Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Липиды биомембран животных при адаптации к экстремальным воздействиям

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Липиды биомембран животных при адаптации к экстремальным воздействиям"

0Г

академия наук узбекской сср_ -уд^-у

~~ин СП1ТУТ~би0хид\ии ~

А

На правах рукописи ИВАНОВ Владимир Иванович

УДК 577.115:577.33.013:599.1/599

ЛИПИДЫ БИОМЕМБРАН ЖИВОТНЫХ ПРИ АДАПТАЦИИ К ЭКСТРЕМАЛЬНЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ

03.00.04 — Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Ташкент — 1989

Работа выполнена в лаборатории радиационной биохимии и цитологии Института биохимии АН УзССР.

Официальные оппоненты: академик АН УзССР, доктор биологических наук, профессор Туракулов Я. X.,

— доктор биологических наук, про* фессор Бурлакова Е. Б.,

— доктор биологических наук, профессор Кудряшов Ю. Б.

Ведущая организация — Институт биологической физики АН

СССР (г. Пущино).

Защита состоится « »_ 1989 г.

в час. на заседании специализированного совета

Д 015.16.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биохимии АН УзССР (Ташкент, 700143, пр. М. Горького, 56).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН УзССР.

Автореферат разослан « » 1989 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, доктор биологических наук —

JLU Г К. Н. НИШАНБАЕБ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Исследование выполнено в райках Всесоюзных проблей 2.28.8 "Структура н функции биологических мембран", 2.8,10 - "Радиационная биология". '

Актуальность проблемы. В системе теоретических и практических проблем, раскрывающих взаимоотношение организма.и среды, к чиолу наиболее актуальных относится адаптация. При зтом существенная роль принадлежит представлениям о ооотоянии структурных компонентов клеточных мембран в уоловиях"патологи», возникающей при . прорыве патогенным агентом системы защитных,, компенсаторных и восстановительных механизмов (П.7.Горизонтов,. 1981; Д.С» Саркисов, 1987; А.К.Кузин, 1987). Представляется очевидным, что решение га-дач этой исключительно важной проблемы современной биохимии, мемб-ранологии и экспериментальной биологии в целом тесно связано с глубоким изучением молекулярной организации клеточных мембран у биологических объектов, обладающих выраженной устойчивостью к поражающему действию экстремальных факторов.

Предшествующими работами (А.А.Турдыев и сотр., 1973-1988) была показана целесообразность филогенетического подхода к выяснению цитоэкологических взаимоотношений в экстремальных условиях. В зтом плане особый интерес представляет феномен уникальной радиорезистентности среднеазиатской черепахи ХевЪийо Ьога£1еЫ1. Не менее важным является факт высокого радкотерапевтического эффекта на млекопитающих фактора, подученного путем экстракции из селезенки черепахи (А.А.Турдыев и сотр., 1987; Р.Б.Усманов, 1986). В биохимии экстремальных и патологических состояний убедительно'показана особая роль синдрома пероксидации липидов биологических мембран {Ю.А.Владимиров, А.И.Арчаков, 1972; Е.Б.Бурлакова и др., 1975; Е.Н.Гоича-ренко, Ю.Б.Кудряшов, 1980; В.Е.Каган, 1980). Изменение фазового состояния липидного матрикса биомембран с одной стороны слухит механизмом резистентности к внешним воздействиям, с другой, если эти изменения выходят за диапазон саморегуляции, лежит з основе развития патологических процессов (Е.Б.Бурлакова и др.,1980; КоЧе1оз, 1979).

Однако, несмотря на бесспорный интерес к изучении роли липидов в адаптационных реакциях животного организма, сдвиги липлдного метаболизма в экстремальных условиях недостаточно изучены даже для

центрального органа липогенеза - печени (И.К.Коломийцева, 1986). До сих пор Ьо многой неясны механизмы липидной стратегии адаптации в процессах видовой устойчивости и репарации повреждений биомембран, индуцированных нелучевыми воздействиями. .

В свою очередь, незнание критериев и эколого-биохимических механизмов адаптации одерживает решение проблей, овнаанных с целенаправленным управлением этим процессом и изысканием научно обоснованных средств повышения резистентности организма к действию различных экстремальных факторов и в том числе к ионизирующему излучению. 4

Цель и задачи ' 1боты. Анализ состояния липидов биомембран при адаптации к экстремальным воздействиям у позвоночных, обладающих наиболее аффективными системами жизнеобеспечения, а также поиск путей управления радиорезистентностью- цель исследования.-.

К числу факторов, способных-увеличивать устойчивость к иони-?.. зирующей радиации, относятся гипоксия, гипотермия, некоторые дру- . гие, механизмы действия которых сводятся к снижению содержания кислорода в тканях животных. Вместе с тем,'решение вопросов адаптации тесно связано о понятием биологической мембраны как кооперативной мишени для экстремальных воздействий, в которой липидный матрикс -самая мобильная структура. В соответствии с целью исследований были сформулированы следующие основные задачи:

- исследовать устойчивость среднеазиатской черепахи к воздействию физических факторов ср л: гипо- и гипертермии, аноксии, со-четанноиу действию аноксии и у-излучения;

- дать сравнительную.характеристику основным классам фосфоли-пидов и нейтральных липидов, их кирнокислотного состава в мембранах макросом гепатоцитов высокорезистентной среднеазиатской черепахи Testudo horsfieldi и белой крысы;

- изучить липидную стратегию биохимической-адаптации среднеазиатской черепахи к экстремальным воздействиям;

- изучить реакции мембранных компонентов клетки на -предлуче-вое повышение уровня эндогенных продуктов .перекисного окисления липидов у млекопитающих;

- выявить особенности пострадиационного восстановления поврежденных мембранных компонентов клетки млекопитающих экзогенным модификатором лучевого эффекта из селезенки среднеазиатской черепахи.

Научная новизна. Разрабатываются теоретические основы сравнительной биохимии видовой устойчивости к экстремальным факторам поз-

воночных животных* Впервые установлена ранее неизвестная способность среднеазиатской черепахи длительно существовать в условиях аноксии за счет снижения интенсивности обменных процессов и выработки энергии путеы гликолиза.

Выявлены отличия в липидном составе субклеточных структур печени среднеазиатской черепахи и млекопитающих.

Получены данные, свидетельствующие, что мембранные липиды более лабильны при охлаждении, чем при перегреве, это объясняет более высокую толерантность черепах к гипотерии, чем к гипертермии.

Показана роль мембранных липидов в механизмах адаптации сред-' неазиатской черепахи к высоким дозам ионизирующего излучения. В микросомах печени черепах, тонально облученных в дозе 500 Гр,наб-людается нарастание перекисей, увеличение количества лизоформ, изменение относительного количества липидов, более стабильных к окислению, возрастает полиненасыщенность основных классов фосфолици-дов. Однако, эти процессы при облучении-кратной дозой СЛЛ50/30) протекают у черепах более продолжительно, чем у млекопитающих. "

Приводятся данные о модифицирующем влиянии длительной аноксии (6 ч) на повреждение ионизирующим излучением (420 Гр) мембранных компонентов клеток печени среднеазиатской черепаху. Перевод биосистемы на филогенетически более древний путь выработки энергии - анаэробный гликолиз устраняет кислородный эффект при тотальном 7-облучении. ^

Подтверждена гипотеза эндогевного фона радиорезистентности (Е.Н.Гончаренко, Ю.Ю.Кудряшов, 1980) и гипотеза универсальности активации липогенеза (И.К.Коломийцева, 1986) при лучевом воздействии не высокорадиорезистевтной среднеазиатской чербпахе.

Приведены новые данные, свидетельствующие о синергическом эффекте совместного воздействия 7-облучения (8 Гр) и предлучевой гипокинезии (¿1 сут) на уровень эндогенных радиосенсибилизаторов и компенсаторный резерв энергетической системы в митохондриях печени крыс.

Показана возможность коррекции нарушений структуры и функции знергетячеокой системы облученных млекопитающих в постлучевой период препаратом, полученным путем экстракции из селезенки среднеазиатской черепахи. .

Взаимосвязь между составом и уровнем окислительных реакций в литтидах позволяет с помощью малых доз экстракта селезенка черепахи,опосредованно влияющего на интенсивность процессов ПОЛ, нап-

равленно-лзменять состав ыитохондриальных и иикросомальных липи-дов и тем самым нормализовать реакции, лежащие "в основе патогенеза лучевой болезни.

Научно-практическая значимость. Работа имеет значение для фундаментальных исследований роли липидной стратегии биохимической адаптации к экстремальный воздействиям у позвоночных.

Представления о механизмах устойчивости высокорадиорезио-тентной среднеазиатской черепахи Testudo horefieidi к условиям длительной аноксии и гипотермии важны для анализа радиационных из менеяий структуры и функций биоыембран при воздействии на органиа летальных и сублетальных доз ионизирующего излучения.

В практике радиационной терапии рекомендуется учитывать явле ние синергического, неаддитивного инициирования уровней вндогенни радиосенсибилизаторов при комбинированной воздействии гипокинезии и y-облучения, так как при этом наблюдаются более значительные нарушения липидной фазы мембран субклеточных органелл и функционе льной активности энергетического аппарата клетки, чем при раздел! ном воздействии ограничения подвижности и облучения.

Практическое значение работы состоит в обосновании перспективности поисков антилучевых средоть среди биогенных регуляторов гемопоэза, полученных путем экстракции из селезенки среднеазиатской черепахи Testudo horsfleldt, способных кодифицировать структуру и функции биомембран, а также оказывать антиоксидантны! аффект в постлучевой период.

Полученные результаты внедрены в учебный процесс на кафедре биофизики и охраны окружающей среда биофака Ташкентского государственного университета.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Устойчивость среднеазиатской черепахи Testudo horstieidi экстремальным факторам среды в значительной мере связана с компе: оаторными изменениями в липидной фазе биоиеибран.

2. В реализации патобиохимических реакций при комбинированн воздействии гипокинезии и "У-облучения ведущим является синергич окий аффект накопления продуктов перекисвого окисления липидов в мембранных компонентах клетки;

3. Экзогенный модификатор радиационного эффекта из селеэенх среднеазиатской черепахи способствует частичному восстановлению физико-химических свойств мембранных компонентов клетки облученн в летальных дозах млекопитающих. .

Апробация работы» Материалы диссертации докладывались на П Ш Всесоюзных симпозиумах "физиологические и клинические проб-¡мы адаптации организма человека и животного к гипоксии, гипер-фмии, гиподинамии и неопецифичеокие средства восстановления" !осква, 1978, 1981); Всесоюзном симпозиуме "Радиочувствитель-ють и процессы восстановления у животных и растений". (Ташкент, Э79); на I и Ш Всесоюзных симпозиумах "Липиды биологических мем->ан" (Ташкент, 1980? Пущино, 1984); Всесоюзной конференции "Бионическая характеристика лабораторных аивотных'и экстраполяция i человека полученных в эксперименте данных" (Москва, 1980); на Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); на Ш съезде фи-юлогов Узбекистана (Ташкент, 1983); на Ш Советско-швейцарском шпозиуме."Биологические мембраны: структура и функции?-(Ташкент, 383); Всесоюзном рабочем совещании "Радиочувствительность оргазма и возможности ее модификации" (Андижан, 1983); Пленуме Науч-эго Совета АН СССР по проблемам радиобиологии "Проблемы радиире-астентности животного организма" (Ташкент, 1984); на У1 Всесоюзен герпетологической конференция (Ташкент, 1985); на 1У кон^рен-1и биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Ашхабад,1986); 1 I конференции биохимиков Узбекистана (Ташкент, 1986); Всеоовз-эм симпозиуме по биохимии липидов (Алма-Ата, 1987); рабочем соверши "Гомеостаз при радиационном повреждении организма" (Пущино,

387). - . .....

Диссертационная работа апробирована на заседании Узбекистан-soro биохимического общества и Ученого совета Института биохимик

I УзССР. . ........

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 32 печатью работы. . .....

Объем и структура диссертации, диссертация иалояана на £25" . машинописного текста, оостоит из введения, обзора литературы^ атериалов и методов исследований; глав собственных исследований, включения и выводов. Работа иллюстрирована "34 рисунками, содер-ит 47 таблиц. Указатель литературы содержит 435 источников, том числе 233 отечественных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено на 500 половозрелых белых беспородных рысах массой 150-180 г, 1200 белых беспородных мышах-самцах мас-

сой 18-24 г, 520 самцах среднеазиатской черепахи ХевОДо Ьогв-г1вЫ1 массой 470-640 г и на 60 эмбрионах черепах (40, 50, 60, 70 сутки развития). В таблице I представлены экстремальные факторы, использованные в экспериментах.

Таблица I

№

п/п

"I---------

I фактор ! ___

"I----

!Объект

-----1-----------

Черепахи От 15 мин до II ч^сов

¡Степень воздействия, 'дога

1. Длительная аноксия

2. Температурный стресс

3. Ионизирующее излучение

4. Аноксия + гамма-облучение

5. Хронический иммобилиза-ционный. отресо + гамма-облучение

6. Интенсивная мышечная деятельность - бег субмакси-ыальной интенсивности на третбане ■

7« Постлучевой терапевтический эффект экзогенного радиомодификатора из селезенки черепахи

Черепахи

Крысы-мыши -

черепахи

Черепахи

Крысы

Крыоы -.

Крысы Ыьши

О - +40°С

8,0-8,5 Гр

100-1000 Гр ■

5 часов 30 мин. 420 Гр

4 недели гипокинезии 8 Гр

Предельная длительность до истощения. Скорость 32 м/мйн. -

8,0 Гр; черев 2 часа внутрибршинно по 200 мкг в 0,5 мл фиг, раствора на I животное

Условия анокоии создавали путем продувки через герметичный стеклянный эксикатор объемом 5000 см3 инертного газа азота оо скоростью 600 мл/мин. Гликолиз ингибировали внутрибрюшинным введением монойодукоусной кислоты в дозе 30 иг на1 кг массы тела , черепахи. Животных брали в опыт через 15, 30, 45, 60 минут; 3, б, 9 и II часов аноксии..

В экспериментах по терморегуляции нагрев и охлаждение черепах производили в термостате ЬР-114(Венгрия). Температуру тела измеряли электротермометром иономера -9В-74. Состояние гипокинезии у крыо вызывали содержанием животных в.специальных клетках-пеналах в течение 4 ледель (Е.А.Коваленко, Н.И.Гуровой, 1980). Влияние мышечной деятельности исследовали на крысах сразу после бега субг,.^кои-мальной интенсивности (32-м/мин) предельной.длительности (15 мин) на ленте горизонтального третбана (В.И.Иванов, 1975). ЭКГ регистрировала на одноканальном электрокардиографе ЭКПСЧ-4 в отведении аур

при усилении I uB=I8 uu и скорости лентопротяжного механизма 50 мм/с.

Однократное тотальное облучение черепах проводили на ^-источнике б0Со при мощности дозы 1,1б-1СГ^ А/кг. Экспозиционные дозы для черепах составили 420 и-500 Гр. Животных брали в опыт на I, 5, 10, 30, 45, 60 сутки с момента облучения.

Мышей и крыс облучали в дозе 8 и 8,5 Гр (2,06'ICT1 Кл/кг) при мощности дозы 1,032Л0"3 А.

Экстракт оелезенки черепах готовили по методу Ellinger (1956).

Митохондриальную фракции выделяли посредством дифференциального центрифугирования гомогената лечени по методу Д.Хогебума-В. Шнейдера (1957) в центрифуге Ц."?-1». Микросомы изолировали из пост- , митохондриальной жидкости при 105000 g в ультрацентрифуге 7ас -602 (ГДР) (И.И.Кару8йна, А.И.Арчаков, 1977). Все операции по выделение субклеточных органелл совершали в термостатируемой комнате при температуре 0 - +2°С. Электронномикроокопический контроль чистоты фракций субклеточных структур осуществляли в электронном микроскопе УЭМВ-IOOk при ускоряющем напряжении 75 кв. .

Регистрацию признаков окислительного фосфорилирования митохондрий печени проводили при помощи открытого вращающегося платинового электрода на полярографе LP-7 (ЧССР) по методу М.Н.Кондра-шовой и др. (1973).

Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ). митохондрий печени определяли по методу King (1967). Активность аденозинтрифосфатазы (АТф-азы) митохондрий проводили в среде, предложенной И.Д.Мансуровой (1964). Прирост неорганического фосфата определяли по методу Я.Х.Туракулова и др. (1967).

Концентрацию белка митохондрий и микросом определяли по биу-ретовой реакции (Д.Бейли, 1965). Количество гликогена в печени определяли модифицированным методом Seifter et al. (1950); содержание молочной кислоты в крови по Barker, Saaarson (1941). Напряжение кислорода в крови (Pq¿) измеряли на автоматическом анализаторе Тип A7L GAS СНЕСК-939 фирмы Radiometer Copenhagen (Дании). Определение глюкозы в крови проводили по цветной реакции с ортото-луидином. Общую активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) устанавливали по Л.М.Пыркову и др. .(1970)* Активность цитохромов З5 н Р^-д определяли по методу Omura, Sato (1964).

Скорость НАДФ»^ - и аскорбатзависимого образования переписей липидов в митохондриях и микросомах определяли по рзэхцкгс с

тиобарби-туровой кислотой (Ю.А.Владиыиров, А.И.Арчаков, 1972).

Количественное содержание начальных продуктов перекисного окисления липидов - конъюгированных диенов и диеикетонов определяли по модифицированное методу Н.К.Шилиной и др. (1978). Извлечение липидов из субклеточных органелл проводили по методу М.Кей-тса (1975). Для определения содержания в крови природного антиок-оиданта о< -токоферола пользовались методом, описанным И.В.Зуевым (1980).

фракционирование липидов и фосфолипидов проводили методом ыикротонкослойной хроматографии (Г.А.Грибанов, С.А.Сергеев, 1975). Для получения классов суммарных липидов проводили разделение на оеликагеле 1Б Chemapol (ЧССР) в системе растворителей: гексан-диэтиловый эфир - метанол г ледяная уксусная кислота (9:2:0,2:0,3) фосфолипиды разделяли в системе хлороформ-метанол-Ш аммиак. (6,5:2,5:0,5).

Состав жирных кислот фосфолипидов и нейтральных липидов определяли на raso-жидкостных хроматографах (Chrom-42 и chrom-5) (ЧССР) Метилирование липидных образцов проводили в среде, содержащей аце-тилхлорид в качестве катализатора (В.З.Ланкин, И.П.Садовникова, 1971). Идентифицировали жирные киолсш путем -сравнения величин, найденных относительных удерживаемых объемов с полученными при pas делении смеси стандартных жирных кислот и литературными'данными (Г.Берчфилд, Э.Сторрс, 1964; Ы.Кейтс, 1975).

Результаты экспериментов обработаны методами вариационной статистики (В.Ю.Урбах, 1964; Н.А.Плохинский, 1970; Г.Ф.Лакин, 1980). Для оценки функциональной активности энергетической системы печени экспериментальных животных использовали метод знаковой корреляции (Н.Н.Мотлох, 1978).

РЕЗУЛЬТАТУ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Устойчивость среднеазиатской черепахи Testudo borsfieldi к экстремальным факторам ореды

Многие водные виды черепах способны длительное время выживать в условиях гипоксии и даже аноксии (Robin et al., I981). Потребление кислорода при этом резко снижаетсн(Са11в3.иг1 et al., 1981), а выработка энергии идет в основном за счет более древнего, анаэробного механизма - гликолиза (Leviston et al., 1981). Совершенно неизученными в этом плане остаются наземные черепахи. Между тем эти

зедения необходимы для создания единого представления о меха-гамах адаптации позвоночных к изменяющимся условиям среды.

Установлено, что среднеазиатская черепаха способна выживать условиях аноксии в течение более II ч (675 мин), в то время ис крыса погибает через 4- мин. На 45 мин пребывания в атмосфере юта частота сердечных сокращений у черепахи составляет 21,6$ :ходной, т.е. снижается в 4,6 рааа, а напряжение кислорода в )Ови (Р0 ) равно 0,306 кЦа (2,3 ми рт.ст.), что составляет 3,3/5 нсодной величины (рис. I). Подобное замедление сердечного ритма среднеазиатской черепахи наблюдается во время она и при гипо-)риии. Снижение частоты сердцебиений у черепахи в условиях анок-ш свидетельствует о резком снижении интенсивности обмена. Потре-юниэ кислорода у черепах во время эксперимента быстро уменьпает-!, при этом напряжение кислорода практически не определяется на )-й мин опыта. Аноксия вызывает значительное повышение уровня нотой кислоты в крови, который к 9-му ч эксперимента составляет игае 2000% исходного показателя (таблица 2). Параллельно почти в ) раз увеличивается концентрация глюкозы в крови, а содержите гакогена снижается в 4,1 раза (см. таблицу.?)«„___

!о. I. Частота сердечных сокращений и напряжение кислорода в крови среднеазиатской черепахи в условиях аноксии и.при введении монойодуксусной кислоты »..А - измбненияпо отношению к контролю (/8)^ Б - время (мин); I - частота сер. дечных сокращений при введении монойодуксусной кислоты в условиях аноксии, 2 - напряжение кислорода в крови (Рд ) в условиях аноксии, 3 частота сердечных сокращений в условиях аноксии, 4 - то же при введении монойодуксусной кислоты в условиях нормоксии;

А

1"

Таблица 2 Уровень гликогена печени, глюкозы и молочной кислоты крови среднеазиатской черепахи в условиях длительной аноксии

Длительность 1 Гликоген, мг/г! Глшоза |ыолочная_кислота аноксии j сырой массы I шоль/л

(ноКсия) . 5^3±3»0 5,46^,30 0,25+0,03

15 мин '7,6íI,3k 5,22jP,I2 I,09j0,05?

30 мин 59,0j4,8K 6,93^0,30х 1,21±0,08х

45 мин 70,í¿4,2* 7,22^,30* 1,73^0,12х

I Ч 80,3i4,jx II,49lO,43x I,43jQ,23x 3 ч 53,4¿4,6 27,5ljjb,23x 4,03^,07х б ч - 34,8612,00*

9 ч 13,213,0х 46,55iP,I9x 5,0510,09*

II ч - 53,7711,60х

Примечание. х - достоверность различий с контролем, Р / 0,05.

На ооновании проведенных исследований и анализа данных литературы оделано предположение о.превалирующей роли гликолиза в продессах выработки энергии в организме черепахи Testudo horsfi-eldi при аноксии. Это предположение подтверждается тем, что при введении специфического ингибитора гликолиза - монойодуксуоной кислоты у черепах в атмосфере азота деятельность сердца прекращается в течение 13-14 мин, тогда как в обычной воздушной среде отме-.чена ЮО^ная выживаемость.

Поиr,,Jo устойчивости к недостатку кислорода среднеазиатская -черепаха, также как и другие.пойкилотермные животные, хорошо пере^ носит охлаждение до температуры +8°С; между тем нижняя температурная граница у крысы для дыхания равна +13°С, для деятельности сердца +8°С. Летом верхняя летальная температура для среднеазиатской черепахи равна 41°С, зимой черепаха погибает при нагреве тела до 39°С. В естественных условиях перегрева под лучами солнца гибель среднеаоиатской черепахи отмечена и при температуре 34°С (И.Ф.Андреев, 1948). Изменение температурной толерантности у среднеазиатской черепахи, по-видимому, возникает в ответ на сезонную смену условий, и это следует рассматривать как пример естественной акклиматизации. Срочная адаптация эктотермных животных к различным темпе-

ратурным режимам происходит при помощи сочетания поведенческих, физиологических и биохимических реакций* Рептилии, которых характеризуют низкие скорости обменных процессов и высокая теплопроводность, достигают температурного равновесия без эндотермических реакций. Вместе с тем среднеазиатской черепахе свойствен физиологический механизм терморегуляции, заключающийся в способности изменять тепловую.проводимость тела и таким образом контролировать скорость теплового потока. Причем, главной физиологической переменной, лимитирующей скорость теплового обмена, является кровообращение, тесно коррелирующее с частотой сердцебиения.

Высокая радиорезистентность черепахи контролируется рядом факторов, в том числе в значительной мере зависит от сезона года. Среднелетальная доза радиации M^q/^q колеблется от 270 Гр летом до 730 Гр осенью.

Черепаха также является хорошей моделью для демонстрации снижения кислородного эффекта при облучении в условиях длительной t аноксии. У черепах, облученных весной в дозе 420 Гр, к 45 суткам после облучения количество выживших анонсированных животных равно 80$ против 5% у облученных в условиях нормоксии.

Таким образом, установлена ранее неизвестная способность среднеазиатской черопахи Testudo horafieldi длительно существовать в условиях аноксии за счет снижения интенсивности обменных процессов и выработки энергии путем гликолиза. Черепаха способна контролировать теплопроводность, причем способность эта проявляется более отчетливо в условиях гипертермии, чем в условиях гипотермии. Вместе с тем черепаха более толерантна к гипотермии, чем к перьгреву тела. В зимний период гибель животных.от перегрева наступает при более низкой температуре, чем летом. На черепахах также установлен выраженный радиопротекторный эффект длительной предлучевой аноксии.

Можно полагать, что столь широкий диапазон переносимых черепахой воздействий, по всей видимости, связан не только с физиологическими или поведенческими реакциями, но и уникальным по своей пластичности биохимическим механизмом, в основе которого мокет лежать изначальное физико-химическое состояние липидного ыатрикса биологических мембран.

2. Характеристика липидного состава микросои печени черепахи Testudo horsfleldi в сравнении с млекопитаьцими

Липидц иикросомальньк меыбран печени черепахи представлены

. в основной фоофолипидами'(71,95%) и нейтральными липидами (28,06%). Сходный состав общих липидов обнаружен и в микросомах печени крыс.

Однако в микросомах печени черепах жирных кислот в свободной состоянии содержится в 2,4 раэа меньше, а эфиров холестерина в 5 раз больше, чем у крыс. Ацилглицерины в микросомах печени черепахи представлены не только триацилглицеринами, но содержат также диацилглицерины (3,27%). Отношение свободный холестерин/ фосфолипиды в препаратах микросом печени черепахи равно 0,099 при 0,085 у крыс и 0,069 у человека (шавкеИ et а1., 1982). Наиболее широко в микросомальных мембранах печени черепахи представлены фосфолипиды. Сфингофосфолипид сфингомиелин (СФМ) составляет 23,95? при 11,26% в микросомах печени крыс. Глицерофосфолипиды микросом печени черепах содержат приблизительно равное количество фосфат-идилхолина (ФХ) и фосфатидилэтеноламина (ФЭА) - по 20%, тогда как у крыс наиболее массивной является фракция ФХ - 64,15%. Содержание фосфатидилоерина (ФС) и фоофатидилинозита (ФИ) у черепахи в сумме составляет 21,28, а у крыс 5,43%. Отношение кислых фосфолипидов к нейтральным у черепахи равно 0,94, а у крысы 0,32. Содержание полиненасыщенных жирных кислот в фосфилипидах биомембран является показателем принадлежности животного к определенному классу и особенностей условий существования - в первую очередь температурных (Е.II.Крепе, 1981). Так, в суммарных фосфолипидах микросом черепахи на ненасыщенные жирные кислоты приходится 55,5, а у крысы -46,5%. Расчеты, сделанные по данным других авторов (Вег2в1воп et а1., 1970), показывают еще меньшую величину - 37,7%. При этом отношение ненасыщенных жирных кислот к насыщенным у черепахи равно 1,24, у крысы - 0,87. Наиболее подверженные пероксидации длинноце-почечные полиненасыщенные жирные кислоты в микросомах печени черепахи в. основном представлены арахидоновой кислотой, содержание которой составляет 11,7% (у крыс 18,8%). Эта величина у крыс может достигать 33 (ЗигикХ еЪ а!., 1980), у человека 22 С»азке11 et

1982), у кролика - 9% (Мооге et а1., 1977).

Также выявлено, что в ФХ микросом печени черепахи содержание арахидоновой и ейкозапентаеновой кислот составляет 5,2%, а доказа-гексаеновая не обнаружена. Данные о составе липидов в микросомах печени человека (Шавке11 et ах., 1982) показывают, что ФХ составляют 48,8% оуммы фосфолипидов и включает около 13% арахидоновой, доказатетраеновой, докозапентаеновой и доказагексаеновой кислот,

согда как у крыс и кроликов содержание этих кислот в ФХ составив! 30 и 5% соответственно (Moore et al., 1977; Suauki et al., [980). Кроме того, установлено, что в ФЭА, составляющем 27% суммы ?осфолипидов в микросомах печени черепахи, содержится больше лег-соокисляемых «ирных кислот, чем в ФХ - 12,2 и 5,2%. В микросомах ючени крыоы и человека ФЭА составляет от 19,16 до 30^5 фракции 5осфолипидов и содержит по Ъ5% полиненасыщенных жирных кислот [Waskell et al., 1982; Suzuki et al., 1980), а у кроликов 16% [Moore et al., 1977).

Расчет десатурационной активности, оцениваемой по отношению гдельного содержания 20:4/18:2 кислот, показывает, что превращена линолевой кислоты в арахидоновую в фосфолипидах микросом пече-ги черепахи протекает на низком уровне. Коэффициент 20:4/18:2 у [ерепахи равен 0,52, у крысы от 1,28 до 1,70 и у человека - 0,79 [Waekell et al., 1982).

Таким образом, сопоставление результатов собственных исс..здо-аний и данных литературы показывает, что в полиненаоыщеннооти фо-фолипидов микросом печени позвоночных имеютоя.существенные газли-ия, причем у черепахи и кролика выявляется низкий, а у крысы вы-окий процент длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот. В том ряду человек занимает промежуточное положение. Указанные раз-ичия, возможно, лежат в основе повышенной липидной перокоиддции, аблюдаемоГ in vitro у крыс в противоположность микросомам пече-и кролика (Jacobson et al., 1972). Величина отношения свободный олестерин-фосфолипиды в микросомах печени черепахи превышает та-овую у крыс и человека.

Полученные результаты позволяют предположить, что невысокое о сравнению о млекопитающими содержание длинноцепочечных палине-асыщенных жирных кислот у черепахи может явиться лимитирующим фак-ором интенсивности процессов микросомального перекисного"окиоле-ия липидов, стимулируемых экстремальными факторами среды.

3. Липидная стратегия биохимической адаптации черепахи Testudo ¿orsfieldl к экстремальным воздействиям

'Многочисленные данные, полученные в опытах по акклиматизации ойкилотермных организмов к среде обитания, показывают, что темпе-атурные условия обычно значительно влияют на состав углеводород-ых компонентов большинства липидов биологических мембран. Однако

закономерности изменения липидной фазы мембран гепатоцитов среднеазиатской 'черепахи в зависимости от температуры тела не были игвестны. Поэтому мы исследовали состав общих липидов и фосфоли-пидов, интенсивность процессов перекисного окисления липидов, а также жирнокислотный состав и ненасыщенность основных классов фосфолипидов микросом печени черепахи в условиях гипо- и гипертермии.

Установлено, что с повышением температуры тела от 10 до 37°С в микрооомальных мембранах гепатоцитов черепах значительно возрастает уровень про. уктов ПОЛ (рис. 2). >

Рис. 2. Содержание.продуктов перекисного окисления липидов в микросомах гепатоцитов черепахи при различных температурах тела. А - оптическая плотность растворов липидов при 232 и 273 нм/мг липидов; Б - температура тела, °С; I - койыогиро-ванные диены; 2 - диеновые кетоны.

Низкой температуре тела черепахи (10°С) соответствует невысокое по сравнению с предпочитаемой (25°С) содержание продуктов ПОЛ, тогда как в печени млекопитающих холодовое воздействие стимулирует процесс шрекиоеобразования (Л.И.Деев и др., 1981).

Значительное колебание температуры по отношению к пред! читаемой существенно не сказывается на удельном содержании фракции суммарных фосфолипидов в микросомах печени'черепах. Вместе с тем отношение свободный холестерин-фосфолипиды резко возрастает в ус-

ювинх нагрева тела - с 0,092 при Ю°С до 0,2 при 37°С, за очет увеличения более чей в два раза свободного холестерина (рис. 3). [олестерин является одних из факторов, оказывающих значительной злияние на фазовое состояние липидного бислоя ыечбрады.

Рис. 3. Содержание свободного холестерина в микросомах пе-% чени среднеазиатской чере-' пахи при гипо- и гипэртер-иии. А - относительное содержание, %\ Б - темпера- 1 тура тела, °С.

10 25 37

Длинноцепочечные эфиры холестерина совсем не могут вотраи-тться в бислой, а небольшие примеси количества зфаров холесте->ина в бислое оказывают на него не конденсирующее, а разжижающее действие (В.Г.Ивков, Г.М.Боростовокий, 1932).

При нагрево тела от 10 до 37°С почти в четыре раза снижает-1Я уровень диацилглицериноз, служащих кофакторами синтеза дифос-[птидилглицерина (кардиолипипа), а'содержание жирных: кислст в ово-1одном состоянии снижается вдвое. С ростом температуры выявлена :енденция к повышению содержания офикгомиелина и снижению фосфат-[дилхолина.

причем и рОС'хим тампьрахуры хала ПОЬышантОн охНОнапио !ФМ/ФХ - с 0,589 при ТО°С до 1,092 при 37°С. В этих услоьиях в |уммарных фосфолипидах снижается индекс ненасыщенности за счет ■меньшения относительного содержания полиненасыщенной арахидоро-юй кислоты (20:4)с Нагрев тела вызывает значительное повышение юноненасыщенности как в суммарных фосфолипидах, та;, и во фракци-к ФХ. Так, во фракциях суммарных фосфолипидов содержанио паль::и-юлеиновой (16:1) и олеиновой (18:1) кислот увеличивается в 2,5 и ,3 ра?а соответственно. Все исследованные фракции фосфолипидов

[ри температуре тела черепах ниже предпочитаемой характеризуюъпп

\

повышенный содержанием арахидоновой кислоты и как следствие, высоким индексом ненасыщенности. Аналогичное явление наблюдается и у аимнеспящих млекопитающих - хомячков, бурундуков (А.Ы.Бело-уо, В.А.Бондаренко, 1982).

Таким образом, при адаптации к холоду у животных, обладающих устойчивостью к низким температурам, ненасыщенные жирные кислоты заменяются на полиненасыщенные. Наряду о десатурацией жирных кислот происходит удлинение их цепей, что лежит в основе увеличения относительной концентрации длинноцепочечных ненасыщенных жирных кислот в мембранных фосфолипидах.

Полученные данные свидетельствуют о том, что черепахи наряду о поведенческими и физиологическими реакциями очень быстро и обратимо изменяют ненасыщенность структурных липидов, интенсивность процессов ПОЛ, уровень холестерина в условиях авритермии,и таким образом, способны модулировать необходимое для жизнедеятельг-ности фазовое состояние мебран. Мембранные липиды более лабильны при низких температурах, чем при перегреве. Этим можно объяснить более высокую толерантность черепах к гипотермии, чем к гипертермии.

Исходя из концепции универсальности адаптационного механизма, использующего липиды при экстремальных воздействиях у позвоночных (Е.М.Крепе, 1981), можно ожидать, что повреждающее действие аноксии также приведет к модификации липидной фазы мембран эн-доплазматического ретикулума печени черепах, многие водные виды которых способны длительное время выживать в условиях дефицита кислорода. В ЫКС печени среднеазиатской черепахи на протяжении 9 ч происходят волнообразные изменения в соотношении липидных классов, что предполагает адаптивное значение этих процеосов. В первые 15 мин наблюдается подъем уровня легкоокисляющихся фосфолипидов - фоо фатидилсерина, фосфатидилинозита, лизофосфатидилэтаноламина; снижение количества фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина, рост холестерина, его усиленная этерификация с образованием эфиров холестерина и снижением содержания неэтерифицированных жирных кислот. К концу воздействия падает уровень ФС, ФИ, ЭХ, H3IK; количество сфингомиелина и ХЛ не снижается ниже интактного, уровень ФЛ, триацилглицеринов, ФЭА к 9-му ч нормализуется.

В течение эксперимента в UKC печени черепах отмечается изменение активности ферментативной и неферментативной систем перекис-ного окисления липидов. К ЗО-й и 45-й мин аноксии происходит рез-

сая активизация НШН-зависииой системы (рис. 4). В основном жисляютоя полненовые кислоты ФЭА и ФХ, в частности, арахидоно-зая, уровень которой снижается в этих фракциях в 12,2 и 1,5 paja соответственно. Длительное воздействие аноксии на среднеазиат-)кую черепаху вызывает перестройку мембран МКС печени о целью адаптации. Это способствует поддержанию функций мембраноовязан-шх ферментов и обеспечивает выживаемость животных.

Рис« Отношение аскор-батзавиоимого АЗ к НАДН-аависимому НЭ паре-кисвому окислению л"пи-дов в микросомах печени среднеазиатской черепахи в условиях аноксии.

А - —; В - длительность НЗ

зкопозиции в атмосфере азота, пин.

30 45 -ео 180 540 Б

Для выяснения роли структурных липидов биомембран в механиэ-<ах высокой радиореэиотедтности среднеазиатской черепахи предота-зляется целесообразным исследовать состав липидной фазы и интен-зивность перекисного окисления липидов микросомальных мембран пе-юни..

•На 3 сутки после облучения черепах в дозе 500 Гр в липидах шкросом печени происходит резкое снижение.перекиси, что, по-ви-демому, связано с истощением субстрата - полиненасыщенных жирных шслот суммарных фосфолипидов, уровень которых составляет 81% от 1нтактного контроля. Так, удельное содержание арахидоновой кисло-

ты снижается в 2,1 рааа, а уровень ее предшественника - линоле-вой кислоты (18:2) возрастает на 12%. Коэффициент конверсии ли-нолевой кислоты в арахидоновую (20:4/18:2) к этому сроку уменьшается в 2,4 раэа. Фосфолипидный бислой а мембранах микросом печени черепаха к 3-м суткам пострадиационного воздействия становится более насыщенным, т.е. более уплотненным за счет увеличения удельного содержания пальмитиновой (16:0) и стеариновой (18:0) кислот на 18 и 22% соответственно.

Снижение уровня образования соединений с диеновой конфигурацией позволяет считать, что разрывов углеродной цепи жирных кислот в этот период не происходит. По-видимому, имеет место'«ормо-жепие синтеза полиненасыщенных жирных кислот. В микросомах млекопитающих это связано со снижением активности комплекса - ацил-СоА линолевой кислоты +.мадонил-СоА, кофактором которого служит НАДФ (А.Уайт и др., 1981). У пойкилотермных же животных ключевой регулирующей ступенью в биосинтезе С^ и С^ тотра-, пента- и гексаеч новых кисйот является А6 -двоатураза, действующая на кислоты 18:2 и 18:3 (Могело еЪ а1., 1979), активность которой модулиру-этоя физическим состоянием мембран и лежит в основе.саморегуляции подвижности мембранных бислоев ( К&8о1 еЪ 1976).'

К 10-м суткам уровень перекиоей вновь повышается.и достигает максимума к 30-м оуткам. К данному сроку концентрация коныоги-рованных диенов и диенкетоноь превышает норму на 193 и 216% соответственно (рис. 5). Это повышение, по-видимому, свидетельствует о подавлении антиокислительного механизма. Для облученной мембраны такие изменения являются характерными и сопровождаются модификацией липидной фазы. Мембрана теряет наиболее легкоокисляемые липкды - кардиолипин, фосфатдиэтаноламин, фосфатидилсерин, в то время как устойчивая к окислению форма - сфингомиелин остается (рио. 6). К этому ив ороку возрастает польненаоыщенность ФХ не 22,5% и ФЭА на 29,5% по отношению к контролю, в основном за счет узеличения содержания арахидоновой кислоты.

Таким образом, в кикрооомех печени черепахи наблюдается картина, свойственная лшшдам облученной мембраны; нарастание перекисей, увеличение количества лизоформ, изменение относительного количества липидных классов, в то« числе в сторону обогащения более стабильными к окислению формами, возрастание поликен&сыщзнчо-сти основншс классов фосфолипидов. Однако эти процессы при облучении кратной дозой (ДДсд/зо) протекают у черепах болео продолжя-

1,0

С,5

1__|_

К / J

10

30 сут

Рио,' 5. Содержание кокьюгиро-ванных диенов (а) и диенкетопов (б) в ии-кросомах гепвтоцитов черепахи после облучения в дозо 5*1С£ Гр.

По оои абсциоо -время после облучения, су®.; по оси ординат -оптическая плотность растворов липидов икк-росом при 232 и 273 юд/мг липидсв. К - Ий-тактнай контроль.

»Г 1 III Л

Рио. 6. Соотаз фосфолипидов иикрооои печени черепахи после облучения в дозе 5*102 Гр: а - фоофатидилсерия; . б ли8офосфатидилэтаноламин, в - сфингомиелин, г - фоофатидилхолин. д - фссфатидилэтанолаиин.

По оси абоцисо,- время "после облучения, аут,; К.«» интактный контроль; по оси ординат * относительное содержание,

тельно, чей у млекопитающих. Так, при облучении нишей в дозе 8 Гр наблюдается резкое уменьшение полиненасыщенных жирных кислот тотальных фоофолипидов печени, тогда как у черепахи даже при 500 Гр этот показатель остается на уровне контроля в течение 45 сут. Известно, что ферменты репарации мембран (синтеза жирных кислот, фосфолипаза, ацилтрансфераза) устойчивы к действию радиации и резко увеличивают свою активность после облучения под действием СФЫ, лизолецитина и перекисних форм липи-дов ( Coleman, 1973).

Получение данные позволяют полагать, что эндогенный фон выоокой радиоре з-"¡тентности черепах наряду с другими факторами может быть обусловлен и тем, что на начальном этапе лучевой болезни, по-видимому, остается возможность активизации липидзави-симых репарирующих мембранные структуры ферментных систем увеличенным содержанием СФЫ, а также незначительным повышением уровня соединений о конъюгированным типом свяги и диеновой конфигурацией.

Изучение влияния длительной предлучевой, тотальной аноксии до сих пор не представлялось возможным из-за отсутствия среди традиционных для лабораторных экспериментов животных, способных продолжительное время существовать в среде с отсутствием киолорода и выдерживать высокие радиационные нагрузки. Как следует из вышеизложенного, этими свойствами в полной мере обладает среднеазиатская черепаха.

У черепах, облученных в дозе 420 Гр в условиях нориоксии на протяжении 30 оуток поотлучевого периода, наблюдается колебание уровней содержания структурных липидов микросом печени, отепе. и их ненасыщенности. Это свидетельствует о том, что системы активации липогенеза при дозе 420 Гр не нарушены. Причем, в обеих группах наблюдается в основном сходная тенденция к снижению иди повышению количества липидов. Но протекают эти процессы на разных уровнях.

Так, содержание холестерина в микросомах печени'колеблется со значительным размахом у животных; облученных в нормоксии, принимая максимальные значения на 5 и 30 сутки (141,9 и тъв,16% соответственно), а при облучении в условиях аноксии 1-е и 20-е сутки характеризуются минимальным уровнем холестерина (42,5243,93$) (рис. 7, А). Изменения в количестве эфиров холестерина в обеих группах однонаправленны - максимальные значения зареги-

12

еЬ

1

4

отрированы на 10 сутки после облучения (192,94 и 140,07% в I и П группах соответственно). Затек следует его уменьшение до 127,03 и 65,71% у облученных в нормоксии и аноксии к 30-ы оуткам (рис. 7, Б).___

Рис. 7« Содержание хо-леотерина (А) и эфиров холестерина (Б) в микросомах печени черепах, облученных в уолови-.* ях аноксии. Доза 420 Гр.

По оси абоцисс -

время после облучения, сут. По оои ординат - содержа-, ние холестерина и

• его эфиров в % к сумме липидов мик-росом. И - интакт-ный контроль. За-шрихованные столбики - аноясия; не заштрихованные столбики - нормо-ксия..

1

и

ю

20

30

Таким образом, у черепах на протяжении 30 оусок постлучевого периода длительная предлучевая аяоксия подавляет активацион-ное влияние облучения на холестериногенез в микрооомах гепатоци-тов. Тогда как у незащищенных черепах та же доза значительно увеличивает содержание холестерина и его эфиров в эндопдззматическои ретикулуме печени.

Содержание индивидуальных ФЛ колеблется в продоя*:еиии эксперимента в довольно широких пределах. При облучении в условиях аноксии количество лизоформ, ФС и ФИ повызается уже в первое оут-

ки опыеа (119,43 и 140,02% соответственно). Затем наступает онижеаиз до нормы ФС и СИ о небольшим увеличением к 30-м суткам. Уровень ЛФЭА к 5-м суткаа.минимален (64,37/5), а весь последующий период соответствует интактному.

Таким образом, аноксический режим облучения предотвращает накопление лизсфосфолипидов, являющихся следствием лучевого воздействия, а таете после 5-х суток нормализует уровень кислых ФЛ - наиболее легкоокисляемых форм.

Содержание наиболее насыщенного ФЛ-сфингомкелина в микро-ссмех пзчени животных П группы в 1-е сутки эксперимента равно 124,3%. На 10 оуткк уровень СФИ минимален (54,17%).

Уровзнь семой массивной фракции ФЛ микрооом печени черепах - фосфатидилхолина при облучении как в нормоксии, так и в анок-сии незначительно колеблется в пределах ¿14%. Близко к норме также содержание фосфатидилэтоноламина в течение 30 оуток у животных П группы.

НА 1-10 сутки поотлучевого периода у черепах, облученных в -условиях аноксии, характерных для лучевой патологии разрывов цепей иолиненасащенных жирных кислот микросомальных мембран не обнаружено, о чем свидетельствует снижение содержания промежуточных продуктов перекисного окисления липидов - диеновых кетонов (рис. 8). В эти же сроки (на 5 оутки) отмечается снижение поли-ненасыщонных суммарных фосфолипидов микросом печени в 1,3 раза в основном за счет падения уровня арахидоновой кислоты на 33,5%. Динамика уровня ненасыщенности микросомальных фосфолипидов печени носит фаэово-колебательный характер. Так, в суммарных фоефо-липидах микросом печени минимум приходится на пятые сутки, а зо фракциях ФХ и Ф9А - ьа.20 сутки. При этом отношение ненасыщенных жирных кислот к насыщенным во фрахции суммарных фосфолипидов имеет два пика - на I и 20 сутки, и значительно снижается к 5 суткам поотлучевого периода» В дальнейшем к 20 оуткам уровень поли-ненасыщенности повышается. Это связано о увеличением относительного содержания линоловой, арахидоновой и докозапентаеновой кислот. Во фракции ФЭА пик полиненасыщенкосхи зарегистрировав на 10 суиси поело облучения, где' о 10 по 30 сутки отмечается интенсификация конверсии шнолевой кислоты-в арахидоновую, следствием чэго, как известно, является замедление скорости обмена моноено-вых кислот. Реализация лучевого поражения у анонсированных черепах начинается ляль на 31 сутки нdблюдsнпя, когда уровень диено-

0,13 -

о,п -0,11 -0,10 -0,03 -0,09 -0,07 -0,06 -

0,05 - . .

_I_| ' '_I-

и 1 5 Ю го зо

о. 8* Содержание продуктов перекисного окисления липидов -коньюгированных диенов (А) и диеновых кетонов (Б) в ий-кросоыах печени черепах, облученные в условиях нормок-сии (I) и анокпим До?» 420 Гр. —

По оси абсцисс - время после облучения» су т.-' По ооям ординат - содержание перекисей липидов, Д/мг липи-дов. Д - единица'оптической плотности, растворов липидов при 232 и 273 ни.'й - интактный контроль.

: кетонов повышается в 1,6-раза, но даже к 45 суткам количество ;ивйих анонсированных животных равно 80% против 5 у облученных словиях нормоксии. Очень важным обстоятельством является то, | при облучении в условиях аноксии уровень ФЭА микросом печени отных примерно соответствует интактному или незначительно его

превышает. Теи самым обеспечивается нормальная функциональная способность гликозо-6-фосфагазы, приникающей важное участие в гликолизе.

Учитывая важную роль липидов в жизнедеятельности клеток, можно заключить, что у черепах, не защищенных аноксией, ведущая роль в радиационной стимуляции липогенеза, по-видимому, принадлежит холестерину, как у млекопитающих (И.К.Коломийцева, 1986), а отставленный эффект воздействия ионизирующей радиации у облученных в условиях аноксии животных в значительной мере связан со снижением интенсивности процессов перекисного окисления в мембранных липидах, предотвращением накопления холестерина, эфиров . холестерина, лиэофосфолипидов, снижением полиненасыщенности суммарных фосфолипидов и повышением уровня эндогенного фона радиорезистентности в первую декаду после облучения, что несомненно препятствует более серьезному лучевому поражению мембран микро- '. сом и усиливает способность их к репарации.

4. Реакции мембранных компонентов -клетки на предлучевое повышение уровня эндогенных продуктов перекисного -окисления липидов в гепатоцитах у крыс

Исходный стационарный уровень продуктов ПОЛ играет важную роль в зарождении и развитии процессов лучевого поражения. Увеличение их содержания при облучении инициирует лучевой токсический аффект. Нами показано, что воздействие экстремальных факторов не лучевой этиологии, в частности гипокинезии и мышечной активности предельной длительности приводит к интенсификации эндогенных процессов ПОЛ и нарушению окислительного конвейера митохондрий, что может явиться радиосенсибилизирущим фактором при экстремально возникшей радиационной обстановке. Облучение интакт-ных крыс приводит к увеличению содержания диеновых кетонов в митохондриях в 1,5 раза на 7 сутки постлучевого периода. Уровень конъюгированных диенов в митохондриях и микросомах возрастает в 1,3 и 1,2 раза соответственно. Комбинированное действие гипокинезии и -облучения оказывает более значительный инициирующий эффект на уровень эндогенных радиосенсибилизаторов в субкл точных органеллпх печени, чем дифференцированное применение этих факторов. Причем, в митохондриях этот процесс более выражен, чем в микросомах.

Совместное действие гипокинезии и облучения приводит к использованию компенсаторного резерва окислительного конвейера митохондрий на 242%, тогда как "чистая" гипокинезия всего лишь на 126%, а облучение - на 233%. На фоне значительных функциональных изменений существенных нарушен :й уровня суммарных фоофоиипидов не выявлено, тогда как содержание холестерина при облучении возрастает в митохондриях и микросомах в 1,2 и 2,7 раза соответственно. В митохондриях при сочетанном действии гипокинезии и облучения содержание НЭ1К снижается, а в микросоыах возрастает в 1,9 раза. При зтом содержание этерифицированнЬго холестерина снижается в 2 раза. *

В митохондриях и микросоьах при комбинированном действии гипокинезии и облучения возрастает уровень фосфатидилоерина и фос-фатидилиноэита на фоне снижения содержания фоофатидилзтаноламина и кардиолипина.

Обращают на себя внимание разнонаправленные сдвиги полинена-сыщеннооти в фосфолипидах митохондрий и микросом. Если в митохондриях происходит увеличение полиненасыщенности на 15%, то в микросомах - снижение на 56%. Однако совместное действие этих факторов приводит к увеличению индекса ненасыщенности на 19,8%, что в основном связано с увеличением конверсии линолевой кислоты в ара-хидоновую (в 1,6 раза), уровень которой возрастает в 1,4 раза по отношению к интактным. Полученные данные свидетельствуют о том, что в микросомах происходит снижение ненасыщенности и соответственно увеличение гомеовязкости при всех трех видах воздействия, тогда как в митохондриях лишь сочетанное применение гипокинезии и обличения вызывает разжижение липидного матрикса»

Таким образом, несмотря на то, что основным патогенным, фактором яппнр'Гоя нонияирушшвй иялуиянип. аре ллчупнпо полите нив упгу-вня эндогенных радиосенсибилизаторов в условиях гипокинезии приводит к более значительным нарушениям как липидной фазы субклеточных органелл, так и функционирования энергетического аппарата гепатоцитов в целом.

5. Модификация липидной фазы биологических меибран экзогенным стимулятором гемопоэза из селезенки черепах - один из факторов формирования механизма радиорезистентности облученных млекопитающих

Развитие лучевого поражения к 8 суткам оопрозожддется значительным снижением скорости дыхания митохондрий при о^ио-тенли

оукцината и приводит к использованию компенсаторного конвейера митохондрий печени на 177,8%, тогда как при введении экстракта селезенки черепахи на 138%. В этот период в липидных компонентах митохондрий печени облученных мышей существенных изменений в содержании общей фракции фосфолипидов не обнаруживается, при этом уровень холестерина, жирных кислот в свободном состоянии и триацилглицеринов увеличивается на 62, 73 и 150% соответственно. Наряду о этим в группе животных, которым вводили экот-ракт селезенки, содержание СЖК, ТГ и общих фосфолипидов не отличается от показателей у интактных животных. Однако содержание холестерина на 30% выше. Восстановление количества CEC и ТГ при введении экстракта селезенки сопровождается еще большим снижением уровня фосфатидилхолина (на 35%, Р / 0,001). Относительное содержание суммарных фосфолипидов при этом остается на том же уровне, что и у интактных животных за счет возрастания количества фосфатидилсерина, кардиолипина и фосфатидилзтаноламина. Полученные данные свидетельствуют, что нормализация суммарного количества фосфолипидов в митохондриях печени облученных реципиентов маскирует истинное соотношение фракций фосфолипидов. По-видимому, имеет место дискоординации биосинтеза структурных липи-дов в митохондриях печени облученных мышей.

Неомотря на значительные изменения в количественном составе нейтральных липидов и структурных фосфолипидов у облученных мышей основная функция митохондрий - окислительное фосфорилиро-вание - не утрачена. Введение экстракта селезенки черепахи способствует переводу митохондрий печени облученных мышей иа деком-пенсированного низкоэнергизированного состояния в состояние компенсированного ниэкоэнергетического сдвига. При этом наблюдается тенденция к воостановлению относительного содержания нейтральных липидов. Вместе о тем в фосфолипидах продолжают преобладать кислые, более ненасыщенные фракции, что свидетельствует о возможности разжижения липидного микроокружения митохондриальных мембран но повышенное содержание холестерина, по-видимому, оказывает компенсаторный конденсирующий эффект, что позволяет приписать активации синтеза холестерина основную функциональную роль в радиационной стимуляции липогенсза (И.К.Коломийцева, 1986).

Таким образом, компоненты экстракта селезенки среднеазиатской черепахи способствуют частичному восстановлению физико-химических свойств липидного микроокружения белков митохондриальных

1бран и энергетической системы печени облученных в летальных )ах мышей.

Вполне вероятно также, что в реализации радиотерапевтичео-чо эффекта экстракта селезенки в значительной мере участвуют ¡пецифические реакции, влияющие на инактивацию продуктов породами липидов цеыбран субклеточных структур, в частности эн-[лазыатического ретикулума гепатоцитов. Для проверки этого дполоаения одной из*групп сразу после облучения ввел1- внутри-шиннно экстракт селезенки черепахи (ЭСЧ) в концентрации 0,2 белка в 0,5 мл физиологического раствора на мышь и прооледили динамикой колебаний уровня структурных липидов никросои, их асыщенности и продуктов ПОЛ через 2, б, 24, 48 и 96 часов поо-облучения..

Динамика колебаний уровня липидов никросои печени мыией по-■у-облучения и введения ЭСЧ носит волнообразный характер, чем, если во фракциях фосфолипидов, диацилглицёринов и триацил-цэринов колебания однонаправлены у обеих групп животных, то со-кание холестерина, неэтерифицированных жирных кислот и эф'"?ов зстерина в контрольной и опытной группах изменяется несогласо-ю. В микросомах печени первой группы животных через б ч поо-зблучения увеличивается количество X, НЭЯК, ДГ и ТГ. К концу 1еримента их уровень (за исключением ДГ) снижается до нормы, Щ - дс 86%. Введение ЭСЧ подавляет накопление поело облуча-НЭЖК, ТГ, в то же время этерификацип X и возрастание содер-1я ЭХ через 6 ч после облучения ЭСЧ не предотвращает.

У мышей, которым после облучения ввели ЭСЧ, количество СФ!1 :ичивается до 183% к 96 ч, причем происходит это поочередно зкими спадами в его уровне. Содержание- ФЭ и ФХ в этой группе тных посла пяля. кояпбани!? пргтбл^гаетсп :: :::Гга:;7;;с«у уровню, чество кислых фракций (ФС и ФИ) снижено. По-видиыоыу, введе-облученным мышам ЭСЧ.изыеняет динамику содержания липидных и олипидных фракций в ыикросомальных мембранах печени, в части X, Н31К, ФХ, СФ.. Этот препарат предотвращает накопление од-липидов (X, НЭЖК, ТГ) и как бы сдвигает во времени процессы, цие место в других классах, часто с определенными изменениями пичественном отношении (Фй, ФЭ, ФХ). Облучение мышей в дозе стимулирует образование первичных продуктов ПОЛ - конъюгиро-« диенов и диенкетонов - в микросомах печени, в то время как вызывает первоначальное (на протяжении 6 ч) сдерживание этого .

процесса"(рио. 9).

2,600 г

2,т\- а £

Рис. 9„ Динамика уровня коныогированных диенов (а) и диенке-тонов (б) в липидах микросом - печени мышей' после облучения а .дозе 8 Гр'(1) и введения облученным кивотным экстракта селезенки черепахи (2)*

По осям абоциоо - время пооле облучения, ч по осям ординат - оптичеокая плотность растворов липидов при 232 и 273 ни на I мг липидов} И - ия-тактный контроль.

С динамикой перекисеобразования совпадает картина изменения содержания полиненасыщенных жирных кислот во фракциях суммарных ФЛ и ФХ микросом печени после введения облученным мышам 9СЧ. Так, количество полиеновых жирных кислот ФЛ к 96 ч опыта возрастает до 131% по сравнение, с интактным уровнем, фоофатидил-холина - до 128%. Это объясняется накоплением важного оубстрата окисления - арахидоновой кислоты, уровень которой достигает к рассматриваемому сроку 145 и 203% в ФЛ и ФХ соответственно. Увеличение в этих фракциях коэффициента конверсии линолевой кислоты в арахидоновую (126 и 213%). по сравнению о'интактным указывает на усиленную десатурацию линолевой кислоты. Без введения.9СЧ у облученных мышей наблюдается та же тенденция, т.е. можно отметить, что в нашем эксперименте процессы пероксидации липидов обеопечиваютоя и поддерживаются высоким содержанием полиненаоы-щенных жирных кислот фосфолипидов и главным образом арахидоновой кислоты. Введение 9СЧ снижает уровень ЫДА. Минимальное его количество в этой группе отмечается через 48 ч (64%) (рис. 10). При неферментативном аокорбатзавиоимом перекирнрм окислении липидов (АЗП) изменение содержания УДА происходит более неровно. Здесь в этличие от НЭП после минимума к 48 ч (62%) в группе облученных лышей к 96 ч уровень ЫДА достигает 120% (рио. 10, б). У животных, которым после облучения ввели 9СЧ, через 6 ч постлучевого перио-ца количество ЫДА повышено (121%), но к исходу I оуток достигает замого низкого уровня - 55%, далее постепенно возрастая.

Таким образом, показано, что облучение, изменяющее уровень зродуктов ПОЛ микросом, вызывает связанные с этим изменения в их зостаье. Взаимосвязь между составом и уровнем окислительных реакций в липидах позволяет о помощью малых доз экстракта селезен-ш черепахи, опосредованно влияющего на интенсивность процеосов ЮЛ, направленно изменять состав митохондриальньсх и микросомаль-шх липидов и тем самым нормализовать реакции, лежащие в основе 1атогенеза лучевой болезни.

Рис. 10. Содержание калонового диальдегида при НАДф>Н-зави сиком (а) и аскорбатзависиноы (б) ПОЛ в иикросоиа печени иышей после облучения (I) и введения обду ченныы животный экстракта селезенки черепахи (2).

По осям абсцисс - вреыя после облучения, ч; по ооям ординат - концентрация иалонового диальде гида, нмоль/мг белка в I иин; И - интактный контроль.

выводы

1. Показано, что фосфолипида микрооом печени позвоночных зга разный уровень полиненаоыщенности. По этому признак; ор-1изыы располагаются в порядке убывания в следующем ряду:кры-, человек, кролик, черепаха, что коррелирует о интенсивностью >цеосов перекисного окисления лиПидов у перечисленных кивот-

2. Установлено, что в процессе эмбрионального развития че-1ах содергание полиненасыщенных жирных кислот в печени повыша-!Я параллельно увеличению срока развития.

3. Установлено, что выживаемость черепах при перегреве и пе-кладдении .тела от предпочитаемой температуры (+24,5°С) в широ-[ диапазоне температур (от +10° до +38°С) обусловлена способною модулировать фазовое состояние фосфолипидного биолоя ыемб-

. Это подтверждается тем, что у черепах быстро а обратимо ь.«?-тоя ненасыщенность мембранных фосфолипидов, интенсивность про-сов перекисного окисления липидов, уровень холестерина, соот-ение киолых и нейтральных липидов*

Высокая видовая резистентность черепахи к аяовоии связа-о адаптивной перестройкой соотношения липидов биоиембран и во-чением гликолиза в процессы выработки энергии.

5* Прс вления лучевого эффекта в ляпидной фазе кикросом ге-эцитов черепах, подвергнутых однократному тотальному облучению ¡гбдетальных дозах, менее выражены и протекают более продолжило, чем у млекопитающих.

6« Эндогенный фон феноменальной радиорезистентности средне-иской черепахи наряду о невысокий по Сравнению о млекопитаю? • ссдарАшпоя длннноцайичачных полиненасыщенных жирных кислот бранных фосфолипидов, обусловлен также высоким уровней"неотру->ных липидных включений, которых у -черепахи содержится в пече-> раз больше, чей у крысы. Неструктурные липиды гепатоцитов шахи в основном представлены триацилгяицеринами и содержат в раза меньше, чем у крысы, полиеновых жирных кислот - основно-¡убстрата процессов перекисного окисления липидов.

7« Выявлено смещение сроков лучевого эффекта на 30 суток у пах, облученных оублетальной дозой в условиях аноксии. Моди-дия лучевого воздействия коррелирует со снижением интенсивно-процеосов перекисного окисления липидов бйомембран и повыше- ,

нием эндогенного фона радиорезистентности в первую декаду постлучевого периода.

8. В результате истощающей мышечной деятельности происходит конденсация фосфолипидного бислоя митохондриальных мембран на фоне усиления'ПОЛ, тогда как значительных изменений мембран микрооом печени и сердца крыс не обнаружено. Интенсификация ПОЛ в субклеточных структурах печени крыс установлена также на начальных этапах гипокинезии - 7 оутки. Сходные реакции наблюдаются у черепах Ь ответ на гипертермию - 37°С, длительную анокоию - 3 часа и сверхвысокие дозы гамма-облучения - 500 Гр. Это, по-видимому, является ni ;азателем первичного метаболического ответа организма на действие различных по этиологии экстремальных факторов.

9. Обнаружено явление синергизма при комбинированном воздействий гипокинезии и "^-облучения. Предлучевое повышение эндогенных" радиооенсибилизаторов в условиях гипокинезии приводит к более значительным нарушениям как липидной фазы субклеточных органелл, так и функционирования энергетического аппарата гепа-тоцитов в целом.

10. Компоненты экстракта селезенки среднеазиатской черепахи способствуют частичному восстановлению физикохимических свойств липидного микроокружения белков митохондрий и энергетической системы печени облученных в летальных дозах мышей.

11. Взаимосвязь между составом и уровнем окислительных реакций в липидах позволяет с помощью малых доз экстракта селезенки черепахи, опосредованно влияющего на интенсивность процессов ПОЛ, направленно изменять состав митохондриальных и микросомаль-ных лыидов, и тем самым нормализовать реакции, лежащие в ochobi патогенеза лучевой болезни.

СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

I. Иванов В.И. Позиционное распределение жирных кислот в липидах митохондрий и микросом печени белых крыс // Актуальные вопросы гастроэнтерологии и токсикологии; Тез» докл. 1У республиканской конференции ДНИЛ Медвузов Узбекистана. - Ташкент,1978 - Т. - С. 56-58.

¿. Иванов В.И. Проявление общего адаптационного синдрома у

животных под влиянием физических нагрузок смешанной аэробно-анаэробной направленности // физиологические и клинические проблемы адаптации организма человека и животного к гипокоии» гипертермии» гиподинамии и неспецифические средства восстановления: Материалы П Всесоюз. симпозиума. - М., Г978. - С. 77-78*

3. Турдыев A.A., Иванов В.И., Васильев А.Н. Спектр жирных киолот общих липидов и фоофолипидов печени облученной черепахи // Радиочувствительность и процессы восстановления у животных и растений: Тез.докл. симпозиума. - Тшшент, 1979. - С. 35-36.

Турдыев A.A., Иванов В.И., Васильев А'.Н. Антиокислительная активность общих липидов печени среднеазиатской черепахи при высоких дозах гамма-облучения // Радиочувствительность и процессы восстановления у животных и растений: Tes. докл. симпозиума. -Ташкент, 1979. - С, 34-35.

5. Иванов В.И. Перекионое окисление липидов сыворотки крови и тканей некоторых органов белых крыо в условиях гипокинезии // Липиды биологических мембран: Тез.докл. Всесоюз. симпозиума. -Ташкент, 1980. - С. 177-178.

6. Метаболическая активность митохондрий печени интактных крыо в различное время оуток / Иванов В.И., Трифонов Ю.А., Шин-дер Е.А., Турдыев A.A. // Узбекский биологический журнал. - 1900. - № 4. - С. 25-28.

7. Иванов В.И., Яроцкий А.И. Особенности механизмов адаптационной резистентности при физических нагрузках и в условиях гиподинамии // физиологические и клинические проблемы адаптации к гипокоии и гипертермии: Тез. докл. Ш.Всесоюз. симпозиума. - П., 1981. - С. 90-92.

8. Иванов В.И., Турдыев A.A., Трифонов Ю.А. изменение .физи-кохимических свойств мембран субклеточных структур гепатоцитов »«¡¡ей прй облучении и введении якптракта селезенки среднеазиатской черепахи // I Всесоюзный биофизический съезд: Тезисы докладов стендовых сообщений. -П., 1932. - С. 224.

9. Васильев А.Н., Иванов В.И., Денисова О.Н. Исследование состава, жирных кислот культуры фибробластов средноозиатской черепахи // Цитологические механизмы гистогенезов / Под ред. Д.Х. Хамидова. - Ташкент,.1983. - С. ¿5.

10. Иванов В.И., Аббасова И.А. Перекисноз окисление липидов tзчени белых крыс в условиях гипокинезии // Цктолотичзс.чка механизмы гистогенезов / Под ред. Д.Х.Хамидоза. - Таахоа',!?^.

- С. 79.

11. Аббасова И.А., Иванов В.И. Особенности адаптационных реакций субклеточных структур печени белых крыс на гипо- и ги-перкинезию // Тев.науч. сообщений Ш Съезда физиологов Узбекистана. - Ташкент, 1983. - С. 3.

12. Иванов В.И., Турдыев A.A. Влияние гипо- и гипертермии на кардиоваскулярную систему черепахи Testudo borefieldi // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 1983. - Т. 19. -№ б. - С. 556-559.

13. Турдыев A.A., Иванов В.И., Аббасова И.А. Состав липидс и интенсивность процессов перекионого окисления в микросомальи мембранах гепатоцитов черепахи // Ш Советско-швойцарокий оимпо-8иум Биологические мембраны: структура и функции: Тез«докл. -Ташкент, 1983. - С. НО.

14. Иванов В.И., Турдыев A.A., Аббаоова И.А. Жирнокислот-ный состав и ненасыщенность фосфолипидов микрооом печени средне азиатской черепахи Testudo borefieldi // ДАН УвССР. - 1984. -№ 4. - С. 45-47.

15. Иванов В.И.» Турдыев A.A., Аббасова И.А. Липидный состав микросом печени черепахи Testudo borefieldi // Журнал аволБционноЙ биохимии и физиологии. - 1984. - Т. 20. - К» 2. -С. I57-I6I.

16. Действие селезеночного экстракта черепах на функциональное состояние митохондрий печени облученных мышей /'Турдыев A.A., Иванов В.И., Трифонов Ю.А., Аббасова И.А., Усманов Р.Б. // Радиобиология. - 1984. - Т. 24. - Вып. 6. - С. 834-838,

17. Иванов В.И. Турдыев A.A. Сезонные особенности терморегуляции у среднеазиатской черепахи // Биологические науки. -1984. - К 10. - С. 61-65.

18. Иванов В.И.» Аббасова И.А. Липидная стратегия адаптации биологических мембран к ионизирующему излучению // Информационный бюллетень научного совета АН СССР по радиобиологии. -1984. - Выя. 30. - С, 40-45.

19. Иванов В.И., Турдыев A.A. К механизму устойчивости сре днеазиатокой черепахи Testudo horsfieldi . к длитечьной аноксии // Журнал эволюционной биохимия и физиологии. - 1985. - Т. 21. ■ te I. - <3. 91-93.

20. Иванов В.И.» Турдыев A.A.» Аббаоова И.А. Роль липидных компонентов микросомальных мембран гепатоцитов среднеазиатской

зпахи в реализации лучевых повреждений // Радиобиология* -5. - Т. 25. - Вып. 2. - С. I91-195.

21. Иванов В.И., Турдыев A.A. Некоторые аспекты адаптации днеазиатской черепахи Toatudo borsfioldi к условиям зврп-ühh и длительной анокоии // Вопросы герпетологии: Авторефа-ы докладов 6 Всесоюзной герпетологической конференции. - Л., 5. - С. 82-83.

22. Иванов В.И., Турдыев A.A., Аббасова H.A. Липидг шисро-гепатоцитов черепахи Testudo borsfioldi прй различных тем-

атурах содержания // Яурнал эволюционной биохимии и фиэиоло-. - 1986. - Т. 22. 3. - С* 240-246.

23. Иванов В.И., Турдыев A.A. Липиды микросом печени чере-, облученных в условиях длительной анокоии // 1У Конференция химиков республик Средней Азии и Казахстана: Тез.докл. - Аш-ад, 1986. - С. 373.

24. Волкова Т.Н., Иванов В.И., Турдыев A.A. Еирнокислотный тав липидов печени черепахи в онтогенезе // 1У Конференция химиков республик Средней Азии и Казахстана: Таз.докл. - ,'и-ад, 1986. - С. 157.

25. Иванов В.И., Турдыев A.A. Биохимические аспекты реали-ии адаптационных эффектов в условиях экстремальных воздейот-

у позвоночных // I Конференция биохимиков Узбекистана: Тёз. л. - Таь.;ент, 1986. - С. 43. -

26. Александрова И.А., Иванов В.И. Липиды микросом печени днеазиатской черепахи в условиях жесткой.аноксии // I Конфе-ция биохимиков Узбекистана: Тез. докл. - Ташкент, 1986. -87.

27. Липиды микросом. печени мышей в условиях облучения и ления экстракта селезенки черепахи / Иванов"В.И.. Турдыев

Александрова И.А., Свидовая I.B.i Родина Е.А. // Радиология. - 1987. - Т. 27. - Ш 2. - С. 257-264.

28. Роль экстракта селезенки черепах в пострадиационном становлении пораженных функций / Турдывв A.A., Усманов Р.Б., лов В.И., Трифонов O.A. // Информационный бюллетень научно-совета АН СССР по радиобиологии. - К., 1987. - Вып. 34. - • 36-37.

29. Иванов В.И., Турдыев A.A. Роль полиеновых жирных кис-

1 фосфолипидов и холестерина в механизмах нарушения и коррек-: мембранного гомеостаза при лучевом поражении // Всесоюзный

симпозиум по биохимии липидов: Tea. докл. - Алма-Ата, 198?. С. 189.

30. Иванов В.И., Турдыев А.А. Липидная фаза биоменбран уровень компенсаторного резерва энергетической системы клеи у облученных в условиях гипокинезии животных // Радиобиолог! - 1988. - Т. 28. - № 2. - С. 245-249.

31. Ivanov V.I., ftirdyev А.А. Blomembrane lipids in re zation of the effects of extremal influence in vertebrates , fourth International Congress of Cell Biology. Abstracts. -14 - 19 August, Uountreal, Quebec, Kanada. - 1988. - P. 5.

32» Иванов В.И., Турдыев A.A. Радиопротекторное действ! длительной аноксии на.мембранные липиды облученных черепах / Радиобиология. - 1909. - Т. 29. - fe 2. - С. 215-220.

3.6

Подписано к печати 5.07.89г. Р - 08859 заказ № 236

Тираж 100 экз. Обьем 1,5 п/д.

Отпечатано на ротапринте £Ь АНУзССР Тапкент Муминова 13