Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние озонированного физиологического раствора на функциональное состояние печени крыс в норме и с саркомой 45

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние озонированного физиологического раствора на функциональное состояние печени крыс в норме и с саркомой 45"

На правах рукописи

АЧ"

р «98

и

Гончарова Татьяна Анатольевна

ВЛИЯНИЕ ОЗОНИРОВАННОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПЕЧЕНИ КРЫС В НОРМЕ И С САРКОМОЙ 45

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород, 1998

Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории Нижегородской государственной медицинской академии

Научный руководитель

доктор биологических наук К.Н. Конторщикова

Официальные оппоненты: *

доктор медицинских наук Д.И. Рыжаков кандидат биологических наук Л.Н. Курганова

Ведущая организация:

Онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН

Защита диссертации состоится " ^¿ Ка/Ум 1998 г. в часов на заседании диссертационного совета К 063.77.13 Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603600, Нижний Новгород, проспект Гагарина, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета

Автореферат разослан .1998 года

Ученый секретарь диссертационного совета к.б.н., доцент / /(. /' / И.Ф.Александрова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Значение печени в осуществлении и регулировании основных звеньев промежуточного обмена определяет ее важную роль в поддержании гомеостаза целостного организма. От активности осуществляемых в печени процессов трансформации и функционального синтеза энергетических и пластических веществ в значительной мере зависит приспособительная деятельность всего организма при воздействии различных экстремальных факторов экзогенного и эндогенного происхождения (Гичев Ю.П., 1990; Матюшин Б.Н. и др., 1992; Obeid O.A., Emery P.W., 1993).

Изучение функционального состояния печени в организме со злокачественной опухолью - своего рода эндогенного экстремального фактора, является частью общей проблемы "опухоль - организм". Основным признаком злокачественного новообразования является нарушение метаболизма тканей организма хозяина, непосредственно не затронутых процессом неоплазии. Гомеостаз клеток печени во многом определяет течение опухолевого процесса и рост опухоли, а также состояние всего организма с опухолью, переносимость к противоопухолевым препаратам. Реакции промежуточного обмена в печени в процессе адаптации к росту и развитию опухоли обеспечивают барьерную функцию, направленную на защиту внутренней среды от неблагоприятного действия токсических продуктов обмена и распада опухолевых клеток, и функцию обеспечения всего организма пластическим материалом в условиях усиленных пролиферативных процессов в опухолевой ткани (Шапот В.С, 1975; Морозкина Т.С., 1981; Shearer J.D. et al., 1984; Liu K.J. et al., 1990). В свою очередь, вследствие системного воздействия опухоли на организм в печени наблюдаются значительные функциональные изменения - нарушение окислительно-восстановительного потенциала, изменение активности реакций углеводного, белкового, липидного обменов, энергообеспечения этих процессов (Gold J., 1968; Vasavi Н. et al., 1990; Brauer M. et al., 1994; Chidambaram N., Baradarajan A., 1995).

Для коррекции функциональных изменений в клетках печени при опухолевом росте необходимо стимулировать эндогенные возможности организма против опухоли с целью нарушения ее метаболизма, снижения токсического и системного воздействий опухоли на организм. Восстановление функциональной активности клеток печени возможно

также вследствие частичной корректировки нарушенного метаболизма гепатоцитов.

Корригирующий эффект газообразного озона и озонированных растворов на кислородзависимые процессы, энергетический потенциал, баланс про- и антиоксидантных реакций в клетках организма при использовании терапевтических концентраций озона обнаружен в экспериментальных исследованиях и в клинической практике (Rilling S., Viebahn R., 1987; Перетягин С.П., 1991; Конторщикова, К.Н., 1995). Показана токсичность озона, в частности озонированного физиологического раствора (ОФР), на метаболизм опухолевых клеток (Щербатюк Т.Г., 1997). Отсюда вытекает целесообразность изучения возможности применения озонированного физиологического раствора для восстановления функциональных нарушений клеток печени и, как следствие этого, повышения адаптационных возможностей организма с опухолью. В настоящее время недостаточно комплексно исследован и эффект ОФР с различными концентрациями озона на состояние метаболических процессов в печени интактных животных.

Цель работы: изучить влияние озонированного физиологического раствора на функциональное состояние клеток печени крыс в условиях физиологической нормы, а также крыс-опухоленосителей в процессе роста и развития саркомы 45 в организме.

Задачи исследования.

1. Исследовать влияние озонированного физиологического раствора на активность про- и антиоксидантных процессов, состав липидов, а также энергообеспечение клеток печени интактных крыс.

2. Оценить функциональное состояние клеток печени крыс с саркомой 45 (содержание циклических нуклеотидов как биорегуляторов физиологической активности клеток, энергетический потенциал, состояние процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной системы защиты, состав липидов) в зависимости от сроков развития опухоли и степени ее системного воздействия на организм экспериментальных животных.

3. Изучить эффект озонированного физиологического раствора на функциональные изменения клеток печени крыс-опухоленосителей, вызванные системным и токсическим воздействиями саркомы 45.

4. Провести сравнительный анализ влияния озонированного физиологического раствора на метаболизм печени животных-опухоленосителей только после внутрибрюшинного введения раствора, а

также после введения озонированного раствора внутрибрюшинно и локально - вокруг опухоли и непосредственно в опухолевую ткань.

Научная новизна. В результате исследований:

1. Проведен комплексный анализ функционального состояния печени животных с саркомой 45 в динамике роста и развития опухоли. В клетках печени показаны взаимосвязанные нарушения окислительных процессов липидов, реакций углеводного обмена, энергообеспечения, а также их регуляции с участием циклических нуклеотидов .

2. Изучены особенности влияния озонированного физиологического раствора с различными концентрациями озона на состояние процесса ПОЛ и состав липидов, содержание продуктов углеводного обмена, а также энергообеспечение клеток печени интактных животных. Обнаружено, что внутрибрюшинное введение озонированного физиологического раствора с концентрацией озона для приготовления раствора 1200 мкг/л озоно-кислородной смеси практически не вызывает изменений метаболических параметров клеток печени. Введение животным ОФР с более высокой концентрацией озона-3000 мкг/л озоно-кислородной смеси приводит к усилению реакций перекисного окисления липидов в крови и изменению активности супероксиддисмутазы в клетках печени.

3. На модели экспериментальной опухоли саркома-45 показано, что введение озонированного физиологического раствора приводит к повышению содержания цАМФ, восстановлению равновесия про- и антиоксидантных процессов, липидного состава, к нормализации энергетического потенциала в клетках печени крыс-опухоленосителей.

5. После введения животным ОФР на фоне восстановления функциональных изменений в клетках печени крыс-опухоленосителей в опухолевой ткани отмечено нарушение активности пролиферативных процессов, обусловленных изменением соотношения цАМФ/цГМФ, усиление окислительных процессов, приводящие к увеличению количества погибших клеток саркомы 45.

Теоретическая и практическая значимость полученных результатов.

В работе получены экспериментальные данные о механизмах воздействия озона на клетки печени организма в норме и при патологии. Показан корригирующий эффект озонированного физиологического раствора на состояние метаболизма печени организма-опухоленосителя. Учитывая важную роль этого органа в процессе адаптации организма к различным экстремальным факторам экзо- и эндогенного происхождения, в том числе и наличию в организме злокачественного

новообразования, теоретические положения, полученные в экспериментальных исследованиях, могут служить обоснованием применения озонированного физиологического раствора как паллиативного средства в комплексной противоопухолевой терапии. Это может способствовать повышению эффективности процессов адаптации организма с опухолью к воздействию злокачественного новообразования, снижению токсического влияния продуктов обмена опухолевой ткани на организм.

Положения, выносимые на защиту.

1. Существенных изменений энергетического потенциала в клетках печени здоровых крыс на фоне введения ОФР с различными концентрациями озона не отмечено. Внутрибрюшинное введение озонированного физиологического раствора с концентрацией озона 3000 мкг/л озоно-кислородной смеси (500-550 мкг/л раствора) вызывает изменение активности ферментов антиоксидантной защиты, работающих на стадии инициирования реакций пероксидации липидов, в клетках печени, а также активацию первичных этапов процесса перекисного окисления липидов в крови. Это свидетельствует о возможности повышения скорости прооксидантных процессов в организме. Введение ОФР с концентрацией озона 1200 мкг/л озоно-кислородной смеси (120140 мкг/л раствора) не вызывает изменений показателей метаболизма гепатоцитов и используется для внутрибрюшинного введения животным-опухоленосителям.

2. У животных с саркомой 45 (эндогенного экстремального фактора) в клетках печени отмечается увеличение содержания цАМФ, что является показателем физиологической активности гепатоцитов, но не компенсирует функциональные изменения в клетках печени крыс-опухоленосителей. Рост и развитие саркомы 45 и усиление ее системного воздействия на организм приводит к нарушению метаболизма клеток печени - усилению реакций ПОЛ, снижению активности ферментов антиоксидантной защиты, изменению состава липидов мембран клеток печени. Уменьшение содержания АТФ, ГТФ, свободных жирных кислот, прогрессирующее по мере роста саркомы 45, свидетельствует о нарушении биоэнергетических процессов в печени.

3. Введение озонированного физиологического раствора с концентрацией озона 120-140 мкг/л внутрибрюшинно и локально с концентрацией 500-550 мкг/л оказывает корригирующий эффект на нарушенные показатели метаболизма клеток печени, вызванные наличием саркомы 45 в организме. В печени крыс-опухоленосителей

нормализуется активность ферментов антиоксидантной защиты, снижается интенсивность реакций ПОЛ, восстанавливается содержание отдельных классов липидов. Дальнейшее увеличение содержания цАМФ в печени крыс-опухоленосителей по сравнению с показателем у животных с саркомой 45, которым не вводили ОФР, свидетельствует об усилении адаптивных процессов для восстановления энергообеспечения гепатоцитов, что подтверждается повышением в клетках печени макроэргических нуклеотидов.

4. В опухолевой ткани увеличение уровня цАМФ и снижение цГМФ - показатели снижения скорости пролиферативных процессов в клетках, накопление содержания лизофосфатидилхолина, увеличение площади некроза в ткани саркомы 45 на фоне введения ОФР свидетельствует о нарушении метаболизма клеток саркомы 45 под воздействием озона.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на II и III Нижегородской сессии молодых ученых (Нижний Новгород, 1997, 1998), III Всероссийской конференции "Озон и эфферентные методы терапии в медицине" (Нижний Новгород, 1998).

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 174 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками и 15 таблицами; состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, четырех глав собственных наблюдений и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 303 источника, из которых 122 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментах было использовано 245 белых нелинейных крыс массой 200-220 г. Проведено две серии экспериментальных исследований (Рис. 1). В 1-й серии экспериментов изучали влияние ОФР с различными концентрациями озона на метаболизм печени здоровых животных. Эта серия состояла из 4 групп.

Группа контрольная (1.1 - ОКФР). Животным (18 крыс) в этой группе внутрибрюшинно (в/б) вводили 1 мл оксигенированного физиологического раствора (ОКФР). Показатели метаболизма печени крыс этой группы служили контролем для таковых в следующих подопытных группах этой серии, в которых животным в/б вводили 1 мл озонированного физиологического раствора. Концентрации озона в газовой фазе для приготовления ОФР составляли 400, 1200 и 3000 мкг/л, соответственно для подопытных групп 1.1 - ОФР - 400, 1.2 - ОФР - 1200

и 1.3 - ОФР - 3000 (концентрация озона в физиологическом растворе -60-80, 120-140 и 500-550 мкг/л). В каждую группу входило по 15 животных. Озонированный и оксигенированный растворы вводили 5 раз через день.

1-я серия экспериментов-здоровые крысы и 2-я серия экспериментов -крысы-опухоленосители и

Контрольная группа - в\б введение ОКФР 1.1 - ОКФР Подопытные группы - в\б введение 1 мл ОФР 1 -1.1 - ОФР-400 Контрольные группы ^ 2.1 -8-45-20 Подопытные группы -введение ОФР 2.1 - 8-45 - 20 -ОФР (введение в/б и локально, 1200 и 3000 мкг/л)

1.2-ОФР - 1200 2.2 - Б-45 - 30 2.2 - 8-45 - 30 -ОФР(введение в/б и локально, 1200 и 3000 мкг/л)

1.3-ОФР -3000 Введение в/б и локально ОКФР 42.3 - 8-45 - 20 -ОКФР 2.3 - 8-45 - 20 -ОФР(введение в/б, 3000 мкг/л)

В\б введение 1,5 мл ОФР 1.3а-ОФР- 3000 2.4 - 8-45 - 30 -ОФР (введение в/б и локально, 3000 мкг/л)

2.4 - в-45 - 30 -ОКФР

1.36-ОФР- 3000

интактные животные

Рцс. 1. Схема экспериментов.

В 3-й подопытной группе (1.3 - ОФР - 3000) также было использовано 20 животных, которым в/б вводили 1,5 мл раствора. Изучение показателей метаболизма печени проводили после 5 и 10 введений ОФР крысам. Включение в эксперименты этих подгрупп животных обусловлено необходимостью оценки воздействия ОФР на функциональное состояние печени крыс в зависимости от объема введенного раствора, а также количества сеансов введения, т.е. дозы озона, которую получали крысы.

Во 2-й серии экспериментов исследовали функциональное состояние печени крыс-опухоленосителей в динамике роста саркомы 45 и усиления ее воздействия на физиологические процессы клеток различных тканей организма с опухолью, в том числе клеток печени, на фоне введения животным-опухоленосителям озонированного

физиологического раствора. Основной моделью экспериментального онкогенеза в работе послужила опухоль саркома 45. Веретеноклеточная саркома 45 возникла в 1949 году в результате введения диметилбензантрацена в подкожную клетчатку беспородной крысы (Погосянц Е.Е., 1949). В работе модель неоплазии создавали путем перевивки штамма опухоли саркома 45: в область правого бедра вводили 1 мл взвеси опухоли на растворе Хенкса (1:3) (осуществляли повторные пассажи опухоли от животных-опухоленосителей со сроками развития саркомы 10-14 дней (20 животных)). В этой экспериментальной серии использовано 8 групп животных. В зависимости от продолжительности воздействия на организм трансплантированной опухоли крысы-опухоленосители были разделены на 2 контрольные группы - 2.1 - 8-45 -20 и 2.2 - в-45 - 30. В каждую группу входило по 15 животных. Исследование метаболических параметров проводили через 20 и 30 дней с момента трансплантации опухоли. Экспериментальный материал этих групп служил показателем системного и токсического воздействий опухоли на организм крыс-опухоленосителей, в том числе и на функциональное состояние клеток печени, в процессе роста и развития саркомы.

Контрольные группы - (2.3 -8-45 - 20 - ОКФР) и (2.4 - 8-45 - 30 -ОКФР), 20 крыс. Животным с саркомой 45 на 10-12 день после трансплантации опухоли начинали вводить оксигенированный физиологический раствор. Частота введения - 5 раз через день. 1 мл раствора вводили внутрибрюшинно и 1,5 мл вокруг опухоли. После этого забирали для исследований экспериментальный материал от 10 животных - контрольная 2.3 группа, у которых сроки развития саркомы

соответствовали животным контрольной 2.1 группы - 20 дней. Остальным крысам (10 особей) - контрольная группа 2.4, продолжали вводить оксигенированный физиологический раствор внутрибрюшинно, вокруг и непосредственно в опухоль (1 и 1,5 мл) с той же частотой. Когда сроки развития опухоли соответствовали таковым в контрольной 2.2 группе - 30 дней, проводили забор материала для исследований. Целесообразность выделения 2.3 и 2.4 контрольных групп во второй серии экспериментов обусловлена необходимостью четкого определения эффекта озонированного физиологического раствора на функциональное состояние клеток печени животных с саркомой. Для этого были выделены следующие подопытные группы животных - 2.1 - 8-45 - 20 - ОФР и 2.2 - в-45 - 30 - ОФР, по 15 крыс в каждой группе. В те же дни, что в контрольных . группах, крысам внутрибрюшинно, вокруг опухоли (подопытная 2.1 группа), а также внутрибрюшинно, вокруг и непосредственно в строму опухоли (подопытная 2.2 группа) вводили соответствующие объемы ОФР. Для приготовления озонированного физиологического раствора использовали концентрации озона 1200 мкг/л озоно-кислородной смеси с целью его введения внутрибрюшинно, а также 3000 мкг/л с целью введения вокруг опухоли. Срок развития опухоли на момент забора материала в 2.1 подопытной группе после 5 введений ОФР соответствовал 20 дням, в 2.2 подопытной группе после 10 введений - 30 дням.

Подопытные 2.3 и 2.4 группы являются материалом изучения влияния на метаболизм печени крыс-опухоленосителей ОФР с концентрацией 3000 мкг/л озоно-кислородной смеси, 1,5 мл которого вводили 5 раз через день только в/б (группа 2.3 - Б-45 - 20 - ОФР) - 15 крыс. Затем еще 5 раз животным (15 крыс) продолжали вводить 1,5 мл ОФР в/б, а также 1,5 мл в/б, вокруг и непосредственно в ткань саркомы.

Нормой служили показатели интактных крыс. Животные этой группы (32 крысы) не подвергались никаким воздействиям, содержались в стандартных условиях вивария.

Озонированный физиологический раствор готовили путем барботажа изотонического физиологического раствора (0,9 % ЫаС1) озоно-кислородной смесью. Скорость подачи кислорода 1 л/мин. Концентрацию озона в газовой фазе контролировали на спектрофотометре при длине волны 254 нм. Концентрацию озона в физиологическом растворе определяли методом йодометрического титрования (Разумовский С.Д., Заиков Г.Е, 1974). Введение озонированного и оксигенированного раствора прекращали за сутки до

момента взятия материала для исследований. Эксперименты проводили на наркотизированных нембуталом (30 мг/кг) животных. Образцы ткани печени и опухоли для биохимических исследований хранили и гомогенизировали в жидком азоте, для приготовления морфологических препаратов образцы опухолевой ткани фиксировали в водном растворе формалина.

Критерием эффективности и безопасности применения озона является интенсивность реакций перекисного окисления липидов (показателя целостности мембранных структур) в тканях. Об активности процесса перекисного окисления липидов можно судить по накоплению продуктов пероксидации. Содержание первичных продуктов - диеновых конъюгатов (ДК), вторичных - триеновых конъюгатов (ТК), и субстратов ПОЛ - общих липидов (ОЛ), определяли спектрофотометрически, уровень конечных продуктов ПОЛ - оснований Шиффа (ОШ), анализировали на флюориметре (Fletcher D., 1973). Наличие свободных радикалов в тканях оценивали методом индуцированной хемилюминесценции (Кузьмина Е.И., 1983).

Для оценки антиоксидантной защиты в работе определяли активность супероксиддисмутазы (СОД), которая контролирует образование супероксидного анион-радикала (Nishirimi М., 1972), каталазы, осуществляющей разложение молекул пероксида водорода (Aebi Н., 1970), а также глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Г-6-Ф-ДГ), которая является ключевым ферментом пентозофосфатного цикла, но в то же время выполняет важную роль для восстановления глутатиона -основного антиоксиданта в клетках печени (Кочетов Г.А., 1980).

Для нормального функционирования гепатоцитов большое значение имеет обеспечение их энергией. Все функции печени (детоксикационная, синтетическая и др.) протекают с затратой энергии. Энергетический потенциал клеток печени оценивали по уровню АМФ, АДФ, АТФ и ГТФ. Количественную оценку содержания адениловых и гуаниловых нуклео^идов в работе проводили методом хроматографии на колонках с эктеол-целлюлозой (Иванова Т.Н., Рубель Л.Н., 1961).

Гликолиз и процесс окислительного фосфорилирования являются двумя регуляторными механизмами, определяющими

энергосинтезирующую функцию клетки. В условиях нарушения кислородного обмена (что имеется в организме с опухолью) снижение интенсивности аэробного окисления в клетках различных органов компенсируется активацией гликолиза. Содержание продуктов реакций

гликолиза - пирувата и лактата, определяли в клетках печени (Асатиани B.C., 1990).

Циклические нуклеотиды - цАМФ и цГМФ участвуют в регуляции биохимических и физиологических процессов в клетках. В опухолевой ткани соотношение цАМФ/цГМФ является показателем активности пролиферации клеток. Содержание циклических нуклеотидов в работе определяли радиоизотопным методом с использованием наборов cGMP [125I], сАМР [12511 фирмы "Amersham" на базе лаборатории Нижегородского областного медицинского диагностического центра.

Морфологическими методами оценивали удельный объем некротизированной ткани саркомы 45 (Романов B.C., 1990).

Полученные данные были обработаны на IBM PC/AT с помощью пакетов прикладных программ Statistica 6.0. для Windows 95. Вероятность различий показателей средних в группах определяли с использованием критерия t-Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследованиях ряда авторов дан анализ физико-химического состояния физиологического раствора, обработанного озоном. Показана высокая растворимость озона в воде и водных растворах, которая значительно больше, чем у кислорода (Алейников С.О., Чучалин А.Г., 1997). С помощью методов ЭПР и хемилюминесценции показано, что в водных средах озон распадается с образованием свободных радикалов (Иванова И.П., Конторщикова К.Н., 1995). В УФ-спектре озонированного физиологического раствора найдена широкая полоса поглощения озона (200300 нм). Показано, что даже длительное барботирование (до 120 мин) физиологического раствора различными концентрациями озона (до 100 мг/л) не сопровождается образованием хлор-кислородсодержащих ионов (Бояринов Г.А. и др., 1998).

После внутрибрюшинного введения крысам ОФР изменения метаболизма клеток печени обусловлены, по всей видимости, влиянием озона и его радикальных форм, образующихся в физиологическом растворе, на обменные процессы в организме и опосредованно на метаболические показатели клеток печени, а также воздействием на клетки печени продуктов взаимодействия озона с клетками крови -озонидов. Существует мнение, что продукты озонирования липидов клеток крови - наиболее вероятные молекулы трансдукции сигнала от озона на метаболизм клеток других органов при его системном влиянии

на организм (Ргуог \У.А. е1 а1., 1995; Зайцев В.Я., Разумовский С.Д., 1998).

В таблице 1 представлены результаты исследования влияния ОФР на скорость реакций перекисного окисления липидов и активность антиоксидантных ферментов в клетках печени здоровых животных. Показано увеличение содержания первичных продуктов ПОЛ в печени здоровых животных 1.1 и 1.2 подопытных групп, свидетельствующее об активации начальных этапов перекисного окисления. Это характерно и для печени крыс, которым в/б вводили ОКФР.

Таблица 1

Содержание общих липидов, продуктов ПОЛ и активность ферментов

антиоксидантной защиты в печени экспериментальных животных, (М±т)

Группы ол, ДК, ед. ТК, ед. ош, СОД, Каталаза

животных мг/мл опт. опт. отн. ед.акт./г ед. акт./г

пл./мг пл./мг ед./мг ткани- ткани-

ОЛ ОЛ ОЛ мин сек

Интактные 0,187± 0,221± 0,135+ 75,09+ 19,87± 1,88+

0,008 0,011 0,011 3,38 0,40 0,12

1.1 - ОКФР 0,194+ 0,269+ 0,202+ 73,53± 22,99+ 2,07±

0,011 0,020 0,019* 4,41 1,35 0,17

1.1 - ОФР 0,162+ 0,345± 0,267+ 80,11 + 19,54+ 0,71+

-400 0,010 0,015*, 0,019* 3,64 1,46 0,13*,

** **

1.2 - ОФР 0,166± 0,291± 0,156± 84,50+ 20,63+ 1,86+

- 1200 0,007 0,011* 0,014 3,03 1,21 0,14

1.3 - ОФР 0,171± 0,209± 0,141 + 68,12+ 28,78+ 1,91+

- 3000 0,009 0,012 0,012** 5,37 1,16*,** 0,12

1.3а - ОФР 0,186+ 0,612± 0,554+ 103,71+ 22,78± 1,98±

-3000 0,017 0,103*, 0,068*, 11,11*, 1,56 0,15

** ** **

1.3Ь - ОФР 0,128+ 0,503± 0,384+ 87,85± 17,89+ 1,57±

-3000 0,022*, 0,061*, 0,049*, 3,45*, 1,78 0,12*,

** ** ** **

* - р<0,05 по сравнению с интактными;** - р<0,05 по сравнению с контролем

На фоне введения ОФР изменений активности ферментов антиоксидантной системы защиты в печени крыс 1.2 подопытной группы не обнаружено. Снижение активности каталазы в печени крыс 1.1 подопытной группы, вероятно, обусловлено увеличением активности

глутатионпероксидазы. Так, известно, что сродство глутатионпероксидазы к пероксиду водорода выше, чем у каталазы (Зенков Н.А. и др., 1993), поэтому первая более эффективно работает при низких концентрациях пероксида водорода (это характерно для клеток печени крыс 1.1 подопытной группы на основании данных о содержании продуктов ПОЛ в печени и результатов, показанных в работе, о стабильности скорости реакций перекисного окисления липидов в крови ). Таким образом, в печени животных, которым в/б вводили ОФР с невысокими концентрациями озона, незначительное увеличение содержания первичных продуктов ПОЛ, по всей видимости, находится в пределах колебания физиологической нормы, уровень конечных продуктов ПОЛ и лизофосфолипидов не изменяется.

В печени животных 1.3 подопытной группы содержание продуктов ПОЛ не изменяется. Однако, увеличение в гепатоцитах активности СОД, а также накопление первичных продуктов переокисления липидов в крови животных этой группы свидетельствует о том, что введение ОФР с данной концентрацией озона создает в организме, в том числе и в клетках печени, предпосылки для сдвига равновесия ПОЛ-антиокислительная активность в сторону усиления прооксидантных процессов. Это подтверждают и полученные в нашей работе результаты об усилении процесса пероксидации липидов (накоплении первичных и конечных продуктов ПОЛ) в печени крыс после в/б введения ОФР с концентрацией озона в газовой фазе 3000 мкг/л, но при использовании большего объема озонированного физиологического раствора (табл. 1).

Уровень макроэргических фосфатов - АТФ и ГТФ, на фоне введения ОФР с различными концентрациями озона не изменяется. Таким образом, основным критерием для выбора концентрации озона в ОФР с целью его внутрибрюшинного введения крысам-опухоленосителям были полученные результаты об активности процесса ПОЛ в печени здоровых животных на фоне введения ОФР.

Злокачественная опухоль, которую можно рассматривать как эндогенный экстремальный фактор, в силу особенностей своего ферментативного аппарата и токсических веществ как продуктов ее обмена нарушает физиологические процессы в тканях организма, непосредственно не затронутых процессом неоплазии. Появление даже неметастазирующего злокачественного новообразования знаменует собой общее заболевание организма (Шапот B.C., 1975). Одна из основных причин расстройства гомеостаза организма - это способность опухоли успешно конкурировать с его тканями за жизненно важные метаболиты и факторы. Вторым моментом «внедрения»

злокачественного новообразования в метаболизм органов и тканей является его токсический эффект (Морозкина Т.С., 1981; Мосиенко B.C. и др., 1985). В связи с этим, активность синтетических процессов и реакций детоксикации в печени во многом определяет изменения физиологической активности клеток различных органов.

Значительную роль в развитии многих патологических процессов, в том числе и злокачественных новообразований, играет чрезмерная активация ПОЛ (Шапот B.C., 1980; Казанова Г.В. и др., 1997). Баланс про- и антиоксидантных систем в клетках различных органов является важным показателем физиологической устойчивости организма к развитию злокачественной опухоли, а также характеризует состояние и эффективность лечения (Михаевич О.Д. и др., 1994; Oberley T.D. et al., 1997).

В ходе наших исследований показано изменение активности про- и антиоксидантных процессов в клетках печени крыс-опухоленосителей, прогрессирующее по мере роста и развития опухоли в организме. Так, отмечено накопление в гепатоцитах как первичных, так и конечных продуктов ПОЛ, уровень которых в печени крыс-опухоленосителей по мере роста и развития саркомы 45 превышает таковой у интактных животных практически в 2 раза (табл. 2). Усиление реакций ПОЛ в гепатоцитах является причиной активации фосфолипазы А2 и накопления в мембранах лизофосфатидилхолина (ЛФХ). На основании полученных данных в печени крыс-опухоленосителей активацию процесса перекисного окисления липидов можно трактовать как «выходящую за рамки физиологической нормы».

Не исключено, что одной из причин усиления процесса ПОЛ в печени животных с опухолью в наших исследованиях является активация и нарушение реакций биотрансформации с участием системы транспорта электронов в ответ на увеличение в крови эндогенных токсических веществ. Так, известно, что микросомальная система переноса электронов в печени - один из источников образования активных форм кислорода, которые рассматриваются в качестве инициаторов процесса ПОЛ в клетках (Bast A. et al., 1984).

Увеличение активности СОД в печени крыс-опухоленосителей контрольных групп 2.1 - S-45 - 20 и 2.2 - S-45 - 30 связано с накоплением в гепатоцитах опухоленосителей О 2" и отражает попытку клеток адаптироваться к усилению реакций свободнорадикального окисления. Снижение активности каталазы, которая относится к классу самых чувствительных к опухолевому росту ферментов-антиоксидантов

(Комов В.П., Рахманина Т.Ф, 1974), активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, показанное лишь в терминальной стадии опухолевого роста, снижает адаптационные возможности клеток печени к повышению ПОЛ (табл. 2).

Таблица 2

Содержание продуктов ПОЛ и активность ферментов антиоксидантной _защиты в печени крыс-опухоленосителей, (М±ш) _

Группы животных ол, мг/мл ДК, ед. опт. пл./мг ол ТК, ед. опт. пл./мг ОЛ ош, отн.ед./ мг ОЛ СОД, ед. акт./г ткани- мин Ката- лаза, ед./г ткани- сек Г-6-Ф- ДГ, нмоль НАДФ Н/г ткани- мин

интактные 0,187+ 0,008 0,221+ 0,011 0,135± 0,011 75,09± 3,38 19,87± 0,40 1,880± 0,121 948,06± 50,18

2.1 - в-45-20 0,169± 0,009 0,335± 0,020* 0,211± 0,020* 126,64± 8,14* 26,71± 2,15* 0,882± 0,243* 972,48± 51,75

2.2 - 8-45 -30 0,155+ 0,007* 0,575± 0,040* 0,372± 0,033* 144,04± 13,41* 27,48± 2,65* 0,653± 0,045* 540,77 ±100,68 *

2.3 - Б-45 -20 - ОКФР 0,187+ 0,017 0,452± 0,181* 0,290± 0,043* 116,61± 7,40* 25,54+ 1,78* 1,342+ 0,058* 655,95± 52,44*, **

2.4 - 8-45 -30 - ОКФР 0,148± 0,005* 0,338+ 0,013*, ** 0,233± 0,009* 115,06± 9,20* 17,21± 0,67*, ** 1,097± 0,108*, ** 624,74± 24,04*

2.1 - 8-45 -20 - ОФР 0,174± 0,020 0,335+ 0,025* 0,203± 0,021* 130,82± 6,94* 25,89± 1,30* 1,522± 0,256 795,16± 42,22 **

2.2 - в-45 -30 - ОФР 0,161± 0,007 0,300± 0,014*, 0,213± 0,014*, ** 104,29± 3,53*, ** 18,62+ 0,86** 1,392± 0,292 ** 852,46± 48,32 **

* - р<0,05 по сравнению с интактными;** - р<0,05 по сравнению с контролем 2.1 - 8-45 - 20 и 2.2 - 8-45 - 30.

Нарушение активности ферментов антиоксидантной системы защиты, работающих на этапах инициирования ПОЛ, в печени крыс с саркомой 45 и Г-6-Ф-ДГ, обеспечивающей клетки печени восстановительными эквивалентами, также играет важную роль в

усилении процессов перекисного окисления липидов. В свою очередь, активация процесса пероксидации липидов и накопление конечных продуктов ПОЛ способствует нарушению активности ферментов-антиоксидантов.

Таким образом, системное воздействие саркомы-45 на организм приводит к увеличению в клетках печени активных форм кислорода, повышению скорости процесса перекисного окисления липидов, снижению антиоксидантного потенциала. Однако, в гепатоцитах на фоне усиления процесса ПОЛ еще не наблюдается полного истощения антиоксидантных систем (активность СОД повышена). По всей видимости, клетки печени крыс-опухоленосителей на данной стадии обладают резервными возможностями для стабилизации про- и антиоксидантных процессов после введения животным антиоксидантов или стимуляторов антиоксидантной активности.

Одним из важных проявлений воздействия злокачественной опухоли на метаболизм тканей организма-опухоленосителя является нарушение энергетического обмена в них (Морозкина Т.С., 1981). В наших экспериментах в печени крыс-опухоленосителей с саркомой 45 установлен факт снижения в клетках АТФ и ГТФ, которое усиливается по мере роста трансплантанта (табл. 3).

Таблица 3.

Содержание макроэргических нуклеотидов, лактата и пирувата в печени

животных-опухоленосителей, мкмоль/г ткани, (М±т)

Группы Лактат Пируват АТФ ГТФ

животных

Интактные 0,308+0,012 0,077±0,002 2,065±0,069 0,398+0,035

2.1 - 8-45-20 0,811+0,096* 0,169±0,029* 1,672+0,125* 0,287+0,012*

2.2 - 8-45 - 30 0,483+0,044* 0,405+0,079* 1,326±0,074* 0,214±0,015*

2.3 - 8-45 - 20 0,786±0,065* 0,234±0,039* 2,034±0,171 0,307+0,055

-ОКФР

2.4 - 8-45 - 30 0,535+0,058* 0,351±0,073* 1,544+0,058* 0,362±0,029**

-ОКФР

2.1 - в-45 - 20 0,758+0,048* 0,08! ±0,023 1,854±0,093 0,377±0,032

-ОФР **

2.2 - в-45 - 30 0,672+0,054*, 0,169+0,069 1,653+0,096 0,684+0,113*,

-ОФР ** ** ** **

* - р<0,05 по сравнению с интактными;** - р<0,05 по сравнению с контролем 2.1 - 8-45 - 20 и 2.2 - 8-45 - 30.

Снижение уровня АТФ и ГТФ обусловлено как ускоренным расходованием макроэргических соединений на реакции синтеза

пластических веществ для всего организма (глюкозы, липидов, белков), а также нарушением их синтеза (снижением активности реакций цикла Кребса, разобщением процессов дыхания и окислительного фосфорилирования, увеличением интенсивности гликолиза), что характерно для поздних стадий роста и развития саркомы 45 в организме крыс. Так, после трансплантации опухоли в печени крыс обнаружено повышение содержания лактата и пирувата (табл. 3). Гипогликемическое давление опухоли на метаболизм нормальных тканей (в связи с хроническим дефицитом основного энергетического субстрата -глюкозы) приводит к мобилизации тканями других энергетических субстратов, в том числе и жирных кислот (Балаж А., 1987). В нашей работе в печени животных с 30-дневным сроком развития саркомы 45 показано снижение содержания свободных жирных кислот.

Уровень цАМФ и цГМФ косвенно может свидетельствовать о направленности и активности физиологических процессов в клетках. В условиях экстремальных воздействий на организм содержание цАМФ в клетках различных органов увеличивается в ответ на активацию гипоталамо-гипофиз-адреналовой системы в организме (Дорофеев Г.И. и др., 1978). В клетках печени циклический нуклеотид выступает в качестве агента мобилизации внутренних ресурсов клеток для обеспечения активных реакций синтеза и энергообразования. Однако, на фоне повышенного уровня цАМФ в печени крыс-опухоленосителей снижение содержания АТФ и ГТФ, свидетельствует о нарушении энергообразующих процессов и их регуляции (табл. 4).

Таблица 4

Содержание циклических нуклеотидов в печени животных-

опухоленосителей, пмоль/г ткани (М±ш)

Группа животных цАМФ цГМФ

Интактные 754,83± 19,02 9,25±0,40

2.1-8-45-20 1057,83+74,04* 10,31±0,78

2.2 - 8-45 - 30 845,07+35,22* 10,88±0,34*

2.3- 8-45 - 20 - ОКФР 994,74+22,38* 10,55±0,45

2.4 - Б-45 - 30 - ОКФР 878,05+28,05* 10,39±0,39

2.1 - 8-45 - 20 - ОФР 760,67±8,31** 9,86±0,55

2.2 - 8-45 - 30 - ОФР 1323,93±71,50*,** 9,9610,20

* - р<0,05 по сравнению с интактными;** - р<0,05 по сравнению с контролем 2.1 - Б-45 - 20 и 2.2 - Б-45 - 30.

Таким образом, наличие саркомы 45 в организме приводит к изменению регуляторных процессов метаболизма печени, выражающееся

в усилении физиологической активности клеток. Однако, дисбаланс про-и антиоксидантных процессов, накопление окисленных форм липидов и, как следствие этого, нарушение свойств мембранных структур, работы мембраносвязанных ферментов, снижение содержания макроэргических фосфатов и энергетических субстратов, накопление пирувата и лактата в клетках печени крыс в процессе роста опухоли в организме свидетельствуют о нарушении функционального состояния клеток.

В нашей работе в качестве корригирующего средства изменения функциональной активности клеток печени крыс-опухоленосителей был использован озонированный физиологический раствор. В основу положена способность озона (озонированного физиологического раствора) при его системном введении через активацию окислительно-восстановительных реакций, индукцию звена антиоксидантной защиты стимулировать энергетический обмен путем оптимизации утилизации кислорода, энергетических субстратов в энергопродуцирующих системах (Перетяган С.П., 1992; Конторщикова К.Н., 1995). Концентрации озона для приготовления озонированного физиологического раствора были подобраны следующим образом. Для локального применения с целью нарушения метаболизма опухолевых клеток и их гибели использовали физиологический раствор, через который пропускали озоно-кислородную смесь с концентрацией озона 3000 мкг/л смеси, так как показан токсический эффект ОФР с данной концентрацией озона на клетки саркомы 45 (Щербатюк Т.Г., 1997). С целью получения системного эффекта озонированного физиологического раствора (мобилизации эндогенных возможностей организма против опухолевых клеток, а также коррекции нарушенных параметров метаболизма печени) животным озонированный физиологический раствор вводили внутрибрюшинно. Для приготовления ОФР использовали концентрации озона, которые не вызывали усиления прооксидантных процессов и серьезных метаболических сдвигов в печени организма интактных животных - 1200 мкг/л озоно-кислородной смеси.

На фоне введения ОФР в печени крыс-опухоленосителей нормализация активности СОД, повышение активности каталазы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы свидетельствуют об увеличении антиоксидантного потенциала клеток печени. Это является основной причиной уменьшения содержания ДК, ТК и ОШ в гепатоцитах (табл. 2). Как следствие снижения скорости реакций процесса пероксидации липидов и накопления продуктов ПОЛ в мембранах гепатоцитов крыс с

саркомой 45 уменьшается содержание лизофосфатидилхолина после введения ОФР.

Необходимо отметить, что после 10 введений экспериментальным животным с опухолью оксигенированного физиологического раствора в клетках печени также снижается уровень первичных продуктов ПОЛ, что менее выражено по сравнению с введением озонированного физиологического раствора. Однако, не отмечается снижения содержания в гепатоцитах ОШ - конечных продуктов процесса пероксидации липидов, повышен и уровень лизофосфатидилхолина по сравнению с интактными животными. Сниженная активность каталазы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы по сравнению с интактными животными свидетельствует о том, что клетки печени крыс-опухоленосителей находятся в состоянии окислительного стресса после введения в организм животных ОКФР, в отличие от клеток печени животных, которым вводили ОФР.

Важным аргументом в пользу эффективного воздействия ОФР на нарушенные энергетические процессы клеток печени животных в условиях роста и развития в организме саркомы 45 являются полученные результаты об изменениях в печени содержания макроэргических нуклеотидов (табл. 3). Накопление АДФ, а также снижение соотношения АТФ/АДФ по сравнению с контролем в печени после 5 введений ОФР способствует активации реакций энергообразования в клетках этого органа. После 10 введений ОФР отмечается достоверное повышение содержания АТФ и ГТФ, а также свободных жирных кислот по сравнению с контролем. По всей видимости, повышение энергетического потенциала клеток печени на фоне введения ОФР обусловлено нормализацией кислородного обмена в организме, активацией цикла Кребса и процессов дыхания в гепатоцитах, что подтверждается снижением в печени животных содержания пировиноградной кислоты после 5 и 10 введений в организм крыс-опухоленосителей ОФР (табл. 3). После 10 введений ОФР в печени крыс-опухоленосителей подопытной 2.2 группы увеличение содержания лактата на фоне нормализации содержания пирувата, АТФ и ГТФ свидетельствует, по всей видимости, об изменении соотношения процессов аэробного и анаэробного окисления.

Исследование соотношений между процессами митохондриального и микросомального окисления, а также ПОЛ показывает определенную связь между нарушением сопряженности окислительного фосфорилирования и накоплением продуктов перекисного окисления липидов. Степень нарушения функциональной активности митохондрий печени зависит от концентрации продуктов свободнорадикального

окисления и активности антиоксидантных ферментов (Рябинович Е.И., Соколова С.Н, 1996). В связи с этим, в наших исследованиях восстановление активности антиоксидантных ферментов до значений у интактных животных, снижение содержания в печени крыс-опухоленосителей продуктов ПОЛ может также определять изменения функционального состояния митохондрий клеток печени, снижать степень разобщения процессов дыхания и окислительного фосфорилирования и повышать эффективности использования кислорода для продукции макроэргов.

Несмотря на увеличение содержания ГТФ в печени крыс-опухоленосителей, которым вводили ОКФР (что не противоречит литературным данным о биоэнергетическом эффекте кислорода), повышения содержания АТФ, нормализации уровня пирувата в печени крыс-опухоленосителей после 10 введений им оксигенированного физиологического раствора не обнаружено. Одной из причин этого может являться повышенное содержание в печени конечных продуктов ПОЛ, лизофосфатидилхолина, которые оказывают разобщающее воздействие на процесс дыхания и окислительного фосфорилирования.

Таким образом, после введения животным ОФР в печени крыс-опухоленосителей отмечали стабилизацию уровня ПОЛ, нормализацию работы антиоксидантных ферментов, восстановление содержания макроэргических нуклеотидов, пирувата при незначительном возрастании уровня лактата. Полученные изменения свидетельствуют об активации внутриклеточных механизмов энергетической, пластической и антиоксидантной функций гепатоцитов под влиянием озонотерапии. Взаимосвязанная деятельность этих механизмов лежит в основе улучшения функционирования печени: во-первых, возрастание энергетического потенциала гепатоцитов характеризует повышение их синтетической способности в условиях обеспечения пластического обмена тканей организма, непосредственно не затронутых процессом неоплазии; во-вторых, нормализация перечисленных процессов в клетках печени способствует улучшению антитоксической функции печени, что важно в условиях поступления продуктов обмена и распада саркомы 45 в организм хозяина.

Восстановление содержания цАМФ в печени крыс-опухоленосителей после 5 введений ОФР до уровня у интактных животных может свидетельствовать о снижении в клетках компенсаторных реакций на ранних стадиях роста и развития опухоли в организме, что возможно связано с уменьшением токсического

воздействия саркомы 45 на организм и метаболизм клеток печени. В дальнейшем, в процессе усиления воздействия опухоли на организм, повышение содержания цАМФ свидетельствует о мобилизации внутренних ресурсов клеток печени, перестройки метаболизма на новый уровень функционирования вследствие восстановления функциональных изменений клеток печени. Снижение скорости реакций ПОЛ, содержания конечных продуктов пероксидации липидов, лизофосфатидилхолина, которые могут ингибировать аденилатциклазу, является фактом, способствующим повышению активности фермента и уровня цАМФ.

На фоне положительного воздействия озонированного физиологического раствора на метаболизм печени в ткани саркомы 45 снижается активность пролиферативных процессов, о чем свидетельствует уменьшение содержания в клетках цГМФ и повышение соотношения цАМФ/цГМФ. В клетках опухоли повышается активность свободнорадикального окисления после введения животным ОФР. Тенденция увеличения ЛФХ после 5 введений ОФР сменяется достоверным накоплением лизофосфолкпида в ткани саркомы после 10 введений животным ОФР. При изучении противоопухолевых препаратов на линии раковых клеток показано, что эффект уничтожения опухолевых клеток связан с активацией фосфолипазы Аг и увеличением содержания лизофосфолипидов в мембранах клеток (Уап-КепзЬш^ С.Е. е1 а1., 1993). По всей видимости, одним из механизмов цитотоксического эффекта на клетки опухоли озонированного физиологического раствора также является накопление лизофосфолипидов в мембранах клеток саркомы 45, что может служить причиной нарушения проницаемости мембран опухолевых клеток и изменения их метаболических параметров вплоть до гибели, что показано морфологическими методами. Таким образом, восстановление функциональной активности клеток печени обусловлено стимуляцией нарушенных параметров метаболизма на уровне всего организма и клеток печени, а также нарушением метаболизма опухолевых клеток и снижением "давления" саркомы 45 на организм хозяина-опухоленосителя.

На основании полученных результатов в группах крыс, которым ОФР с концентрацией озона 500-550 мкг/л (3000 мкг/л озоно-кислородной смеси) вводили только в/б, а затем еще и локально, можно сделать выводы о том, что совместное введение озонированного физиологического раствора как локально, так и внутрибрюшинно более эффективно для восстановления функций печени у животных со злокачественной опухолью..

ВЫВОДЫ

1. Введение внутрибрюшинно озонированного физиологического раствора интактным животным не вызывает изменения энергетического потенциала в клетках печени. Изменение активности ферментов антиоксидантной защиты в печени и повышение скорости реакций ПОЛ наблюдается лишь при использовании ОФР с концентрацией 500-550 мкг/"л раствора (3000 мкг/л озоно-кислородной смеси).

2. Наличие саркомы 45 - эндогенного экстремального фактора в организме, приводит к изменению функционального состояния клеток печени крыс-опухоленосителей по мере роста и развития опухоли в организме: а) нарушению баланса про- и антиоксидантных процессов и, как следствие этого, изменению липидного состава клеток; б)уменьшению содержания АТФ и ГТФ, свободных жирных кислот, прогрессирующего по мере роста и развития саркомы в организме; г)накоплению пирувата и лактата и усилению роли гликолиза в энергосинтезирующей функции клеток печени, что не предотвращает, однако, снижения в печени энергетического потенциала.

3. Введение озонированного физиологического раствора внутрибрюшинно и в опухолевую ткань оказывает корригирующий эффект на нарушенные показатели метаболизма печени экспериментальных животных, что выражается: а)снижением интенсивности реакций ПОЛ, содержания лизофосфолипидов вследствие нормализации активности ферментов антиоксидантной защиты;

б)повышением энергетического потенциала клеток, вызванное восстановлением кислородзависимых процессов в организме и активацией реакций энергетического обмена в клетках печени;

в)восстановлением до уровня интактных животных содержания пирувата на фоне незначительного увеличения лактата, свидетельствующее об оптимизации использования пировиноградной кислоты в реакциях промежуточного обмена.

4. Корригирующий эффект ОФР на нарушенные показатели метаболизма печени крыс с саркомой 45 обусловлен как восстановлением обмена веществ в организме,. так и нарушением пролиферативных и окислительных процессов в опухолевых клетках, снижением воздействия опухоли на организм крыс-опухоленосителей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Конторщикова К.Н., Гончарова Т.А. Вторичные мессенджеры в процессе канцерогенеза. - Н. Новгород, 1996. - 10 с. - Деп. в ВИНИТИ 14.10.96, № 3023-В 96.

2. Конторщикова К.Н., Гончарова Т.А. Вторичные мессенджеры. Участие в метаболизме клетки. - Н. Новгород, 1996. - 16 с. - Деп. в ВИНИТИ 14.10.96, № 3024-В 96.

3. Конторщикова К.Н., Щербатюк Т.Г., Гончарова Т.А., Козлов Д.В. Влияние озона на состояние процессов перекисного окисления липидов и спектр макроэргических нуклеотидов у экспериментальных животных при неоплазии // Паллиативная медицина и реабилитация. - 1997. - № 2. -С. 46-47.

4. Contorschikova С., Goncharova Т. Ozone corrective effect on liver metabolism indexes in experimental animals with neoplasm // II International Symposium on Ozone Application. - Havana, 1997. - P. 24.

5. Гончарова Т.А. Корригирующий эффект озонированного физиологического раствора на спектр макроэргических фосфатов крови и печени экспериментальных животных при неоплазии // Тез. докл. II Нижегородской сессии молодых ученых. - Н.Новгород, 1998. - С. 211.

6. Гончарова Т.А., Конторщикова К.Н., Щербатюк Т.Г. Влияние озонированного физиологического раствора на метаболические показатели печени крыс в процессе роста экспериментальной опухоли саркома 45 // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины: Тез. докл. конф. молодых ученых России с международным участием. -Москва, 1998. - С. 227.

7. Щербатюк Т.Г., Конторщикова К.Н., Гончарова Т.А..Гуляева H.A., Козлов Д.В. Озонотерапия в условиях экспериментального онкогенеза У/ Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины: Тез. докл. конф. молодых ученых России с международным участием. - Москва, 1998. - С. 226-227.

8. Гончарова Т.А. Метаболизм-модифицирующие свойства озонированного физиологического раствора в печени экспериментальных животных // Тез. докл. III Нижегородской сессии молодых ученых. - Н.Новгород, 1998. -в печати.

9. Гончарова Т.А., Конторщикова К.Н. Влияние озонированного физиологического раствора на биохимические показатели печени при неоплазии // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 1998. - Т. 126, № 8. - С. 207-209.

10. Гончарова Т.А., Конторщнкова К.Н., Сиднев Б.Н. Влияние озонированного физиологического раствора на функциональное состояние печени крыс в норме и крыс-опухоленосителей с саркомой 45 // Озон и методы эфферентной терапии в медицине: Тез. докл. III Всероссийской научн.-практ. конф. - Н.Новгород, 1998. - С. 25-26.

11. Щербатюк Т.Г., Конторщикова К.Н., Снопова Л.Б., Романов B.C., Гончарова Т.А. Противоопухолевый эффект озона в условиях экспериментального онкогенеза// Озон и методы эфферентной терапии в медицине: Тез. докл. III Всероссийской научн.-практ. конф. Н.Новгород, 1998. - С. 23-24.

12. Щербатюк Т.Г., Гончарова Т.А., Послов Г.А., Илларионов В.Ю. Опыт использования озона при лечении злокачественных новообразований у собак // Озон и методы эфферентной терапии в медицине: Тез. докл. III Всероссийской научн.-практ. конф. Н.Новгород, 1998. - С. 24-25.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гончарова, Татьяна Анатольевна, Нижний Новгород

НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

Гончарова Татьяна Анатольевна

ВЛИЯНИЕ ОЗОНИРОВАННОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПЕЧЕНИ КРЫС В НОРМЕ И С

САРКОМОЙ 45

03.00.13 - физиология человека и животных

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук К.Н. Конторщикова

НИЖНИЙ НОВГОРОД -1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

СТР.

СОКРАЩЕНИЯ И УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ...............................................................6

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................................7

ГЛАВА 1 .ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПЕЧЕНИ В ОРГАНИЗМЕ С

ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛЬЮ - ЭНДОГЕННЫМ ЭКСТРЕМАЛЬНЫМ ФАКТОРОМ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Функциональная характеристика клеток печени..........................13

1.2. Значение основных функций печени при действии на организм экстремальных факторов............................................................15

1.3. Состояние метаболизма печени в организме со злокачественной опухолью.......................................................................................19

1.3.1. Особенности метаболизма клеток злокачественных опухолей. 19

1.3.2. Системное влияние опухоли на организм..................................22

1.3.2.1.Изменение гормонального статуса и функционирования системы вторичных мессенджеров в организме с опухолью...........................................................................23

1.3.2.2. Состояние процесса перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы защиты в печени организма с опухолью...................................................25

1.3.2.3. Состояние энергетического обмена в печени организма с опухолью......................................................................26

1.4. Метаболизм-модифицирующие свойства озона...........................30

1.4.1. Физико-химические свойства озона...........................................30

1.4.2. Биохимические аспекты влияния озона на организм................31

1.4.3. Влияние озона на функциональное состояние клеток печени...33

1.4.4. Использование озона в онкологии.............................................35

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Схема экспериментов.....................................................................37

2.2. Характеристика групп экспериментальных животных................37

2.2.1.1-я серия экспериментов - влияние озонированного

физиологического раствора на метаболизм печени крыс в

условиях физиологической нормы..............................................39

2.2.2. 2-я серия экспериментов - влияние озонированного физиологического раствора на метаболизм печени

крыс-опухоленосителей...............................................................40

2.3. Методы исследований....................................................................42

2.3.1. Методы определения интенсивности процесса перекисного окисления липидов.......................................................................42

2.3.1.1. Определение интенсивности свободнорадикального окисления методом индуцированной хемилюминесценции.......................................................44

2.3.1.2. УФ - спектроскопия продуктов перекисного окисления липидов..........................................................44

2.3.1.3. Флюориметрический метод определения содержания оснований Шиффа...........................................................44

2.3.1 АОпределение содержания общих липидов......................44

2.3.2. Методы исследования активности ферментов антиоксидантной

защиты..........................................................................................44

2.3.2.1.Определение активности супероксиддисмутазы.............45

2.3.2.2. Определение активности каталазы................................45

2.3.3. Определение активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы.....46

2.3.4. Количественная оценка содержания отдельных фракций липидов.........................................................................................46

2.3.5. Определение содержания циклических нуклеотидов................47

2.3.6. Определение содержания макроэргических нуклеотидов.........48

2.3.7. Определение содержания продуктов углеводного обмена -пирувата и лактата......................................................................49

2.3.8. Морфологические методы исследования...................................49

2.3.9. Методы статистической обработки материала.........................49

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ОЗОНИРОВАННОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА НА

МЕТАБОЛИЗМ ПЕЧЕНИ ИНТАКТНЫХ ЖИВОТНЫХ 3.1. Результаты исследований..............................................................50

3.1.1. Активность процесса перекисного окисления липидов в печени экспериментальных животных .....................................50

3.1.2. Активность ферментов антиоксидантной защиты в печени экспериментальных животных....................................................53

3.1.3. Состав липидов печени экспериментальных животных............55

3.1.4. Содержание макроэргических нуклеотидов в печени экспериментальных животных....................................................58

3.1.5. Содержание пирувата и лактата в печени экспериментальных животных.....................................................................................60

3.2. Обсуждение результатов...............................................................62

ГЛАВА 4. ИЗМЕНЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ПЕЧЕНИ ЖИВОТНЫХ-ОПУХОЖНОСИГЕЛЕЙ В ПРОЦЕССЕ РОСТА САРКОМЫ 45

4.1. Результаты исследований.............................................................72

4.1.1. Состояние процесса перекисного окисления липидов в печени животных-опухоленосителей.....................................................72

4.1.2. Активность ферментов антиоксидантной защиты и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в печени животных-опухоленосителей..74

4.1.3. Состав липидов печени животных-опухоленосителей..............75

4.1.4. Энергетический потенциал печени животных-опухоленосителей.......................................................................77

4.1.5. Содержание пирувата и лактата в печени животных-опухоленосителей.............................................................................79

4.1.6. Содержание циклических нуклеотидов в печени животных-опухоленосителей......................................................................80

4.2. Обсуждение результатов................................................................81

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ОЗОНИРОВАННОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА

НА МЕТАБОЛИЗМ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ ЖИВОТНЫХ-ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕЙ

5.1. Результаты исследований...............................................................96

5.1.1. Интенсивность процесса перекисного окисления липидов, активность ферментов антиоксидантной защиты и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы в печени животных-опухоленосителей на фоне введения озонированного

физиологического раствора.........................................................96

5.1.2. Влияние озонированного физиологического раствора на состав липидов печени животных-опухоленосителей................101

5.1.3. Влияние озонированного физиологического раствора на энергетический потенциал печени

животных-опухоленосителей.......................................................103

5.1.4. Содержание пирувата и лактата в печени животных-опухоленосителей на фоне введения озонированного физиологического раствора........................................................106

5.1.5. Влияние озонированного физиологического раствора на содержание циклических нуклеотидов в печени животных-опухоленосителей........................................................................107

5.1.6. Сравнительное изучение влияния озонированного физиологического раствора на метаболизм печени животных-опухоленосителей приразличных способах ведения раствора.. 111

5.2. Обсуждение результатов................................................................115

ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ ОЗОНИРОВАННОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА НА МЕТАБОЛИЗМ КЛЕТОК САРКОМЫ 45

6.1. Результаты исследований.............................................................128

6.1.1. Содержание циклических нуклеотидов в опухолевой ткани.....128

6.1.2. Состав липидов опухолевой ткани.............................................129

6.1.3. Морфологическая характеристика опухолевой ткани...............131

6.2. Обсуждение результатов.................................................................132

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................................................................137

ВЫВОДЫ.....................................................................................................................................142

ЛИТЕРАТУРА.............................................................................................................................144

СОКРАЩЕНИЯ И УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

АДФ - аденозиндифосфорная кислота

АМФ - аденозинмонофосфорная кислота

АОА - антиоксидантная активность

АОЗ- антиоксидантная защита

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

ГДФ - гуанозиндифосфорная кислота

ГТФ - гуанозинтрифосфорная кислота

Г-6-Ф-ДГ - глюкозо- 6-фосфат-дегидрогеназа

ДК - диеновые конъюгаты

ЛФХ - лизофосфатидилхолин

НЖК - ненасыщенные жирные кислоты

ОКФР - оксигенированный физиологический раствор

ОЛ - общие липиды

ОФР - озонированный физиологический раствор

ОШ - основания Шиффа

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СЖК - свободные жирные кислоты

СМ - сфингомиелин

СОД - супероксиддисмутаза

СРО - свободнорадикальное окисление

ТГ - триглицериды

ТК - триеновые конъюгаты

ФХ - фосфатидилхолин

ФЭА - фосфатидилэтаноламин

ХЛ - хемилюминесценция

ХС - холестерин

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат ЭХ - эфиры холестерина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Печень играет важную роль в межорганных и межсистемных взаимодействиях организма, так как от активности осуществляемых в печени процессов трансформации и функционального синтеза энергетических и пластических веществ в значительной мере зависит метаболизм других органов и систем, а также приспособительная деятельность всего организма при воздействии различных экстремальных факторов экзогенного и эндогенного происхождения [37,103,258,276,281].

Изучение функционального состояния печени в организме со злокачественной опухолью - своего рода эндогенного экстремального фактора, является частью общей проблемы "опухоль - организм". Основным признаком злокачественного новообразования является нарушение метаболизма тканей организма хозяина, непосредственно не затронутых процессом неоплазии. Гомеостаз печени во многом определяет течение опухолевого процесса и рост опухоли, а также состояние всего организма с опухолью, переносимость к противоопухолевым препаратам [45, 110, 176]. Реакции промежуточного обмена в печени в процессе адаптации к росту и развитию опухоли обеспечивают барьерную функцию, направленную на защиту внутренней среды от неблагоприятного действия токсических продуктов обмена и распада опухолевых клеток, и функцию обеспечения всего организма пластическим материалом в условиях усиленных пролиферативных процессов в опухолевой ткани [110, 176, 182, 239, 240, 241, 274, 277]. В свою очередь, вследствие системного и токсического воздействия опухоли на организм в печени наблюдаются значительные функциональные изменения - нарушение окислительно-восстановительного потенциала, изменение активности реакций углеводного, белкового, липидного обмена и энергообеспечения этих процессов [107, 110, 158,175,197, 200, 215, 222,274].

Для коррекции функцональных изменений в клетках печени при опухолевом росте на фоне нарушения метаболизма клеток опухоли необходимо стимулировать эндогенные возможности организма против опухоли с целью нарушения ее метаболизма, снижения токсического и

системного воздействия опухоли на организм. Восстановление функциональной активности печени возможно также вследствие частичной корректировки ее нарушенного метаболизма (увеличения рОг, индукции антиоксидантов и снижения активности реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ), нормализации процессов окислительного фосфорилирования и восстановления содержания энергетических субстратов клеток).

Корригирующий эффект газообразного озона и озонированных растворов на кислородзависимые процессы, энергетический потенциал, баланс про- и антиоксидантных реакций в клетках организма при использовании терапевтических концентраций озона обнаружен в экспериментальных исследованиях и в клинической практике [22, 78, 124, 137]. Показан токсический эффект озонированного физиологического раствора (ОФР) на метаболизм опухолевых клеток [180]. Отсюда вытекает целесообразность изучения возможности применения озонированного физиологического раствора для восстановления изменения метаболизма клеток организма с опухолью и повышения адаптационных возможностей организма хозяина. Интерес представляет и исследование эффекта озонированного физиологического раствора на состояние метаболических реакций в печени интактных животных, что недостаточно комплексно исследовано в настоящее время.

Цели и задачи исследования: Цель представленной работы - изучение влияния озонированного физиологического раствора на функциональное состояние клеток печени крыс в условиях физиологической нормы, а также крыс-опухоленосителей в процессе роста и развития саркомы 45 в организме.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние озонированного физиологического раствора на активность про- и антиоксидантных процессов, состав липидов, а также энергообеспечение клеток печени интактных крыс.

2. Оценить функциональное состояние клеток печени крыс с саркомой 45 (содержание циклических нуклеотидов как биорегуляторов

физиологической активности клеток, энергетический потенциал, состояние процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы защиты, состав липидов) в зависимости от сроков развития опухоли и степени ее системного воздействия на организм экспериментальных животных.

3. Изучить эффект озонированного физиологического раствора на функциональные изменения клеток печени крыс-опухоленосителей, вызванные системным и токсическим воздействиями саркомы 45.

4. Провести сравнительный анализ влияния озонированного физиологического раствора на метаболизм печени животных-опухоленосителей только после внутрибрюшинного введения раствора, а также введения озонированного раствора внутрибрюшинно и локально -вокруг опухоли и непосредственно в опухолевую ткань.

Научная новизна работы. В результате исследований впервые:

1. Проведен комплексный анализ функционального состояния печени животных с саркомой 45 в динамике роста и развития опухоли. В клетках печени показаны взаимосвязанные нарушения окислительных процессов липидов, реакций углеводного обмена, энергообеспечения, а также их регуляции с участием циклических нуклеотидов.

2. Изучены особенности влияния озонированного физиологического раствора с различными концентрациями озона на состояние процесса перекисного окисления липидов и состав липидов, содержание продуктов углеводного обмена, а также энергообеспечение, клеток печени интактных животных. Обнаружено, что внутрибрюшинное введение озонированного физиологического раствора с концентрацией озона для приготовления раствора 1200 мкг/л озоно-кислородной смеси практически не вызывает изменений метаболических параметров клеток печени. Введение животным озонированного физиологического раствора с более высокой концентрацией озона - 3000 мкг/л озоно-кислородной смеси приводит к усилению реакций перекисного окисления липидов в крови и изменению активности супероксиддисмутазы в клетках печени.

3. На модели экспериментальной опухоли саркома 45 показано, что введение озонированного физиологического раствора приводит к повышению содержания цАМФ, восстановлению равновесия про- и антиоксидантных процессов, липидного состава, к нормализации энергетического потенциала в клетках печени крыс-опухоленосителей.

4. После введения животным озонированного физиологического раствора на фоне восстановления функциональных изменений в клетках печени крыс-опухоленосителей в опухолевой ткани отмечено нарушение активности пролиферативных процессов, обусловленных изменением соотношения цАМФ/цГМФ, усиление процессов окисления липидов, приводящие к увеличению количества погибших клеток саркомы 45. Теоретическая и практическая значимость полученных результатов.

В работе получены экспериментальные данные о механизмах воздействия озона на клетки печени организма в норме и при патологии. Показан корригирующий эффект озонированного физиологического раствора на состояние метаболизма печени организма-опухоленосителя. Учитывая важную роль этого органа в процессе адаптации организма к различным экстремальным факторам экзо- и эндогенного происхождения, в том числе и наличию в организме злокачественного новообразования, теоретические положения, полученные в экспериментальных исследованиях, могут служить обоснованием возможности применения озонированного физиологического раствора в комплексной противоопухолевой терапии. Использование озонированного раствора может способствовать повышению эффективности процессов адаптации организма с опухолью к воздействию злокачественного новообразования, снижению токсического влияния продуктов обмена опухолевой ткани на организм.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на II и III Нижегородской сессии молодых ученых (Нижний Новгород, 1997, 1998), III Всероссийской конференции "Озон и методы эфферентной терапии в медицине" (Н.Новгород, 1998 г.).

Положения, выносимые на защиту.

1. Существенных изменений энергетического потенциала в печени здоровых крыс на фоне введения озонированного физиологического раствора с различными концентрациями озона не отмечено.

Внутрибрюшинное введение озонированного физиологического раствора с концентрацией �