Радикальные состояния и циклические превращения липидов в биологических мембранах

Дмитриев, Леонид Федорович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Радикальные состояния и циклические превращения липидов в биологических мембранах
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Радикальные состояния и циклические превращения липидов в биологических мембранах"

российская академия медицинских наук

кардиологический научный центр, институт клинической кардиологии

РГБ од

.■•(;;т .л-./ На правах рукописи

* 1 "'!и УДК 577.352.38

ДМИТРИЕВ Леонид Федорович

радикальные состояния и циклические превращения ли1щов в биологических мембранах 03.00.02 -Биофизика

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологическх наук в форме научного доклада

Москва - 1994

Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического ф-та МГУ и в отделе ССП Кардиологического научного центра РАМН

Официальные оппонент:

доктор биологических наук, профессор Е.Б.Бурлакова

доктор биологических наук, профессор Ю.В.Евтодиенко

доктор биологических наук, профессор А.Я.Потапенко

Ведущее учреждение

Институт биохимии РАН им.А.Н.Баха

Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Московская область г.Пущино)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

в А 3 нас ОО мин на : .. рованного совета

Защита состоится

года

Реферат разослан

Ученый секретарь специализированного советг кандидат биологических наз

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время тесная связь между перекисным окислением липидов (ПОЛ) и активностью клеточных мембран, более того, определяющая роль ПОЛ в проявлении биологической активности не вызывает сомнений. Однако, ПОЛ обычно рассматривается как универсальный процесс,ответственный за повреждение мембран. При выяснении роли ПОЛ, на наш взгляд, прежде всего следует иметь в виду интенсивность этого процесса. Оценивая степень интенсивности ПОЛ можно выделить три качественно разных случая: интенсивное, умеренное и слабое ПОЛ. Умеренное ПОЛ можно рассматривать как нормальный, строго контролируемый in viro процесс. Для клеточной линии (органа или ткани) умеренное ПОЛ означает старение. Его изменение в сторону слабого или интенсивного ПОЛ может означать соответственно бессмертие (появление раковых клеток) или гибель; интенсивное ПОЛ - это уже повреждение структуры и функции мембран. Патологию в этом случае можно рассматривать как состояние промежуточное между умеренным и интенсивным ПОЛ.

Чрезвычайно важно, что мембраны эндоплазматического ретику-лума, осуществляющие гидроксилирование ксенобиотиков, и мембраны митохондрий, осуществляющие синтез АТР, функционируют в условиях, способствующих окислительной деструкции мембранных липидов. Это происходит в силу высокого уровня потребления кислорода, протекания многочисленных биохимических процессов, сопровождающихся генерацией активных форм кислорода и присутствия в мембранах основного субстрата ПОЛ - полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖ).

Известно, что в обеспечении структурно-функциональной стабильности липидного бислоя биологических мембран ключевая роль принадлежит а-токоферолу. При рассмотрении механизмов, обеспечивающих надежную работу биологических мембран в различных органах и тканях это положение не вызывает сомнений. Тем не менее, к началу настоящего исследования было практически ничего не известно об особенности функционирования токоферола в биологических мембранах по сравнению с другими биологическими структурами, например, липо-протевдами низкой плотности и химическими (гомогенными) системами.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в систематическом исследовании процессов, связанных с образованием, липидных радикалов в ненасыщенных жирных кислотах фосфолипидов,

включая циклические превращения радикальных состояний липидов, а также в установлении связи между образованием перекисши: радикалов в норме и функционированием биологических мембран.

В соответствии с этим в работе были поставлены следующие основные задачи, решение которых потребовало проведение экспериментальных исследований з три этапа:

- Исследовать механизмы, обеспечивающие структурную стабилизацию искусственных мембран (липосомы) а-гокоферолом при разных значениях рН в условиях активации ПОЛ азоишщиатором.

- Исследовать механизмы, обеспечивающие структурно-функциональную стабилизацию биологических мембран (микросомы печени) а-токоферолом при разных значениях рН в условиях ыАОРН-зависишго перекисного окисления липидов.

- Провести исследование синергетического действия а-токоферо-ла и таких восстановителей как аскорбат и глутатион. Исследовать механизм действия глутатиона в микросомах, т.е. выяснить является ли энтиоксидантный эффект глутатиона результатом прямого действия или результатом работы ферментативной системы.

Кроме того,

- Провести детальное исследование перекисного окисления липидов при нормальном функционировании митохондрий печени. В частности, выяснить какова интенсивность перекисного окисления липидов в митохондриях в разных функциональных состояниях.

- Изучить влияние редоке состояния убихинона, контролирующего уровень липидных радикалов в мембранах митохондрий, на процесс синтеза АТр.

- Исследовать возможность регуляции фосфорилирования Аор с помощью про- и антиоксидантов, т.е. изменения скорости синтеза АТр в результате направленного изменения уровня липидных радикалов.

Наконец,

- Изучить перекисное окисление липидов в микросомах печени и связь этого процесса с гидроксилированием ксенобиотиков, а также влияние антиоксидантов (а-токоферола, пропилгаллата) на процесс гидроксилирования полициклического углеводорода бенз(«)пирена.

Научная новизна. В диссертационной работе впервые проведено систематическое изучение функционально значимого, т.е. умеренного ПОЛ. В работе выдвинута и экспериментально обоснована совокупность

представлений о важной функциональной роли липидов в биологических мембранах; рассмотрено образование липидных радикалов в ненасыщенных жирных кислотах фосфолипидов и циклические превращения радикальных состояний липидов. Установлено наличие тесной связи между умеренным перекисным окислением липидов и функционированием биологических мембран. Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что перекисное окисление липидов зависит от функциональной активности мембран. Это касается как процесса гидроксилирования ксенобиотиков в мембранах макросом, так и окислительного фосфори-лирования в мембранах митохондрий. Чем выше функциональная активность, тем ниже уровень перекисного окисления липидов. И наоборот, при работе редокс цепи вхолостую, происходит усиление перекисного окисления липидов, которое служит своего рода инструментом разборки биологических мембран.

В работе рассмотрена роль антиоксидантов в стабилизации биологическх мембран и дан критический анализ общепринятого механизма взаимодействия перекисных радикалов с токоферолом. Предложен новый механизм действия токоферола, который ведет не к образованию гидроперекисей, а к восстановлению первичной структуры жирной кислоты; в результате такой реакции высвобождается супероксид. Рассмотрены два механизма действия токоферола: неферменгативный (двухзлектронное окисление токоферола) и ферментативный, при котором реализуется однозлектронное окисление токоферола

Полученные в настоящем исследовании результаты указывают на то, что высокая антиокислительная эффективность токоферола в биологических мембранах связана не просто с реакцией обрыва цепи, а с циклическим превращением молекулы липида. При этом защитное действие токоферола осуществляется, по-видимому, путем разрыва С-0 связи и превращения перекисного радикала ьо* в исходную неокислен-ную молекулу ьн. Только таким образом токоферол может полностью блокировать перекисное окисление липидов в мембранах и тем самым способствовать выполнению их многочисленных функций в широком диапазоне температур.

Полученные в работе данные указывают на то, что скорость гидроксилирования Б(а)П может значительно варьировать при неизменном содержании в мембранах цитохрома Р-448. Такая регуляция скорее всего связана с изменением концентрации липидных (перекисных) ради-

калов, которые могут слукить донором кислорода для реакции гидрок-силирования Б(а)П с участием цитохрома Р-448. В этом случае в микросомах происходит циклическое превращение липидных радикалов (lh—- l'—- Loj—- lh) и тормозится образование гидроперекисей.

Полученше в работе данные свидетельствуют в пользу представлений о том, что фосфолипидная мембрана играет активную роль в преобразовании энергии в ттохоздряях. Предполагается, что с одной стороны ¿мн+ контролирует работу дыхательной цепи, т.е. скорость окисления субстрата (дыхательный контроль), с другой - дыхательная цепь с помощью липидного интермедиата контролирует утилизацию протонного градиента, т.е. скорость синтеза АТР. Это означает.что наличие ддн+ является необходимым, но недостаточным условием аффективной работы атр - синтетазы.

Научно-практическая значимость работы. Данное диссертационное исследование является составной частью программы ГКНТ 0.69.05 и 0.69.07 "Роль структурной организации мембран в их устойчивости и биоэлектрических функциях".

Полученше в работе экспериментальные результаты и теоретические обобщения расширяют представления о механизмах защиты и повышения структурно-функциональной устойчивости биологических мембран, что открывает перспективы разработки новых подходов к терапии ряда патологий.

Разработанный в работе УФ-метод инициирования ПОЛ с помощью изоинициатора может быть использован для скрининга антиоксидантов на таких моделях как липосомы и липопротеиды низкой плотности, что необходимо в ходе поиска новых соединений данного класса.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту: Витамин Е (а-токоферол) обладает универсальным стабилизирунцим действием во внутриклеточных мембранах; это действие реализуется при физиологически значимых способах модификации липидного бислоя (активации ПОЛ кислородными радикалами).

Механизмы действия токоферола в химических (гомогенных) системах и биологических (гетерогенных) системах могут быть различны. Результат взаимодействия токоферола с перекисными радикалами в биологических мембранах иной, чем в гомогенных системах и липопро-теидах, где появление гидроперекисей неизбежно и они образуются в количестве эквимолярном убыли токоферола.

Помимо существенного влияния перекисного окисления лишдов на ионную проницаемость необходимо иметь в виду и другой аспект -возможное участие промежуточных продуктов перекисного окисления (перекисных радикалов) в редокс реакциях. Восстановление радикалов Loj может происходить как в мембранах микросом.так и митохондрий. В первом случае в реакции ьо^—- [ьо^участвует фермент gsh(lo2) редуктаза, во втором - ферменты редокс цепи. Благодаря этому в митохондриях осуществляется регуляция скорости фосфорилирования за счет поддержания определенного уровня липидных радикалов.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на всесоюзных и международных конференциях и на научных семинарах.: на кафедре биофизики Биологического ф-та МГУ, на кафедре биофизики Физического ф-та МГУ, в институте биохимии им.Баха, в институте химической физики им.Семенова, на Всесоюзных конференциях" Биоантиокислители и регуляция окислительных процессов в клетке", Москва (1972), "Факторы антиканцерогенеза" Киев (1974), "Структура биосинтез и превращение липидов в организме животных и человека", Ленинград (1975), "Свободнорадикальное окисление липидов в норме и патологии",Москва (1976), "Перекисное окисление липидов и стресс", Ереван (1990), "Active oxygens, lipid peroxides and antioxidants", Kyoto,Japan (1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 33 работы в центральных академических и международных изданиях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ (ВВЕДЕНИЕ).

Перекисное окисление липидов (ПОЛ) - процесс, спонтанно протекающий во всех биологических системах и являющийся проявлением токсического действия кислорода по отношению к легкоокисляемым органическим соединениям, прежде всего фосфолипидам мембран, точнее к входящим в их состав ненасыщенным жирным кислотам. Активаторами этого процесса и одновременно его промежуточными продуктами являются радикалы кислорода: супероксвдный, гидроксильный, гидро-пероксидный, а также перекись водорода. Продуктами процесса являются перекиси липидов, эпоксиды, альдегида и кетоны, в частности, малоновый диальдегид, а также конечные продукты - так называемые шиффовы основания (липофусциновые пигменты).

По механизму перекисного окисления осуществляются в организме

и многие ферментативные реакции дано- и диоксигеназного окисления; вдклооксигеназные и лшоксигеназные реакции синтеза простагланди-нов, лейкотриенов, тромбоксанов обеспечивают синтез в организме этих высокоактивных соединений, используя ПОЛ в интересах живой системы. Такой деструктивный по своему механизму процесс, как окислительная разборка избыточных внутриклеточных мембран, также осуществляется в интересах организма. Таким образом едва ли следует рассматривать реакции ПОЛ как исключительно токсические. Более того, совокупность неферментативных и ферментативных реакий ПОЛ может лежать в сфере биоэнергетических процессов, обеспечивающих энергией метаболизм за счет биологического окисления и окислительного фосфорилирования.

Основные внутриклеточные биоэнергетические машины - это системы электронного транспорта, расположенные во внутренней мембране митохондрий и эндоплазматическом ретикулуме (микросомах). В процессе работы этих систем энергия биологического окисления, освобождающаяся порциями при последовательном переносе электронов на молекулу кислорода, с высоким КЦД расходуется на синтез атр (митохондрии) и на окислительный метаболизм разнообразных ксенобиотиков (микросош). Следует, однако отметить, что в процессе функционирования этих цепей, по мере ступенчатого восстановления кислорода образуются промежуточные продукты, обладающие высокой окислительной активностью, т.е. продукты, способные инициировать цепные реакции свободнорадакального окисления. При четырехэлектронном восстановлении молекулы кислорода, как известно, происходит последовательное образование О^, Н202» ОН' и, наконец, Н20.

Системы электронного транспорта представляют собой высокосовершенные молекулярные машины; в процессе их работы промежуточные активные продукты если и образуются, то в очень малых концентрациях и они тут же утилизируются тем или иным способом. Однако, саше точные машины, в том числе и биологические, имеют свой предел точности функционирования. Иными словами существует определенная опасность "утечки" промежуточных активных продуктов и выхода цепных свободнорадикальных реакций из под контроля. В этом случае пррявляется токсическое деструктивное действие кислородных радикалов. В частности, активация ПОЛ может привести к нарушению структуры и функции митохондрий и отрицательно повлиять на систему

электронного транспорта и окислительное фэсфорилирование.

Бесперебойная и длительная работа этого молекулярного механизма возможна лишь в условиях защиты мембранной системы электронного транспорта от подобной опасности. Такая защита осуществляется специализированными антиоксидантными (АО) системами, прежде всего АО-ферментами. Будучи структурно и пространственно связанными с митохондриальными мембранами, эти АО-ферменты четко ориентированы против конкретных активных форм кислорода. Гак, например, суперок-сидщисмутаза (СОД) дасмутирует супероксидные анион-радикалы, а каталаза превращает перекись водорода в воду. Наиболее активный продукт восстановления кислорода - гидроксильный радикал. Это короткоживущий радикал и очевидно поэтому отсутствует ферментная система, способная его эффективно инактивировать. Защита от действия гидроксильного радикала осуществляется принципиально иным способом,: непосредственно в бислойную структуру мембран встроены молекулы веществ, способные инактивировать первичные радикалы и защитить от радикальной атаки двойные связи полиненасыщенных жирных кислот. Такую функцию выполняют прежде всего токоферолы - наиболее универсальные липорастворимые АО, убихинон - важнейший компонент электроннотранспортной цепи митохондрий, а также ретиналь. При взаимодействии АО с липидными радикалами в результате переноса атома, водорода образуются радикалы антиоксидантов, которые не продолжают цепи свободнорадикального окисления, а обрывают ее, реализуя тем самым эффект АО-защиты.

В АО-защите нуждаются не только мембраны - митохондриальные, эндоплазматические и плазматические,но и липопротеиды. Такая защита необходима также биологическим жидкостям (кровь, лимфа) и здесь важную роль играют водорастворимые АО. Это аскорбиновая кислота и серосодержащие АО - прежде всего глутатион и цистеин. Аскорбиновая кислота и глутатион образуют в крови своего рода буферные системы, поддерживающие в определенных пределах окислительный гомеостаз. Глутатион, кроме того, выступает в качестве кофактора сопряженной системы АО-ферментов глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы, разрушающих липидные перекиси. Наконец, весьма важную роль в АО-системе крови играют церулоплазмин и трансферин.

В организме, по-видимому, существует определенная иерархия АО-систем, обеспечивающая поддержание в клетках, внутриклеточных

мембранах и липопротевдах, а также в крови окислительно-антиокси-дантного равновесия, позволяющего удерживать в обычных условиях жизнедеятельности процесс ПОЛ на некоем минимальном уровне, не представляющем реальной опасности для структуры и функции биосистем. Однако, всякого рода состояния напряжения, связанные в частности с повышенными, физиологическими нагрузками и предъявляющие повышенные требования к системам биоэнергетики и метаболизма в целом, вносят более или менее весомые коррективы в состояние данного равновесия. Гак, усиленное функционирование электронно-транспортных цепей может сопровождаться увеличением продукции активных форм кислорода и существенным ростом нагрузки на АО-системы. Имеющиеся АО-резервы, постепенно расходуяь, могут в определенных пределах обеспечить поддержание и нормальное функционирование клеток. Однако, по мере исчерпания этих резервов возрастает опасность неконтролируемого усиления реакций ПОЛ, окислительной деструкции и даже гибели клеток.

Существуют АО-системы, функционирующие на более высоких уровнях организации и на воздействие агентов, необычных по силе и продолжительности организм, как правило, отвечает адекватной реакцией - подключением системных и организменных механизмов поддержания окислительного гомеостаза [Меерсон 1981, Барабой 1989]. В ней наряду со специфическим ответом на действие данного раздражителя важнейшее место занимает не специфический комплекс реактивных изменений, получивший название стресса - общего синдрома адаптации. Стресс в широком смысле является приспособительной реакцией, присущей всем биологическим системам, начиная с клетки, и обеспечивающей повышение устойчивости последних к неблагоприятным условиям существования. Применительно к высшим организмам стресс представляет собой стереотипную прспособигельную реакцию, генетически детерменированную и проявляющуюся в ранней мобилизации так называемых стрессреализующих систем. Продукты функционирования этих систем - катехоламины и глюкокортикоиды - обладают кратковременной (катехоламины) или довольно продолжительной АО-активностью и их гиперпродукцию моясно рассматривать как механизм аварийного пополнения АО-ресурсов тканей. Наряду с другими сторонами механизма действия стресс-реализущих систем (мобилизации пластических и энергетических ресурсов) АО-эффект чрезвычайно важен; он обеспечи-

вает формирование и пролонгацию характерной для стресса фазы повышенной резистентности.

Таким образом, усиление окислительного метаболизма, развивающееся в ответ на воздействие экстремальных ситуаций, обуславливает повышенную нагрузку на АО-системы организма и в целях сохранения окислительного гомеостаза требует включения дополнительных механизмов поддержания окислительно-антиоксидантного равновесия, необходимого для эффективной работы внутриклеточных биоэнергетических систем на предельном для них уровне. Иными словами, включение стресс-реализующих механизмов рассматривается как адекватный ответ организма на опасность окислительной деструкции биологических структур. Считается, что стресс-агенты запускают ответную реакцию систем регуляции гомеостаза не непосредственно, а путем образования гипотетического "первичного медиатора". Вполне возможно, что роль "первичного медиатора" выполняют промежуточные продукты ПОЛ, инициирующие свободнорадикальные реакции и сигнализирующие об опасности окислительной атаки. В частности, активные формы кислорода могут выступать в роли первичных и вторичных медиаторов стресса . Очевидно, что в конечном счете, повышение мощности АО-систем организма путем оптимального поступления таких необходимых компонентов, как АО-витамины (А,С,Е) способно обеспечить длительное функционирование ферментных систем, расположенных во внутренней мембране митохондрий и эндоплазматическом ретикулуме.

материалы и методы исследования.

Экспериментальное решение поставленных в работе задач потребовало применения набора физико-химических и биохимических (препаративных и аналитических) методов, основные из которых перечислены ниже.

В работе использовали крыс-самцов линии Вистар, которых содержали на стандартной диете. Митохондрии и микросомы печени выделяли методом дифференциального центрифугирования, фракции липопро-теидов плазмы крови выделяли последовательным центрифугированием в солевой среде заданной плотности.

Однослойные липосомы формировали озвучиванием липосом приготовленных из природных и синтетических фосфолипидов (фосфатидил-холин, кардиолипин). Липиды из мембран микросом и митохондрий экстрагировали, используя стандартную методику(экстракцию смесью хло-

роформ-метанол). Содержание фосфолипидов определяли по липидному фосфору. Степень восстановленности убихинона определяли по поглощению окисленной И восстановленной форм [Kroger,Klingenberg 1966]. Токоферол определяли по методике [Burton et ai.isss] с некоторой модификацией.

Перекисное окисление липидов инициировали ферментативнш и неферментативным способом. В ряде случаев использовали азоинициа-тор Azo-isobutyronitrii (aibn); разработанный нами метод УФ-облу-чения позволяет использовать азоинициатор и генерировать первичные радикалы при температуре 25-37°. В частности перекисное окисление липидов в липосомах инициировали УФ-светом ( а з2о-380 nm). Используемый в работе инициатор при определенных условиях образует первичные радикалы r\(ro').

R—N=N-R----N2 + 2R-

Такой способ инициирования перекисного окисления липидов выбран потому, что он позволяет контролировать скорость инициирования и кроме того в этом процессе не участвует супероксид. Содержание липидаых гидроперекисей определяли по УФ- поглощению диеновых коньюгатов В Области 233 HM [Recknagel, Glende 1984]; содержание малонового диальдегида - по его реакции с тиобарбитуровой кислотой [Asakawa, Matsushita 1980].

Содержание цитохрома Р-450 в микросомах печени определяли по поглощению комлекса цитохрома С СО [Matsubara et al.1976].Скорость гидроксилирования полициклического углеводорода бенз(а)пирена и скорость убыли nadph определяли методом прямой регистрации флуоресценцию ЭТИХ соединений [Yang,Kicha 1978].

Для генерации супероксида использовали метод облучения nadph ультрафиолетом. Поглощение кислорода определяли полярографическим методом с использованием платинового электрода.

Мембранный потенциал определяли с помощью селективного электрода по распределению проникающего катиона тетрафенилфосфония [Kamo et ai. 1979]. Скорость синтеза АТР оценивали, контролируя длительность фосфорилирования Adp по величине мембранного потенциала либо с помощью гексокиназы, глюкозы и глюкозо-6-фосфатдегидро-геназы [Lamprecht, Trantschoid 1974], а также полярографически, определяя отношение adp/O.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Глава 1. ПРОБЛЕМА СТАБИЛИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН ТОКОФЕРОЛОМ

Процессы ПОЛ являются важнейшим физиологическим и патофизиологическим фактором модификации липидного бислоя мембран митохондрий и микросом. Это связано не только с тем, что внутриклеточные мембранные структуры потенциально подвержены окислительной деструкции, но и с тем, что при интенсификации ПОЛ изменяются интегральные характеристики липидного бислоя, в частности, проводимость и микровязкость.

Основные этапы перекисного окисления липидов.На первой стадии процесса - стадии инициирования (реакция I) происходит образование липидного радикала в результате атаки первичного радикала и'. Чаще всего это супероксидный анион радикал о^ (но^) или гидроксильный радикал он*. Первичный радикал отнимает у ненасыщенной жирной кислоты фосфэлипида атом водорода, вследствие чего радикальное состояние переходит на молекулу липвда (ьн—с последующим присоединением к аллильному радикалу ь" молекулы кислорода.

инициирование и" цепи га

looh

продолжение о2

цепи

обрыв цепи Lo:~4tv

(1)

стабильные продукты

продукты взаимодействия с антиоксидантом

Схема l-i. Основные стадии перекисного окисления липидов

Из схемы следует, что перекисное окисление липидов (накопление looh) может контролироваться различными способами?! либо путем ослабления стадии инициирования (реакция I), либо путем усиления стадии ингибирования (реакция v). Существенным фактором, влияющим

Принятые сокращения: lh - ненасыщенная жирная кислота фэсфолипида, l* и lo* аллильный и перекисный радикалы соответственно; looh -гидроперекись, аон - антиоксидант.

на стадию продолжения цепи, является вероятность взаимодействия ненасыщенных жирных кислот мевду собой. От этого зависит скорость бимолекулярной реакции Ш, лежащей в основе цепного процесса.

Цепной процесс характерен тем, что каждый радикал l-(lo*) ведет к появлению множества молекул looh. Количественной характеристикой этого процесса является такой параметр как длина цепи п, т.е. количество молекул looh, возникающих в последовательной реакции после инициирования:

LH о, LH

1Л. I т. * . тп. I ^ ,. ___ стабильные ,,,

ьо2 L L02 ----^^ продукты (2)

looh (1) looh (2) looh (п)

Каждая молекула looh при определенных условиях может послужить началом новой цепи

Fe2+ Fe3+ LH О.

V_S .1 . i

LOOH --► LO' L'-1-» LO^------(3)

OH~ LOH

В этом случае обрыв цепи (в процессе (2)) не играет решающей роли. На наш взгляд, этот факт приобретает особый интерес при рассмотрении механизма действия биоантиоксвдантов и, в частности, механизма действия основного биологического антиоксиданта <х-токоферола (тон).

Общепринятый механизм действия токоферола. Конкретные физико-химические механизмы, лежащие в основе стабилизации токоферолом структурно-функциональных свойств биологических мембран, являются предметом исследования уже не один десяток лет. В настоящее время считается, что токоферол стабилизирует липидный бислой посредством нескольких молекулярных механизмов [Niki гэат, Ерин и соавт.1988]. Функция токоферола состоит в том, что он: а)защищает от перекисно-го окисления липидов; б)стабилизирует лишдный состав и, значит, физическое состояние липидного бислоя; в)защищает от деструкции, вызванной продуктами гидролиза фосфолипидов фосфолипазой А2; г)блокирует повреждающее действие синглетного кислорода. Мы оставляем в стороне две последние функции ТОН (они подробно рассмотрены в обзоре [Ерин и соавт.1988], а будем рассматривать только его антиокислительную активность.

В 1962 г. Тапель [Tappei 1962] предложил следующую реакцию в

качестве основного механизма обрыва цепи а-токоферолом:

lß'2 + тон -- looh + то- (4)

которая впоследствии стала общепринятой. Активный перекисный рада-кал LOj превращается в гидроперекись липида, а радикальное состояние переходит на токоферол. В дальнейшем радикал токоферола может взаимодействовать с другим перекисным радикалом, приводя, таким образом, к обрыву еще одной цепи:

loj + то* -- loo-ot (5)

Вывод о том, что радикал токоферола взаимодействует еще с одним перекисным радикалом возник при исследовании стехиометрии процесса, которое показало, что на уничтожение двух молекул ьо'

расходуется ОДНа Молекула ТОКОферОЛа [Burton,Ingold 1981].

Само взаимодействие lo^ и тон было доказано во многих экспериментах [Tappei,Gruger 1970, Еурлакова и соавт.1975] и не вызывает сомнений. Например, убыль токоферола регистрировали по полосе поглощения при 292 нм, а уменьшение концентрации ьо' -по затуханию интенсивности хемилюминесценции, отражающей скорость рекомбинации этих радикалов. Тем не менее реакция (4) требует более детального изучения. Что касается продуктов этой реакции, то несмотря на то, что с помощью ЭПР было зарегистрировано образование радикалов ТО' [Bascetta et ai.,1983] стехиометрическое соотношение то' к исходному тон неизвестно. Вторым продуктом этой реакции должна быть гидроперекись, однако следует отметить, что образование looh в количестве эквимолярном убыли тон в биологических мембранах (в отличие от гомогенных систем) наблюдать не удается. В частности,

бОЛЬШОЙ Интерес ПреДСТаВЛЯЮТ Данные рабОТЫ [Liebler et al.l986], в

которой изучали перекисное окисление липидов в липосомах, регистрируя одновременно убыль токоферола и потребление кислорода, а также накопление малонового диальдегида (МДА). Оказалось, что в течение определенного периода времени токоферол надежно защищает фосфолипиды липосом от окисления; не наблюдается сколько-нибудь значительного потребления кислорода, которое должно было бы иметь место по общепринятому механизму (4), ни образования МДА. Эти процессы начинались только после израсходования токоферола и, значит, реакция (4) не может быть признана удовлетворительной.

Возможные альтернативы.Предлагаемая гипотеза. В качестве альтернативы рассмотренному выше механизму предлагалось взаимодейст-

вне токоферола с аллильшми (не содержащими кислород) радикалами [Иванов 1984]. Нам представляется, что такое взаимодействие вполне реально, но оно может <3ыть существенным при условии, что концентрация радикалов ь" сопоставима с концентрацией перекисных радикалов. В мембранах такая ситуация,по-видимому, может иметь место, но и тогда предпочтительный выбор между радикалами г/ и ьо'2 должен определяться константами скорости их взаимодействия с молекулой ингибитора. Величины констант скоростей, характеризующих способность токоферола реагировать с радикалами ь', составляет ю5, а с Lo* - ю7 M_1c-1[simic,Hunter 1983], что заставляет нас оценивать взаимодействие ТОН с аллильными радикалами как сравнительно редкое событие. Такое взаимодействие, по-видимому, имеет место при очень низком парциальном давлении кислорода. При реальных значениях концентрации 02 в липосомах и биологических мембранах (константа взаимодействия радикалов l' с О^ равна ю7-ю8 m-1c-:l) концентрация перекисных радикалов превышает концентрацию радикалов I/ и, значит, рассмотрение антиоксидантного эффекта токоферола невозможно без учета взаимодействия ТОН с ьо'.

Рассматривая взаимодействие перекисных радикалов с ТОН, мы должны признать, что такое взаимодействие в гомогенной системе ведет к образованию гидроперекисей [witting 1969]. В то же время, принимая во внимание рассмотренные факты, мы считаем неприемлимым механическое перенесение реакций (4) и (5) из гомогеннной в гетерогенную систему. Отметим также, что электрохимическое изучение oi-токоферола свидетельствует о том, что в присутствии Н20 (в отличие от гомогенной неводаой фазы) окисление ТОН может идти по двух-электронному механизму [Marcus,Hawley 1970]:

+ 2е + Н+

Мы полагаем, что в гетерогенной системе взаимодействие ТОН с пере-кисными радикалами следует рассматривать с других позиций.

Известно, что при взаимодействии гидроперекисей с ионами железа происходит редок-зависимый разрыв о-о связи

ЬООН + Ге2+-► ЬО' + он" +Ге3+

Можно думать, что подобная реакция ( разрыв С-0 связи) происходит при взаимодействии перекисных радикалов с токоферолом

loj + тон .. l" + тон+ + 0~ с последующим восстановлением радикала L'

l" + тон+-- lh + т+0

В целом можно записать несколько наиболее вероятных реакций взаимодействия радикалов Loj с токоферолом;.

looh + то' (4)

1£>2 + тон-/ г то- + 02 (7)

lh + <

1 T+0 + 0~ (8)

Следствием реакций (7) и (8) является разрыв С-0 связи в молекуле жирной кислоты с одновременным восстановлением С-Н связи

тон т0'(т+0)

-сн=сн-сн=сн-сн -^^-- СН+СН-СН2~СН=СН- + 02(0~)

00'

В отличие от реакции (4), где ТОН реализует обрыв цепи с образованием looh, здесь нет образования гидроперекиси. Ясно, что реакция (4) не обеспечивает полное ингибирование процесса перекис-ного окисления, коль скоро есть потребление 02 и накопление looh. Ингибитор, введение которого не останавливает реакцию, а лишь замедляет ее, следует считать слабым. Токоферол, однако, является одним из самых эффективных антиоксидантов и его действие, скорее всего, направлено на возвращение молекулы липида в ее исходное состояние. Такого рода механизм реализуется, в частности, при взаимодействии токоферола с аминокислотными остатками, точнее, с образующимися В НИХ радикалами [Bisby et al.1984].

Некоторые следствия из гипотезы. Из реакции (8) видно, что в процессе взаимодействия ТОН. с перекисными радикалами образуется супероксид. При выборе подходящего способа инициирования (без участия Og) в липосомах, по-видимому, может быть зарегистрировано образование супероксида как результат двухэлектронного окисления токоферола. Конечно, образование супероксидного анион-радикала выглядит несколько неожиданным. Но в реальных биологических системах супероксид, как известно, утилизируется супероксиддисмутазой, которая представляет собой один из факторов, контролирующих

перекисное окисление ЛИПИДОВ [Devasagayam 1986],

Рассматриваемые реакции (7) и (8) восстанавливают молекулу липида в ее исходное состояние и в этом случае перекисное окисление липидов действительно блокировано. Из этих двух реакций реакция (8) энергетически более выгодна.

Глава 2. СТАБИЛИЗАЦИЯ ЛШОСОЖЛЬНЫХ МЕМБРАН ТОКОФЕРОЛОМ ПРИ АКТИВАЦИИ ПОЛ А30ИНИЦИАТ0Р0М. Данная глава посвящена изучению перекисного окисления липидов в липосомах без токоферола и с токоферолом (мольное отношение токоферол / фосфолипид 1/200 ).

На рис.2-1 показано накопление гидроперекисей в липосомах, не содержащих токоферол. Реакцию инициировали добавлением aibn, концентрация которого варьировалась в пределах 0 - 250 мкМ. Образование looh в этом случае происходит практически сразу после добавления к липосомам инициатора и скорость образования гидроперекисей прямо зависит от концентрации инициатора до [aibn]=25o мкМ Накопление гидроперекисей в липосомах, содержащих токоферол показано на рис.2-2. На этом же рисунке показано изменение содержания токоферола, убыль которого происходит в одной или нескольких реакциях взаимодействия токоферола с радикалами lo2. Мы определяли содержание токоферола и одновременно регистрировали гидроперекиси в течение всего индукционного периода. Если реакция (4) является преобладающей, то должно наблюдаться образование looh (если считать, что токоферол перехватывает все радикалы lo') в количестве эквимолярном убыли токоферола. В противном случае образование looh в этот период должно быть небольшим по сравнению с убылью токоферола и возможно появление иных продуктов взаимодействия токоферола с ьо*.

Длительность индукционного периода зависит от концентрации токоферола и для [трн]= 9 мкМ она составляет 80 минут. Индукционный период можно условно разделить надвое (первые 40 минут) и х^ (вторые 40 минут). Токоферол полностью контролирует образование looh в течение периода гг. Количество перекисей, образующихся за 50 мин оказывается равным 1.8 мкМ (рис.2), т.е. в пять раз меньше количества израсходованного токоферола. Таким образом отношение alooh/atoh равно 1:5 и 2':7 для 50 и 60 минут инкубации соответст-

[ЬООН^мкМ

мин

А 55 О-600 пт

МИН

[<А-ТФ],мкМ [Ю0Н],мкМ

мин

Рис.2-1.Образование гидропере-кисей в липосомах в зависимости от концентрации инициатора. Трис-НС1 50 шМ, липосомн 2 мМ I - 250 МкМ А1Ж, 2 - 100 мкМ, 3-50 мкМ, 4 - без АЗЖ

Рис.2-2.Убыль токоферола (I) и образование гидроперекисей (2) в липосомах при рН 8.5.

Рис.2-3.Восстановление цитох-рома с в липосомах при разных условиях инкубации. 1-е токоферолом, 2 - без токоферола, Зи4-1и2+ СОД, 5 - I + инактивированная СОД.

вешо вместо эквимолярного отношения, которое должно иметь место в случае-реакции (4). Заметим, что образование looh в течение индукционного периода (особенно т2) в небольшое количествах неизбежно. Хотя токоферол перехватывает большую часть радикалов ьо', при небольших концентрациях токоферола невозможно достичь 100%-ного перехвата. Наряду с,looh мы регистрировали о~, вероятное появление которого следует из реакции (8).

Согласно реакциям (7) и (8) при взаимодействии токоферола с радикалами lo* может высвобождаться кислород или супероксид. Мы попытались обнаружить супероксид в липосомах, инкубируемых при различных значениях рн, в частности, 5.5,. 7.о и 8.5. На рис.2-3 показано изменение степени восстановленности цитохрома с в липосомах инкубируемых в среде с рН 8.5. Б липосомах не содержащих токоферол наблюдается незначительное восстановление цитохрома с; оно может быть связано с тем, что какое-то количество суяероксида образуется в результате взаимодействия 02 с возбувденными молекулами инициатора. В липосомах, содержащих токоферол восстановление цитохрома с идет с более высокой скоростью и этот процесс прекращается после израсходования токоферола.

Существует как минимум три разных варианта объяснения обнаруженного нами восстановления цитохрома с:

(1) цитохром с восстанавливается в результате прямого взаимодействия с токоферолом;

(2) цитохром с восстанавливается супероксидом, который образуется в результате автоокисления ТОН при щелочных рН;

(3) восстановление цитохрома с связано с образованием супероксида в результате взаимодействия радикалов lo^ с токоферолом.

Восстановление цитохрома с действительно является результатом его взаимодействия с супероксидом; в присутствии супероксидцисму-тазы этот процесс ингибируется полностью. После инактивации фермента ( кипячение sod) он уже не оказывал влияния на восстановление цитохрома с. В работе мы использовали два вида липосом - липосомы из фосфатидилхолина и из азолектина. Липосомы приготовленные из азолектина устойчивы к окислению и при рН=8.5 мы не наблюдали ни убыль токоферола, ни появление супероксида. Это означает, что в отличие от убихинона рН-зависимое автоокисление токоферола (рК 13) может быть исключено из рассмотрения.

Из подученных наш данных видно, что за 40 минут инкубации в липосомах восстанавливается а дМ цитохрома с. Количество образующихся гидроперекисей за этот период можно оценить как дьоон = о, а количество окисленного токоферола ¿тон = б дм. Таким образом, количество регистрируемого супероксида составляет лишь 17-20% от количества окисленного токоферола. Не исключено, что реальный уровень образуемого супероксида гораздо выше, а полученный нами результат занижен из-за днсмутации и окисления цитохрома с перекисью водорода.

Отметим, что способность токоферола к двухэлектронному окислению и вероятность обнаружения о" зависит от рн среды. Нам удалось зарегистрировать образование супероксида в липосомах только при рн 8.5 и уровень супероксида зависел от того в каком растворителе добавляли инициатор (для бутанола заметно выше, чем для этанола). Различие в величинах диэлектрической проницаемости в данном случае незначительно и поэтому эффект растворителя остается неясным. Так например, количество гидроперекисей образующихся в липосомах, не содержащих токоферол, зависело только от концентрации инициатора, а не от используемого растворителя. Но, независимо от количественного результата сам факт образования 0^ и сравнительно низкий уровень looh свидетельствуют о том, что взаимодействие перекисных радикалов с токоферолом в липосомах не ведет к образованию перекисей. Предлагаемый нами механизм можно представить в виде цикла:

Схема 2-1. Циклическое превращение липидных радикалов

Эта схема показывает два возможных пути превращения ъо'2 в биологических мембранах; направление процесса зависит от соотношения скоростей уд и у4. в отсутствии токоферола в мембранах (у3= О) неизбежно образование гидроперекисей и других продуктов перекисно-

го окисления. В присутствии токоферола и аскорбата происходит ингибирование образования looh (v^ > v^). Важно отметить, что рассматриваемый механизм окисления токоферола исключает накопление гидроперекисей и это означает стабилизацию жирнокислотного состава биологических мембран.

Наличие такого.цикла позволяет поддерживать в мембранах определенную концентрацию лшшдных радикалов без риска накопления разрушающих мембрану гидроперекисей. Очевидно, что рассматриваемый процесс окисления наряду с вопросом о молекулярном механизме антиокислительного действия токоферола затрагивает вопросы ионной проводимости мембран и функционирование мембран в целом.

Известно, что во многих случаях функция мембраны напрямую связана с ее фазовым состоянием и температура фазового перехода зависит от степени ненасыщенности углеводородных цепей в фосфоли-пидной молекуле. Важно отметить, что чем больше число двойных связей в углеводородной цепи, тем ниже температура плавления и вместе с тем больше опасность окислительной деградации фосфолипи-дов. Поэтому защищая мембраны от перекисного окисления липидов, такие антиоксиданты, как токоферол, одновременно обеспечивают выполнение мембранами их многочисленных функций в широком диапазоне температур.

Следует отметить, что реакция обрыва цепи (реакция 4) не обеспечивает полное ингибирование процесса перекисного окисления липидов (коль скоро происходит накопление looh). И все же для гомогенной системы она весьма эффективна поскольку прерывает образование большого числа молекул looh (IO^-IO3). В мембранах, где длина цепи, как правило, варьирует в пределах 2-10 эффект антиоксидан-та, если он действует по реакции (4), должен быть на два порядка слабее. Это означает, что любой ингибитор, действующий в мембране по механизму lo* + аон—- looh + ао* может лишь замедлить процесс образования гидроперекисей. Ингибитор, введение которого не останавливает реакцию, а лишь замедляет ее следует считать слабым. Токоферол, однако, является одним из самых эффективных биоантиок-сидантов и мы считаем, что при взаимодействии токоферола с перекисным радикалом происходит не просто обрыв цепи; в процессе такого взаимодействия происходит возвращение структуры углеводородной цепи в ее исходное состояние.

Глава 3. ПРОБЛЕМА СТАБИЛИЗАЦИЯ МИКРОСОМАЛЬНЫХ МЕМБРАН токоферолом ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ЗНАЧЕНИЯХ pH.

Витамин Е, известен как мощный антиоксидант действующий по механизму обрыва цепи. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что антиокислительное действие токоферола в мембранных структурах и липоцротеидах низкой плотности является важнейшим механизмом его биологического действия.

Антиоксидантные свойства токоферола определяются:: х.Наличием но-группы хроманового ядра, способной легко отдавать атом водорода на радикал (величиной 1^). 2. Высокой липофильностыо, которая обеспечивает встраивание токоферола в мембраны. 3. Достаточно высокой подвижностью токоферола в липидном бислое, которая, тем не менее, не столь высока, чтобы оказывать побочное пертурбирущее воздействие на мембраны. Эти свойства обеспечивают взаимодействие токоферола с липидными радикалами в биологических мембранах и его высокую эффективность. Вопрос в том, каков результат такого взаимодействия; действительно ли это просто перенос Н-атома на радикал lo* (образование ьоон) или реакция идет по другому пути.

Нами была высказана гипотеза о том, что в мембранах возможны два типа взаимодействия токоферола с перекисными радикалами [Дмитриев, Верховский 1990].Помимо одноэлектроного окисления токоферола и образования ьоон, в мембранах может иметь место двухэлектронное окисление токоферола и возврат молекулы липида в исходное состояние (замена молекулы кислорода на атом водорода).

-Л

l01-7—► looh (1) [ lo: -—*- [lol ] —lh (2)

2 / [ 2 / 2 /

н атом [ .e н атом

'__r /___/

/----4 [ s-----^--» ,

тон TO* [ тон TO

Схема 3-1. Возможные варианты взаимодействия токоферола с перекисными радикалами

Постулируя реакцию (2) мы исходили из данных, согласно которым окисление токоферола в присутствии Н^О (в отличие от гомогенной неводной фазы) может идти по двухэлектронному механизму.

Очевидно, что ингибирующий эффект токоферола при его взаимо-

действии с радикалами ьо- зависит от того, каков результат такого взаимодействия. Реакция (i) позволяет снизить скорость образования гидроперекисей, но они все же образуются в количестве эквимолярном убыли токоферола. В случае реакции (2) образование looh блокируется полностью. Ранее мы регистрировали образование гидроперекисей, убыль токоферола и образование супероксида в лилосомах, инициируя ПОЛ с помощью азоинициатора и используя в качестве акцептора электронов цитохром с и показали, что:

1.Восстановление цитохрома с происходит вслед за инициированием ПОЛ азоинициатором.

2.Восстановление цитохрома о ингибируется супероксиддисмутазой.

3.Период восстановления цитохрома о совпадает с периодом расходования токоферола.

4.Количество израсходованного токоферола (дтон) и количество гидроперекисей (дьоон), образованных во время индукционного периода не эквимолярны; дьоон « лтон (при отношении токоферол/фосфолипид не менее 1/500).

Эти данные получены при рН=8.5 (но не 7.5) и, значит, реакция

тон т+о

-сн-сн=сн-сн=сн- "N-—-сн=сн-сн,-сн=сн- +■ о" | 2 2

00-

т.е. высвобождение кислорода в форме 0^ имеет место лишь при щелочных значениях рн. Разрыв С-0 связи в молекуле ьо^ происходит, по-видимому, в результате акцептирования электрона точно также как и разрыв 0-0 связи в молекуле looh, катализируемый ионами Fe2+.

В биологических мембранах, на наш взгляд, вполне реальным является вариант, представляющий собой комбинацию описанных выше реакций, а именно.:

.Jt

loj-j- [loj ] - l"—lh

e Jl атом

TOH TO'

Схема 3-2. Редокс превращения перекисных радикалов с двух доноров электрона.

(з)

участием

Хотя в липосомах основной реакцией взаимодействия ьо" с тон при физиологических значениях рН остается реакция (i),в мембранах, инкубируемых при физиологических значениях рН, может быть получено полное блокирование ПОЛ, если стадия восстановления перекисных радикалов, т.е. ьо'—-[Loj]" реализуется с помощью внешнего донора. Если в восстановлении ьо' + в —» [ьо^]~ участвует внешний донор, то тогда при взаимодействии с токоферолом возможен возврат молекулы липида в ее исходное состояние в результате одноэлектронного окисления токоферола (реакция (з)). В конечном счете это означает возможность полного блокирования ПОЛ при физиологических значениях рН, что весьма важно, если учесть, что токоферол и аскорбат при нормальном рН функционируют как доноры н-атома [Njus, Kelley 1991, Liebler,Burr 1992].

Этот вариант может быть реализован в биологических мембранах, если среди редокс компонентов имеется подходящий донор электронов. Основным результатом этой реакции является ослабление и последующий разрыв С-0 связи в молекуле ьо^. Последнее фактически означает изменение отношения концентраций аллильных и перекисных радикалов. Отношение cl']/[Lo'] существенно меняется в пользу [l'j; при таких условиях продуктом реакции взаимодействия токоферола с липидными радикалами является не looh, а исходная молекула lh и 0^. Таким образом, можно предположить, что в ингибировании перекисного окисления мембранных фосфолшщдов участвуют три основных фактора:; неизвестный редокс переносчик, а-токоферол и супероксиддисмутаза.

Изложенное выше имеет прямое отношение к проблеме модификации липопротеидов низкой плотности (ЛНП). Известно, что перекисное окисление лишдов ведет к модификации ЛНП и появлению у них атеро-генных свойств [Steinberg 1989]. На вопрос о месте модификации ЛНП (печень, кровь и артериальная стенка) едва ли можно дать однозначный ответ, поскольку она может начаться в печени и завершиться на конечном этапе транспортировки липопротеидов. В общем случае вспышку ПОЛ следует рассматривать как результат сбоя антиокислительной системы, вызванного тем или иным способом. Следствием этого может быть ряд негативных изменений, в том числе и окислительная модификация ЛНП. Такая первичная модификация ЛНП может быть незначительной, т.е. затрагивать сравнительно небольшую часть фосфолипидов, используемых для образования защитного слоя

липоцротевдов. но, в этом случае среда ЛНП секретируемых в кровь могут оказаться не только нормальные ЛНП, но и липопротеиды у которых нарушена структура защитного слоя.

Необходимым условием формирования и секретирования в кровь немодифицированных липопротеидов является блокирование ПОЛ в печени. Оно предполагает эффективный контроль всех стадий ПОЛ с помощью ангиоксидантов и антиоксидантных ферментов. Что касается исследований, связанных с антиоксидантами и их ролью в атерогенезе то исследование механизма антиокислительного действия токоферола в мембранах эндоплазматического ретикулума печени, включая возможное участие в восстановлении ьо^ таких субстратов как nad(p)h и gsh, представляет несомненный интерес.

Глава 4. СТАБИЛИЗАЦИЯ МИКРОСОМАЛЬНЫХ МЕМБРАН ТОКОФЕРОЛОМ

РОЛЬ ГЛУТАТИОНА.

существует постоянный и все возрастающий интерес к такой проблеме как участие липидов в процессах старения и в возникновении и развитии сопутствующих болезней, таких как болезни сердца и атеросклероз.. При этом особо пристальное внимание, на наш взгляд, заслуживает такое соединение как восстановленный глутатион (gsh). Хотя глутатион часто рассматривают как потенциальный ингибитор перекисного окисления липидов, механизм ингибирующего действия глутатиона во многом остается неясным.

В данной главе рассматривается gsh-зависимый ферментативный механизм ингибирования перекисного окисления липидов, стимулируемого nadph-зависимой системой микросом. Мы регистрировали потребление кислорода и образование малонового диальдегида в микросомах обогащенных токоферолом с целью оценить влияние глутатиона на эффективность ингибирующего действия токоферола. Эффект токоферола может быть реально оценен по длительности индукционного периода, который обычно предшествует образованию МДА.

Перекисное окисление липидов в микросомах. Эффект рН. Встраивание токоферола в микросомы проводили следующим образом: 5 мкл этанольного раствора токоферола (различной концентрации) добавляли к суспензии микросом (содержащей примерно 20 мг белка) и втряхива-ли, 60 или 90 секунд в зависимости от концентрации встраиваемого токоферола с помощью vortex. Исходная концентрация токоферола в выделенных микросомах печени была равна о.4о +о.ов нмоль/мг.белка.

Микросомы щкубировали при t=300C в присутствии ИАОРН при рН 7.5 и 8.5 (рис.4-1). Как видно из рисунка микросомы, инкубируемые при щелочном рН более резистентны к перекисному окислению по сравнению с микросомами, инкубируемыми при нормальном рН. Этот эффект мог бы быть связан со снижением активности каорн-зэвисимого флавопротеида, но активность иы>рн-цитохром с редуктазы остается неизменной. Таким образом токоферол как антиоксидант более эффективен при рН=8.5, чем при рН=7.5, что хорошо согласуется с данными полученными при окислении липосом.

Скорость образования супероксида в биологических мембранах может меняться при изменении рН среды или оставаться неизменной. Регистрация о^-зависимого восстановления нитросинего тетразолия в микросомах показывает, что с увеличением рН от 7.5 до 8.5 скорость процесса возрастает примерно втрое [Мишин и соавт. 1976] Вопрос в том, чем вызван этот эффект; на наш взгляд, он может быть вызван как увеличением времени жизни супероксида (о~ + н^но', рк=4.8), так и другими причинами. В биологических мембранах, инкубируемых при нормальных и особенно при щелочных значениях рН, возможны два пути образования супероксида : 1) за счет переноса электрона от флавопротеида на кислород, 2) в результате двухэлектронного окисления токоферола (реакции ьо'2 + ТОН—-и + Т+0 + о").

С учетом этого мы изучали образование супероксида в микросомах, регистрируя О^-зависимое восстановление НСТ (рис.4-2).Если в системе ксантин - ксантиоксидаза скорость образования супероксида при увеличении рН с 7.5 до 8.5 возрастает в три раза, то в микросомах наблюдается более чем трехкратное увеличение. Такое превышение в генерации может быть связано с тем, что регистрируемый наш супероксид появляется не только при восстановлении кислорода флавопротеидом ( в этом случае при сдвиге рН в щелочную сторону следовало бы ожидать трехкратное увеличение уровня 0^). На наш взгляд, при рН=8.5 существует еще один путь образования 0^, а именно появление супероксида в результате разрыва с-о связи в молекулах жирной кислоты (ьор при их взаимодействии с токоферолом. Перекисное окисление лилидов в микросомах. Эффект сэн.

Эффект глутатиона на перекисное окисление липидов в нативных микросомах и в микросомах, обогащенных токоферолом показан на рис.4-3. Как видно из рисунка глутатион оказывает явный защитный

эффект против ПОЛ в микросомах, содержащих токоферол. В этих экспериментах интенсивность поглощения кислорода и образования ЩА зависела не только от содержания токоферола, но в значительной степени и от содержания глутатиона и аскорбата. Так, например, длительность лаг периода увеличивалась с 6 до 12 мин. (0.2 мМ gsh) и с 6 до 16 мин. (0..5 мМ аскорбата). Важно отметить, что в микросомах, инкубируемых с gsh молярное отношение [02]/[МДА] оставалось неизменным и, следовательно, ингибирование ПОЛ происходило на стадии образования ьоон.

Существует как минимум три разных варианта объяснения защитного действия глутатиона:

1.gsh перехватывает липидные радикалы и (или) супероксид.

2.gsh восстанавливает радикалы токоферола.

3.gsh является субстратом ферментативной реакции.

Роль глутатиона как перехватчика липидных (i/ и lo^) радикалов можно исключить; в противном случае глутатион должен был бы оказывать защитное действие и в липосомах и это действие должно было бы зависеть от концентрации gsh. Что касается взаимодействия gsh с супероксидом, то помимо него существует еще требующий объяснения синергизм gsh с токоферолом [Reddy et al. 1982].

Далее, если бы глутатион подобно аскорбату восстанавливал радикал токоферола, то кооперативное действие этих двух субстратов было бы аддитивным; лаг период в этом случае был бы равен сумме трех величин б + б + ю= 22 мин. Но как видно из рис.4-3 индукционный период в присутствии глутатиона и аскорбата значительно больше и кроме того gsh, как известно, не контролирует статус токоферола в липосомах [Liebler et al. 1986].

В целом, мы считаем, что наблюдаемый наш gsh-зависимый защитный эффект отличается от того, что известно о глутатионе [Reddy

et al.1982, Liebler et al. 1986, Wefers ,Sies 1988, Palamanda,

Kehrer 1992]. На наш взгляд, существут два gsh-зависимых фермента с разными константами Михаэлиса - фосфолипид gsh(looh) пероксидаза [Ursini et ai.i982] и еще один gsh-зависимый фермент.

С учетом этого в микросомах возможны два механизма взаимодействия ' токоферола с перекисными радикалами - неферментативный (неизбежное образование гидроперекисей при взаимодействии с lo') и ферментативный с участием gsh-зависимого фермента (исключающий об-

A535nm 0,25

0,20

0,15

0,10

0,05

/(pH 7,5) 2 (pH 8,5)

0 iO 20 30

мин

/0 4 <y

1 CM

О 3

X О

cd О го О о. Ю О

■О £ о о а О

Г <_>

п \

\ \

Ъй

7.5

8,0

X X X X X X

X ^

X X

X ^

8,5

мин

Рис.4-Г.Кинетика образования МДА в контрольных микросомах (1,3) и в микросомах, обогащенных токоферолом (2,4). Среда инкубации: 0.15 М KCl, 50 мМ Трис-HCl буфер, 5 шМ MgS04, 500 мкМ NADPH Рис.4-2.Скорость образования 0g в растворе, содержащем ксантин-ксантиноксидазу - [X] и в микросомах печени - И Рис.4-3.Кинетика образования ЭДЦА в микросомах печени. I - без токоферола, 2-5 - с токоферолом. 2 - контроль, 3 + глутатион, 4 + аскорбат, 5 + глутатион и аскорбат.

Рис. . Защита мембранных липидов от окисления СБН-зависимым ферментом. На рисунке представлена половина бислоя мембраны, (а) Инициирование процесса ПОЛ первичным радикалом И* - отрыв атома водорода от молекулы жирной кислоты и образование аллильного радикала; (Ь) Присоединение кислорода с образованием перекисного радикала(коньюгированшх диенов); (с) Изменение конформации жирной кислоты (локализация С-00" группы на границе раздела фаз); (й) Перенос электрона на молекулу жирной кислоты (е) Превращение перекисного радикала в исходную молекулу и высвобождение супероксидного анион радикала.

разование looh).

looh

mda

loh

(I)

тон

TO*

ilo'] 2

(И)

Схема 4-1.Два механизма действия токоферола в микросомах.

В отличие от механизма (I) ферментативный механизм (II) означает возможность полного блокирования ПОЛ при физиологических значениях рН, что весьма важно, если учесть, редокс свойства токоферола и аскорбата [Njus, Kelley 1991, Liebler, Burr 1992].

Хотя мы не имеем прямых доказательств, существование нового ферментативного механизма контроля за перекисным окислением липи-дов, который включает в себя не только токоферол, но и глутатион, (как субстрат предполагаемого фермента) кажется весьма вероятным. Скорее всего глутатион участвует в восстановлении перекисных радикалов ферментом gsh(lo') редуктазой( реакция 4). Согласно общей схеме, включающей в себя механизм I и II, взаимодействие токоферола с перекисными радикалами в форме [L°¿]~ ведет не только к возврату липидной молекулы в ее исходное состояние, но и к высвобождению супероксида.

Иначе говоря, при инкубации микросом с gsh (как и в эксперименте с рН=8.5) образование вовсе не ограничивается восстановлением кислорода флавопротеидом. Наиболее интенсивного образования супероксида следует ожидать в микросомах, обогащенных токоферолом, в присутствии gsh как субстрата gsh(lo') редуктазы. Однако, мы не смогли обнаружить предполагаемое увеличение интенсивности образования 0g вследствие реакций (4) и (5) и это обстоятельство вполне объяснимо если учесть факт взаимодействия глутатиона с суперокси-

5 —1 —1

дом (константа второго порядка в этом случае равна 6.7 ю м с

[Asada, Kanematsu 1976]). ТаКИМ образом GSH играет ДВОЯКУЮ РОЛЬ:'

ингибирование образования looh (реакция 4) и удаление супероксида. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах конт-

радируется, как известно, несколькими факторами. Мы полагаем, что в контроле ПОЛ участвуют три основных фактора: gsh(lo¿) редуктаза, ¿-токоферол и аскорбат.

Известно,что заболеваемость сердечно-сосудистыми болезнями в разных регионах различна и это в какой-то мере определяется различиями в потребляемо^ пище и содержанием в печени и липопротеидах НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ липорастворимых антиоксидантов [Gey, Puska 1989]. Так, исследования среди европейцев указывают на наличие обратной связи между смертностью от шемической болезни сердца и содержанием аНТИОКСИДаНТОВ В ПЛаЗМе КРОВИ [Gey et ai.1991]. Основной вклад в формирование этой зависимости вносит токоферол. Уровень токоферола в крови и риск заболеваемости атеросклерозом также имеют Обратную корреляцию [Gey et al.1987].

Представленные здесь данные свидетельствуют о том, что токоферол особенно эффективен в том случае, когда он действует вместе с gsh-зависимым ферментом. Мы пока еще не имеем данных о наличии корреляции между возникновением и развитием какой -либо патологии и активностью фермента gsh(lo2) редуктазы. В то же время очевидно, что изучение всех аспектов, связанных со статусом ЛНП и особенно выяснение вероятной зависимости модификации ЛНП в печени in vivo от активности обоих gsh-зэвисимых ферментов могло бы существенно расширить наши знания о биохимических аспектах атерогенеза. МЫ не исключаем и существование изоферментов (ьо')редуктазы, использующих разные субстраты, например, gsh(lo')редуктазы (мембраны микро-сом печени) и nadh(lo¿)редуктазы (мембраны эритроцитов).

На важную роль антиоксидантов указывают экспериментальные данные, полученные Вильсоном и соавт. [Wilson et ai.1972-74]. Используя холин-дефицитную даету авторы вызывали вспышку ПОЛ в гомогенате печени. Дефицит холина тормозит синтез фосфолипидов и приводит к увеличению содержания триглицеридов (что равносильно усилению прооксидативного фактора). На фоне такой вспышки у крыс в короткое время развивался атеросклероз. Многократные исследования свидетельствуют о том, что атеросклероз развивается не у всех, а примерно у 60* животных. Добавление в пищу антиоксиданта ионола при холин-дефицитной диете приводило к увеличению антиокислительной активности печени, что позволяло не только блокировать ПОЛ в гомогенате, но и предотвращало развитие атеросклероза.

зо

Основной вопрос, который возникает при анализе этих данных заключается в том, почему при одинаковом воздействии на систему ПОЛ атеросклероз развивался у 60% животных и не развивался у остальных 40%. В настоящее время на этот вопрос нет определенного ответа. Однако, согласно нашим данным, наряду с хорошо известными антиоксидантными ферментами - супероксиддисмутазой и глутатионпе-роксидазой мы можем включить в рассмотрение еще один фермент, действующий в паре с токоферолом, а именно фермент gsh(lo~2;редуктазу. Учитывая это обстоятельство, группу животных использованных в эксперименте Вильсона можно было бы разделить на две подгруппы - с высокой активностью (у 40%) и с низкой активностью сяясгл^редук-тазы (у 60%). Низкая активность этого фермента предопределила слабую эффективность токоферола и единственной защитой против вспышки ПОЛ в этом случае было применение искусственного антиоксиданта. В экспериментах Вильсона в качестве такого антиоксиданта использовался ионол. Конечно предлагаемое объяснение это только предположение, которое требует самой серьезной экспериментальной проверки.

Глава 5. ПРЕОБРАЗОВАНИЕ ЭНЕРГИИ В МИТОХОНДРИЯХ.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ.

В разное время в журнале "Nature" были опубликованы три статьи, авторы которых определили новое направление в биохимии, называемое биоэнергетика [Engelgardt 1939, Slater 1953, Mitchell 1961]. В одной из них была сформулирована химическая концепция энергетического сопряжения [slater 1953]. В основе ее лежит предположение о том, что цреобразовэние энергии, освобождающейся при электронном переносе, заключается в образовании макроэргического соединения, содержащего один из компонентов редоке реакции и низкомолекулярный лиганд. Концепция мембранного фосфорилирования, сформулированная Слэйтером, по-существу мало чем отличалась от объяснения субстратного фосфорилирования. Окислительное фосфорили-рование отличается от субстратного фосфорилирования пожалуй тем, что в последнем случае окисленный субстрат превращается в конечный продукт и выводится из клетки, а окислительное фосфоршшрова-ние сопряжено с циклическим редокс превращением функциональной группы фермента (кофермента). Иными словами, в митохондриях химической реакцией, идущей с понижением энергии, является перенос

электрона между фиксированными соседними компонентами редокс-цепи, т.е. для образования макроэрга используется редокс переход.

Вопрос об образовании первичного макроэрга был основной проблемой, неизбежно возникавшей при рассмотрении механизма окислительного фосфорилирования на протяжении многих лет (до появления гипотезы Митчела [Mitchell i96i] и осознания роли мембраны). Сейчас представляется маловероятным, что интермедиа! окислительного фосфорилирования может быть идентифицирован как растворимое соединение. Уже нет сомнения в том, что фосфолипидная мембрана - это необходимый элемент сопрягающего устройства, однако ее роль все еще остается неясной. Либо это просто липидный матрикс и мембрана играет пассивную роль(модель Митчела), либо она представляет собой "активную среду", удаленную во время функционирования от состояния термодинамического равновесия. В последнем случае возможен поиск мембранного интермедиата, что делает более вероятной адаптацию химической концепции к мембранному фосфорилированию.

При этом следует иметь в виду, что в настоящее время гипотеза Митчела, согласно которой Дмн+ является единственным энергетическим посредником при синтезе атр, принимается большинством исследователей /Скулачев 19897. Удалось получить сщтез атр за счет искусственно созданной Ддн+. Опыты были поставлены, в частности, на субмитохондриальных частицах(СМЧ) в условиях, когда на мембране этих частиц создавали как Дрн, так и диффузионный потенциал ионов К+ (Thayer, Hinkie 1975;. Результатом развития экспериментальных подходов, позволяющих регистрировать постулированную Митчелом дин+ (обе ее составлкщие), явилось снижение интереса к поиску первичных макроэргов, предшествующих атр. Однако, начиная с середины 80 г. вопрос о том, существует ли прямая связь между функционированием редокс цепи и работой дтр-синтазы дискутируется вновь [Дмитриев 1986, Slater 1987].

Элементарный акт синтеза атр.

Напомним, что в 1966 г. Ягендорф и Юрайб показали, что создание искусственного градиента рн на мембране хлоропластов (быстрое изменение рН ОТ 4 ДО 8) ПРИВОДИТ К синтезу ATP [Jagendorf, Urlbe 1966J. Выяснилось также, что синтез атр как в хлоропластах, так и в митохондриях можно получить при однонаправленном изменении рн ¿Маленкова и соавт. л980;. Объяснение этому явлению было дано

Блюменфельдом, который постулировал,что освобождение атр из активного центра фермента связано с депротонированием определенных груш в комплексе г1(сг1; и, следовательно, элементарный акт синтеза атр может быть представлен следующим образом*.

г^хн* )[аор,нро^~ р±(хн+)[атр,он~] (1)

у1(хн*)[атр,он~] ---+ атр + нго (2)

При инкубации хлоропластов и митохондрий в среде при рн 4 (или 5) группы х комплекса протонированы и в этих условиях имеет

место обратимая фосфорилазная реакция (1). При скачкообразном изменении рн с исходного значения до рн 8 происходит депротониро-вание х-групп, т.е. реакция (2).

В хлоропластах при скачкообразном изменении ря синтезируется около 100 молекул атр на один комплекс Сг1, а в митохондриях 2-3 молекулы атр на гг Для хлоропластов образование такого количества молекул атр не удивительно. Однократное фосфорилирование за счет скачка рн происходит снаружи мембраны, где локализован Сг1, а многократное - за счет градиента рн, точнее градиентов д1 и д2, составляющих в сумме дрн:

Д1= РНОиС~ РК<Х> и V РК<Х>~ РН1п В митохондриях следовало бы ожидать образование лишь одной молекулы атр на реально же наблюдается образование 2-3 молекул. На наш взгляд, это можно объяснить следующим образом. Для того, чтобы реакция (2) могла быть реализована однократно, достаточно создать значение ря внутри митохондрий более высокое, чем рк х-групп. Для каздого последующего акта фосфорилирования вслед за реакцией (2) должно обязательно следовать протонирование

+ Н+— Р2(ХН*) (3)

Мы уже отмечали, что исходное значение рн внутри митохондрий и снаружи равно 5. При скачке рн происходит мгновенное увеличение рн снаружи, но не внутри митохондрий, где локализован Очевидно, что однократное фосфорилирование является результатом повышения рн (оно происходит в присутствии протонофора) внутри митохондрий, точнее в примембранном слое. Что касается многократного фосфорилирования, то оно может быть следствием колебаний рн в области локализации ^ в результате двух процессов: выброса протонов через мембрану молекулами протонофора (увеличение ря) и одновременного притока протонов из объема матрикса в цримембранную область (сни-

ясеше ря). Таким образом, совокупность реакций (i)-(3) отражает элементарный акт синтеза атр.

Попытка синтезировать атр в митохондриях, изменяя величину ря в противоположном направлении - от щелочного значения к кислому описана в единственной работе Митчела и сотр. [Reid et ai i966]\ количество ATP, улученного в митоходриях было в 5 раз меньше, чем в аналогичных эксперментах с СМЧ. Здесь, по-видимому, имеют значение размеры везикул и ориентация АТР-азного комплекса; ориентации комплексов f2 в мембранах СМЧ и мембранах митохондрий, как известно, различны. Данные Блюменфельда и сотр. говорят о том, что. можно получить синтез АТР в митохондриях, изменяя величину ря в любом направлении - не только от щелочного значения к кислому, но и от кислого к щелочному (в обоих случаях происходит активация АТР-син-тазы). Количество молекул АТР на комплекс fx в том и другом случае невелико и оно определяется величиной времени релаксации комплекса из активного в неактивное состояние. Вопрос в том имеет ли это отношение к механизму сопряжения окисления и фосфорилирования.

Особенности синтеза атр в митохондриях.

В митохондриях, как известно, локализованы три редокс-комп-лекса - три протонных насоса, которые включены в протонный цикл паралллельно, а относительно потока электронов - последовательно. Что касается синтеза атр, то остается не ясным способ контроля Атр-синтазы со стороны редоке цепи. При анализе механизма преобразования энергии необходимо иметь в виду некоторые факты, которые до сих пор не принимались во внимание. Во-первых, все три пункта дыхательной цепи, в которых идет фосфорилирование ¿dp, близки к равновесию и это важно для оценки эффективности переноса энергии. Близкие к равновесию реакции могут обеспечивать почти 100<—ную эффективность. Во-вторых, известно, что работа протонных насосов позволяет создать запас энергии в форме Ддя+. Хотя этот факт не вызывает сомнений, он не может служить доказательством основного постулата Митчела, пока отсутствуют данные в пользу того, что с образованием ддя+ связано превращение всей свободной энергии в эту форму. (Если окажется, что в форме Дин+ запасается только часть энергии, то это будет означать возможность запасания энергии в иной форме). Наконец, как отмечалось выше, создание на мембране митохондрий йцн+ требуемой величины и знака приводит к незначите-

льному синтезу атр (в отличие от СМЧ), хотя получить хорошо сопряженные митохондрии гораздо легче, чем хорошо сопряженные СМЧ.

Мы считаем, что эти факты могут найти объяснение, если предположить для комплекса существование двух конформационных состояний. Допустим, что в мембранах митохондрий возможны два состояния s1 и s2. Предположим далее, что в результате редокс-перехода имеет место кратковременный переход комплекса fqf1 из основного состояния Sj в состояние Sg, в результате чего происходит значительное снижение порогового значения лгр-азного комплекса (например, до 150 мВ). В этом случае синтез атр можно рассматривать как результат прямого сопряжения между редокс- и лтр-азным комплексами. Ясно, что функционирование протонного цикла (утилизация Адн+) будет зависеть от внутримембранного переноса энергии. Очевидно также, что в этой модели возможны разные способы разобщения - падение лии+(uncoupling) и блокирование внутримембранного переноса энергии. Первый из них может быть реализован как в условиях электронного транспорта, так и искусственно созданной дия+. Второй способ разобщения может быть реализован только на нативных митохондриях в условиях окислительного фосфэрилирования.

В настоящее время мы имеем достаточно оснований для того, чтобы предположить существование двух потоков энергии: потока энергии через Дин+ и внутримембранного потока энергии. В пользу этого свидетельствуют данные Роттенберга [Rottenberg л983]. Исследуя влияние общих анестетиков на окислительное фэсфэрилирование Роттенберг показал, что анестетики не влияют на величину но

в зависимости от концентрации ингибируют синтез атр полностью или частично. Поскольку анестетики не снижали Атр-азную активность, Ротенберг предположил, что их действие связано с блокированием внутримембранного переноса энергии.

Предположение об одновременном существовании протондвижущей силы и запасании энергии окисления в форме, отличной от Дмн+, требует количественной оценки обоих потоков энергии. Поток энергии через лин+сagh+ > определяется, как известно, количеством протонов, транслоцируемых через мембрану [Mitchell, Moyie i$69] и зависит от отношения н+/о. Стехиометрия двух штоков также будет зависеть от этого отношения. При окислении сукцината "потери" энергии (ag) составляют

Лв= 4.18( - К-Адн+-Г.Н+/0 ) КДж/МОЛЬ

где г число Фарадея, коэффициент 1 учитывает тот факт, что 4/ин+ в состоянии 3 меньше, чем в состоянии 4 . Если подставить в эту формулу значение ¿6^^=40 ккал/моль, к=0.70 и ддн+=0.25 в, то получим ас= о лишь при отношении н+уо=ю. Коэффициент н+/о, рассчитанный для сукцината равен 6-8 [ьеьыпдег ее а1.1975], но эта величина получена для состояния 4 и представляет собой (н+/ог .

эЕ

Если учесть существование в состоянии 3 локального градиента н , то значение н+/о, используемое при расчете л<зн+, не будет превышать 4-6. Это значит что дсн+ = 1/2 ¿сох1(1. Отсюда следует, что сопрягащее устройство имеет КПД 50*-, либо существует второй поток энергии (близкие к равновесию реакции могут обеспечивать почти 100*--ную эффективность). Тогда энергия, высвобождающаяся при окислении представляет собой сушу дс?ох1с1= До1гЛ+ Асн+-

Роль липидов в преобразовании энергии.

Существует еще один аспект проблемы - это особая роль кислорода в процессе сопряжения. Это следует из серии опытов проводимых в присутствии ингибитора цитохромоксидазы - цианида гКондрашова, Миронова 1971]. В работе регистрировали скорость переноса электронов в митохондриях при разных условиях инкубации и в качестве конечного акцептора использовали феррицианид. Восстановление фер-рицианида регистрировали в аэробных и анаэробных условиях. Переход из состояния 4 в фосфорилирущее состояние 3, регистрируемый по изменению скорости восстановления феррицианида, реализуется только в аэробных условиях.

Таким образом, митохондрии способны использовать ддн+ для синтеза атр лишь в присутствии кислорода. Иными словами, кислород необходим даже в том случае, когда он как конечный акцептор заменен на феррицианид. Эти данные указывают на то, что в норме кислород может выполнять не одну, а две функции; феррицианид же, выступая в качестве конечного акцептора способен лишь обеспечить создание на мембране дуин+. Утилизация Ддя+ дтр-синтазой (т.е. протонный цикл) реализуется, если имеет место внутримембранный перенос энергии, который обеспечивает кратковременный переход лтр-азы в состояние в2.

В 1950х годах большое внимание привлекала гипотеза об участии токоферола в сопряжении окисления и фосфорилирования [вотпап.

slater 1957]. После того, как удалось получить синтез лтр за счет искусственно созданной Ддя+ интерес к поиску интермедиата сопряжения и к идее участия токоферола в процессе сопряжения заметно упал. Полученные наш данные о взаимодействии токоферола с пере-кисными радикалами поволяют вновь вернуться к этой проблеме. Мы считаем, что образование радикальных состояний в митохондриях связано с циклическими превращениями липидов;

lh l'

redox chain

LOOH ——— LOH (I)

mda

(П)

°г окисление

sh групп

Схема 5-i. Циклические превращения липидов в митохондриях.

Особенность этой схемы в том, что здесь имеет место восстановление перекисных радикалов w2 редокс цепью с последующим взаимодействием ru^f с токоферолом. Указанные превращения липидов (lh—-и—~vo'z—~ [lo'2]~-—-lh) должны сопровождаться изменением конформации углеводородной цепи в мембране. Известно, что основным фактором, влияющим на структуру бислоя, является нарушение равновесия сил электростатического отталкивания заряженных групп молекул фосфолипида и ван-дер-ваальсовского притяжения углеводородных цепочек молекул в гидрофобном объеме бислоя /"Бадалян, Шагинян 1988J. Нарушение указанного равновесия сил должно привести к локальному изменению структуры бислоя - его плотности и толщины. В нашем случае речь идет о кратковременном (редокс-зависимом) нарушении, следствием чего может быть кратковременное локальное сжатие мембраны. В итоге происходит изменение состояния комплекса f0f1 и перенос н+ через канал fq на f2.

Гипотеза Митчела нашла надежное подтверждение в работах Гра-бера С АТР-азОЙ, встроенной В ЛИПОСОМЫ [Schmidt, Graber 1987]. Хотя, следует отметить, что в таких экспериментах заведомо исключается любая иная модель, не предполагающая преодоление энергетического барьера за счет Ддн+. Кроме того, результаты полученные на СМЧ не всегда могут быть безоговорочно перенесены на митохондрии

ввиду разных размеров везикул и разной ориентации комплекса f1 . Работы Грабера /craber, Junesch i984; представляют интерес в связи с тем, что в них рассматривается термодинамический аспект активации дгр-азного комплекса. Существенным достоинством этих работ является создание на мембранах любой заданной величины Ддя+. Считается, что скорость синтеза лтр в этом случае пропорциональна величинам

Еа

VATP--(Ьри^ф) .WATp (hpH, W)

где Eg/Ej - доля активных лгр-аз, vatp- скорость синтеза лтр на ферменте.

Опыты на СМЧ с искусственно созданным ддя+ действительно позволяют получить синтез АТР и здесь важно отметить роль скачка Ддн+. Это факт, которому до сих пор не уделялось должного внимания. На наш взгляд, при таком скачке на мембранах СМЧ как раз и создается импульс электрического потенциала dip Ait, что обеспечивает перевод АТР-азы из состояния s1 в состояние s^. Что касается сопряжения окисления и фосфорилирования в митохондриях в обычных условиях, то генерация импульсов (аф/dt) может быть результатом рассмотренного выше локального сжатия мембраны. Скорость синтеза лтр на активном центре FqF^atp- азы контролируется не только про-тондвижущей СИЛОЙ, НО И редокс-цепыо [Perez, Ferguson 1990}, ЧТО хорошо согласуется с моделью утилизации ¿ин+ в ходе образования интермедиата. Тогда в отличие от формулы Грабера, имеем

v Еа

vATPx—a (dip/dt) ' WAjp(ЬрН, Ьф) Е.

где доля активных АТР-аз определяется производной бф/dt.

Согласно Мягчелу, в случае фосфорилирования, связанного с переносом электронов, окислительный (или дыхательный контроль) осуществляется с помощью градиента рн и мембранного потенциала. В пользу этой концепции говорят результаты опытов с реконструированными системами; дыхательный контроль снимается только в том случае, когда такие соединения как нигерицин и валиномицин, снимающие йрн и мембранный потенциал, вводятся одновременно. Особенность предлагаемого механизма сопряжения состоит в наличии прямого и обратного контроля; с одной стороны интермедиат контролирует утили-

зе

зацию протонов атр- синтазой, т.е. потребление а с другой -

контролирует работу дыхательной цепи и потребление субстрата (дыхательный контроль). В мембранах митохондрий протондвижущая сила используется для образования атр и обеспечивает дыхание до тех пор, пока есть алр и р} и действует липидный цикл. В этом случае можно говорить о существовании в мембранах митохондрий более сложной, но и более надежной модели, чем модель Митчела. Подтверждением функциональной роли липидов могут служить данные, согласно которым для окислительного фосфорилирования необходимы у -линоленовая и архидоновая КИСЛОТЫ [РгоисЛоск еЬ а1.1969].

Такая динамическая модель обладает рядом преимуществ. Сюда можно отнести определенную устойчивость к действию фосфолипаз, протеаз и разобщающему действию жирных кислот. В такой модели маловероятно появление футильного цикла, . т.е. опасного для энергетики состояния, в котором скорость синтеза атр и скорость гидролиза атр в матриксе равны. Кроме того, такая система очень хорошо дополняет гликолиз, где обеспечивается режим автоколебаний, являющийся, по-видимому, единственно возможной формой длительного существования энергетического метаболизма.

Глава 6. СВЯЗЬ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ С ПЕРЕКИСНЫМ

ОКИСЛЕНИЕМ ЛИПИДОВ.

В данной главе представлены результаты экспериментов госвя-

щенных изучению влияния антиоксиданта пропилгаллата и ионов ге , стимулирующих образование липидных радикалов, на перекисное окисление липидов и окислительное фосфорилирование, а также возможную взаимосвязь этих двух процессов.

На первом этапе работы изучалось образование малонового ди-альдегида(МДА) в фосфорилирующих и нефосфорилирующих митохондриях. На рис.6-1 показаны спектры комплекса с тиобарбитуровой кислотой (ТЕК); из приведенных данных видно, что в присутствии сахарозы регистрировать образование комплекса МДА-ТБК (д= 535 нм) не удается. Однако, при замене сахарозы маннитом можно с высокой точностью определять концентрацию МДА (менее 1 нмоль в пробе), образующегося в интактных митохондриях, когда процесс перекисного окисления липидов зависит лишь от работы дыхательной цепи.

Учитывая это обстоятельство, мы изучали образование МДА в ми-

тохондриях в состояниях 4 и 3 (по Чансу). Как и следовало ожидать, в состоянии 4 в присутствии ИОНОВ Ге (рис.6-2, кривая 1) скорость перекисного окисления липидов значительно вше, чем без ионов железа (кривая 2). В то же время в состоянии 3 перекисное окисление ингибируется (кривая 3) так, как если бы к митохондриям добавили антиоксидант. Заметим, что эффект вызываемый аюр связан с процессом фосфэрилирования, поскольку разобщитель снимает ингибирувдее действие лир на перекисное окисление липидов. В присутствии разобщителя ( ю~7и асср) МДА образуется с той же скоростью, как и в контроле (кривая 4).

Одной из вероятных причин такого ингибирующего эффекта может

быть конкуренция за липидные радикалы:

образование интермедиата, ",то"твующего в синтезе атр

Это означает, что помимо образования гидроперекисей есть еще одна реакция утилизации радикалов w2, тесно связанная с фосфэрилирова-нием. Поэтому на следующем этапе работы нами было изучено влияние одного из перехватчиков радикалов - пропилгаллата - на дыхание митохондрий, фосформирование и на мембранный потенциал (рис.6-3 и рис.6-4). Из рис.6-3 видно, что пропилгаллат усиливает дыхание митохондрий в состоянии 4 и не влияет на скорость дыхания в состоянии 3. Кроме того, он ингибирует синтез АТР, но не влияет на величину йГ (рис.6-4). Снижение интенсивности фосфорилирования прямо зависит от концентрации пропилгаллата, снижающего концентрацию липидных радикалов lo~2 и, значит, уровень интермедиата [lo'z]7 Из этих данных следует, что образование на внутренней мембране митохондрий является необходимым, но не достаточным условием синтеза АТР и "сбрасывание" потенциала - отнюдь не единственный способ разобщения окисления и фосфорилирования.

Если скорость синтеза АТР в митохондриях действительно зависит от концентрации интермедиата [lo'2j~, то концентрация интермедиата должна поддерживаться на определенном уровне и ее снижение должно неизбежно приводить к ингибированию синтеза АТР. Предложенная ниже схема отражает разные способа разобщения окисления и

won-- иДА

(перекисное окисление липидов)

600НИ

8 мин

100 150 200 [ПГ], мкМ

Рис.6-1.Регистрация комплекса МДА с ТБК в митохондриях, инкубируемых в среде с сахарозой (I) и маннитом (2). Рис.6-2,Кинетика образования МДА в митохондриях.

1 -с Ре , 2 - бэз ионов Fec

3 - в присутствии 1 mM ADP

4 - после добавления С1-ССР Среда инкубации: 0.25 М мвннит 15 мМ KCl, 30 тМ фосфат, pH 7.4 2.5 гаМ MgS04, 0.2 мМ ВДТА

2 мкМ ротенон, белок 2 мг/мл. Рис.6-3.Влияние пропилгаллата на скорость потребления Og.

1 - в присутствии С1-ССР

2 и 3 - дыхание в состоянии 3 и 4 соответственно.

АТФ нмоль

мин мг белка 200 V

150 -

100

50 -

дЧС m V 200

150

100

100 150 200 [П Г], мкМ

10 100

сукцинат

( £ мин

> £

200

—I_I_i_

20 ЬО

[Fe2+] , мкМ

Рис.6-4.Влияние пропилгаллата на скорость синтеза ATP (I) и мембранный потенциал (2).

Рис.6-5.Влияние пропилгаллата

на длительность фосфорилирова-

ния (т) в митохондриях.

I - без ПГ, 2 - 100 мкМ ПГ и

3 - 200 мкМ ПГ.

сукцинат 5 мМ, ADP 0.4 мМ

Рис.6-6.Зависимость скорости фосфорилирования (1/а) в митохондриях, инкубируемых с ПГ (100 мкМ) от концентрации Ре2+

фосфорилирования (pgoh - пропилгаллат, тон - токоферол).

02 pgoh pgo'

LOOH--МОЛ

redox I ТОН ТО• PGO' -—^ chains

dlnit rophenol

looh

схема 6-i.Разобщающее действие пропилгаллата и динитрофенола. Здесь показаны два способа разобщения - uncoupling I (протежирование 1Ю'2Г—-LOOH и "сбрасывание" потенциала динитрофенолом и др. протонофорами) и uncoupling II (снижение концентрации ьо~2 про-пилгаллатом и др. искусственными антиоксидантами). Помимо этого существует третий способ разобщения, описанный Ротенбергом. Такое разобщение (decoupling) наблюдается при действии общих анестетиков (хлороформ и др.); они изменяют вязкость мембраны, что делает невозможным локальное сжатие мембраны. Заметим, что открытый нами способ разобщения - uncoupling II - является обратимым.

Эффективность синтеза АТР можно оценить различными способами, например, измеряя концентрацию АТР или контролируя мембранный потенциал. Изменение величины потенциала в митохондриях после добавления adp показано на рис.6-5. Длительность фосфорилирования (т) в нативных митохондриях определяется концентрацией adp. Из рисунка видно, что в нативных митохондриях (дыхательный контроль 4) при добавлении 0.4 мМ adp длительность т = 4 мин. В митохондриях, инкубируемых с пропилгаллатом, длительность фосфорилирования возрастает и составляет уже 7 минут, т.е. синтез АТР идет с меньшей скоростью, чем в контроле. Известно, что антиоксиданты осуществляют перехват аллильных ( не содержащих кислород) и перекисных радикалов, снижая тем самым концентрацию последних. Из полученных нами данных можно сделать вывод, что ловушки липидных радикалов ( если они присутствуют в митохондриях в избытке) являются одновременно антиоксидантами и ингибиторами окислительного фосфорилирования.

В следующем эксперименте в среду инкубации наряду с ловушкой радикалов добавляли ионы ге2"1", стимулирующие образование липидных

радикалов. Как видно из рис.6-6, увеличение концентрации ионов Fe2+ ведет к увеличению скорости фосфорилирования почти до исходного уровня (с 60 до 90%; за lOO*- принято значение а/т, соответствующее т = 4 мин.). Максимум соответствует некоторой оптимальной концентрации ионов ге2+. При дальнейшем увеличении концентрации Fe2+ скорость фосфорилирования снижается.

Полученные данные, в частности, ингибируюцее действие фосфорилирования на перекисное окисление липидов , а также зависимость интенсивности фосфорилирования от концентрации ионов указывают на участие липидных радикалов в процессе фосфорилирования.. Если это так, то снижение скорости синтеза АТР слева и справа от максимума (рис.6-6) можно объяснить двумя причинами^ слева - дефицитом радикалов, справа - избытком радикалов ж2 и образованием looh. Образование looh, как известно, приводит к структурным нарушениям в мембране. Существование ьо^-зависимого механизма преобразования энергии указывает на гибкий способ регуляции синтеза АТР за счет поддержания определенного уровня липидных радикалов.

Глава 7. СОПРЯЖЕНИЕ ОКИСЛЕНИЯ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ.

ДВОЯКАЯ РОЛЬ КИСЛОРОДА-

Известно, что можно блокировать цитохромоксидазу цианидом, а кислород как конечный акцептор заменить на феррицианид [Estabrook i96ij Кондрашова, Миронова i97ij. Перенос электронов на феррициа-нид (ФЦ) приводит к образованию на мембране Ддн+, а при добавлении adp происходит ускорение переноса электронов на ФЦ и синтез АТР. Важно отметить, что переход из состояния 4 (-adp) в состояние 3 с+adp), регистрируемый по восстановлению ФЦ, наблюдается только в аэробных условиях и отсутствует в анаэробных. В связи с этим возникает вопрос о роли 02 в сопряжении окисления и фосфорилирования и, в частности, требуется тщательное изучение различных способов разобщения окисления и фосфорилирования при ¿дн+=соп%.

Полученные ранее данные,касающиеся скорости переноса электронов в цепи nadh—-ФЦ /"Кондрашова, Миронова i97i] дают интересную, хотя и не совсем полную информацию об окислительном фосфорилирова-нии и роли кислорода в этом процессе. Поэтому наряду с измерением скорости восстановления K3Fe(CN)6 мы измеряли мембранный потенциал и количество АТР. Полученные нами данные суммированы в таблице I.

Скорости переноса электронов в цепи мллн—-ФЦ , величины дф, клтр и р/2е, полученные при инкубации в аэробных и анаэробных условиях.

условия ~ то д + у Р/2е

инкубации е ^ АТР

-АОР +АЭР Д0 ДрН

аэробные 34 132 4 170+5 не 120 1.8

измеряли

анаэробные 34 34 1 170+5 о

Уе и удтр нмоль/мин.мг белка,д^ -мвольт, ДК-"дыхательный" контроль

определяемый как отношение скоростей переноса электронов на ФЦ.

Из данных, приведенных в таблице следует, что митохондрии способны использовать ддн+ для синтеза АТР лишь при работе редокс-цепи в аэробных условиях. Эти данные свидетельствуют о том, что в норме кислород, по-видимому, выполняет не одну, а две функции; феррициа-нид же, заменяя кислород в качестве конечного акцептора, обеспечивает лишь создание на мембране Дин+. но не обеспечивает функционирование протонного цикла, т.е. синтез атр.

Вполне вероятно, что помимо роли терминального акцептора кислород выполняет и другую функцию, а именно образование супероксидного анион-радикала о~ (HOj>), способного инициировать образование радикального состояния в молекуле полиненасыщенной жирной кислоты. Многоступенчатый процесс образования в липидах аллильных(ьн—I/) и перекисных радикалов (1/—~ LOp может быть прерван ловушками липидных радикалов - антиоксидантами. В частности, содержащийся в мембране цепи убихинон (убихинол) взаимодействует с аллильными радикалами 1/+ qh2 — lh + qh" и, значит, убихинон может контролировать уровень радикалов W^.

Мы изучали влияние на дыхание и фосфорилирование двух ингибиторов - малоната и kcn; регистрировали потребление кислорода и скорость синтеза АТР. Оказалось, что в присутствии kcn скорость фосфорилирования снижается в большей степени, чем скорость дыхания в состоянии 3. Например, снижению скорости дыхания в 4 раза соответствует снижение скорости фосфорилирования в 7 раз. Это означает падение Р/0 (рис.7-1). Согласно [Tahaynagi et ai.i9eo],при использовании kcn в СМЧ вместе со снижением скорости переноса электронов на кислород изменяется степень восстановленности убихинона. То же

V(02), нмоль/мин

мин

Рис.7-1.Эффективность фосфори-лирования (P/0) ЕБ и степень восстановленное™ убихинона В при инкубации митохондрий с KCN (0,50,100,150 мкМ).

Рис.7-2.Ингибирование синтеза АТР в митохондриях печени после включения УФ-света(генерация 0^) I - без NADPH, 2 - I мМ NADPH, 3 - 2 мМ NADPH, 4 - NADPH и СОД

Рис.7-3.Изменение скорости синтеза АТР в митохондриях после включения УФ-света (генерация супероксида) и эффект СОД. I - без ПГ, 2 - 120 мкМ ПГ

самое происходит и в митохондриях; отношение qh2/(qh2+q), измеренное нами в состоянии 4 возрастает с 0.55 (+0.05) до 0.9 (рис.7-1). Снижение Р/0 может быть обусловлено ростом степени восстановленно-сти убихинона. Отметим, что при снижении скорости дыхания малона-том коэффициент Р/0 остается постоянным, так же как и отношение qh2/(qh2+q)', данные не приведены (они совпадают с данными работы

[Kramer, Pearlstein 1983]).

Подтверждением того, что контроль окислительного фосфорилиро-вания убихиноном связан с его антиоксидантными свойствами, могли бы служить данные по влиянию на окислительное фосфорилирование экзогенных антиоксидантов. В таблице 2 представлены данные о влиянии ПГ на потребление кислорода в состояниях 3 и 4, на фосфорилирование и мембранный потенциал.

Скорости переноса электронов в цепи сукцинат —~о2, величины дф, vatp И р/° П0ЛУченные при инкубации с пропилгаллатом и без него

УСЛОВИЯ V(°2> № AttH+ VATP Р/°

инкубации _ADP +ADP_ ^ Дрн _

без ПГ 8 40 5 175+5 не 145 1.8

измеряли

100 МКМ ПГ 20 40 2 175+5 72 0.9

200 МКМ ПГ 40 40 1 170+5 15

v(o2) и vATp нмоль/мин.мг белка.ду -мвольт.ДК-дыхательный контроль

Видно, что окислительное фосфорилирование ингибируется частично или полностью в зависимости от концентрации ПГ. Следует отметить, что наличие ПГ не приводит к падению потенциала как это имеет место при действии цротонофоров и здесь нет снижения потребления о2 в состоянии 3 как при действии ингибиторов АТР-азы. Следовательно, ПГ - это разобщитель, действующий по механизму uncoupling II

Мы полагаем, что разобщающее действие пропилгаллата связано с созданием дефицита радикалов lO£ и в этом случае синтез АТР можно стимулировать вновь, используя один из способов генерации супероксида. Супероксид может инициировать образование липидных радикалов образуя первичный радикал нолибо путем взаимодействия с я2°2:

н202 + о"- ог + 0н~(н20) + он•

Скорость синтеза АТР в митохондриях и ее изменение при включении УФ-света показаны на рис.7-2 и 7-3. Как видно из рисунков УФ-генерация супероксида ингибирует, а в присутствии пропилгаллата стимулирует синтез АТР и супероксиддисмутаза снимает этот эффект. Интенсивность образования супероксида и скорость УФ-стимулируемого синтеза АТР зависит от концентрации nadph. Оптимальной в данном случае является концентрация [nadph2 мМ.

В целом, полученные нами данные противоречат представлениям о модели Митчела как об универсальной модели. Они свидетельствуют о том, что создание на внутренней мембране митохондрий дин+ равной 250 мВ является необходимым, но не достаточным условием синтеза АТР. Нами предложен механизм энергетического сопряжения, в основе которого лежит взаимодействие мевду редокс комплексами и атр-син-тазой (квази-стэкинг). В сопряжении двух процессов участвует липидный интермедиа!, который стимулируя периодическое локальное сжатие мембраны обеспечивает внутримембранный перенос энергии на комплекс igFj. Это означает, что в мембранах митохондрий протонный цикл функционирует в импульсном режиме. Внутримембранный перенос энергии ингибируется анестетиками [Rottenberg 1983] и антиоксидан-тами, блокирующими образование радикалов ьО^. В целом, согласно рассматриваемой здесь модели мембрана играет активную роль в преобразовании энергии, т.е. ее роль еще более важна, чем это следует из гипотезы Митчела.

Мы полагаем, что в митохондриях могут быть реализованы обе модели сопряжения и возможен переход от одного механизма сопряжения к другому. Одним из критериев реализации в мембранах митохондрий той или иной модели может быть способность антиоксидантов ингибировать синтез атр, другим - постоянство коэффициента Р/0, либо его изменение при изменении степени восстановленности убихи-нона. Примером могут служить митохондрии печени в норме (снижение Р/0) и после гепатоэктомии, где такого рода зависимость отсутствует, а также митохондрии гепатомы. Содержание ненасыщенных жирных КИСЛОТ В ПОСЛеДНИХ ГОраЗДО НИЖе, Чем В НОрме [Hasotti et al.1986]', в этом случае, по всей вероятности, реализуется модель Митчела, т.е. наличие Ддя+ является необходимым и достаточным условием синтеза АТР.

Глава 8. ГИДРОКСИЛИРОВАНИЕ ПОЛИЩШШЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ.

СВЯЗЬ С ПЕРЕКИСНЫМ ОКИСЛЕНИЕМ ЛШЩОВ.

Биологические мембраны при всем их разнообразии в зависимости от тканевого происхождения и функциональной специализации в соответствии с принадлежностью к тем или иным внутриклеточным структурам имеют, тем не менее, решающее сходство. Это сходство заключается в том, биологические мембраны представляют собой структурированный и одновременно динамический ансамбль, формируемый из липидного бислоя и встроенных в него белков.

Известно, что физическое состояние биомембран чрезвычайно важно для выполнения свойственных им функций. Стабильность бислой-ных мембран, образованных фосфэлипидами в живых организмах, обеспечивается своеобразным механизмом обратной связи: при незначительном увеличении гидрофильности фосфолипиды соединяются с нейтральными липидами (типа холестерина), в результате чего происходит повышение липофильности мембраны и наоборот. Известно также, что накопление перекисей липидов приводит к заметному изменению жидкостности мембран и оно противоположно изменению жидкостности мембран при накоплении холестерина.

Очевидно, что контроль за физическим состоянием мембран осуществляется в основном природными антиоксидантами. В неменьшей степени это относится и к разного рода ксенобиотикам, терапевтическая активность и побочное действие которых тесно связаны с их метаболизмом в организме и, в первую очередь, в печени. Гидрокси-лирование ксенобиотиков - это монооксигеназная реакция, катализируемая яаорн, точно также как и перекисное окисление липидов. Поэтому при скрининге новых искусственных антиоксидантов важно учитывать не только оценку собственно антиоксилительной активности (прямое антиоксидантное действие). Он должен включать в себя и эффект ксенобиотика (косвенное антиоксидантное действие).

В настоящее время имеется ряд работ, посвященных исследованию ингибирующего действия полициклических углеводородов на перекисное окисление липидов [РейегБвп 1974, Белевич и соавт.1988;. Это действие не может быть объяснено простой конкуренцией за цепь окисления ыаорн и имеет, по-видимому, более сложный характер. На это, в частности, указывает тот факт, что бенз(а)пирен- Б(а)П - эффективно ингибирует образование продуктов перекисного окисления липидов

В системе NAVPH +аскор0ат [Pedersen 1974]. Поэтому ингиОирущее действие Б(а)П на окисление липидов и особенно влияние про- и ан-тиоксидантов на эти процессы требует более детального рассмотрения

Мы исследовали влияние Б(а)П на процесс перекисного окисления окисления липидов в микросомах печени. Введение Б(а)П в суспензию микросом снижает интенсивность образование малонового диальдегида при wadph-зависимом перекисном окислении липидов (рис.8-1 и 8-2). Как видно из рисунка B-i постепенное увеличение содержания Б(а)П до 600 нМ приводит к полному ингиОированию образования МДА в микросомах. Следует отметить, что ингибирование ПОЯ за счет гид-роксилирования Б(а)П наблюдается только в отсутствие экзогенного железа (рис.8-2). С учетом этого факта существующее объяснение ингибирующего действия процесса гидроксилирования Б(«)П на пере-кисное окисление липидов, связанное с антиоксидантным действием 3-ОН-бензпирена, нельзя признать удовлетворительным.

Влияние прооксидантов на гидроксилирование Б(^-)П. Известно, что процесс перекисного окисления липидов стимулируется ионами переменной валентности, в частности, ионами железа [wills 1969]. В этом процессе ионы железа эффективны в концентрации 5 -15 мкМ. Мы изучали влияние ионов железа на гидроксилирование Б(а)П, используя тот же диапазон концентраций. Было обнаружено, что при добавлении к микросомам ге2+ происходит увеличение интенсивности wadph-зэви-симого гидроксилирования Б(<* )П. Стимулирующее влияние ионов ге2+ снималось при добавлении ЭДТА. Трехвалентное железо' в тех же концентрациях не влияет на процесс гидроксилирования Б(а)П.

На рис.8-3 представлена зависимость скорости гидроксилирования Б(а)П от концентрации Ре2+, которая имеет вид кривой с насыщением в области Ю-15 мкМ точно также, как это имеет место для перекисного окисления липидов. Представляется важным, что одни и те же концентрации ионов железа оказываются оптимальными для двух различных реакций. Необходимо отметить, что хранение микросом при 4°С в течение 1-2 суток приводит к снижению скорости гидроксилирования Б(а)П на 20-304-, но характер влияния ионов железа на процесс гидроксилирования при этом сохраняется.

При исследовании влияния ионов железа на гидроксилирование Б(а)П обнаружена способность fe2+ стимулировать не только nadph-зависимое, но и гшэн-зависимое гидроксилирование Б(а)П. Известно,

[Б(а)п], мкМ

[Fe2+J, мкМ

Рис.8-1.Влияние Б(а)П на ПОЛ в микросомах печени, за 100% принято накопление МДА в отсутствие Б(а)П.

1 - контрольные микросомы (100% - 2 нМ/мин.мг белка)

2 - микросомы + 10 мкМ Ре2+ (100% - 19 нМ/мин.мг белка) белок I мг/мл, t=3S°C. Среда инкубации: 0.15 М KCl, 50 мМ Трис-HCl буфер,pH 7.4; 5 мМ MgS04, 100 мкМ NADPH Рис.8-2.Влияние Б(а)П на кинетику ПОЛ в микросомах печени, (кривая I и 2 как на рис.8-1). Рис.8-3.Зависимость скорости гидроксилирования Б(а)П от концентрации ионов Fe2+.

2,5 мин

о <

ш ю

а х

X X £ ч

-О §

£ I

С п

Чм/

0,05 0,0к

0,05 0,02

0,01

3,25 3,30 3,35 3,Ь0

/0-3 10'1

¿.-ТФ, мг/мл

Рис.8-4.Стимулирование ионами Ре2+ МШ-зависимого гидрокси-лирования Б(а)П. №ШН - 100 мкМ, Ре2+- 5 мкМ

Рис.8-5.Зависимость скорости гидроксилирования Б(а)П от температуры.

1 - контрольные микросомы

2 - микросомы + 10 мкМ Ре2+

Рис.8-6.Зависимость скорости гидроксилирования Б(а)П от концентрации токоферола в микросомах печени.

что nadh может оказывать синергетическое действие на ^лоря-зависимое гидроксилироваше Б(а)П [Nebert.Gielen 1972]. Нами обнаружено гидроксилирование Б(а)П в микросомах печени в условиях, когда в качестве восстановительных эквивалентов использовался только nadh (рис.8-4). Добавление nadh в суспензию микросом не изменяет интенсивность флуоресценции Б(а)П. Однако, при последующем добавлении Fe2+ наблюдается снижение интенсивности флуоресценции в результате активации w-дш-зависимого гидроксилирования Б(а)П. Скорость nadh-зависимого метаболизма Б(а)П в этом случае сравнима со скоростью гидроксилирования Б(а)П, стимулируемого nadph.

Активирующее действие Fe2+ на гидроксилирование Б(а)П, особенно «Аоя-зависимое, скорее всего объясняется, что ионы железа стимулируют образование какого-то интермедаата, участвующего в реакции метаболизма Б(«)П. Не исключено, что образование такого интермедиата тесно связяно с перекисным окислением лшшдов. В связи с этим мы использовали для активации метаболизма Б(а)П другой прооксидант cci4. В этих опытах обнаружено, что добавление cci4 (в концентрации до 0.08 мкл/мг бежа) увеличивает скорость млпян-зависимого гидроксилирования Б(а)П. Дальнейшее увеличение концентрации cci4 приводило к тушению флуоресценции Б(а)П, что затрудняет регистрацию эффекта. Отметим, что в случае илш-зави-симого метаболизма Б(а)П эффект cci4 значительно слабее, чем эф|ект ИОНОВ Fe2+.

Таким образом, прооксиданты cci4 и Fez+ (несмотря на различие механизмов и локализации мест образования липидных радикалов) оказывают одинаковое стимулирующее действие не только на процесс перекисного окисления, но и на монооксигеназную систему, активируя nadph-зависимое гидроксилирование полициклического углеводорода Б(а)П. Все это позволяет думать, что липидные радикалы являются общим интермедиатом двух реакций.

^-- гидроксилирование Б(а)П

lh -- v--

looh перекисное окисление липидов

Известно, что благодаря участию в перекисном окислении липидов атомов переходных металлов, в частности железа, образование частиц с неспаренным электроном может происходить без значительных

энергетических затрат [Hamilton 1974]. Это означает, что и процесс гидроксилирования (если он включает в себя образование радикалов) в присутствии Fe2+ должен осуществляться с небольшим активационным барьером.Мы исследовали температурную зависимость скорости гидроксилирования Б(а)П в реакции без добавления железа и в присутствии 10 мкМ Fe2+. Зависимость скорости гидроксилирования Б(ос)П от температуры (в полулогарифмических координатах) представлена на рис.8-5. Рассчитанные из графиков значения энергии активации составили 25.2 ккал/моль в отсутствие ге2+ и 7.7 ккал/моль в присутствии ионов железа. Эти данные свидетельствуют в пользу предполагаемого участия липидных радикалов в гидроксилировании Б(а)П.

Основываясь на этом предположении, можно по-новому рассмотреть взаимосвязь процессов перекисного окисления липидов и гидроксилирования Б(«)П. Хотя 3-0Н-Б(а)П и обладает антиокислительным действием /'Бурлакова и соавт.1975;, в реакции Б(ос)П—3-0Н-Б(а)П-диоксипроизводные Б(а)П он является промежуточным соединением и, вероятно, не оказывает на перекисное окисление липидов существенного влияния. В то же время в случае участия в гидроксилировании Б(а)П липидных радикалов легко объяснить эффект ингибирования. Слабое накопление продуктов перекисного окисления липидов в присутствии Б(<*)П в этом случае может быть результатом конкуренции за lo'2. Присутствие в микросомах такого липофильного субстрата как Б(а)П, должно снижать долю радикалов lo2, участвующих в образовании looh. Следствием этого должно быть снижение интенсивности образования гидроперекисей и одного из продуктов распада looh -малонового диальдегида.

Влияние антиоксидантов на гидроксилирование Б(^)П. Если увеличение скорости гидроксилирования Б(а)П в присутствии прооксидан-тов действительно связано с образованием интермедиата - липидных радикалов, то можно предположить, что присутствие в среде инкубации антиоксидантов должно ингибировать процесс гидроксилирования. Поэтому на следующей стадии работы мы изучали влияние различных антиоксидантов на гидроксилирование Б(а)П. Следует отметить, что влияние антиоксидантов, в частности, а-токоферола (а-ТОН) на функционирование оксигеназной системы изучалось и ранее. Показано, что а-ТОН не оказывает ингибирующего действия на метаболизм кодеина и аминопирина [carpenter 197г], хотя и ингибирует перекисное

окисление липидов. Мы использовали два разных антиоксиданта а-ТОН и пропилгаллат (ПГ), а также спиновую ловушку липидных радикалов 2-метил-2-нитрозопропан (МНП).

На рис.8-6 и 8-7 представлены полученные нами кривые зависимости скорости гидроксилирования Б(а)П от концентрации ПГ и а-ТОН. Известно, что ПГ влияет на активность илорн-зависимого флавопро-теида [Torriein, slater 1971] и, значит, его влияние на процесс гидроксилирования можно объяснить двояко. Что касается а-ТОН, то видно, что при небольших концентрациях (менее 10~^мг/мл) он стимулирует гидроксилирование Б(а)П. Подобное стимулирующее действие а-ТОН отмечалось рядом авторов и для лекарственных соединений [Giassuddin et а 1. 1975]. Возможно, что стимулирующее действие о£-Т0Н на метаболизм различных ксенобиотиков (как лекарственных соединений, так и полициклических углеводородов) связяно с ингиби-рованием образования цитотоксического продукта, взаимодействующего с цитохромом Р-450 (Р-448) [Benedetti et а1.1980].

Из полученных данных следует также, что при высоких концентрациях а-ТОН оказывает ингибирующее действие на гидроксилирование Б(а)П точно также, как и пропилгаллат. Снижение скорости гидрокси-лазной реакции связано, по-видимому, с влиянием антиоксидантов на участок, находящийся за флавопротеидом, поскольку а-ТОН не влияет на активность иАОРЯ-зависимого флавопротеида [nahimtuia et ai. 1977]. Ингибирующее действие антиоксидантов а-ТОН и ПГ, являющихся перехватчиками свободных радикалов скорее всего представляет собой результат снижения концентрации липидных радикалов, например, w2.

Образование липидных радикалов в микромальных мембранах подтверждается многочисленными данными и более того существует возможность регистрации липидных радикалов с помощью спиновых ловушек. Так, например, показано, что анаэробная инкубация микро-сом с cci4 в присутствии спиновой ловушки МНП приводит к появлению спиновых аддуктов, спектр ЭПР которых идентифицируется как спектр диенильного радикального аддукта [Kalyanaraman et а1.1979].

Мы иссдедовали влияние спиновой ловушки МНП на скорость гидроксилирования Б(а)П. Результаты этих экспериментов представлены на рис.8-8. Присутствие МНП в микросомах приводит к снижению скорости гидроксилирования Б(а)П. Подобное действие МНП проявляется и в том случае, когда гидроксилирование МНП было стимулировано

ионами двухвалентного железа. Таким образом, присутствие спиновой ловушки, образующей аддукты с липидными (аллильными) радикалами, снижает скорость гидроксилирования Б(а)П точно также как присутствие в микросомах с/-ТОН или ПГ.

На следующем этапе работы мы изучали кинетику восстановления цитохрома Р-450(Р-448) и влияние на этот процесс про- и антиокси-дантов. Типичная кинетика восстановления комплекса цит.Р-450-С0, полученная в анаэробных условиях, представлена на рис,8-9(а). Характер этой кривой обычен для анаэробного восстановления цитохрома Р-450, т.е. кривая имеет двухфазный характер и может, быть описана уравнением, включающим в себя в качестве экспоненциальных множителей константы - быструю KQ и медленную Ку. Полученные нами экспериментальные кривые анализировались с помощью ЭВМ. 300 точек каждой экспериментальной кривой использовались для построения модельной кинетической кривой в виде

A(t) = Aje"* t + л2е~к Z + с

среднеквадратичное отклонение данных эксперимента от модельной кривой при такой аппроксимации не превышало 2г.

С помощью ЭВМ исследовали возможное влияние ке2+ на кинетику восстановления цитохрома Р-450. Полученные результаты представлены в таблице (для расчета констант скоростей в каждом, эксперименте обрабатывалось 6-8 кривых).

Влияние Fe2+ на кинетику восстановления цитохрома Р-450

Объект исследования Й5нЖ°? % «м

Микросомы без Fe2+ 38 + 6 о.з1 + о. об о. озч + о. oos

Микросомы + 12 МКМ Fez+ 45 + 4 О. 35 + 0.06 0.032 + 0.003 Данные приведенные в таблице свидетельствуют об отсутствии влияния ионов железа на восстановление цитохрома Р-450.

При исследовании влияния пропилгаллата были получены аналогичные результаты. Заметные изменения значений К0 и вызывали лишь очень высокие (150 мкМ) концентрации пропилгаллата, значительно превышающие величины (10-20 мкМ), эффективно ингибирующие гидрок-силирование Б(а)П. Таким образом, полученные в этом эксперименте

60 80 [ПГ],мкМ

40 80

[МНП], мкМ

<50-т

Рис.8-7.Зависимость скорости гидроксилирования Б(а)П от концентрации пропилгаллата в микросомах печени.

Рис.8-8.Зависимость скорости гидроксилирования Б(а)П от концентрации МНП.

1 - контрольные микросомы

2 - микросомы +- 10 мкМ

Рис.8-9.Кинетика восстановления цитохрома Р-450 (Р-448), полученная методом stop-flow, а - экспериментальная кривая б - модельная кривая

30 с

данные позволяют сделать вывод об отсутствии какого-либо влияния про- и антиоксидантов на процесс восстановления цитохрома Р-450. Такого результата следовало ожидать, если учесть тот факт, что метаболизм гидрофильных лекарственных соединений (в отличие от липофильных полициклических углеводородов) практически не зависит ни от генераторов, щ от ловушек липидных радикалов.

Полученные в работе данные указывают на то, что скорость гидроксилирования липофильного ксенобиотика Б(<*)П может значительно варьировать при неизменном содержании в мембранах цитохрома Р-448. Такого рода регуляция скорее всего связана с изменением концентрации липидных (перекисных) радикалов, которые могут служить донором кислорода для реакции гидроксилирования Б(а)П с участием цитохрома Р-448. В этом случае происходит циклическое превращение липидных радикалов (¿н—- х/—~ио2—-ьн) и тормозится образование гидроперекисей (ьо2-^ ьоои). Гидроксилирование Б(а)П в мембранах микросом печени можно представить следующим образом:

НАДФ-Н-

Б(а)П + Ее + 2Н

•Флавопротеид

Б(«)П + 2е + 2Н

И2° ^ЗОН-БП

гидроксилирование Б(а)П

1Л

ьо

°г

■ьЕ

ЗОН-БП 4он•

юон

перекисное окисление липидов

Схема 8-1. Гидроксилирование Б(а)П в микросомах печени.

В целом полученные нами данные указывают на еще одну важную сторону участия липидов в регуляции внутриклеточных процессов и позволяют рассматривать перекисное окисление липидов не только как процесс, ответственный за повреждение мембран. Начальная стадия этого процесса - образование липидных радикалов имеет определенное функциональное назначение. Образование перекисных радикалов, по-видимому, необходимо для осуществления метаболизма липофильных соединений, включая полициклические углеводороды, экзогенные (искусственные) антиоксиданты и др. ксенобиотики.

заключение

Завершая анализ полученных в настоящем исследовании результатов, необходимо отметить следующее:

Ключевая роль свободно-радикальных реакций в патологических процессах определяется тотальной окислительной деструкцией основных классов биологических веществ и , как следствие этого, нарушением клеточных функций. Полученные в данном исследовании новые данные о молекулярных механизмах защитного действия витамина Е в мембранах печени могут с учетом функциональных особенностей, определяемых составом белков и липидов, быть распространены на мембранные структуры других органов и тканей.

Чрезвычайно важным является тот факт, что инициирование сво-боднорадикальных реакций ПОЛ в биологических мембранах может и не приводить к образованию липидаых перекисей. Иначе говоря, в мембранах может происходить циклическое превращение липидных радикалов, а именно - вслед за образованием перекисного радикала происходит его восстановление (акцептирование электрона) и последующее превращение радикала в исходную неокисленную молекулу.

ш2-- ьоон

Существование такого цикла отмечено в разных внутриклеточных мембранах, содержащих редокс-комплексы. Фактически, это основные внутриклеточные мембранные структуры, т.е. системы электронного транспорта, расположенные во внутренней мембране митохондрий и эндопла-зматическом ретикулуме (микросомы). Такого рода цикл обнаружен,: 1 .В микросомах - при гидроксилировании липофильных кснобиотиков редокс-цепью с участием цитохрома 1-448.

2.В микросомах - при кооперативном действии фермента ази(ьо'2) ре-дуктазы и токоферола;

3.В митохондриях - при кооперативном действии дыхательной цепи и токоферола. Образующийся в митохондриях интермедиат [Ю'гГ играет роль интермедиата сопряжения окисления и фосфорилирования. Важно отметить, что в последних двух случаях такой цикл может быть блокирован разобщителем-протонофэром ([1Х>'2]~+ Н+--ьоон). В митохондриях это приводит к разобщению окисления и фосфорилирования.

выводы

1. В работе выдвинута и экспериментально обоснована совокупность представлений о функциональной роли липидов в биологических мембранах; рассмотрено образование липидных радикалов в ненасыщенных жирных кислотах фосфолипидов и циклические превращения радикальных состояний липидов. Установлено наличие тесной связи между умеренным перекисным окислением липидов и функционированием биологических мембран. Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что перекисное окисление липидов зависит от функциональной активности мембран. Это касается как процесса гидроксилирования ксенобиотиков в мембранах микросом, так и окислительного фосфори-лирования в мембранах митохондрий. Чем выше функциональная активность, тем ниже уровень перекисного окисления липидов. И наоборот, при работе редокс цепи вхолостую, происходит усиление перекисного окисления липидов, которое служит своего рода инструментом разборки биологических мембран.

2. В работе рассмотрена роль антиоксидантов в стабилизации биологическх мембран и дан критический анализ общепринятого механизма взаимодействия перекисных радикалов с токоферолом. Предложен новый механизм действия токоферола, который ведет не к образованию гидроперекисей, а к восстановлению первичной структуры жирной кислоты; в результате такой реакции высвобождается супероксид. Рассмотрены два механизма действия токоферола: неферментативный (двухэлектронное окисление токоферола) и ферментативный, при котором реализуется однозлектронное окисление токоферола

3. В эксперименте на лшосомах установлено, что разрыв С-0 связи в углеводородной цепи как следствие переноса двух электронов на перекисный радикал действительно может иметь место; при этом зарегистрировано образование супероксида. Установлено, что токоферол может выступать как донор двух электронов, но лишь при щелочных значения рн. Таким образом, показано, что в присутствии токоферола образование липидных гидроперекисей в лилосомах при рН 8.5 может быть блокировано полностью.

4. Изучен ингибирующий эффект токоферола в микросомах печени при физиологических значениях рН. Полученные данные позволяют предаоложить, что взаимодействию токоферола с перекисными радикалами (ю'2) предшествует их восстановление сгн-зависимым ферментом.

Этот фермент, по-видимому, действует как gsh егл^редуктаза. Таким образом, предложен новый глутатион-зависимый ферментативный механизм защитного действия токоферола в биомембранах. В целом, из полученных данных следует, что перекисное окисление липидов в микросомах контролируют три основных фактора: gsh ¡гхо^;редуктаза, токоферол и аскорбат.

5. Проведено детальное исследование перекисного окисления липидов при нормальном функционировании митохондрий печени. Обнаружено, что скорость перекисного окисления липидов в митохондриях зависит от их функционального состояния; в присутствии сукцината в митохондриях происходит накопление одного из продуктов перекисного окисления - малонового диальдегида. (Скорость образования МДА не превышает o.i нмоль/мин. мг. белка). МДА не образуется при инкубации митохондрий с аденозиндифэсфатом, т.е. переход митохондрий в активное состояние сопровождается ингибированием перекисного окисления липидов. Этот эффект снимается разобщителем ciccp.

6. Исследована возможность регуляции фосфорилирования Adp с помощью про- и антиоксидантов, т.е. изменения скорости синтеза АТр в результате направленного изменения уровня липидных радикалов.

а. Показано, что антиоксидант пропилгаллат является разобщителем окислительного фосфорилирования. В зависимости от концентрации он ингибирует окислительное фосфорилирование полностью или частично, не влияя на величину электрохимического потенциала. Такое ингибирование (разобщение по типу uncoupling Due является необратимым. Синтез атр может быть возвращен к исходному уровню при добавлении в среду инкубации ю мкМ ионов Fe2+. В целом зависимость скорости синтеза атр от концентрации ионов ре2+ представляет собой кривую с экстремумом в области 5-10 мкМ.

б. Изучен синтез атр в митохондриях печени и влияние на этот процесс супероксида, образующегося при облучении nadph ультрафиолетом. Показано, что генерация супероксида с помощью УФ-облучения активирует образование липидных радикалов, что приводит к изменению скорости синтеза АТР. В условиях, когда уровень липидных радикалов невелик (т.е. при инкубации с щхяшлгаллатом) УФ-облучение приводит к усилению синтеза АТР. Эффект УФ-облучения снимается супероксиддисмутазой.

7. Изучено влияние на дыхание и фосфорилирование таких инги-

биторов как малонат и ксы с целью выяснения связи между синтезом АТР и редокс состоянием убихинона, контролирующего уровень липидных радикалов в митохондриях. Показано, что в црисутствии kcn скорость фосфорилирования снижается в большей степени, чем скорость дыхания (Снижению скорости дыхания в 4 раза соответствует снижение скорости фосфорилирования в 7 раз). При этом обнаружена корреляция между снижением р/о и увеличением степени восстановлен-ности убихинона.

е. Полученные в работе данные свидетельствуют в пользу представлений о том, что фосфолипидная мембрана играет активную роль в преобразовании энергии в митохондриях. Это означает, что с одной стороны Ддн+ контролирует работу дыхательной цепи, т.е. скорость окисления субстрата (дыхательный контроль), с другой - дыхательная цепь с помощью липидного интермедиата контролирует утилизацию протонного градиента, т.е. скорость синтеза АТР. Предполагается, что наличие дун+ является необходимым, но недостаточным условием эффективной работы лтр - синтетазы.

э. Обнаружено участие липидного интермедиата в гидроксилиро-вании полициклического углеводорода бенз(а)пирена в микросомах печени. Изучено влияние прооксиданта (ионы Fe2+) и антиоксидантов (а-токоферол, пропилгаллат) на гидроксилирование Б(а)П и влияние процесса гидроксилирования Б(«)П на перекисное окисление липидов. Показано, что гидроксилирование Б(а)П оказывает ингибирующее действие на перекисное окисление липидов. В свою очередь, процесс гидроксилирования Б(а)П ингибируется антиоксидантами, что подтверждает наличие общего липидного интермедиата в этих двух процессах.

ю. Показано, что отношение содержания цитохромов Р-448 и Р-450 в микросомах печени в норме равно 1/3. Полученные в работе данные свидетельствуют о возможности регуляции скорости гидроксилирования Б(а)П при неизменном содержании в мембранах цитохрома Р-448. Такая регуляция скорее всего связана с изменением концентрации липидных (перекисных) радикалов, которые могут служить донором кислорода для реакции гидроксилирования Б(а)П цитохромом Р-448. В этом случае происходит циклическое превращение липидных радикалов (lh — и — ьо'2 и lo~2 — lh) , вследствие чего тормозится образование гидроперекисей.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дмитриев Л.Ф., Иванов И.И. НАОРИ и №АВН~зависилая систела гид-роксилирования бенз(а)пирена.//&Ш СССР,1977,т.236,с.471-473

2. Дмитриев Л.Ф., Иванов И.И. Метаболизл бенз(аМирена в печени крыс. Недостаток ЫАОРН как лихитирукщий фактор при. инактивации. Оенз(а)пирена.//Биологические науки 1977,№ 12, с.36-40

3. Дмитриев Л.Ф., Иванов И.И. О распределении восстановительных эквивалентов в клетке в активной фазе летаболизла бенз(а)пирена.// Вопросы мед. химии 1979, № 4,с.451-455

4. Белевич Н.П., Дмитриев Л.Ф., Иванов И.И. ЕАЗШ и МШ-зависимая систела гидроксилирования бенз(а)пирена. Связь с перекисши, окислениел лилидов.//Бюллетень эксп.биол.мед.,19812,с.158-160

5. Дмитриев Л.Ф., Белевич Н.П., Давлетшина Л.Н., Иванов И.И. Возложное участие сбободнорадикалъного лилидного интерледиата 6 гидроксилировании полициклических углеводородов.//Биохимия 1983, 48,0.2041-2048

6. Дмитриев Л.Ф. О роли лилидов в ферментативных реакциях с пере-носол заряда.// Молекулярная биология 1983,17, с.1060-1067

7. Дмитриев Л.Ф. Лилидные радикалы - возможные медиаторы переноса заряда и преобразования энергии /Мол.биология 1983,17,с.1297-1305

8. Дмитриев Л.Ф., Давлетшина Л.Н., Белевич Н.П., Иванов И.И. Участие липидных радикалов в реакциях с переносол электронов и преобразованиел энергии.// Мол.биология 1984,18, с.427-435

9. Давлетшина Л.Н., Дмитриев Л.Ф., Иванов И.И. Возлохное участие сбободнорадикалъного липиВного интерледиата в сопряжении окисления и фосфорилирования.//Биологические науки 1984,.№ 9, с.25-30

10. Дмитриев Л.Ф., Давлетшина Л.Н., Белевич Н.П. Об участии лшидного интерледиата в гидроксилировании бенз(а)пирена.// Бюллетень эксп.биол.мед. ,1983,5,0.127-129

11. Дмитриев Л.Ф., Давлетшина Л.Н., Иванов И.И., Рубин А.Б. Взаимосвязь окислительного фосфорилирования и переписного окисления лилидов.//Биологические мембраны 1985, 2,с.795-799

12. Дмитриев Л.Ф. О роли лелбранкых фосфолилидов в окислителънол фосфорилировании . Гипотеза 1С сопряжения.//Мол.биология 1985, 19, с. 1001-1010

13. Дмитриев Л.Ф. О механизме сопряжения окисления и фосфорилиро-вания.// Молекулярная биология 1986, 20, с.1111-1125

14. Белевич Н.П., Дмитриев Л.Ф. .Баутина А.Л., Иванов И.И. Два пути гидроксилирования полициклических углеводородов в лелбранах эндо-плазлшического ретикулула.// Биологические науки 1988,№ 4,с.37-41

15. Дмитриев Л.Ф. .Иванова М.В.,Иванов И.И. Синтез АТР в литохондриях печени, ложно сгшлулировашъ и ингибироватъ, генерируя супероксид с полощъю УФ-облучения.// Биол. мембраны 1990, 7,с.961-965

16. Дмитриев Л.Ф.,Иванова М.В.,Иванов И.И. Синтез АТР в литохонд-риях: взаилодействие редокс-цепей внешней и внутренней лелбран.// ДАН ССОР, 1990,312,С.986-989

17. Дмитриев Л.Ф. Возложная роль лалонового диалъдегида в регуляции клеточного деления.// Мол. биология 1990, 24, с.566-571

18. Дмитриев Л.Ф. Преобразование энергии в литохондриях. Активная роль лелбраш.// Биофизика 1990, 35, с.685-687

19. Дмитриев Л.Ф., Верховский М.И. 0 леханизле взаимодействия токоферола о перекисныли раЭшсалаш.//Биохимия 1990,55,с.2025-2030

20. Дмитриев Л.Ф. Фосфорилиравание в литохондриях и хлоропластах: сходство и различие.// Биол. мембраны 1991, 8, с.341-360

21. Дмитриев Л.Ф.«Иванова М.В. Взаилодействие токоферола с перекисныли радшалали в лилосолах не ведет к образованию гидроперекисей Докл.РАН 1992,324,0.459-464

22. Дмитриев Л.Ф. Малоновый дьалг^дегид ложет контролировать клеточное деление на стадии репликации ДНК.// Журнал эвол. биохимии и физиологии 1992, 28, с.720-730

23. Дмитриев Л.Ф. Участие липидов в реакциях переноса заряда и преобразования энергии в литохондриях и хлоропластах.// Биологические мембраны 1992, 9, с.281-289

24. Dmitriev L.F. On the mechanism of tocopherol Interaction with peroxyl radicals.// Excerpta Medlca, ser. Int.Congress, 1992, H 998 p.183-185

25. Дмитриев Л.Ф. .Иванова M.B., Давлетшина Л.Н. Создание на внутренней лелбране литохондрий Дц^ равной 250 лВ является необходи-лыл, но не достаточныл условиел синтеза АТР.// Биохимия 1993,58, с.255-260

26.' Dmitriev L.Р., Ivanova M.V. Interaction of tocopherol with peroxyl radicals does not lead to the formation of lipid hydroperoxides in liposomes.// Chemistry and Physics of Lipids 1994, 69, p.35-39

27. Дмитриев Л.Ф. Механизмы энергетических превращений при дыхании и фотосинтезе: роль фосфолилидной лелбраны.// Биофизика 1994 (принята в печать).

28. Дмитриев Л.Ф. Биохилические аспекты атерогенеза: роль антиок-сидантоб.// Терапевтический архив 1994 (принята в печать).

29. Дмитриев Л.Ф., Иванова М.В., Самуилов Я.Д. Аналог пробукола защищает липопротеиби от окисления лучше чел пробукол.// Бюллетень эксп.биол.мед. 1994 (принята в печать).

30. Dmitriev L.F. Lipid peroxidation: novel CSH-medlated enzymatic mechanism of protective effect of tocopherol in biological membranes (short communication).// Redox Report 1994 (accepted).

31. Dmitriev L.F. A novel GSH-medtated enzyme realizes the protective effect of tocopherol in biological membranes.// Chemistry and Physics ol Lipids 1994 (accepted).

32. Dmitriev L.F., Ivanova M.V. Effect of pH and GSH on the lipid peroxidation in liver microsomes supplemented with tocopherol.// Chemistry and Physics of Lipids 1994 (accepted).

33. Dmitriev L.F., Ivanova M.V. Energy transduction in mitochondria: is the role of oxygen twofold ?// Biochem.J. 1994 (accepted).

Типография "¿Ъктакспецстро:!" зак.525 тир.100

Информация о работе

Дмитриев, Леонид Федорович
доктора биологических наук
Москва, 1994
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы