U , то в этом случае синтез АТФ можно стимулировать вновь, используя тот способ генерации суперокскда, что и на рисунках 7 и 8. Действительно, как видно из рис. 9 УФ-ге-нерация суперокскда стимулирует синтез АТФ /кривые 2 и 3/, а супероксиддисмутаза снимает этот эффект /кривая 5/. Степень возврата АТФ к исходному уровню зависит от концентрации НАДФН. До-видимому,,пропилгаглат создает дефицит радикалов L." , а УФ-генерация О2 независимым способом /независимо от работы дыхательной цепи/ устраняет этот дефицит и восстанавливает интенсивность синтеза АТФ до исходного уровня. Следует отметить,

что пропилгаллат в соответствии с коэффициентом распределения!, в системе липид-вода находится и в водной фазе. Значит он может взаимодействовать как с и так и непосредственно с 0^, но,,, во-первых", в растворе находится 10% добавленного пропилгалла.-та, во-вторых, как показывают модельные эксперименты с использованием УФ-облучения, константа скорости такой реакции сравнительно мала. Полученные данные указывают на возможность кон«-троля за синтезом АТФ путем поддержания-определенного уровням липвдных радикалов.

В мембранах митохондрий эту роль, как известно выполняет" убихинон, точнее восстановленная форма-убихинол ЦН2 /ОаЛи^г-а-па,^1е(а.1, 1980/. Возможно, убихино" не просто обеспечивает некоторую защиту от перекясного окисления липидов,. а- поддерживает определенный оптимальный уровень радикалов Ь". В связи: С'этим мы изучали влияние на редокс-цепь ингибитора дыхания Ш, регистрируя как потребление 02>. так и скорость синтеза АТФ. Оказалось, что в присутствии цианада процесс фосфдр'ллиро-вания ингибируется в большей степени, - чем дыхание /придяН* = . = соти( /. Это означает падение коэффициента Р/0,, /данные не приведены/. Одной из вероятных причин такого падения^коэффициента Р/0 может быть увеличение соотношения Ог^/^ + как и в опытах с ЩА /рис.1/ и как следствие этого восстановление радикалов Ц убихинолом. Это тем белее вероятно, что как показано выше экзогенная ловушка радикалов - пропилгаллат ингиби-рует перекисное ^кисление липидов так и синтез АТФ.- ■

4. Взаимодействие редокс-ц&пей внешней и.внутренней мембран.

Известно, что в мембранах, сОдержадих ненасыщенные- жирные кислоты./ 1Л/ перекисное окисление липидов можно инициировать различным; способами; чаще всего с помощью'супероксидного анион-радикала.

Наряду с 02 в качестве первичного радикала может выступать гидроксильный радикал ОН", образующийся, в частности,, в реак-цки Хабсра-Зайса /Леи, (2са1 , 1982/:

Гэ2+ + Н20.> --- Ге3+ + он- + он-: ■ 1

Разрыв -л связи в молекуле Н202 или гидроперекиси происходит в результате акцептирования электрона /доноров электрона могут служить ноны То2*/. Что касается возможного участия в ре-

акции 1 мембранных белков, то при изучении влияния гидроперекисей на гомогенат и микросомы печени, установлено, что гидроперекиси окисляют цитохром Вд /Зсе-ь , &?ои&ор4 , 1975/. Вполне возможно, что окисление цит.Вд происходит в результате реакции Хабера-Вайса и, значит, цепь НАДН - цит.в^ в принципе может генерировать ОН* радикал. Хотя цепь НАИН - цит.в5 во внешней мембране митохондрий обнаружена давно, ее назначение остается во многом не ясным. Можно предположить, что митохон-дриальнач цепь НАДН - цит.в- также может генерировать ОН" радикалы, т.е. монет быть реализован ферментативный вариант реакции Хабера-Вайса.

Как уже отмечалось в предыдущей главе, на процесс фосфори-лирования влияют не только разобщители - протонофоры, но и разобщители другого типа - соединения, снижающие концентрации липядных радикалов, в частности,- пропклгаллат. Если падение интенсивности фосфорилирования в присутствии пропилгаллата вызвано снижением концентрации радикалов и , то оно может быть компенсировано путек генерации радикалов каким-нибудь независимым способом. Ранее наблюдалось увеличение скорости синтеза АТФ при добавлении в среду инкубации ионов Ге^+, которые в комплексе с АДФ /РР/ могут генерировать первичные радикалы /супероксид/. Для этих целей могло использовать и НАДН, если учесть, что его'окисление в цепи НАДН - чит.в^ может также стимулировать образование первичных радикалов, в частности, гидроксильного радикала.

Полученные результата представлены на рисунке 10.

■о

Рис.Ю. Скорость синтеза АТФ в зависимости от концентрации НАЛЛ в присутствии 100 дай пропилгаллата.

5:

О

~ю 15 гп [нр.ВН]пкм

--IS'—

Добавление в среду инкубации 100 мкМ пропилгаялата приводит к снижению интенсивности синтеза АТФ со 150 до 60 нмоль/мин. мг . белка и соответственно к снижению величины дыхательного контроля /ДК/ с 5 до'2. Последующее добавление НАИН в малых концентрациях /меньших K^j/ существенно влияет на процесс синтеза АТФ. Если в среде инкубации вместе с сукцинатом присутствует 5 мжМ'НДДН величины ДК восстанавливаются почти до исход- •

ного уровня. Следует отметить, что при добавлении 5 мкМ НАДНл скорость потребления кислорода заметно меняется /данные не ■ представлены/; в состояний 3 она возрастает на 10 натом/мин.,' , что. , без. сомнения, связано с ускорением электронного транспорта, т.е. окислением сукцината. Наблюдаемый эффект мечет быть результатом взаимодействия редокс-целей внешней и внутренней мембран, Hp.это взаимодействие заключается не в передаче электронов из одной,цепи в другую, а в передаче первичных радикалов /в случае их дефицита/ из одной мембраны в другую'.4-.

Вата о отметить, что кривая, представленная на рис. 10 имеэт. экстремальный характер. Подъем синтеза АТФ почти до исходного --> уровня можно трактовать как приближение к оптимальным условие ям, т.е. как увеличе :ие концентрации радикалов'Ь* за Счет окис-с-леиул НАДН. При увеличении содержания НАДН 'выше- 5' ihU,y по-ви-т:!; димому, происходит дальнейшее повышение; уровня липияных ради« катов, что приводит к активахши перекисного окисления, охри-т-л-' цательно сказыва-^дегося на фосфорилировании. В нативных мемб-д-ранах митохондрий образовщ.1ие и утилизация радикалов L' , по- :•.-• видимому, точно сбалансированы.'

ЗАКЛКЯЙГЛЗ

На основании полученных здесь данных и анализа, проведен—'-ного* в ряде работ J&otlenbezq, 1933; Дмитриев, 1983; S2atez, , 1987/ можно утверждать, что процесс фосф^рилироваши в мято,-? .... хондриях включает в себя внутримембрадный перенос энергии...

Еолучепше нами данные по действию прояилгаллата на окис- .. лительное фосфоршшрование не могут быть объяснены в рамках модели Митчела. Почти все известные разобщители окислительного;0 фосфорилирования являются протонофорами; они снижают величину,... . д/Н"1", г о коррелирует с ингибированием синтеза АТФ. В то же.-вре,г.,,... мя игвесыы соединения, механизм действия ко. фых должен быть , кним, чем у протонофоров. Это относится, в частности, к анес-

me концентрации НАДН изменяют скорость синтеза АТФ. Это изменение имеет экстремальный характер.

6. Изучено изменение эффективности фо сформирования /коэффициент Р/0/ в присутствии ингибитора электронного транспорта KCN. Ш^азано, что при снижении скорости электронного транспорта /при лмН*" = ccm.it / коэффициент Р/0 не остается постоянным. ,

7. Полученные в работе данные свидетельствуют в пользу предположения о том, что фосфолипидная мембрана играет активную роль в преобразовании энергии. Это означает, что наличие днff1" является необходимым но.не достаточным условием синтеза АТФ.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Дмитриев Л.Ф., Иванова М.В., Иванов И.И. Взаимодействие ре-докс-цепей внешней и внутренней мембран митохондрий.// Докл. АН СССР, 1990, т.312. й 4, с.986-989.

2. Дмитриев Л.Ф., Иванова М.В., Иванов И. И. Синтез АТФ в митохондриях печени можно.стимулировать и ингибировать, генерируя супероксид с помощью УФ-облучения. // Еиол. мембраны, 1990, т.7, a s, с.

3. Дмитриев Л.Ф., Иванова M.B., Иванов И.И. Взаимосвязь пере-кисного окисления липидов и окислительного фосфорилирования в митохондриях печени.// Всесоюзная конференция "Перекисное окисление липидов и стресс*'. Сборник статей, Ереван,. 1390, в печати.