Радикальные состояния и циклические превращения липидов в биологических мембранах

Дмитриев, Леонид Федорович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Радикальные состояния и циклические превращения липидов в биологических мембранах
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Радикальные состояния и циклические превращения липидов в биологических мембранах"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

57 БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

См

ДМИТРИЕВ Леонид Федорович

РАДИКАЛЬНЫЕ СОСТОЯНИЯ И ЦИКЛИЧЕСКИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ ЛИПИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАНАХ

Специальность 03.00.02 - биофизика

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва -

1997

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Е.Б.Бурлакова Доктор биологических наук, профессор Ю.В.Евтодиенко Доктор биологических наук, профессор АЛ. Потапенко

Ведущая организация

Институт биохимии РАН им. Баха

Защита состоится 1997 г. в ^ час. ^^ мин.

г на заседании диссертационного совета Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Московская область, г.Пущино)

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Института теоретической и экспериментальной биофизики

Диссертация в виде тучного доклада разослана " " 1997.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических нау П. А.Нелипович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время тесная связь между перекисным окислением липидов (ПОЛ) и активностью клеточных мембран, более того, определяющая роль ПОЛ в проявлении биологической активности не вызывает сомнений. При этом ПОЛ обычно рассматривается как универсальный процесс, ответственный за повреждение мембран.

Современная стадия изучения ПОЛ в биологических системах во многом предопределена работами Б.Н. Тарусова, сформулировавшего в середине 50 г.г. гипотезу о решающей роли цепной реакции свободно-радикального окисления липидов при действии на клетку повреждающих факторов. Из работ Б.Н.Тару-сова и его школы следует, что повреждение мембран клеток и клеточных орга-нелл - это один из универсальных патологических процессов.

В настоящее время наблюдается усиление интереса к исследованию роли кислородных радикалов [Скулачев В.П. 1995] и к радикальным процессам, протекающим в биологических мембранах. Наибольший интерес в этом случае представляют мембраны эндоплазматического ретикулума и мембраны митохондрий. Первые осуществляют гидроксилирование ксенобиотиков, вторые -синтез АТР, Наличие в мемранах митохондрий и микросом редокс-цепей, способных генерировать активные формы кислорода, и взаимодействие последних с ненасыщенными жирными кислотами фосфолипидов приводит к переносу радикального состояния на липидные молекулы, т.е. к образованию липидных радикалов, а затем и липидных перекисей.

При выяснении роли ПОЛ, на наш взгляд, прежде всего следует иметь в виду - интенсивность этого процесса. Оценивая степень интенсивности ПОЛ можно выделить три качественно разных случая: интенсивное, умеренное и слабое ПОЛ. Слабое ПОЛ характерно для раковых клеток; умеренное ПОЛ можно рассматривать как нормальный, строго контролируемый in vivo процесс. Интенсивное ПОЛ- это уже нарушение структуры и функции мембран и, наконец, патологию можно представить как промежуточное состояние между умеренным и интенсивным ПОЛ.

При выяснении роли радикальных процессов и роли интермедиатов ПОЛ возникает два вопроса: во-первых, всегда ли образование радикалов ведет к образованию липидных гидроперекисей и имеют ли радикальные процессы значение для функционирования биологических мембран в норме; во-вторых, каково их влияние на структуру и функции мембран?

Ответ на эти вопросы требует детального изучения гидроксилирования ксенобиотиков в микросомах и окислительного фосфоршшрования в митохондриях и, в частности, изучения влияния на эти процессы соединений, действующих в качестве ингибиторов (антиоксидантов) и промоторов (проокси-дантов) свободно-радикальных реакций.

Механизмы перекисного окисления и действия антиоксидантов на ПОЛ в гомогенных и гетерогенных системах на протяжении многих лет изучаются в таких крупных центрах, как Институт химической физики (Бурлакова Е.Б., Пальмина Н.П.,Глущенхо Н.Н) Российская медицинская академия (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., Потапенко А.Я.) и Биологический факультет МГУ (Козлов Ю.П., Иванов И.И.,Мерзляк М.Н.). Иными словами, вопросы перекисного окисления липидов уже почти полвека находятся на пересечении интересов биохимиков и биофизиков, а также специалистов в области физико-химической медицины.

Известно, что в защите биологических структур участвуют два антиокси-данта - убихинон и токоферол и что ключевая роль в обеспечении структурно-функциональной стабильности липидного бислоя принадлежит а-токоферолу. При рассмотрении проблемы обеспечения надежной работы биологических мембран в различных органах и тканях, это положение не вызывает сомнений. Тем не менее, учитывая особенности функционирования токоферола в биологических мембранах и других биологических структурах (например, в липопро-теидах низкой плотности) по сравнению с химическими (гомогенными) системами следует признать, что механизм действия токоферола остается во многом неясным.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в исследовании процессов, связанных с образованием липидных радикалов в ненасыщенных жирных кислотах фосфолипидов, а также в установлении связи между процессом образования липидных (перекисных) радикалов и функционированием биологических мембран в норме.

В соответствии с этим, в работе были поставлены следующие основные задачи, решение которых потребовало проведение экспериментальных исследований в три этапа; во первых

- Исследовать механизмы действия токоферола, обеспечивающего структурную стабилизацию искусственных мембран (липосомы) при активации ПОЛ азоинициатором, а также структурно-функциональную стабилизацию биологических мембран (микросомы печени) в условиях NADPH-зависимого ПОЛ и роль цепи NAD(P)H-nHioxpoM bs.

- Провести исследование синергетического действия а-гокоферола и таких восстановителей, как аскорбат и глутатион в микросомах. Исследовать механизм действия глутатиона, т.е. выяснить является ли синергетический эффект глутатиона результатом прямого (неферментативного) действия или результатом работы GSH-зависимого фермента.

Кроме того,

- Изучить инициирование образования липидных (перекисных) радикалов в микросомах печени и возможность контроля уровня радикалов с помощью про- и антиоксидантов, а также возможное влияние про- и антиокси-дантов на процесс гидроксилирования липофильного ксенобиотика, полициклического углеводорода - бенз(а)пирена.

Наконец,

- Провести детальное исследование редокс-зависимого перекисного окисления липидов в митохондриях печени, т.е. выяснить каковы разичия в интенсивности ПОЛ в митохондриях в различных функциональных состояниях.

- Изучить влияние редокс состояния убихинона, контролирующего уровень липидных радикалов в мембранах митохондрий, на процесс синтеза ATP, а

также возможность регуляции фосфорилироваиия ADP в результате напра! ленного изменения уровня липидных радикалов (с помощью про- и антиокс! дантов).

Научная новизна. В диссертационной работе предложен:

1. новый механизм действия биоантиоксиданта - а-токоферола, позвояющи объяснить его высокую эффективность в мембранах;

Исходя из новой роли токоферола в биомембранах, предложен:

2. механизм преобразования энергии в мембранах микросом; он позволяет обт яснить явление активации "спящих" цитохромов типа Р-450;

3. механизм внутркмембранного переноса энергии в мембранах митохондрш позволяющий объяснить явление decoupling (отключение).

Впервые проведено изучение функционально значимого, т.е. умеренног ПОЛ; установлено, что чем выше функциональная активность, тем ниже урс вень перекисного окисления липидов в мембранах. И наоборот, при работе ре доке цепи вхолостую происходит усиление ПОЛ, которое служит своего род инструментом разборки биологических мембран.

Предложен принципиально новый механизм действия токоферола, сс гласно которому взаимодействие с перекисными радикалами ведет не к образе ванию гидроперекисей, а к восстановлению исходной структуры жирной кис лоты фосфолипида. Рассмотрены два механизма действия токоферола: нефер ментативный (двухэлектронное окисление токоферола) и ферментативный м< ханизм с участием цепи NAD(P)H- цитохром bs.

Полученные в работе данные свидетельствуют в пользу представлений том, что фосфолипидная мембрана играет активную роль в преобразовали энергии. Предлагается механизм функционирования липидно-радикальны циклов, которые приводят к появлению липидных пульсаций в мембранах. Тг кой механизм преобразования энергии обеспечивает ее использование дл ферментативного катализа: гидроксилирования ксенобиотиков (микросомы) синтеза АТР. Рассматривается модель сопряжения окисления и фосфорилирс

вания, в которой находят свое объяснение не только uncoupling (разобщение), но и decoupling (отключение).

Научно-практическая значимость работы. Данное диссертационное исследование является составной частью программы ГКНТ 0.69.05 и 0.69.07 "Роль структурной организации мембран в их устойчивости и биоэлектрических функциях".

Полученные в работе экспериментальные результаты и теоретические обобщения расширяют представления о механизмах защиты биологических мембран, что позволяет по-новому оценить роль антиоксидантов и открывает новые подходы к проблеме использования природных и искусственных антиоксидантов.

Предложенный в работе УФ-мегод инициирования ПОЛ с помощью азо-инициатора может быть использован для скрининга антиоксидантов на таких моделях как липосомы и липопротеиды низкой плотности, что необходимо в ходе поиска новых соединений данного класса.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту. Витамин Е (токоферол) обладает универсальным стабилизирующим действием во внутриклеточных мембранах; это действие реализуется при физиологически значимых способах инициирования ПОЛ в биологических мембранах (активации кислородными радикалами).

Механизмы действия токоферола в химических (гомогенных) системах и биологических (гетерогенных) системах различны. Результат взаимодействия токоферола с лкпидными (перекисньши) радикалами в биологических мембранах может бьггь иной, чем в гомогенных системах. При взаимодействии токоферола с радикалами LO2 наряду с образованием гидроперекисей LOOH, возможен возврат жирной кислоты в исходное состояние LO2 —> LH (в результате замены Ог на Н-атом).

Для оценки роли радикалов необходимо иметь в виду возможность участия интермедиатов ПОЛ(перекисных радикалов) в редокс реакциях. Восстановление радикалов LO2 можег происходить в мембранах микросом и мито-

хондрий. В первом случае в реакции LOj -> LO2 участвует цепь NAD(P)H- ц» тохром b5, во втором - ферменты редокс-цепи.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на ко* ференциях и на научных семинарах; на кафедрах биофизики Биологического Физического ф-та МГУ, в институте биохимии им.А.Н. Баха, в институте хл мической физики им.Н.Н.Семенова, в кардиоцентре РАМН, в институте физи ко-химич. медицины, на конференциях в Москве, Ленин-граде, Киеве, Ереван« Kyoto (Japan), Lion (France).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 33 работы центральных академических и международных изданиях.

Методические аспекты работы. В качестве объекта исследования был использованы искусственные мембраны (липосомы), внутриклеточные орга неллы (митохондрии) и мембраны эндоплазматического ретикулума (микро сомы). В работе использовали крыс-самцов линии Вистар, которых содержал: на стандартной диете в условиях вивария.

Митохондрии и микросомы печени выделяли методом дифференци ального центрифугирования; фракции липопротеидов плазмы крови выделял] последовательным центрифугированием в солевой среде заданной плотности Однослойные липосомы получали методом озвучивания многослойных лило сом, приготовленных из природных и синтетических фосфолипидов.

Экспериментальное решение поставленных в работе задач потребовал! применение набора физико-химических и биохимических (препаративных) ме тодов; основные из этих методов перечислены ниже.

Суммарные лшшды из внутриклеточных мембран экстрагировали, ис пользуя стандартную методику (экстракцию смесью хлороформ-метанол). Со держание фосфолипидов определяли по фосфору. Степень восстановленност убихинона в митохондриях определяли после экстракции по поглощению окис ленной и восстановленной форм [Kroger,Klingenberg 1966]. Токоферол опреде ляли по методике [Burton et al. 1985] с некоторой модификацией.

б.

Перекисное окисление липидов инициировали ферментативным и неферментативным способом. В ряде случаев использовали азоинициатор Azo-isobutyronitri 1 (AIBN); разработанный нами метод УФ-облучения позволяет использовать этот инициатор и генерировать первичные радикалы при температуре 25-37° С . В частности, при инициировании ПОЛ в липосомах УФ-светом (X 320-380 нм) с помощью AIBN образование первичных радикалов происходит следующим образом:

R-N=N-R------------N2 + 2R"

Такой способ инициирования ПОЛ позволяет контролировать скорость процесса и в инициировании ПОЛ не участвует супероксид.

Содержание лшшдных гидроперекисей определяли по УФ-поглощению диеновых коньюгагов в области 233 нм [Recknagel, Glende 1984]; содержание малонового диальдегида (МДА) - по его реакции с тиобарбитуровой кислотой [Asakawa, Matsushita 1980].

Содержание цитохрома типа Р-450 в микросомах печени определяли по поглощению комплекса с СО [ Matsubara et al. 1976]. Скорость гидро-ксилирования полициклического углеводорода бенз(а)пирена и скорость расходования NADPH определяли методом прямой регистрации флуоресценции этих соединений [Yang,Kicha 1978].

Для генерации супероксида в микросомах использовали менадион; в митохондриях - эффект облучения NADPH ультрафиолетом.

NADPH -> NADPH* и NADPH* + 02 NADP+ + OJ

Поглощение кислорода регистрировали полярографическим методом с использованием платинового электрода. Мембранный потенциал определяли с помощью селективного электрода по распределению проникающего катиона тетрафенилфосфония (ТФФ+) [Кашо et al. 1979].

Скорость синтеза АТР оценивали тремя независимыми методами: фер-ментативно с помощью гексокиназы, глюкозы и глюкозо-6-фосфат-дегидро-геназы [Lamprecht, Trantschold 1974], либо контролируя длительность фосфори-

лирования ADP по величине мембранного потенциала, а также полярографи ски, определяя отношение ADP/0.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ (ВВЕДЕНИЕ)

Известно, что по механизму перекисного окисления осуществляются mi гие ферментативные реакции моно- и диоксигеназного окисления; циклоокс геназные и липоксигеиазные реакции синтеза простагландинов, лейкотриею тромбоксанов, обеспечивая нормальный синтез этих высокоактивных соедоя ний, используют ПОЛ в интересах живой системы. Заметим, что такой дестр> тивный процесс как окислительная разборка избыточных или неэффектив: функционирующих мембран также осуществляется в интересах организма.

Перекисное окисление липидов - процесс, протекающий практически : всех биологических структурах и являющийся проявлением токсического де ствия кислорода по отношению к легкоокисляемым соединениям, прежде все: фосфошшидам мембран, точнее к входящим в их состав ненасыщенным жи ным кислотам.

Перекисное окисление липидов инициируется первичными радикалам образующимися в основных и наиболее активных внутриклеточных редок системах - это системы электронного транспорта, расположенные во внутри ней мембране митохондрий и эндоплазматическом ретикулуме(микросомы). процессе работы этих систем энергия биологического окисления, ocbi бождающаяся при переносе электронов на кислород, с высоким КПД расход; ется на синтез АТР (митохондрии) и на окислительный метаболизм разнообра ных ксенобиотиков (микросомы). Однако, в процессе функционирования эти цепей по мере ступенчатого восстановления кислорода, как известно, образ; ются промежуточные продукты; это означает, что четырехэлектронное boccti новление молекулы кислорода до воды обычно сопровождается образование 0{ , Н202 и ОН'. Обладая высокой реакционной способностью и атакуя ней; сыщенные липиды, эти продукты могут инициировать реакции свободам: радикального окисления липидов.

Конечно, системы электронного транспорта представляют собой совершенные молекулярные машины, однако, самые надежные машины, в том числе и биологические, имеют предел точности функционирования. Поэтому существует определенная вероятность "утечки" промежуточных активных продуктов, а, значит, и опасность деструктивного действия кислородных радикалов. Мишенью для продуктов одно и трехэлектронного восстановления кислорода являются не только жирные кислоты фосфолипидов и белки; наиболее уязвимой и наименее защищенной мишенью для 0£ и ОН' является ДНК.

Заметного увеличения уровня супероксида, т.е. усиления его образования можно ожидать, например, при дефектах дыхательной цепи или в результате ишемии-реперфузии (когда происходит распад AMP с образованием ксан-тина). В таких случаях резко возрастает риск повреждения ДНК кислородными радикалами и, в первую очередь, митохондриальной ДНК, которая играет ключевую роль в целом ряде патологий, а также в процессах старения. Очевидно, что сосуществование клеток, страдающих подобными дефектами, с нормальными клетками представляет определенную опасность. Чтобы избежать такой ситуации, клетки, не имеющие эффективной системы защиты и не способные предотвратить накопление активных форм кислорода, должны быть уничтожены и это, по-видимому, происходит в результате апоптоза (Скулачев В.П. 1995).

В настоящее время установлено, что один из типов апоптоза запускается в условиях повышенной аккумуляции О2 и последующих ннтермедиатов (KaneD.J. etal. 1993). Программа клеточного самоубийства -"апоптоза" включает активацию свободнорадикальных процессов в плазматических мембранах [Fukasawa et al. 1996].

В настоящее время нет сомнения в том, что процесс ПОЛ является важнейшим физиологическим и патофизиологическим фактором модификации ли-пидного бислоя мембран митохондрий и макросом. Это связано не только с тем, что мембранные структуры потенциально подвержены окислительной деструкции, но и с тем, что ПОЛ изменяет интегральные характеристики бислоя -проводимость и микровязкость.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Глава 1. ПРОБЛЕМА СТАБИЛИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН ТОКОФЕРОЛОМ

Основные этапы перекнсного окисления липидов. На первой стадии процесса - стадии инициирования (реакция I) происходит образование лшщд-ного радикала в результате атаки первичного радикала И.'. Чаще всего это супероксидный анион радикал ) или гидроксильный радикал ОН". Первичный радикал отнимает у ненасыщенной жирной кислоты фосфолипида атом водорода, вследствие чего радикальное состояние переходит на молекулу липида (Ш—> С) с последующим присоединении к аллильному радикалу Ь* молекулы кислорода.

инициирование Я' цепи

ЬООН (1)

продолжение 02 цепи

ЬО'г^^р' (р* АОН

стабильные продукты взаимодейст-продукты вия с антиоксидантами

Схема 1-1. Основные стадии перекисного окисления липидов.

Из схемы следует, что перекисное окисление липидов (т.е. образование ЬООН) может контролироваться различными способами: либо путем ослабления стадии инициирования (реакция I), либо путем усиления стадии ингибиро-вания (реакция V). Существенным фактором, влияющим на стадию продолже

Принятые сокращения: ЬН - ненасыщенная жирная кислота фосфолипида; V и Ь0'2. аллильный и перекисный радикалы соответственно; ШОН - гидроперекись, АОН - антиоксидант.

ния цепи, является взаимодействие ненасыщенных жирных кислот между собой Вероятность такого взаимодействия т.е. липид-липидной (бимолекулярной) реакции ill , лежит в основе цепного процесса перекисного окисления липидов.

Для цепного процесса характерно то, что появление каждого радикала L' (LO2) ведет к появлению множества молекул LOOH. Количественной характеристикой этого процесса является такой параметр, как длина цепи п, т.е. количество молекул LOOH, возникающих в последовательной реакции после инициирования:

Каждая молекула ШОН (или Н202 ) при определенных условиях может послужить началом новой цепи

С учетом этого, обрыв цепи (в процессе (2)) не играет решающей роли, особенно в том случае, когда длина цепи п невелика. На наш взгляд, этот факт приобретает особый интерес при рассмотрении механизма действия биоантиоксидан-тов и, в частности, механизма действия основного биологического антиокси-данта а-токоферола (ТОН).

Общепринятый механизм действия токоферола. Конкретные физико-химические механизмы, лежащие в основе стабилизации токоферолом структуры и функциональных свойств биологических мембран, являются предметом исследования уже не один десяток лет. В настоящее время считается, что токоферол стабилизирует липидный бислой посредством нескольких молекулярных механизмов [Niki 1994, Ерин и соавт.1988]. Функция токоферола состоит в том, что он: а) защищает от перекисного окисления липидов; б) стабилизирует липидный состав и, значит, физическое состояние липидного бислоя; в) защищает от деструкции, вызванной продуктами гидролиза фосфолипидов фосфолипазой

LH 02 LH LOi —L- —L0'2 -Ар L"-----у—

LOOH (1) LOOH (2) LOOH (n)

LOOH

Fe2" Fe3* LH 02

-4-—y" LO'-Hjj——-- L02'— •

OH" LOH

(3)

Аг ; г) блокирует повреждающее действие синглетного кислорода. Мы оставляем в стороне две последние функции токоферола ( они подробно рассмотрены в обзоре [Ерин и соавт. 1988]), а будем рассматривать только его антиоксидант-ную активность.

В 1962 г. Таппель [Tappel 1962] предложил реакцию обрыва цепи в качестве механизма действия токоферола, т.е. реакцию:

LOj + ТОН Н> LOOH +■ ТО' (4)

которая снижает вероятность продолжения цепи. Таким образом, активный пе-рекисный радикал LO2 превращается в лерекиссь LOOH, а радикальное сотоя-ние переходит на токоферол. В дальнейшем радикал токоферола может взаимодействовать с другим перекисньш радикалом, приводя к обрыву еще одной цепи (LOj + ТО'-» LOO-ОТ).

Вывод о том, что радикал токоферола взаимодействует еще с одним пере-кисным радикалом следует из данных исследования стехиометрии процесса, согласно которым на уничтожение двух молекул LO2 (уровень радикалов регистрируется по интенсивности хемилюминесценции) расходуется одна молекула токоферола [Burton, Ingold 1981].

Факт взаимодействия LOj с ТОН был доказан во многих экспериментах [Tappel, Gruger 1970; Бурлакова и соавт. 1975] и не вызывает сомнений; тем не менее реакция (4) требует более детального изучения. В первую очередь это касается продуктов реакции; так, несмотря на то, что с помощью ЭПР удается зарегистрировать образование радикалов ТО' [Bascetta et al. 1983], стехиометриче-ское отношение ТО' к исходному ТОН не известно. Вторым продуктом этой реакции является перекись, однако образование LOOH в количестве эквимоляр-ном убыли ТОН достоверно наблюдается только в гомогенных системах, но отнюдь не всегда в биологических мембранах. Отметим, в связи с этим, работу [Liebler et al. 1986], в которой изучали кинетику перекисного окисления липи-дов в липосомах; регистрировали одновременно убыль токоферола и потребление кислорода, а также образование малонового диальдегида (МДА). Из по-

лученных данных следует, что в некоторых случаях реакцию (4) нельзя признать удовлетворительной.

Возможные альтернативы. Предлагаемая гипотеза. В качестве альтернативы рассмотренному выше механизму предлагалось взаимодействие токоферола с аллильными(не содержащими кислород) радикалами [Иванов 1985]. Нам представляется, что такое взаимодействие вполне реально при условии, что концентрация радикалов L' сопоставима с концентрацией перекисных ради-калолов. Такая ситуация может иметь место как в гомогенных системах, так и в мембранах, но и тогда предпочтительный выбор между радикалами L' и LCb должен определяться константами скоростей их взаимодействия с молекулой ингибитора. Величины констант скоростей, характеризующих способность токоферола реагировать с радикалами L' составляет 105 , а с LO2 - Ю7 М"' с"1 [Simic,Hunter 1983], что заставляет нас оценивать взаимодействие ТОН с ал-лильными радикалами как сравнительно редкое событие. Такое взаимодействие, по-видимому, имеет место при очень низком парциальном давлении кислорода.

При реальных значениях концентрации Ог в липосомах и биологических мембранах (константа взаимодействия радикалов L' с Ог равна 107 - 108 М"1 с"' ) концентрация перекисных радикалов превышает концентрацию аллильных радикалов и, значит, рассмотрение антиоксидантного эффекта токоферола невозможно без учета взаимодействия ТОН с LO2 . Рассматривая взаимодействие ТОН с LOi , мы должны признать, что такое взаимодействие в гомогенной системе безусловно ведет к образованию гидроперекисей [Witting 1979]. В то же время, принимая во внимание ряд фактов, мы считаем неприемлимым механическое перенесение реакции (4) из гомогенной на гетерогенные системы (липопротеиды и биомембраны); не исключено, что в биомембранах взаимодействие ТОН с радикалами LO2 следует рассматривать с других позиций.

Отметим также интересный факт, касающийся токоферола; электрохимическое изучение токоферола свидетельствует о том, что в присутствии НгО (в

отличие от гомогенной неводной фазы) окисление ТОН может идти по дву: электронному механизму [Магси5,Налу1еу 1970].

o-^ß

+ 2е + Н"

Мы уже отмечали, что при взаимодействии гидроперекисей с ионами ж< леза происходит редокс-зависимый разрыв 0-0 связи LOOH + Fe2+ -> LO'+ 0Н~+ Fe3' Можно думать, что подобного рода реакция (разрыв С-0 связи) происходит пр взаимодействии перекисных радикалов с токоферолом

LO; + ТОН ->(L' + 0J) + ТОН" с последующим восстановлением аллильного радикала

L' + ТОН+ -> LH + Т+ О

В целом можно записать две наиболее вероятные реакции взаимс действия радикалов LO2 с токоферолом:

LOOH + TO" (4)

LOj+ ТОН-<^

LH + Т О + Ol (5)

а также ТО' +- +2Н+-> Т* О + Н202 (6)

Согласно реакции (5) мы имеем дело с разрывом С-0 связи в молекуле жирно кислоты с последующим восстановлением С-Н связи ТОН Т+0

-СН=СН-СН=СН-СН^=-=^СН=СН-СН2-СН=СН- + Oj I .

В отличие от реакции (4), где ТОН реализует обрыв цепи с образо вание L00H, здесь нет образования гидроперекиси. Ясно, что реакция (4) не обесп< чивает полное ингибирование процесса перекисного окисления, коль скоро ест потребление О2 и накопление L00H. Ингибитор, введение которого не остан;

вливает процесс образования LOOH, а лишь замедляет его, следует считать слабым, в то время как токоферол является одним из самых эффективных антиоксид антов.

Из реакции (5) видно, что в процессе взаимодействия ТОН с пере-кисными радикалами образуется супероксид. Тогда, при выборе подходящего способа инициирования (без участия Ог ) в липосомах может быть зарегистрировано образование супероксида как результат двухэлектронного окисления токоферола. Конечно образование супероксидного анион-радикала выглядит несколько неожиданным. Но, супероксид может восстанавливаться в реакции (6) и кроме того в реальных биологических системах он утилизируется супе-роксиддисмутазой, которая, как известно, представляет собой один из факторов, контролирующих перекисное окисление липидов [Devasagayam 1986].

Глава2. СТАБИЛИЗАЦИЯ МЕМБРАН ЛИПОСОМ ТОКОФЕРОЛОМ ПРИ АКТИВАЦИИ ОКИСЛЕНИЯ АЗОИНИЦИАГОРОМ.

Глава посвящена изучению перекисного окисления липидов в липосомах не содержащих токоферол и в липосомах, обогащешшх токоферолом (мольное отношение токоферол/фосфолипид 1:200).

На рис.2-1 показано накопление гидроперекисей липидов в липосомах, не содержащих токоферол. Реакцию инициировали с помощью азоинициатора AIBN, концентрацию которого варьировали в пределах 0 - 250 мкМ; видно, что в интервале используемых концентраций скорость образования гидроперекисей прямо зависит от [ AIBN].

Образование перекисей липидов в липосомах, содержащих токоферол показано на рис.2-2. На этом же рисунке можно видеть убыль токоферола, который расходуется в одной или нескольких реакциях взаимодействия токоферола с радикалами L02 .В этом случае важно одновременно регистрировать содержание перекисей и токоферола в течение всего индукционного периода. Если реакция (4) является преобладающей, то должно наблюдаться образование LOOH в количестве эквимолярном убыли токоферола (ALOOH > ДТОН) . В любом другом случае образование LOOH должно быть небольшим по сравне-

кию с убылью токоферола и в этот период возможно появление иных продук тов взаимодействия токоферола с радикалами LO2.

Очевидно, что длительность индукционного периода зависит от кон центрации токоферола и для [ТОН]= 9 мкМ она составляет 80 минут. Индукци онный период можно условно разделить надвое: х{ (первые 40 минут), когдг токоферол полностью контролирует образование LOOH и х2 (вторые 40 минут) Количество перекисей, образующихся за 50 мин оказывается равным 1.8 мкМ (рис.2-2), т.е. в пять раз меньше количества израсходованного токоферола. Таким образом ALOOH < ЛТОН (при исходном отношении токоферол / фосфоли-пцд не менее 1:500) и отношение ДЬООН/ДТОН для 50 и 60 мин. инкубации равно соответственно 1:5 и 2 :7 вместо эквимолярного отношения, которое должно иметь место в реакции (4). Заметим, что образование LOOH в небольших количествах (особенно в период т2 ) неизбежно. Хотя токоферол перехватывает большую часть радикалов LO2 , при небольшой концентрации токоферола невозможно достичь 100%-ного перехвата.

Согласно реакции (5) при взаимодействии токоферола с радикалами LO2 может высвобождаться кислород в виде супероксида. Наряду с LOOH мы регистрировали Ог , пытаясь обнаружить супероксид в липосомах, инкубируемых при различных значениях pH, а именно 5.5 и 7.0, а также pH 8.5. На рис.2-3 показано восстановление цитохрома с в липосомах, инкубируемых в среде с pH 8.5. Видно, что в липосомах, содержащих токоферол, восстановление цитохрома с идет с высокой скоростью и этот процесс прекращается после израсходования токоферола. (В липосомах, не содержащих токоферол, наблюдается небольшое восстановление цитохрома с; это может быть связано с взаимодействием возбужденных молекул инициатора с кислородом и образованием Ог ).

Из полученных данных видно, что за 40 минут инкубации в липосо-мах восстанавливается 1 мкМ цитохрома с. Количество образующихся гидроперекисей можно оценить как ALOOH=0, а количество окисленного токоферола за этот период ДТОН=6 мкМ. Таким образом, количество регистрируемого суле-роксида составляет лишь 17-20% от количества окисленного токоферола. Не

[looh^MKm

МИН

^550-600nm

МИН

[0к-тф]/мкМ [looh],mkm

мин

Рис.2-1.Образование гидроперекисей в липосомах в зависимости от концентрации инициатора. Трис-НС1 50 тМ, липосомы 2 мМ I - 250 мкМ AIBN, 2 - 100 мкМ, 3-50 мкМ, 4 - без AIBN

Рис.2-2.Убыль токоферола (I) и образование гидроперекисей (2) в липосомах при pH 8.5.

Рис.2-3.Восстановление цитох-рома с в липосомах при разных условиях инкубации. 1-е токоферолом, 2 - без токоферола, Зи4-1и2 + СОД, 5 - I + инактивированная СОД.

исключено, что реальный уровень образуемого супероксида гораздо выше, а полученный нами результат занижен из-за реакции (6) и окисления цитохрома перекисью водорода.

Существует как минимум три разных варианта объяснения обнаруженного нами факта восстановления цитохрома с.

(1) цитохром с восстанавливается в результате прямого взаимодействия с токоферолом;

(2) цитохром с восстанавливается супероксидом, который образуется в результате автоокисления ТОН при щелочных рН (как это имеет место с убихиноном);

(3) восстановление цитохрома с связано с предполагаемым образованием супероксида в результате взаимодействия Ь0'2 с токоферолом.

В работе мы использовали липосомы из азолектина и лецитина. Липосо-мы приготовленные из азолектина устойчивы к окислению и, инкубируя такие липосомы при рН 8.5, мы не наблюдали ни убыль токоферола, ни образование супероксида. Это означает, что рН-зависимое автоокисление токоферола (рК=13) может быть исключено из рассмотрения. Восстановление цитохрома с действительно связано с появлением суперокида; в присутствии супероксид-дисмутазы этот процесс ингибируется полностью.

В целом эксперименты с липосомами показали, что

1. Восстановление цитохрома с происходит вслед за инициированием ПОЛ азоинициатором.

2. Восстановление цитохрома с ингибируется супероксиддисмутазой.

3. Период восстановления цитохрома с совпадает с периодом расходования токоферола.

4. Количество израсходованного токоферола и количество образованных гидроперекисей, измеренные в течение индукционного периода, не эквимолярны (ДЬООН < ДТОН).

Отметим, что вероятность окисления токоферола по двухэлектронному механизму и обнаружения О2 зависит от рН среды. Нам удалось достоверно за-

регистрировать образование супероксида в липосомах только при рН 8.5 и уровень супероксида зависел от того, в каком растворителе добавляли инициатор (с бутанолом он оказался выше, чем с этанолом, однако эффект растворителя остается неясным). В то же время, количество гидроперекисей, образующихся в липосомах, не содержащих токоферол, зависело только от концентрации А1ВЫ и не зависело от используемого растворителя.

Независимо от количественного результата само образование Ог и сравнительно низкий уровень ЬООН свидетельствуют о том, что мы имеем дело с нетривиальным фактом; взаимодействие радикалов Ь02 с токоферолом в липосомах (рН 8.5) не ведет к образованию перекисей. Предлагаемый нами механизм можно представить в виде цикла:

Схема 2-1. Циклическое превращение липидных радикалов.

Эта схема показывает два возможных пути превращения Ь02 в биологических мембранах; направление процесса зависит от соотношения скоростей У3 и У4. В отсутствии токоферола (Уз=0) в мембранах неизбежно образование гидроперекисей и других продуктов перекисного окисления липидов. В присутствии токоферола и аскорбата происходит ингибирования образования ЬООН (У3 > У4). Важно отметить, что рассматриваемая модель исключает накопление перекисей, т.е. наличие цикла позволяет поддерживать в мембранах определенную концентрацию липидных радикалов без риска накопления разрушающих мембрану гидроперекисей.

Очевидно, что рассматриваемый процесс окисления наряду с вопросом о молекулярном механизме действия токоферола затрагивает вопросы стабилизации жирнокислотного состава мембран, ионной проницаемости и функционирования мембран в целом. Во многих случаях функция мембраны, как известно,

ЬООН

Т+0

ТОН

аскорбат

связана с ее фазовым состоянием и температура фазового перехода зависит от степени ненасыщенности жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов. Чем больше двойных связей в углеводородной цепи, тем больше опасность окислительной деградации фосфолипидов. Поэтому, защищая мембраны от пе-рекисного окисления липидов, токоферол тем самым обеспечивает выполнение мембранами их многочисленных функций в широком диапазоне температур.

Отметим, что являющаяся общепринятой реакция обрыва цепи , т.е. реакция 4 не обеспечивает необходимое ингибирование процесса перекисного окисления липидов (коль скоро накапливается LOOH). Реакция обрыва цепи эффективна для гомогенной системы, поскольку она прерывает образование большого числа молекул LOOH (102 - 103). В мембранах, где длина цепи, по некоторым данным, не превышает нескольких единиц эффект антиоксиданта, если он действует по реакции (4) должен быть значительно слабее.

Это означает, что любой ингибитор, действующий в мембране по механизму L02 + АОН-> LOOH + АО может лишь снизить скорость образования перекисей. Ингибитор, введение которого не останавливает реакцию, а лишь замедляет ее следует считать слабым. Токоферол, однако, является одним из самых эффективных биоантиоксидантов и мы считаем, что тому есть единственное объяснение; суть его в том, что при взаимодействии токоферола с пе-рекисным радикалом происходит не просто обрыв цепи. В процессе такого взаимодействия возможно полное блокирование образования LOOH и оно происходит в результате возврата молекул липидов в их исходное (неокисленное) состояние.

Глава 3. ПРОБЛЕМА СТАБИЛИЗАЦИИ МЕМБРАН ТОКОФЕРОЛОМ ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ЗНАЧЕНИЯХ pH.

Антиоксидантные свойства токоферола, как известно, определяются: 1. Наличием HO-группы хроманового ядра, способной легко отдавать атом водорода на липидный радикал; 2.Высокой липофильностью, которая обеспечивает встраивание токоферола в мембраны; 3. Достаточно высокой подвижностью в липидном бислое, которая, тем не менее, не столь высока, чтобы оказывать по-

бочное пертурбирующее воздействие на мембрану. Эти свойства обеспечивают взаимодействие токоферола с липидными (перекисными) радикалами в биологических мембранах. Вопрос в том, каков результат такого взаимодействия; действительно ли это просто перенос Н-атома на радикал Ь02 (образование ЬООН) или есть другой путь - блокирование образования ЬООН?.

В 1990 г. была высказана гипотеза о том, что в биомембранах возможны два типа взаимодействия токоферола с перекисными радикалами ЬО"2 [Дмитриев,Верховский 1990]. О!

ю;-у—>■ ЬООН Ь02 , > ЬОг-^Д ЬН

Н-атом (е) Н-атом

ТОН —> ТО тон ^--^—>• т+о

Схема 3-1. Возможные варианты взаимодействия токоферола с перекисными радикалами.

Данные о несоответствии в образовании ЬООН и убыли ТОН получены при рН 8.5, но они представляют несомненный интерес, поскольку демонстрируют принципиальную возможность блокирования образования перекисей ли-пидов. В биологических мембранах при рН 7.5, на наш взгляд, вполне реальным является вариант двухэлектронного восстановления радикалов Ь02, представляющий собой комбинацию описанных выше реакций, а именно:

Ь02 > ьо2 ь ^ > ьн

донор —» (£) Н-агом

ТОН -> ТО'

Схема 3-2. Редокс-реакции радикалов с участием донора электрона и донора водорода.

Это означает, что в биологических мембранах, функционирующих при физиологических значениях рН, можно достичь полного блокирования ПОЛ,

если обязательная стадия восстановления перекисных радикалов, т.е. Ь02->

Ь02 реализуется с помощью внешнего донора. Наличие такого донора позволяет использовать токоферол на второй заключительной стадии. Если в восста-

новлении Юг + е —> Ь02 участвует внешний донор, то тогда при взаимодействии с токоферолом возможен возврат молекулы липида в ее исходное состояние в результате одно-электронного окисления токоферола. Последнее весьма важно, поскольку и токоферол и аскорбат при нормальном рН функционируют как доноры Н-атома (ЪЦшДеПеу 1991, иеЫег 1992].

Таким образом, вариант, обеспечивающий высокую эффективность токоферола как антиоксиданта (представленный на схеме 3-2), может быть реализован в биологических мембранах, если среди редокс компонентов имеется подходящий донор электронов. Основным результатом реакции с его участием является ослабление и последующий разрыв С-0 связи в молекуле Ъ0'2 . Благодаря разрыву С-0 связи, происходит изменение отношения концентраций ал-лильных и перекисных радикалов (при этом оба радикала локализованы на границе раздела фаз вблизи ОН-группы токоферола). Отношение [Ь' ]/ [ЬОг ] существенно меняется в пользу Ь' ; при этом продуктом реакции взаимодействия с токоферолом является исходная молекула ЬН (и О2), а не ШОН. Таким образом, можно предположить, что в ингибировании перекисного окисления мембранных фосфолипидов участвуют три основных фактора: неизвестный редокс переносчик, токоферол и супероксидписмутаза.

Глава 4. СТАБИЛИЗАЦИЯ МЕМБРАН МИКРОСОМ ТОКОФЕРОЛОМ РОЛЬ ГЛУТАТИОНА И ЦЕПИ ЫАО(Р)Н-ЦИТОХРОМ Ь5.

В данной главе рассматривается ингибирующий эффект глутатиона (глутатион-зависимого фермента) и редокс цепи К,АО(Р)Н-цитохром Ь5 . Предполагается, что таким образом удасться найти кандидатов на две вакантные роли: роль ЬОг -редуктазы и ТО (Т+0)- редуктазы. На одну из них может претендовать цитохром Ьз, на другую - мембранный глутатион-зависимый фермент.

Перекисное окисление липидов в мик-росомах.Эффект рН.

Выделение микросом, как известно, это длительная процедура и всегда в процессе выделения значительная часть токоферола превращается в токофе-рилхинон. Нативные микросомы печени (содержащие в основном токоферил-хинон) и микросомы, обогащенные токоферолом, инкубировали в присутствии ЫАБРН (или ЫАОРН-генерирующей системы) при 1=30° С и рН 7.5 или 8.5 (рис.4-1).

Как видно из рисунка микросомы, инкубируемые при щелочном рН более резистентны к ПОЛ по сравнению с микросомами, инкубируемыми при нормальном рН. Этот эффект не связан с МАОРН-зависимым флавопротеидом, т.к. активность ЫАБРН-цитохром с редуктазы при этих значениях рН остается неизменной. Таким образом, токоферол оказался более эффективен при рН 8.5, чем при рН 7.5, что согласуется с данными полученными на липосомах.

Естественно, что здесь возникает вопрос о супероксиде. Если речь идет о его регистрации при разных рН, то следует учитывать такой фактор, как время жизни супероксида (02 +- Н-й-НОг, рК= 4.8). С учетом этого мы изучали рН- зависимость генерации О; в микросомах и системе ксантин-ксантиноксидаза, регистрируя Ог-зависимое восстановление НСТ (рис.4-2). Если в ксантиноксидаз-ной системе скорость образования супероксида при увеличении рН с 7.5 до 8.5 возрастает в три раза, то в микросомах наблюдается более чем трехкратное увеличение.

Такое превышение, на наш взгляд, можно объяснить тем, что при рН 8.5 существует еще один путь образования 02 помимо известного восстановления кислорода флавопротеидом. В противном случае при сдвиге рН в щелочную сторону в микросомах следовало бы ожидать трехкратное увеличение уровня 02, как это имеет место в ксантин-оксидазной системе. Скорее всего регистрация "избыточного" О2 может быть следствием появления дополнительного О2 в результате разрыва С-О связи в молекуле жирной кислоты при ее взаимодействии с токоферолом (Ь0'2 + ТОН —> ЬН + Т+0 + Ог).

Перекисное окисление липидов в микросомах. Эффект ввН.

Эффект глутатиона на перекисное окисление липидов в нативных микро-

aS35nm 0.25

■/(pH 7,5) / ,¿2 (pH 8,5)

10 20 30 мин

Ю ч

о;

1 см

о 3

ос

х О са

о о

Ю О а. Ю о

Е ^

и о а. о

<р,0

к535 лгл

мин

Рис.4-1.Кинэ тика образования МДА в контрольных микросомах (1,3) и в микросомах, обогащенных токоферолом (2,4). Среда инкубации: 0.15 М KCl, 50 мМ Трис-HCl буфер, 5 шМ MgS04, 500 мкМ NADPH Рис.4-2.Скорость образования 0g в растворе, содержащем ксантин-ксантиноксидазу -и в микросомах печени - И Рис.4-3.Кинетика образования МДА в микросомах печени. I - без токоферола, 2-5 - с токоферолом. 2 - контроль, 3 + глутатион, 4 + аскорбат, 5 + глутатион и аскорбат.

сомах и в микросомах, обогащенных токоферолом показан на рис.4-3. Как видно из рисунка глутатион оказывает явный защитный эффект против ПОЛ в микросомах, содержащих токоферол. В этих экспериментах интенсивность поглощения кислорода и образования МДА зависела не только от содержания токоферола, но в значительной степени и от содержания глутатиона и аскорба-та. Так, например, длительность лаг-периода увеличивалась с 6 до 12 мин. (0.2 мМ GSH) и с 6 до 16 мин. (0.5 мМ аскорбата). Важно отметить, что в микросомах, инкубируемых с GSH, мольное отношение [02] / [МДА] оставалось неизменным и, следовательно, ингибирование ПОЛ происходило, по-видимому, на стадии образования LOOH.

Существует как минимум три разных варианта объяснения защитного действия глутатиона:

1. GSH перехватывает липиднме радикалы и (или) супероксид;

2. GSH напрямую восстанавливает радикалы токоферола;

3. GSH является субстратом ферментативной реакции.

Роль глутатиона как перехватчика липидных ( L' и L02) радикалов можно исключить. Что касается взаимодействия GSH с супероксидом, то оно действительно существует [Asada,Kanematsu 1976], но никак не объясняет синергизм GSH с токоферолом [Reddy et al. 1982].

В целом, с учетом сходного действия глутатиона и аскорбата мы полагаем, что наблюдаемый нами защитный эффект несколько отличается от того, что известно о глутатионе [Reddy et al. 1982, Liebler et al. 1986, Wefers and Sies 1988, Palamanda and Kehrer 1992]. На наш взгляд, существуют два GSH-зависимых фермента - GSH (LOOH) пероксидаза и мембранный фермент, открытый Урзини [Ursini et al. 1982] .Последний, подобно аскорбату, обеспечивает регенерацию токоферола, восстанавливая радикал и/или карбокатион токоферола, и его можно рассматривать как GSH (Т+0) редуктазу. В этом случае благодаря постоянной регенерации токоферола будет поддерживаться неизменный уровень токоферола и длительность лаг-периода будет зависеть от концентрации восстановленного глутатиона.

Перекисное окисление липидов. Цепь NADH- цитохром bs.

Мы считаем, что в мембранах микросом возможны два принципиалы разных механизма взаимодействия токоферола с перекисными радикалами:

LH-' L'-- LOj ^— > LOOH (I)

(ё)-J ТОН ТО'

' V У

L02-^ ^ ■ LH (И)

о2т

На схеме показано взаимодействие токоферола с перекисными радикалами L( и восстановленными перекисными радикалами LO2. Мы полагаем, что в биол гических мембранах возможны два механизма действия токоферола - обгцепр] нятый механизм обрыва цепи и механизм, полностью исключающий образов ние LOOH. Вместо LOOH во втором случае образуется супероксид, а с учето его взаимодействия с радикалами токоферола ТО', т.е.

ТО' + 01 Г О + Н202 (III)

конечным продуктом реакции является перекись водорода. Регенерация ток< ферола осуществляется аскорбатом или GSH(T+ О) редуктазой.

Таким образом, в ингибировании перекисного окисления мембранны фосфолипидов наряду с а-токоферолом участвует LOj-редуктаза и при с< вместном действии фермента и а-токоферола возможен возврат молекулы ш пида в ее исходное состояние. Липидно-радикальный цикл (LH —► LO2 —«• LF и полное блокирование образования LOOH в биологических мембранах могу быть реализованы, если среди компонентов редокс-цепи имеется подходящи донор электронов, способный отдавать электрон на радикал LO2.

Известно, что мембраны микросом содержат две системы электронног транспорта. NADPH-зависимая система, как известно, способна восстанавлг вать кислород по одно-, двух- и трехэлектронному механизму, что приводит образованию гидроксильных радикалов. Последние выполняют роль первичны радикалов, инициирующих ПОЛ. Вторая, т.е. NADH- зависимая цепь не спс

Рис.4-4. Кинетика ЫАОРН-зави-симого образования МДА в контрольных микросомах (1) и в микросомах, обогащенных токоферолом (2).

Среда инкубации: 0.15 М КС1, 50 шМ Трис-НС1 буфер ,рН 7.5 5 мМ Мв304, 500 мкМ КАОРН

Рис. 4-5. Изменение эффективности токоферола как антиоксиданта при ингибировании цепных свободно-радикальных процессов ПОЛ с разной длиной цепи.

Рис.4-6. Кинетика СиООН-зависи-мого образования МДА в контрольных микросомах (1) и в микросомах, обогащенных токоферолом (кривые 2 и 3) 2 - без ЫАБН, 3 - с ЫАОН

собна восстанавливать кислород до ОН' радикалов и стимулировать образование липидных радикалов. Эта система обрывается на цитохроме Ъ5, не достигая кислорода.

Отметим, что вопрос о функциональной роли цепи ЫАБН-цитохром Ь5 остается среди нерешенных проблем микросомального и митохондриального окисления на протяжении 20 лет. Огромная каталитическая мощность этой системы, ее широкое распространение в мембранных структурах в какой то мере противоречат представлениям о тех функциях, которые она выполняет.

В поисках возможного кандидата на роль ЬОг-редуктазы мы предположили, что эту функцию может выполнять цепь ЫАБ(Р)Н- цитохром Ьг. Для проверки этого предположения мы изучали перекисное окисление липидов в на-тивных микросомах печени и микросомах, обогащенных токоферолом, инициируя ПОЛ двумя разными способами, а именно используя ЫАОРН или перекись кумола (рисУ-£). Оказалось, что токоферол как антиоксидант абсолютно неэффективен во втором случае; антиоксидантный эффект токоферола при инициировании ПОЛ перекисью кумола проявляется, если в среде инкубации присутствует ЫАОН.

Кроме того, в присутствии токоферола следует ожидать усиление образования перекиси водорода. (Отметим, что измерение уровня Н202 в микросомах проводится в присутствии ингибитора каталазы, например, азида натрия). Однако, оказалось, что точное количественное измерение Н2О2 сопряжено с определенными трудностями, поскольку ингибитор каталазы является также и ингибитором ЫАОРН-цит.с редукгазы. Достоверные данные удается получить только на дважды осажденных ыикросомах; такие микросомы содержат меньше белка-каталазы, чем микросомы, выделенные по обычной методике.

Напомним, что процесс последовательного восстановления молекулярного кислорода лежит в основе двух главных типов окислительных превращений биосубстратов в клетке: оксидазного и оксигеназного.

5 гс ох

- оксидазный путь - Ог -- Н20

См

О2 — ,- диоксигеназный путь-- Ь - ООН

П—монооксигеназный путь —- X - ОН + Н20

Первый и второй пути утилизации кислорода реализуется в мембранах митохондрий, второй и третий - в мембранах микросом. Предложенный нами механизм восстановления липидных (перекисных) радикалов с участием токоферола фактически означает включение Ог в Н2О2 вместо образования ЬООН.

Таким образом, в мембранах микросом с помощью цепи ЫАВ(Р)Н- цито-хром Ьз и токоферола существует возможность переключения кислорода с диоксигеназного пути на оксидазный путь. На первый взгляд, кажется, что переключение на оксидазный путь это просто бесполезная трата восстановительных эквивалентов и кислорода. В то же время не исключено, что именно такой процесс свободного окисления в микросомах позволяет снизить уровень кислорода в клетке до некого оптимального значения.

Один из основных выводов данной работы состоит в том, что в биологических мембранах исходно имеется система контроля, способная блокировать окислительный стресс в печени. Начиная с работ Н,М.Эмануэля считается, что свободно-радикальные ингибиторы в биологических процессах (по аналогии с процессами окисления органических соединений) действуют по механизму обрыва цепи. Вопрос в том, могут ли классические цепные радикальные процессы реализовываться в биологических мембранах или же длина цепи в мембранах равна единице (т.е. в результате одного акта инициирования возникает одна молекула гидроперекиси). Но, даже если длина цепи в мембранах равна единице (именно на это указывают эксперименты с перекисью кумола), токоферол может действовать эффективно как антиоксидант благодаря суще-

микросомы и митохондрии

митохондрии

Рис. . Защита мембранных липидов от окисления

На рисунке представлена половина бислоя мембраны, (а) Инициирование процесса ПОЛ первичным радикалом И' - отрыв атома водорода от молекулы жирной кислоты и образование аллильного радикала; (Ь) Присоединение кислорода с образованием перекисного радикала(коньюгированных диенов); (с) Изменение конформации жирной кислоты (локализация С-00" группы на границе раздела фаз); Ш) Перенос электрона на молекулу жирной кислоты (е) Превращение перекисного радикала в исходную молекулу и высвобождение супероксидного анион радикала.

ствованию в мембранах особой редокс-цепи, обеспечивающей восстановление перекисных радикалов, т.е. цепи КАО(Р)Н- цитохром Ь5.

Процесс образования и превращения липидных радикалов включает в себя несколько стадий:(а) Инициирование процесса первичным радикалом Я'- отрыв атома водорода от молекулы жирной кислоты и образование аллильного радикала; (Ь) Присоединение кислорода и образование перекисного радикала (С- О- О О С- О -б, делокализация электрона приводит к появлению диполя ). (с) Изменение конформации фрагмента жирной кислоты и выход С-0-0 группы на границу раздела фаз; (<1) Присоединение электрона к группе С-0-0 ; (е) Возврат жирной кислоты в исходное состояние и высвобождение супероксида.

Цитохром Ъ5, как известно, - амфифильный белок; он содержит 133 аминокислоты и своим меньшим по размеру гидрофобным доменом (25 остатков) погружен в микросомальную мембрану. Остальной, больший по размеру гидрофильный, каталитически активный домен находится в полярной фазе и его гемовая группа доступна для атаки различными агентами, растворимыми в воде. Таким образом, гемовая группа цитохрома Ь3 (потенциальный донор электрона), как и С-00 группа жирной кислоты фосфолипида (акцептор) находятся вблизи границы раздела фаз.

В настоящее время вопрос, связанный с функционированием АОС печени, на наш взгляд, становится все более актуальным и здесь на первом плане оказывается проблема контроля за образованием перекисей в мембранных структурах. Отметим, что поддержание оптимального уровня липорастворимых антиоксидантов - это необходимое, но не достаточное условие. Мы полагаем, что в контроле ПОЛ в печени участвуют три основных фактора: цепь ЫАБН-цитохром Ьз , действующая как Ь02 -редукгаза, а-токоферол и аскорбат. Если учитывать роль цитохрома 1>5, то становится понятным почему снижение антиокислительной активности в печени, как правило, не компенсируется даже большим количеством токоферола, поступающего в организм с пшцей.

Перекисное окисление липидов и атерогенез.

Сейчас уже очевидно, что развитие атеросклероза связано с окислительным стрессом (взрывом), однако до сих пор окислительный стресс в печени не рассматривался в числе вероятных причин модификации LDL. В то же время, окислительная модификация LDL, по-видимому, в равной степени может быть результатом слабой антиокислительной системы (АОС) печени и/или результатом имунного воспаления, развивающегося в сосудистой стенке. Иными словами, окислительный стресс в печени по своим последствиям сходен с окислительным взрывом в макрофагах. Сейчас уже во многих экспериментах in vitro показано, что инкубация LDL с макрофагами или моноцитами, продуцирующими анион-радикалы 02 приводит к окислительной модификации LDL.

Из изложенного выше следует, что вспышка ПОЛ в печени может возникнуть тогда, когда совокупность мер по защите липидов печени от окисления недостаточна. Такая ситуация, в частности, возникает в печени в результате ишемии/реперфузии. Другим примером могут служить эксперименты на крысах с использованием диеты, дефицитной по холину [Wilson et al.1972]; дефицит холина тормозит синтез одного из основных фосфолипидов и приводит к значительному увеличению отношения фосфатидилэтаноламин/фосфатидилхолин (ФЭ/ФХ). Это приводит к вспышке ПОЛ в печени и окислительной модификации LDL, а затем и к постепенному развитию атеросклероза у большей части животных.

Известно, что физическое состояние плазматической и внутриклеточных мембран чрезвычайно важно для выполнения свойственных им функций. Например, адекватный ответ клетки на то или иное внешнее воздействие зависит от вязкости плазматической мембраны. Установлено, что отношение ФЭ/ФХ в норме составляет примерно 1:2 и от этого отношения зависит вязкость бислой-ных мембран, образуемых фосфолипидами в живых организмах. Один из способов изменения вязкости - активация метилтрансферазных ферментов.

Отметим что, результат избытка холестерина(ХЛ) по влиянию на вязкость мембраны аналогичен результату дефицита холина и в обоих случаях имеет место активация ПОЛ (образование гидроперекисей, LOOH). Возможно это связано с компенсаторной реакцией, направленной на сохранение исходной вязкости мембран, но тогда возникает вопрос, насколько значительны могут быть негативные последствия такой компенсаторной реакции.

Известно, что заболеваемость сердечно-сосудистыми болезнями в разных регионах различна и это в какой-то мере определяется различиями в потребляемой пище и содержанием в печени и липолротеидах низкой плотности ли-порастворимых антиоксидантов [Gey,Puska 1989]. Так, исследования среди европейцев указывают га наличие обратной связи между смертностью от ишеми-ческой болезни сердца и содержанием антиоксидантов в плазме крови [Gey et al. 1991]. Основной вклад в формирование этой зависимости вносит токоферол. Уровень токоферола в крови и риск заболеваемости атеросклерозом также имеют обратную корреляцию [Gey et al. 1987].

Представленные здесь данные свидетельствуют о том, что токоферол эффективен в биомембранах как антиоксидант , если он действует вместе с ре-докс-цепью NAD(P)H- цитохром Ь5. Конечно, мы пока еще не имеем данных о наличии корреляции между возникновением и развитием какой-либо патологии и активностью ЬОг -редуктазы. В то же время очевидно, что изучение всех аспектов, связанных со статусом LDL и особенно выяснение вероятной зависимости модификации LDL в печени in vivo от активности ферментов, обеспечивающих работу токоферола, могло бы заметно расширить наши знания о биохимических аспектах атерогенеза. Речь, в частности, идет о двух редуктазах, играющих ключевую роль: LOj- редуктазе и GSH-зависимом ферменте Т^О -редукгазе.

Мы уже отмечали экспериментальные данные, полученные Вильсоном и соавт. [Wilson et al. 1972-74]; согласно этим данным при дефиците холина атеросклероз развивается не у всех, а примерно у 60% животных. Эти данные указывают и на важную роль антиоксидантов; добавление в пищу ионола при хо-

лин-дефицитной диете приводило к увеличению антиокислительной актив-кости печени, что позволяло не только блокировать ПОЛ в печени, но и предотвращало развитие атеросклероза.

Основной вопрос, который возникает при анализе этих данных заключается в том, почему при одинаковом прооксидантном воздействии атеросклероз развивается только у 60% животных и не развивается у остальных 40%. В настоящее время на этот вопрос нет определенного ответа. В то же время, согласно нашим данным, наряду с хорошо известными цитозольными ферментами - супероксиддисмутазой и глутагионпероксидазой мы можем включить в ан-тиоксидантную систему еще один фермент; это мембранный фермент, действующий в паре с токоферолом, а именно Ь0'2- редуктаза.

Учитывая это обстоятельство, группу животных, использованных в эксперименте Вильсона, на наш взгляд, можно было бы разделить на две подгруппы - с высокой активностью (у 40%) и с низкой активностью Шг- редуктазы (у 60%). Вполне возможно, что низкая активность этого фермента предопределила слабую эффективность токоферола и единственной защитой против вспышки ПОЛ в этом случае было применение искусственного антиоксиданта. В эксперименте Вильсона в качестве такого антиоксиданта использовали ионол. Конечно, предлагаемое объяснение это только предположение, в основе которого лежит новый механизм действия токоферола и, как всякое новое предположение, оно требует самой серьезной экспериментальной проверки. Глава 5. ГИДРОКСИЛИРОВАНИЕ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ.

СВЯЗЬ С ПЕРЕКИСНЫМ ОКИСЛЕНИЕМ ЛИПИДОВ.

Чужеродные соединения (ксенобиотики) и, в частности, полициклические углеводороды (липофильные ксенобиотики), попадающие в организм животных, подвергаются биотрансформации, в результате чего превращаюся в более полярные и легко выводимые метаболиты. Системы, осуществляющие метаболизм ксенобиотиков обнаружены во многих тканях млекопитающих; главным органом, ответственным за метаболизм чужеродных соединений, является печень.

Гидроксшшрование ксенобиотиков - это монооксигеназеая реакция, катализируемая цитохромом типа Р-450 при участии NADPH- зависимой редокс-цепи, точно также как и перекисное окисление липидов. Начиная с середины 70-х г.г. было опубликовано ряд работ, посвященных исследованию ингиби-рующего действия полициклических углеводородов на перекисное окисление липидов [Pedersen et al. 1974, Бурлакова и соавг. 1975, Белевич и соавт.1988]. Уже тогда было ясно, что это действие не может быть объяснено простой конкуренцией за цепь окисления NADPH и имеет, по-видимому, более сложный характер. На это, в частности, указывает тот факт, что бенз(а)пирен -Б(а)П -эффективно ингибирует об-разование продуктов перекисного окисления липидов в системе NADPH+ аскорбат [Pedersen et al. 1974]. Поэтому ингибирующее действие Б(а)П на ПОЛ и особенно влияние про- и антиоксидантов на эти процессы требует более детального рассмотрения.

Мы исследовали влияние Б(а)П на процесс перекисного окисления липидов в микросомах печени. Введение Б(а)П в суспензию микросом заметно снижает интенсивность накопления МДА при NADPH-зависимом ПОЛ. Постепенное увеличение концентрации Б(а)П до 600 нМ приводит к полному ингибиро-ванию образования МДА в микросомах. Следует отметить, что такое ингибиро-вание ПОЛ бенз(а)пиреном наблюдается лишь в отсутствии экзогенного железа (рис.5-1). С учетом этого трудно признать удовлетворительным существующее объяснение ингибирующего действия гидроксилирования Б(а)П на ПОЛ, связанное только с аниоксидантным действием 3-ОН-Б(а)П.

Влияние прооксидантов на гндроксилирование Б(а)П. Известно, что процесс ПОЛ стимулируется ионами переменной валентности, в частности, ионами железа [Wills 1969]; ионы Fe2+ эффективны в концентрации 5-15 мкМ. Мы изучали влияние ионов Fe 2+ на гндроксилирование Б(а)П, используя тот же диапазон концентраций. На рис.5-2 представлена зависимость скорости гидроксилирования Б(а)П от концентрации Fe2+, которая имеет вид кривой с насыщением в области 10-15 мкМ точно также, как это имеет место для процесса

о <

О!

со £

п <

о £

< <с

у:

СО £

1 X

л <

X •р

Сз

20 -

1 2 3 4 5 6 мин.

10 15 20 [Ге2+]/ мкМ

2.5 мин.

I !

№Т)Н РеЭО/, КАИН,

Рис.5-1. Влияние Б(а)П на кинетику ПОЛ в микросомах печени.

1 - контрольные микросомы

2 - микросомы + 10 мкМ РеЗСЛ белок 1 мг/мл, £ = 35°С. Среда инкубации: 0.15 М КС1, 50 мМ Трис-НС1 буфер, рН 7.4 5 ыМ М^ЗО* 100 мкМИАОРН

Рис.5-2. Зависимость скорости гидрохсилирования Е(а)П от концентрации ионов Ре2+ . (Среда инкубации как на рис.5-1)

Рис.5-3. Кинетика КАОН-зависи-иого гидрохсилирования Б(а)П; стимулирование гидроксиирова-ния ионами Ре2+. ЫАБН -100 мкМ, РеЗОл-5 мкМ

ПОЛ образование МДА). Представляет интерес тот факт, что одни и те же концентрации ионов железа оказываются оптимальными для двух разных реакций.

Таким образом, обнаружено, что при добавлении к микросомам Ре2+ происходит увеличение скорости ЫАОРН-зависимого гидроксилирования Б(а)П -процесса, катализируемого цитохромом типа Р-450. Стимулирующее влияние ионов Ре2+ полностью снимается при добавлении ЭДТА, а трехвалентное железо при тех же концентрациях не влияет на процесс гидроксилирования Б(а)П.

При исследовании влияния ионов железа на гидроксилирование Б(а)П обнаружена способность Ре24" стимулировать не только КАБРН-зависимое, но и ЫА1)Н-зависимое гидроксилирование Б(а)П. Известно, что ЫАБН может оказывать синергетическое действие на КАОРН-зависимое гидроксилирование Б(а)П. Нами было обнаружено гидроксилирование Б(а)П в микросомах печени в условиях, когда в качестве восстановительных эквивалентов использовали только ИАБН (рис.5-3).

Как видно из рисунка, добавление ИАБН в суспензию микросом не стимулирует гидроксилирование Б(а)П и только при последующем добавлении РеБ04 наблюдается снижение интенсивности флуоресценции в результате активации КАОН-зависимого гидроксилирования Б(а)П. Скорость метаболизма Б(а)П в этом случае сравнима со скоростью гидроксилирования Б(а)П, стимулируемого КАБРН-зависимой цепью. Наблюдаемое действие Ре2+ на процесс гидроксилирования Б(а)П, особенно ЫАБН-зависимый, скорее всего объясняется тем, что ионы Ре2+ стимулируют образование какого-то интермедиата, участвующего в реакции метаболизма Б(а)П.

Не исключено, что образование такого интермедиата тесно связано с процессом ПОЛ. В связи с этим мы использовали другой прооксидант ССЦ как возможный активатор метаболизма Б(а)П. В этих опытах обнаружено, что добавление СС1, (в концентрации до 0.08 мкл.мг белка) увеличивает скорость ЫАОРН-зависимого гидроксилирования Б(а)П. Отметим, что в случае КАОН-зависимого процесса эффект ССЦ бьщ слабее, чем эффект ионов Ре2+ .

Таким образом, прооксиданты CCLt и ионы Fe2+ (несмотря на различие механизмов и локализации мест образования липидных радикалов) оказывают одинаковое стимулирующее действие не только на процесс ПОЛ, но и на моно-оксигеназную систему, активируя NADPH-зависимое гидроксилирование полициклического углеводорода - бенз(а)пирена. Это позволяет думать, что липид-ные радикалы являются общим интермедиатом двух процессов, прооксиданты

Т oxyR' RH ^ гидроксилирование Б(а)П

L"-- LOj

LOOH (перекисное окисление липидов) Влияние антиоксидантов на гидроксилирование Б(а)П. Если увеличение скорости гидроксилирования Б(а)П в присутствии прооксиданта действительно связано с образованием интермедиата - липидных радикалов, то можно предположить, что присутствие в среде инкубации антиоксидантов должно ингибировать процесс гидроксилирования. Следует отметить, что влияние такого антиоксиданга, как а-токоферол (а-ТОН) на функционирование монооксигеназной системы изучалось и раньше [Carpenter et al.1972, Giassuddin et al. 1990]. Показано, что а-ТОН не оказывает существенного влияния на метаболизм таких соединений, как кодеин и аминопирин, хотя и ингибирует ПОЛ.

Мы изучали влияние антиоксидантов (ТОН и пропилгаллага), а также спиновой ловушки 2-метил-2-нитрозопропана (МНП) на гидроксилирование Б(а)П. Оказалось, что а-ТОН (при физиологических концентрациях) стимулирует гидроксилирование Б(а)П; при этом блокируется переход цитохрома Р-450 в неактивную форму Р-420 [Benedetti et al 1980].

На рис.5-4 показано изменение скорости гидроксилирования Б(а)П в зависимости от концентрации пропилгаллага (ПГ). В 1971 г. Ториэли и Слэйтер [Tomelli, Slater 1971] показали, что ПГ ингибирует восстановление цитохрома с и предположили, что ПГ ингибирует NADPH-цит.с редуктазу. Наши исследования показали, что снижение скорости восстановления цитохрома с вызвано перераспределением штока электронов между переносчиками в цепи окисле-

ния КАБРН, а не снижением активности ЫАБРН-зависимого флавопротеида. Следствием действия ПГ как ловушки свободных радикалов является компенсаторный процесс - усиление потока электронов от ЫАО(Р)Н-зависимого флавопротеида на цитохром Ь5.

Образование липидных радикалов в мембранах микросом подтверждается многочисленными данными и более того существует возможность регистрации липидных радикалов с помощью спиновых ловушек. Так, например, показано, что анаэробная инкубация микросом с ССЦ в присутствии спиновой ловушки МНП приводит к появлению спиновых аддуктов, спектр ЭПР которых идентифицируется как спектр аддукта диенильного радикала с МНП (МНП - Ь) [ Ка1уапататап е1 а1.1989].

Мы исследовали влияние ловушки МНП на гидроксилирование Б(а)П. Результаты этих экспериментов представлены на рис.5-5. При-сутствие МНП в микросомах приводит к снижению скорости гидроксилирования Б(а)П; эффект МНП проявляется и в том случае, когда гидроксилирование Б(а)П было стимулировано ионами ге .

пропилгаллат МНП

п гг

он' + ш —- и + н20

1х>2

Присутствие спиновой ловушки, образующей аддукты МНП - Ь*, фактически означает снижение уровня липидных радикалов и это приводит к снижению скорости гидроксилирования Б(сс)П точно также, как присутствие в микросомах ПГ, взаимодействующего с ОН* радикалами. Акт гидроксилирования включает в себя несколько стадий: ХН (е) 02 (е) ХОН

е ехн х х це-хон-4 е 1 2 3 4 5

Считается,что лимитирующей стадией гидроксилирования является освобождение продукта реакции ХОН из активного центра фермента. Для выяснения

о <

20 4'0 6"0 80 [ПГ],мкМ

40 80

[МНП]/ мкМ

А 450-490

Рис.-5-4.Зависимость скорости гидроксилирования Б(а)П от концентрации пропилгаллата в микросомах печени.

Рис.5-5 .Зависимость скорости гидроксилирования Б(а)П от концентрации МНП.

1 - контрольные микросомы

2 - микросомы + 10 мкМ Fe2+

Рис. 5-6.Кинетика восстановления цитохрома Р-450 (Р-448), полученная методом stop-flow, а - экспериментальная кривая б - модельная кривая

механизма действия про- и антиоксидантов мы изучали кинетику реакции восстановления цит. (Ре3+ ) —> цит. (Те2* ) и влияние на процесс восстановления цитохрома типа Р-450 (стадия 2) ионов двухвалентного железа и пропилгалла-та. Типичная кинетика восстановления комплекса цит.Р-4бО-СО, полученная в анаэробных условиях представлена на рис. 5-6 (а). Характер этой кривой обычен для анаэробного восстановления цитохрома Р-450, т.е. кривая имеет двухфазный характер и может быть описана уравнением, включающем в себя в качестве экспоненциальных множителей константы - быструю Кб и медленную Км. Полученные нами экспериментальные кривые анализировались с помощью специального анализатора; 300 точек каждой экспериментальной кривой использовались для построения модельной кинетической кривой в виде

Аф = А! е"к' + А2е"к' + с среднеквадратичное отклонение данных эксперимента от модельной кривой при такой аппроксимации не превышало 2%.

Полученные результаты представлены в таблице (для расчета констант скоростей в каждом эксперименте обрабатывалось 6-8 кривых).

Влияние Ре2> на кинетику восстановления цит. Р-450

Объект Вклад быстрой Кб Км

компоненты

микросомы без Ре2+ 38 ±6 0.31 ±0.06 0.037 + 0.005

микросомы +• 12 мкМ 45 ±4 0.35 ±0.06 0.032 ±0.003

Такой метод позволил исследовать возможное влияние Ре2+ и пропилгал-лата на кинетику восстановления цитохрома типа Р-450. Данные приведенные в таблице свидетельствуют об отсутствии влияния ионов Ре2+ на восстановление цитохрома Р-450. При исследовании влияния ПГ были получены аналогичные результаты. Таким образом, полученные нами данные позволяют сделать вывод об отсутствии какого-либо влияния про- и антиоксидантов на реакцию NADPH->FP-»cyt.P-450.

Заметим, что в случае ПОЛ эффекты ПГ и ионов Бе2* хорошо изучены; они вызывают ингибирование и усиление перекисного окисления липидов. В то же время аналогичное влияние антиоксиданта и прооксиданта на монооксиге-назную реакцию (рис. 5-4 и 5-2) выглядит неожиданным. Пропилгаллат и ионы Ре2+ снижают и соответственно увеличивают концентрацию ОН радикалов и, тем самым, влияют на какой-то другой параметр, от изменения которого в конечном счете зависит скорость моноксигеназной реакции. Поэтому, на наш взгляд, было бы целесообразно заменить значения концентраций пропилгаллата (слева от оси ординат) и ионов Ье2* (справа от оси ординат) на какой-нибудь общий (гипотетический) параметр и объединить данные, представленные на рисунках 5-4 и 5-2 в один рисунок (рис.5-7). Пусть таким параметром будет величина п*. Физический смысл этого параметра рассмотрен ниже.

На рисунке 3 на оси абсцисс отмечены два значения П1 * и п2 *, для которых определены соответствующие значения скоростей гидроксилирования бен-зпирена. При увеличениии этого параметра от П1 * до п2 * валовая скорость гидроксилирования возрастает; при неизменной концентрации фермента (цитохрома типа Р-450) она пропорциональна двум величинам Ум = (Еа/Е)-\¥м

где Е„ / Е - доля активных ферментов, \У ьуа - скорость гидроксилирования на ферменте

Известно, что в мембранах микросом ЫАБРН-зависимый флавопротеид и цитохромы типа Р-450 образуют кластеры, в которых цигохромы группируются вокруг флавопротеида. Можно предположить, что при п* = П1 * доля активных ферментов составляет 1/3, а остальные цитохромы Р-450 - это "молчащие" цитохромы. При увеличениии параметра п* от П! * до п2 * происходит снижение доли "молчащих" цитохромов и увеличение доли активных ферментов. Соответственно возрастает валовая скорость гидроксилирования бензпирена, достигая максимального значения при п*= п2*(рис.5-7).

Не исключено, что функция ферментов заключается еще и в том, что они как бы собирают "тепловую"(кинетическую) энергию мембраны. Для цитохромов типа Р-450 увеличение энергии мембраны (п*Т) может означать умень-

о <

со Т.

о 2Г X

0,05 0,04

003 0,02

001

325 3,30 3,35 3,40

Рис.5-7 Изменение скорости гид-роксилирования Б(а)П при изменении концентрации пропилгал-лата(слева) и ионов железа(справа) можно представить как зависимость от общего параметра- уровня ОН радикалов или величины условного параметра - п*.

Рис.5-£ Зависимость скорости гидроксилирования Б(а)П (в полулогарифм ических координатах) от температуры.

1- контрольные микротомы

2- микросомы + 10 мкМ Ре!+

шение энергии активации. Зависимости скорости гидроксилирования Б(а)П от температуры (в полулогарифмических координатах) представлены на рис.5-8. Расчитанные значения энергии активации составили 25.2 ккал/моль (без Ре2+ ) и 7.7 ккал/моль (в присутствии ионов Ре2')

Напомним (глава 4), что интерес к токоферолу как к антиоксиданту вызван тем, что он может эффективно блокировать образование гидроперекисей на последней стадии.

перекисное окисление липидов

ТОН то

л х >

ЬН^ 01(Н202) ^ ьо2 / ЬООН ->МОЛ

липидно-радикальныи цикл

ИН ^ Ь\ 02

ТО"

^ Ю~2

ТОН редокс-цеп^

Схема2. Двухэлекгронное восстановление перекисных радикалов (слева), обеспечивающее функционирование лилидно-радикального цикла. Ь02 - восстановленный перекисный радикал, 02 - супероксидный анион радикал.

Это означает, что благодаря реализации липидно-радикального цикла окисление токоферола (ТОН-»ТО ) не сопровождается образованием перекиси ЬООН; вместо нее образуется супероксид, а затем и перекись водорода (02 +ТО -> Т+0 + Н202). Иными словами, предложенный нами механизм двухэлектрон-ного восстановления лшшдных (перекисных) радикалов с участием токоферола предполагает включение 02 в Н202 вместо образования ЬООН. Таким образом, в мембранах микросом существует возможность переключения кислорода с опасного диоксигеназного пути (ЬН —> ЬООН) на менее опасный оксидазный путь (02-> Н202 и Н202-> Н20 + 1/2 02).

Заметим,что при переключении на оксидазный путь решается не только проблема защиты мембранных липидов от окисления; здесь может быть решена и вторая проблема. Речь идет о новом аспекте функционирования мембран (микросомы и митохондрии), а именно о внутримембранном переносе энергии

и, в частности, об активной роли липидиых интермедиатов в функционировании мембранных белков. Заметим также, что явление decoupling (отключение), открытое Ротенбергом на митохондриях, может иметь место и в микросомах в том случае, если оно означает блокирование внутримембранного переноса энергии.

Напомним, что в ходе оксидазных реакций кислород не встраивается в молекулу субстрата, а акцептирует электроны, превращаясь в конечном счете в воду (4-х электронное восстановление). Если субстратом является NADH, то перенос электронов по термодинамическому потенциалу, как известно, означает высвобождение 52 ккал. Помимо этого, можно говорить о существовании второго оксидазного пути - двухэлектронном восстановлении кислорода; это цианид-независимый путь, в процессе которого также высвобождается энергия, равная примерно 25 ккал.

На первый взгляд, кажется, что переключение с диоксигеназного пути на оксидазный путь-2 означает просто бесполезную трату восстановительных эквивалентов. Однако, при этом кардинальным образом решается проблема контроля за образованием перекисей в внутриклеточных мембранах; во-вторых, вполне вероятно, что такой процесс позволяет снизить уровень кислорода в клетке до некого оптимального уровня. Что касается вопроса о том, является ли лилидно-радикальный цикл футильным, то ответ на него зависит от того, какова судьба выс-вобождаемой энергии - рассеивается ли она в тепло или при переносе электронов га кислород (с участием токоферола) имеет место преобразование энергии окисления (оксидазный путь-2) в иную форму.

Биологические мембраны при всем разнообразии в зависимости от тканевого происхождения и их функциональной специализации в соответствии с принадлежностью к тем или иным внутриклеточным структурам имеют, тем не менее, решающее сходство. Это сходство заключается в том, что биологическая мембрана представляет собой структурированный и одновременно динамический ансамбль, формируемый из лилидного бислоя и встроенных в него белков.

На наш взгляд, проблема динамического поведения мембраны напряму связана с вопросом о том, какова судьба энергии окисления, расходуемой в XI де липидно-радикального цикла. Заметим, что каждый такой цикл сопровоя дается пульсацией углеводородной цепи (перемещение фрагмента цепи попере мембраны на границу раздела фаз и обратно). Для того чтобы мы могли каки.\ то образом учитывать роль липидных пульсаций при анализе мембранных прс цессов мы и предлагаем ввести новый параметр п*.

Это параметр, который отражает среднюю кинетическую энергию перс мещений липидов (Ш—»ЬСЬ—>ЬН) в мембране. Более того, это чисто мембраг ный параметр, символизирующий общий принцип функционирования белков биологических мембранах, содержащих ненасыщенные жирные кислоты. Уве личение "п* означает увеличение числа липидных пульсаций в единице объем мембраны в единицу времени. В качестве количественной меры, позволяюще оценивать состояние мембраны может быть выбрана произвольная физическа величина (например, интенсивность флуоресценции какого-нибудь гидрофоб ного зонда). Такая физическая величина должна претерпевать разумные изме нения при изменении числа липидных пульсаций (числа редокс-зависимых ли пидно-радикальных циклов в мембране).

Оценивая влияние ионов Ре2т на гидроксилирование бензпирена мь должны признать, что фактически речь идет о ферментативном катализе. Су ществует несколько точек зрения на природу каталитической активности фер ментов [Блюменфельд 1974] и среди них есть утвер ждение, из которого следу ет, что фермент может "забирать" энергию из своего окружения и даже использовать флуктуации энергии в среде. Эта идея была предложена в 195( г.Мелвин-Хыозом и, на наш взгляд, она может быть адаптирована к мембранным структурам с той разницей, что в случае мембран речь идет уже не с спонтанных флукгуациях, а о реальных периодических (за счет окисления субстрата) пульсациях. Такие пульсации, по-видимому, создают активное состояние мембраны, что позволяет обеспечить эффективную работу цитохромов Р-450 и монооксигеназной системы в целом.

Вопросы связанные с внутримембранными взаимодействиями белков и липидов обсуждаются давно [Яковенко и соавт. 1987] и, возможно, что липид-ные пульсации как раз и обеспечивают такое взаимодействи. Один из основных выводов данной работы состоит в том, что, если в митохондриях энергия окисления субстрата преобразуется в энергию потенциала Дцн+, которая используется для синтеза АТР, то в микросомах энергия окисления субстрата преобразуется в энергию лшшдных пульсаций, которая используется для ферментативного катализа.

Эффективность монооксигеназной системы возрастает при увеличении уровня кислородных (ОН) радикалов. Увеличение концентрации первичных (ОН," НОг ) радикалов равносильно увеличению п* при условии, что LO2 -редуктаза не является лимитирующей стадией цикла. В противном случае усиление образования LO2 радикалов будет сопровождаться усилением образования липидных перекисей. Это означает, что одно из главных условий нормального функционирования мембранных структур клетки - поддержание оптимального уровня кислородных радикалов.

Глава 6. ПРЕОБРАЗОВАНИЕ ЭНЕРГИИ В МИТОХОНДРИЯХ ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Вероятно, открытие окислительного фосфорилирования следует отнести к 1930-39 г.г., когда Энгельгардустановил связь между дыханием и фосфорным обменом, а Белицер и Цыбакова впервые установили стехиометрические соотношения между дыханием и фосфорилированием. Позднее благодаря работам Слэйтера [Slater 1953] и других возникло новое направление в биохимии и биофизике - биоэнергетика, которая получила новый толчок и новое содержание после появления фундаментальной работы Митчела [Mitchell 1961].

В настоящее время химическая гипотеза [Slater 1953] представляет лишь исторический интерес, хотя вопрос об образовании первичного макроэрга на протяжении многих лет (до появления гипотезы Митчела) был основной проблемой, неизбежно возникавшей при рассмотрении механизма окислительного фосфорилирования. Сейчас представляется маловероятным, что интермедиат

окислительного фосфорилирования может быть выделен как растворимое соединение. Уже нет сомнения в том. что фосфолипидная мембрана - это необходимый элемент сопряш-ющего устройства, однако ее роль все еще остается неясной. Либо это просто липидный магрикс и мембрана играет пассивную роль, либо она представляет собой "активную среду", удаленную за счет окисления субстрата от состояния термодинамического равновесия.

При этом следует иметь в виду, что в настоящее время гипотеза Митчела, согласно которой Ар.ц+ является единственным энергетическим посредником при синтезе АТР, принимается большинством исследователей. Удалось получить синтез АТР за счет искусственно созданной Лцн». Опыты были поставлены, в частности, на субмитохондриальных частицах (СМЧ) в условиях, когда на мембране этих частиц создавали как ДрН, так и диффузионный потенциал ионов К+ [ Thayer, Hinkle 1975]. Результатом развития экспериментальных подходов, позволяющих регистрировать постулированную Митчелом Дцн+ (обе ее составляющие), явилось снижение интереса к химической и конформационной моделям. Однако, начиная с середины 80 г.г. вопрос о том, существует ли прямая связь между функционированием редокс цепи и работой АТР-синтаз дискутируется вновь [Дмитриев 1986, Slater 1987].

За 35 лет, прошедших со времени появления гипотезы Митчела, накопились экспериментальные данные, которые пока не нашли своего объяснения в рамках этой гипотезы. Такие данные составляют основу трех "аномалий" хемиосмогического сопряжения [Kell 1979, Rottenberg 1979, Westerhoff et al. 1984, Slater 1987]:

- скорость окисления субстратов и скорость фосфорилирования не имеют тесной корреляции с величиной Дцн+1

- отсутствует постоянство отношения АСгр/Дцн+ при варьировании Дцн+ (AGp - фосфатный потенциал);

- ингибирование Н+ - транслоказной функции первичных генераторов дыхательной цепи или Н+ -АТР-азы не компенсируется соответствующим повышением активности протонной помпы.

Иначе говоря, речь идет о том, что разобщитель окислительного фосфо-рилирования (прогонофор) снижает скорость фосфорилирования значительно медленнее, чем величину Дцн+ • Основу второй "аномалии" составляют данные исследований, в которых наблюдалось увеличение отношения ДОр/Дцн+ при снижении величины Дрн+ под действием разобщителя или ингибитора дыхания. Основу третьей аномалии составляют экспериментальные результаты двойного ингибирования.

Попытки объяснить эти экспериментальные результаты не ставят под сомнение основной постулат Митчела. Речь идет о том, является ли образование Дцн+ необходимым и достаточным условием синтеза АТР. Или же существует альтернатива: Дцц+ является лишь необходимым условием синтеза АТР и, значит, необходим второй (внутримембранный) поток энергии, который позволяет АТР-азам использовать энергию Дцн-г. Необходимость во втором потоке энергии давно обсуждается, в связи с явлением decoupling [Rottenberg 1983], но пока отсутствует реальный механизм внутримембранного переноса энергии.

Элементарный акт синтеза АТР. Напомним, что создание искусственного градиента рН на мембране хлороютастов (быстрое изменение рН от 4 до 8) приводит к синтезу АТР [Jagendorf, Uribe 1966]. Выяснилось также, что синтез АТР как в хлоропластах, так и в митохондриях можно получить при однонаправленном изменении рН [Маленкова и соавт. 1980]. Объяснение этому явлению было дано Блюменфельдом; он предположил, что освобождение АТР из активного центра фермента связано с депротонированием определенных групп в комплексе F] (CFi) и, следовательно, элементарный акт синтеза АТР может быть представлен следующим образом:

F, (ХН") [ADP,HPOf] . Fi (ХН') [АТР, ОН ] (1)

f, (хн+) [атр, он"] -- fj (x) + атр + н20 (2)

При инкубации хлоропластов и митохондрий в среде при рН 4 (или 5) группы X комплекса Fj (CFi) прогонированы и в этих условиях имеет место обратимая

фосфорилазная реакция (1). При скачкообразном изменении рН с исходного значения до рН 8 происходит депротонирование X групп, т.е. реакция (2).

В хлоропластах при скачкообразном изменении рН синтезируется около 100 молекул АТР на один комплекс CFb а в митохондриях 2-3 молекулы АТР на F|. Для хлоропластов образование такого количества молекул АТР не удивительно. Однократное фосфорилирование за счет скачка рН происходит снаружи мембраны, где локализован комплекс CFi, а многократное - за счет градиента рН, точнее градиентов Д1 и Д2, составляющих в сумме ДрН:

Д, = рН out - рК(Х) и Д2 = рК(Х)-рНш В митохондриях следовало бы ожидать образование лишь одной молекулы АТР на Fi, реально же наблюдается образование 2-3 молекул. На наш взгляд, это можно объяснить следующим образом. Для того, чтобы реакция (2) могла быть реализована однократно, достаточно создать значение рН внутри митохондрий более высокое, чем рК Х-групп. Для каждого последующего акта фосфоршш-рования вслед за реакцией (2) должно обязательно следовать протонирование:

fi (x) + h+ -» f,(xh+) (3)

Мы уже отмечали, что исходное значение рН внутри митохондрий и снаружи равно 5. При скачке рН происходит мгновенное увеличение рН снаружи, но не внутри митохондрий, где локализован Fj . Очевидно, что однократное фосфорилирование является результатом повышения рН (оно происходит в присутствии протонофора) внутри митохондрий, точнее в примембранном слое. Что касается многократного фосфорилированкя, то оно может быть следствием колебаний рН в области локализации Fj в результате двух процессов: выброса протонов через мембрану молекулами протонофора (увеличение рН) и одновременно притока протонов из объема матрикса в примембранную область (снижение рН). Таким образом, совокупность реакций (1) - (3), по-видимому, отражает элементарный акт синтеза АТР.

Попытка синтезировать АТР в митохондриях, изменяя величину рН в противоположном направлении - от щелочного значения к кислому - описана в единственной работе Митчела и сотр. [Reid et al. 1966]; количество АТР, полу-

ченное в митохондриях было в 5 раз меньше, чем в аналогичных экспериментах с СМЧ. Здесь, по-видимому, имеют значение размеры везикул и ориентация АТР-азного комплекса; ориентация комплексов Fi в мембранах СМЧ и мембранах митохондрий, как известно, различны. Данные Блюменфельда и сотр. говорят о том, что можно получить синтез АТР в митохондриях, изменяя величину pH в любом направлении - не только от щелочного значения к кислому, но и от кислого к щелочному (в обоих случаях происходит активация АТР-синтазы). Количество молекул АТР, синтезируемых на комплекс Fj в том и другом случае невелико и оно определяется величиной времени релаксации комплекса из активного в неактивное состояние.

Синтез АТР на искусственно созданном Лцц+. Гипотеза Митчела нашла надежное подтверждение в работах Грабера с АТР-азой, встроенной в липосо-мы [Schmidt,Gräber 1987]. Хотя, следует отметить, что в таких экспериментах заведомо исключена любая иная модель, не предполагающая преодоление энергетического барьера за счет Дцн+- Кроме того, результаты полученные на реконструированных системах и на СМЧ не всегда могут быть перенесены на митохондрии ввиду разных размеров везикул и разной ориентации комплекса Fi . Работы Грабера [Graber, Junesch 1984] представляют интерес в связи с тем. что в них рассматривается термодинамический аспект активации АТР-азных комплексов. Существенным достоинством этих работ является создание на мембранах любой заданной величины Дцн+- Согласно Граберу и соавт., скорость синтеза АТР в этом случае пропорциональна двум величинам

yatp = ------ (арн, дч,) -w атр (дрн, ду)

С г*

где Ea/Ei - доля активных АТР-аз, W Атр - скорость синтеза АТР на ферменте

Опыты с СМЧ и липосомами, со встроенным CFi, действительно позволяют получить синтез АТР на искусственно созданном Др.н+ и здесь важно отметить роль скачка потенциала. Это факт, которому до сих пор не уделялось должного внимания и, на наш взгляд, именно скачок потенциала dvjy/dt может

обеспечить перевод АТР-аз из неактивного в активное состояние. Тогда, вместо формулы Грабера имеем

VATP = ----- (dv|//dt) -W АТР (ДрН, Ay)

где доля активных АТР-аз определяется производной dvy/dt.

Таким образом, из приведенных выше экспериментальных данных Блю-менфельда и сотр., а также Грабера и сотр. следует, что во всех случаях для синтеза АТР необходим перевод АТР-аз в активное состояние. Что касается сопряжения окисления и фосфорилирования в митохондриях в обычных условиях, то перевод АТР-азных комплексов в активное состояние, на наш взгляд, может быть обеспечен повышением условного параметра п*. Это означает, что скорость синтеза АТР на активном центре FoFpATP-азы должна контролироваться не только протондвижущей силой, но и редокс-цепью, что действительно имеет место [Perez, Ferguson 1990]. Тогда, одно из главных условий нормального функционирования мембранных структур - это поддержание оптимального уровня кислородных радикалов. При этом, как и в микросомах, важно взаимодействие ОН с ненасыщенными жирными кислотами фосфолипидов, благодаря которому создается активное состояние мембран оно позволяет АТР-азам митохондрий использовать энергию в форме Дцц-.

Особенности синтеза АТР в митохондриях. В митохондриях, как известно, локализованы три редокс-комплекса - три протонных насоса, которые включены в протонный цикл параллельно, а относительно потока электронов -последовательно. Что касается синтеза АТР, то выявление способа контроля АТР-синтаз со стороны редокс цепи остается наиболее актуальным. При анализе механизма преобразования энергии необходимо иметь в виду ряд фактов. Во-первых, все три пункта дыхательной цепи, в которых идет фосфоршшрование ADP, близки к равновесию и это важно для оценки эффективности переноса энергии. Близкие к равновесию реакции могут обеспечить почти 100% эффективность.

Во-вторых, работа протонных насосов, как известно, заключается в создании запаса энергии в форме Дрн+- Хотя этот факт и не вызывает сомнений, он

не может служить доказательством основного постулата Митчела (образование Л|ац+ -необходимое и достаточное условие синтеза АГР), поскольку отсутствуют данные в пользу того, что с образованием Дцн+ связано превращение всей свободной энергии. Если окажется что в форме Дрн- запасается только часть свободной энергии, то это будет означать возможность запасания энергии в иной форме. Наконец, как отмечалось выше, создание на мембране митохондрий Дрн+ требуемой величины и знака приводит лишь к незначительному синтезу АТР (в отличие от СМЧ), хотя получить хорошо сопряженные митохондрии гораздо легче, чем хорошо сопряженные СМЧ.

Мы считаем, что эти факты могут найги объяснение, если предположить для комплексов FoFj существование двух конформационных состояний; допустим, что в мембранах митохондрий возможны два состояния S| и S2 . Предположим далее, что в результате окисления субстрата происходит увеличение параметра п*, а, значит, и увеличение вероятности кратковременных переходов комплексов F0F| из основного состояния S| в состояние S2 . В этом случае синтез АТР можно рассматривать как результат активации комплексов FoF| и использования последними энергии, запасаемой на мембране в форме Дцн+ •

Ясно, что утилизация Ацн. и функционирование протонного цикла в целом будет зависеть от внутримембранного переноса энергии. Очевидно также, что в этой модели возможны два принципиально разных способа разобщения -снижение величины Дрн+ (uncoupling) и блокирование внутримембранного переноса энергии (decoupling). Первый из них может быть реализован как в условиях электронного транспорта, так и искусственно созданной Дцн+ • Второй способ разобщения (отключения) может бьггь реализован только на нативных митохондриях в условиях окислительного фосфорилирования.

В настоящее время мы имеем достаточно оснований для того, чтобы говорить о существовании двух потоков энергии: потока энергии через Дцн+ и внутримембранного потока энергии. В пользу этого свидетельствуют данные Ротенберга [Rottenberg 1983]. Исследуя влияние общих анестетиков на окислительное фосфорилирование, Ротенберг показал, что анестетики не влияют на

величину Дцн+ , но в зависимости от концентрации интибируют синтез АТР полностью или частично. Поскольку анестетики никак не влияли на АТР-азную активность, Ротенберг предположил, что их действие на синтез АТР связано с блокированием внутримембранного переноса энергии.

Предположение об одновременном запасании энергии в форме Дцн+ и переносе энергии в форме, отличной от Дрнт , требует количественной оценки обоих потоков энергии. Поток энергии через Д|1ц+ (agh+ ) определяется, как известно, количеством протонов, транслоцируемых через мембрану [Mitchell, Moyle 1969] и зависит от отношения Н+/0. Стехиометрия двух потоков также будет зависеть от этого отношения. При окислении сукцината "потери" энергии (AG) составляют

AG = 4.18 (AGox - K-A|xHv F-H70) кдж/моль где F - число Фарадея, коэффициент К< 1 учитывает тот факт, что Дцн+ в состоянии 3 меньше, чем в состоянии 4. Если подставить в эту формулу значение AGox = 40 ккал/моль, К = 0.7 и Дцн+ = 0.25 в, то получим AG=0 лишь при отношении Н70 =10. Коэффициент Н70, расчитанный для сукцината равен 6-8 [Lehninger et al.1975], но эта величина получена для состояния 4 и представляет (Н+/0)тах; реально значение Н+/0, используемое при расчете agh+, не будет превышать 4-6. Отсюда следует, что сопрягающее устройство имеет КПД 50%, либо существует второй поток энергии (близкие к равновесию реакции могут обеспечить почти 100% -ную эффективность).

Глава 7. СВЯЗЬ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ С ПЕРЕКИСНЫМ ОКИСЛЕНИЕМ ЛИПИДОВ.

В данной главе представлены результаты экспериментов посвященных изучению влияния антиоксиданта прохшлгаллата и ионов Fe2+, стимулирующих образование липидных радикалов, на перекисное окисление липидов и окислительное фосфорилирование; их цель выявление возможной связи этих двух процессов.

т 500

600т

6 8 мин

WO 150 200 [ПГ], мкМ

.2+

Рис. 7-1.Регистрация комплекса МДА с ТБК в митохондриях, инкубируемых в среде с сахарозой (I) и маннитом (2). Рис.7-2.Кинетика образования ИДА в митохондриях.

1 -с Fe2+, 2 - без ионов Рес

3 - в присутствии 1 Ш ADP

4 - после добавления С1-ССР Среда инкубации: 0.25 М маннит 15 мМ KCl, 30 шМ фосфат, pH 7.4 2.5 ШМ MgS04, 0.2 ММ ЕДТА

2 мкМ ротенон, белок 2 мг/мл. Рис.7-3.Влияние пропилгаллата на скорость потребления 023 - в присутствии С1-ССР

,1 и 2 - дыхание в состоянии 3 и 4 соответственно.

ь5.

[ПГ],мкМ

_<_I_

20 4О

¡>е2+] ,мкМ

Рис. 7-4.Влияние пропилгаллата на скорость синтеза АТР (I) и мембранный потенциал (2).

Рис.7-5.Влияние пропилгаллата

на длительность фосфорилирова-

ния (т) в митохондриях.

I - без ПГ, 2 - 100 мкМ ПГ и

3 - 200 мкМ ПГ.

сутсцинат 5 мМ, АВР 0.4 мМ

Рис. 7-6.Зависимость скорости фосфорилирования (1/1) в митохондриях, инкубируемых с ПГ (100 мкМ) от концентрации Ре2+

На первом этапе работы изучали образование малонового диальдегида (МДА) в фосфорилирующих и нефосфорилирующих митохондриях. На рис.7-1 показаны спектры комплекса МДА с тиобарбитуровой кислотой (ТБК); из этих данных видно, что регистрировать образование комплекса МДА-ТБК (Х=535 нм) в присутствии сахарозы не удается. Если заменить сахарозу на маннит, то можно с высокой точностью определять МДА (в концентрации менее 1 нмоль), образующийся в интакгных митохондриях, когда процесс перекисного окисления липидов зависит лишь от работы дыхательной цепи.

С учетом этого обстоятельства мы изучали образование МДА в митохондриях в состояниях 4 и 3 (по Чансу). Как и следовало ожидать, в состоянии 4 скорость перекисного окисления липвдов в присутствии ионов Fe2" (рис.7-2, кривая 1) значительно выше, чем без ионов железа (кривая 2). В то же время, в состоянии 3 перекисное окисление ингибируется (кривая 3) точно также, как если бы к митохондриям добавили не ADP, а антиоксид ант. Заметим, что эффект ADP тесно связан с процессом фосфорилирования, т.к. разобщитель снимает ингибирующее действие ADP на ПОЛ. В присутствии разобщителя (10"7 М С1ССР) МДА образуется с той же скоростью, как в контроле (кривая 4).

Одной из вероятных причин такого эффекта может быть конкуренция за липидные (перекисные) радикалы. Это означает, что помимо образования перекисей, возможна еще одна реакция утилизации радикалов LO2, тесно связанной с фосфорилированием. Проверить это предположение можно с помощью ловушек кислородных радикалов, которые позволяют блокировать появление ли-пидных радикалов. Поэтому нами было изучено влияние одного из перехватчиков свободных радикалов - пропилгаллата на параметры, характеризующие окислительное фосфорилирование - дыхание, синтез АТР и мембранный потенциал. Полученные данные представлены в таблице 1, а также на рисунках 73,7-4 и 7-5.

Пропилгаллат ингибирует синтез АТР, но не влияет на величину Дц/ (рис.7-4). Снижение скорости фосфорилирования прямо зависит от концентрации пропилгаллата, снижающего концентрацию первичных радикалов и уро-

вень липидных радикалов. Видно, что ПГ усиливает дыхание в состоянии 4, но не влияет на скорость дыхания в состоянии 3.

Скорости переноса электронов в цепи сукцинат —> Ог, величины Ду, V дтри Р/О полученные при инкубации с пропилгалатом и без него.

Условия V(02) ДК V атр Р/О

инкубации -ADP +ADP Ду ДрН

без ПГ 8 40 5 175+5 не 145 1.8

измеряли

ЮОмкМПГ 20 40 2 175±5 72 0.9

200 мкМ ПГ 40 40 1 175±5 15 -

У(Ог) и V дтр нмоль/мин.мг белка, Ду - мв, ДК- дыхательный контроль.

На основании этих данных можно сделать ряд выводов:

1. Ловушка свободных радикалов, ПГ является одновременно антиокси-дантом и ингибитором окислительного фосфоршшрования.

2. Присутствие пропилгаллата не приводит к падению потенциала Дцн+ и следовательно, в отличие от протонофоров, ПГ - это разобщитель, действующий по механизму decoupling (отключение).

3. Образование на внутренней мембране митохондрий Дцн- является необходимым, но не достаточным условием синтеза АТР.

Скорость синтеза АТР можно оценивать разными способами; например, измерять концентрацию АТР или контролировать мембранный потенциал. Изменение величины потенциала в митохондриях в ответ на добавление ADP показано на рис. 7-5. Очевидно, что длительность фосфоршшрования (т ) определяется концентрацией ADP. Из рисунка видно, что в нативных митохондриях (ДК= 4) при добавлении 0.4 мМ ADP, х = 4 минуты. В митохондриях, инкубируемых с пропилгаллатом, длительность т возрастает и составляет уже 7 минут, т.е. синтез АТР идет с меньшей скоростью, чем в контроле.

Если разобщающее действие пропилгаллата связано только с созданием дефицита липидных радикалов, то в этом случае синтез АТР можно стимулиро-

вать вновь, используя один из известных способов генерации свободных радикалов. В следующем эксперименте в среду инкубации наряду с ловушкой радикалов, добавляли FeSO,» с целью стимулировать образование радикалов (рис. 76). Как видно из рисунка, увеличение концентрации ионов Fe2+ ведет к увеличению скорости синтеза АТР почти до исходного уровня (за 100% принято значение 1/т , соответствующее т = 4 мин.). Максимум достигается при некоторой оптимальной концентрации ионов железа (FeSO.*). При дальнейшем увеличении концентрации ионов Fe2+ скорость фосфорилирования снижается.

Полученные данные и, в частности, ингибирование ПОЛ в митохондриях в фосфорилирующем состоянии, а также зависимость скорости фосфорилирования от [Fe2+ ] указывают на участие липидных радикалов в процессе фосфорилирования. Кривая, представленная на рис. 7-6 имеет масимум и снижение скорости фосфорилирования ADP слева и справа от максимума можно объяснить как следствие дефицита липидных радика-лов (слева) и их избытка, т.е. образования LOOH (справа). Образование перекисей, как известно, приводит к структурным нарушениям в мембране. Отметим, что существование LOj -зависимого механизма преобразоиания энергии указывает на гибкий способ регуляции синтеза АТР за счет поддержания уровня липидных радикалов. Глава8. СОПРЯЖЕНИЕ ОКИСЛЕНИЯ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ

Двоякая роль кислорода. Существует еще один аспект проблемы - это особая роль кислорода в процессе сопряжения. Известно, что кислород, как конечный акцептор, можно заменить на феррицианид. При этом необходимость в кислороде все же остается [Кондрашова, Миронова 1971]; в этой работе регистрировали восстановление феррицианида при инкубации митохондрий в аэробных и анаэробных условиях. Переход из состояния 4 в фосфорилирующее состояние 3, регистрируемый по измерению скорости восстановления феррицианида, реализуется только в аэробных условиях. В анаэробных условиях присутствие ADP не вызывает увеличение скорости восстановления феррицианида.

Полученные ранее данные, касающиеся переноса электронов в цепи NADH-> ФЦ [Кондрашова, Миронова 1971] дают интересную, хотя и не совсем

полную информацию о роли кислорода в окислительном фосфорилировании. Поэтому одновременно с измерением скорости восстановления K3Fe(CN6), мы контролировали мембранный потенциал и измеряли количество АТР. Полученные данные суммированы в табл.2

Скорости переноса электронов в цепи NADH—>ФЦ, величины Ду, V агр и Р/2е, полученные при инкубации в аэробных и анаэробных условиях.

Условия Ve ДК дцш vatp р/2е

инкубации -ADP +ADP Д*|/ ДрН

аэробные 34 132 4 175+5 не 120 П

измеряли

анаэробные 34 34 1 175+5

Ve и V атр нмоль/мин.мг белка, Дц/ - мв, "ДК"- дыхательный контроль

Из данных, приведенных в таблице следует, что митохондрии спо-собны использовать Дци+ для синтеза АТР лишь в присутствии кислорода. Иными словами, кислород необходим и в том случае, когда он как конечный акцептор заменен на феррицианид. Эти данные свидетельствуют о том, что в норме кислород выполняет не одну, а две функции; феррицианид же, выступая в качестве конечного акцептора, способен лишь обеспечить создание на мембране Дцн+ .Утилизация энергии Дцн+ FoFi-ATP-азными комплексами (т.е. протонный цикл) реализуется, если происходит активация этих комплексов, а это, в свою очередь, имеет место за счет внутримембранного переноса энергии.

Не исключено, что помимо роли терминального акцептора кислород выполняет и другую функцию, а именно образование супероксидного анион-радикала Oi (Н02 ), способного инициировать образование радикального состояния в молекуле полиненасыщенной жирной кислоты.

Процесс образования в липидах аллильных (LH—>L*) и перекисных радикалов (L'-> LO2 ), а, значит, и липидно-радикальный цикл (LO2 —> L02—>LH ) может быть прерван ловушками первичных или аллильных радикалов, т.е. ан-тиоксидантами. В частности, один из компонентов редокс-цепи митохондрий

Р/0

1,9

1,5

t,f

0,9

0,7

072

QH2/(QH2+Q) 1,0

и5

' 0,8 0,6 OJ

955

10 15 20 30 W У(02), нмоль/мин

0,2

600

и ю

у 500

-О

§ w

ь-<

200

/Ш

УФ

/ 2 J 4 5мин

Рис.8-1.Эффективность фосфори-лирования (Р/0) И и степень восстановленное™ убихинона В при инкубации митохондрий с KCN (0,50,100,150 мкМ).

Рис.8-2.Мнгибирование синте за АТР в митохондриях печени после включения УФ-света(генерация 0^) I - без NABPH, 2 - I мМ NADPH, 3 - 2 MM NADPH, 4 - NADPH и СОД

Рис.й-3.Изменение скорости синтеза АТР в митохондриях после включения УФ-света (генерация супероксида) и эффект СОД. I - без ПГ, 2 - 120 мкМ ПГ

убихинон (убихинол) активно взаимодействует с аллильными радикалами +QH2 -» LH + QH и, таким образом, влияет на уровень перекисных радикалов

Влияние QH2 на окислительное фосфорилирование можно оценить, и пользуя ингибиторы дыхания. Мы изучали влияние на дыхание и фосфора® рование двух известных ингибиторов - KCN и малоната; регистрировали m требление кислорода и скорость синтеза АТР. Оказалось, что в присутствг KCN скорость фосфорилирования снижается в большей степени, чем скорое: дыхания в состоянии 3. Например, снижению скорости дыхания в 4 раза соо ветствует снижение скорости фосфорилирования в 7 раз (рис. 8-1).

Согласно данным, полученным при использовании KCN на СМ [Takaynagi et al.1980], наряду со снижением скорости переноса электронов i кислород изменяется степень воссгановленности убихинона. То же самое npi исходит и в митохондриях; отношение QH2 /( QH2 + Q), измеренное в состо: нии 4 возрастает с 0.55 (±0.05) до 0.9 (рис.8-1). Отметим, что при использов; нии малоната снижение скорости дыхания хорошо коррелирует со снижение скорости синтеза АТР. Коэффициент Р/О остается постоянным, так же как степень восстановленности убихинона, т.е. отношение QH2 /( QH2 + Q); даннь не приведены. Мы считаем, что снижение Р/О при использовании KCN обу ловлено ростом степени восстановленности убихинона.

В работе мы использовали еще один способ генерации супероксида; с» рость синтеза АТР можно было изменять при включении УФ-света. Кинетич ские кривые образования АТР представлены на рис. 8-2 и 8-3. Видно, что эс фект УФ-света существенно различен в митохондриях инкубируемых с прот лгаллатом (рис. 8-3) и без него (рис. 8-2). В присутствии пропилгаллата генер ция супероксида восполняет дефицит первичных радикалов и стимулирует см тез АТР; супероксиддисмутаза снимает этот эффект. Интенсивность образов ния супероксида и скорость стимулируемого синтеза АТР зависит от концен рации NADPH.

Роль липидов в преобразовании энергии.В 1950-60 г.г. большое вним ние привлекала гипотеза об участии токоферола в сопряжении окисления

фосфорилирования [В о uni an, Slater 1957]. Полученные нами данные о взаимодействии токоферола с перекисными радикалами позволяют вновь вернуться к этой проблеме. Липидные радикалы обязательно образуются в мембранах (коль скоро ПНЖК входят в составе фосфолипидов) как только появляются первичные (кислородные) радикалы. Избежать образование кислородных радикалов при функционировании редокс-цепей невозможно.На наш взгляд, высокая степень ненасыщенности липидов в мембранах митохондрий, а также зависимость Р/О от содержания ненасыщенных жирных кислот [Proudlock et al. 1969] становятся понятны, если предположить, что липидные интермедиаты участвуют в активации мембранных белков (АТР-аз).

Мы считаем, что образование радикальных форм кислорода и ли-пидных радикалов в митохондриях не только неизбежно, но и необходимо. Образование радикалов L02 не всегда означает образование перекисей LOOH; следует учитывать возможность восстановления радикалов L02 редокс цепью до их взаимодействия с токоферолом. Таким образом, эффект кислородных радикалов в биологических мембранах можно считать положительным, если образование радикалов связано с функционированием липидно-радикальных циклов. Н20 ^ V —- L02' ^—^ LOOH LOH

)( Т0Н Т0' MDA ОН' ^ LH LOILH

01 + то'->. Т+0 + н202

Схема 8-1. Липидно-радикальные циклы в митохондриях.

В мембранах каждый липидно-радикальный цикл ( LH —> L" —» L02 —> L02 -> LH) должен сопровождаться изменением конформации фрагмента углеводородных цепей. В митохондриях липидные пульсации, возможно, провоцируют изменение конформации комплексов F0F1, а значит, и активацию этих комплексов. В этом случае можно говорить о существовании в митохондриях динамической, т.е. более сложной модели, чем модель Митчела.

Т(ДЦ]ь ) 4- <= uncoupling

окисление субстрата

АТР-аза (синтез АТР)

LH —> LO2 —> LR-циклы t(n* ) 4- <= decoupling

ПОЛ —> разборка мембран

Схема 8-2. Участие LR-циклов в активации АТР-аз и синтезе АТР.

Особенность предлагаемого механизма сопряжения состоит в наличи прямого и обратного контроля; с одной стороны липидно-радикапьные цикл контролирует утилизацию протонов АТР-синтазой и фактически потреблен! энергии, запасаемой в форме Дцн+, с другой - Дцн+ контролирует работу дых; тельной цепи и потребление субстрата (дыхательный контроль). В мембрана митохондрий протондвижущая сила используется для образования АТР, п< видимому, до тех пор, пока есть ADP и Pi и пока функционируют липиднс радикальные циклы.

Такая динамическая модель обладает рядом преимуществ. В такой мод« ли маловероятно появление футильного цикла, т.е. опасного для энергетики сс стояния, в котором скорость синтеза АТР и скорость гидролиза АТР равнь Кроме того, такая система очень хорошо дополняет гликолиз, где обеспечь вается режим автоколебаний, являющийся, по-видимому, единственно возмо» ной формой длительного существования энергетического метаболизма. Накс нец, к преимуществам модели можно отнести большую устойчивость к внеш ним воздействиям - к действию фосфолипаз, протеаз и разобщающему дей ствию жирных кислот.

В целом, рассматриваемая нами модель не противоречит представ-лекщц о модели Митчела как об универсальной модели (галобактерии, хлоропласть: митохондрии). Однако, мы полагаем, что в митохондриях возможно существо вание двух моделей сопряжения. В качестве критерия реализации в мембрана митохондрий той или иной модели может служить факт отключения синтез АТР экзогенными антиоксидангами, а также изменение коэффициента Р/О (шл его постоянство) при изменении степени восстановленности убихинона.

Примером могут служить митохондрии печени; в норме наблюдается снижение Р/О при увеличении отношения QH2 /(QH2 + Q)), но такая зависимость отсутствует после гепатоэктомии. Интерес представляют и митохондрии гепатомы; содержание полиненасыщенных жирных кислот в последних гораздо ниже, чем в норме [Masotti et а1.198б]. В этом случае, по всей вероятности, реализуется модель Митчела, т.е. наличие Дцн+ является необходимым и достаточным условием синтеза АТР. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При обсуждении роли свободно-радикальных реакций неизбежно возникает вопрос об известных негативных последствиях таких реакций: коль скоро живые организмы в их нынешнем виде являются результатом естественного отбора, то как могло случиться, что отбором не элимини-ровались биохимические механизмы, сопряженные с образованием продуктов, накопление которых со временем снижает жизнеспособность организма и, более того, создает в организме условия, прямо способствующие его гибели? Принципиальный ответ на этот вопрос содержится в известной теории старения Медавара -Уильямса. Суть ее в первом приб-лижении состоит в том [Голубев 1966 ], что, если появление какой-либо функции (и соответствующего гена) способствует повышению вероятности участия организма в самовоспроизведении особей вида, то она будет закреплена в эволюции, даже если сопряжена с отсроченными плей-отропными эффектами, которые снижают жизнеспособность организма после того, как он обеспечил себя (а, значит, и вид) потомством.

Основным возражением против этой теории был вопрос о том, что переключает действие генов с раннего благоприятного действия на позднее неблагоприятное. Но если благоприятное действие генов сопряжено с образованием продуктов, которые, накапливаясь, оказывают все более неблагоприятное воздействие, то этот вопрос снимается [Голубев 1996 ]. Одним из ярких примеров тому может служить предполагаемое участие свободных радикалов в мембранных биохимических процессах. Образование свободных радикалов оправдано, но только до тех пор, пока обеспечивается функционирование липидно-

радикального цикла. Отключение или ослабление функции цитохрома Ь5, как (L02 )-редуктазы неизбежно приводит к тому, что положительный эффект свободных радикалов тут же превращается в свою противоположность.

Функциональная роль цепи NAD(P)H- цитохром Ь5 тесно связана с ан-тиоксидантным действием токоферола. Вывод, который можно сделать из данной работы состоит в том, что мы должны по-новому оценить роль токоферола в функционировании биологических мембран и, по-видимому, вернуться к проблеме 40-летней давности - к вопросу о возможном участии токоферола в преобразовании энергии [Bouman J..Slater Е.С., 1957]. Токоферол, будучи необходимым компонентом мембран, не только защищает мембранные лшщцы от окисления; он является одним из редокс-соединений, обеспечивающих функционирование липидно-радикальных циклов. Иными словами, благодаря токоферолу происходит преобразование свободной энергии окисления субстрата в иную форму - в энергию липидных пульсаций.

Завершая обсуждение отметим, что полученные нами результаты позволяют нам сделать вывод о том, что инициирование свободно-радикальных реакций в биомембранах может и не приводить к образованию липидных перекисей. Из этого нетривиального вывода следует, что для нормальной работы мембран важно отнюдь не блокировать образование кислородных радикалов, а направить свободно-радикальный процесс в нужном русле, поддерживая функционирование липидно-радикальных циклов. Таким способом обеспечивается преобразование энергии в мембранах и использование энергии окисления для ферментативного катализа: гидроксилирования ксенобиотиков (микросомы) и синтеза АТР (митохондрии). Для эффективного контроля за процессом преобразования энергии и получения предельно высокого выхода энергии природа, по-видимому, создала два цикла (на старте и финише этого процесса): первый цикл - в матриксе митохондрий (цикл Кребса), второй - в фосфолипидной мембране (липидно-радикальный цикл). ВЫВОДЫ.

1. В работе выдвинута и экспериментально обоснована совокупность представлений о функциональной роли липидов в биологических мембранах; рассмотрено образование липидгшх радикалов в ненасыщенных жирных кислотах фосфолипидов, а также циклические превращения радикальных состояний липидов. Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что перекисное окисление мембранных липидов зависит от функциональной активности мем-бран(гидроксилирования ксенобиотиков в мембранах микросом и окислительного фосфорштирования в мембранах митохондрий). Чем выше функциональная активность, тем ниже уровень перекисного окисления липидов. И наоборот, при работе редокс-цепи вхолостую происходит усиление перекисного окисления, которое служит своего рода инструментом разборки ненужных биологических мембран.

2. Рассмотрена роль антиоксидантов в стабилизации биологических мембран и дан критический анализ общепринятого механизма действия основного биоантиоксиданта токоферола. Предложен новый механизм действия токоферола; его взаимодействие с перекисными радикалами ведет не к образованию гидроперекисей, а к возврату жирной кислоты в исходное состояние. В результате такой реакции высвобождается супероксид. Рассмотрены два механизма действия токоферола: неферментативный (двухэлектронное окисление токоферола) и ферментативный, при котором реализуется одноэлектронное окисление токоферола.

3.В эксперименте на липосомах установлено, что образование липидных перекисей в присутствии токоферола при рН 8.5 может быть блокировано полностью. Таким образом, показан реальный способ защиты липидов от окисления; это разрыв С-0 связи в углеводородной цепи и образование С-Н связи; при этом зарегистрировано образование продукта реакции - супероксида. Такая замена является следствием переноса двух электронов на перекисный радикал. Установлено, что токоферол может выступать как донор двух электронов при щелочных рН.

4.Изучен ингибирующий эффект токоферола в микросомах печени. На основании полученных данных можно предположить, что взаимодействию токоферола с перекисными радикалами при физиологических значе ниях рН предшествует их восстановление редок-цепью ЫАВ(Р)Н-дит.Ь5. Эта цепь, по-видимому, действует как Ь02 -редуктаза. Таким образом, предложен новый ферментативный механизм защитного действия токоферола в биомембранах. В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что перекисное окисление липидов в мембранах контролируют три основных фактора: Ь02 -редуктаза, токоферол и С8Н(Т+0)-редуктаза.

5. В работе получены данные, из которых следует, что скорость гидро-ксилирования липофильных ксенобиотиков можно изменять при неизменном содержании в мембранах цитохрома типа Р-450. Активация "спящих" цитохро-мов возможна при повышении уровня кислородных радикалов и, как следствие этого, концентрации липидных радикалов. Последние, по-видимому, включаются в липидно-радикалышй цикл; при этом активируются цитохромы типа Р-450 и заметно блокируется образование гидроперекисей. Функционирование такого цикла в мембранах микросом осуществляется благодаря редокс-цепи, обеспечивающей восстановление радикалов Ь02, а именно цепи ЫА£)(Р)Н- ци-тохром Ьз.

6. Изучение влияния прооксиданта (ионы Ре2+ ) и антиоксидантов (пропилгаллата и др.) на гидроксилирование Б(а)П позволяет предположить, что для монооксигеназной реакции необходимы перенос электронов и энерги-зация мембраны. Рассмотрена возможность редокс-зависимых периодических (за счет окисления субстрата) пульсаций углеводородных цепей фосфолипидов. Такие пульсации, по-видимому, позволяют создавать активное состояние мембраны, что обеспечивает эффективную работу цитохромов Р-450 и монооксигеназной системы в целом.

7. Проведено детальное исследование перекисного окисления липидов в митохондриях печени при нормальном функционировании редокс-цепи (состояния 3 и 4 ). Обнаружено, что интенсивность образования перекисей ли-

пидов зависит от функционального состояния митохондрий; в присутствии сукцнната наблюдается образование продуктов перекисного окисления липидов и, в частности, происходит накопление малонового диальдегида. При инкубации митохондрий с ADP происходит снижение скорости образования МДА, т.е. переход митохондрий в фосфорилиругощее состояние сопряжен с ингибирова-нием перекисного окисления липидов. Этот эффект снимается разобгцителем-протонофором С1ССР.

8. Исследована возможность регуляции фосфоршшровання ADP с помощью про- и антиоксидантов, т.е. изменения скорости синтеза АТР в результате направленного изменения уровня липидных радикалов.

а. Показано, что ангиоксидант пропилгаллат является разобщителем окислительного фосфоршшрования. В зависимости от концентрации он инги-бирует окислительное фосфорилирование полностью или частично, не влияя на величину электрохимического потенциала. Такое ингибирование представляет собой разобщение по типу decoupling и оно не является необратимым. Синтез АТР можен быть возвращен к исходному уровню с помощью ионов FeJ+. Зависимость скорости синтеза АТР от концентрации ионов Fe2" представляет собой кривую с экстремумом (максимуму соответствует оптимум уровня свободных радикалов).

б. Изучено образование супероксида в митохондриях печени и влияние супероксида на окислительное фосфорилирование. Показано, что генерация супероксида активирует образование липидных радикалов; в условиях, когда уровень липидных радикалов ниже оптимального (при инкубации митохондрий с пропилгаллатом) активация образования супероксида приводит к усилению синтеза АТР. Наблюдаемый эффект снимается супероксиддисмутазой.

в. Предложена динамическая модель сопряжения. В такой модели мембрана это не просто липидный матрикс, где генеририруется и затем используется разность потенциалов; благодаря липидным пульсациям мембрана играет активную роль в преобразовании энергии, т.е. ее роль еще более важна, чем это следует из гипотезы Митчела.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дмитриев Л.Ф., Иванов И.И. BADPH и NADH-зависилая система ги роксилирования бенз(а)гшрена.//ДАН СССР, 1Э77,т.236,с.471-473

2. Дмитриев Л.Ф., Иванов И.И. Ыетаболизл бенэ(а)пирена в пене крыс. Недостаток NADPH как лилитирующий фактор при, инашивац бензfaJпиреко.//Био логические науки 1977.JÈ 12, с.36-40

3. Дмитриев Л.Ф., Иванов И.И. О распределении восстановителън эквивалентов в клетке 6 активной фазе летаболизла бенз(а)тшрена.. Вопросы мед. химии 1979, £ 4,с.451-455

4. Белевич Н.П., Дмитриев Л.Ф., Иванов И.И. WADPH и NADH-зобис лая систела гиЗроксилировагшя бенз(а)шрена. Связь с перекиси окислениел липидов.//Бюллетень энсп.биол.мед. ,1981 ,Л 2, с.158-160

5. Дмитриев Л.Ф., Белевич Н.П., Давлетшина Л.Н., Иванов И.] Возлохное участие свободнорадшсального липидного интерледиата гтдроксилированш полицшлических углеводородов.//Биохимия 198; 48,с.2041-2048

6. Дмитриев Л.Ф. 0 роли липидов в ферлентативних реакциях с пер посол заряда.// Молекулярная биология 1983,17, с.1060-1067

7. Дмитриев Л.Ф. Липиднью радикалы - возложние ледиаторы перенос заряда и преобразования энергии //Мол.биология 1983,17,с. 1297-131

8. Дмитриев Л.Ф., Давлетшина Л.Н., Белевич Н.П., Иванов И.1 Участие липидних радикалов в реакциях с перепосол электронов преобраэованшл энергии.// Мол.биология 1984,18, с.427-435

9. Давлетшина Л.Н., Дмитриев Л.Ф., Иванов И.И. Возлохное учасгт свободнорадшсального липидного интерледиата в сопряжении окислет и фосфорилирования.//Биологические науки 1984,№ 9, с.25-30

10. Дмитриев Л.Ф., Давлетшина Л.Н., Белевич Н.П. Об участиг липидного интерледиата в гидромсилировании бенз(а)пирена.// Бяшк тень эксп.биол.мед.,1983,Д 5,с.127-129

11. Дмитриев Л.Ф., Давлегншна Л.Н., Иванов И.И., Рубин A.I Взаилосвяэъ окислительного фосфорилирования и переписного окисл( кия лтидов.//Биологические мембраны 1985, 2,с.795-799

12. Дмитриев Л.Ф. 0 роли лелбранкых фосфолипидов в окислителънх фосфорилированш . Гипотеза 1С сопряжения.//Мол. биология 1985, 1i с.1001-1010

13. Дмитриев Л.Ф. О леханизле сопряжения окисления и фосфорилирс вания.// Молекулярная биология 1986, 20, с.1111-1125

14. Белевич Н.П., Дмитриев Л.Ф. .Еаутина А.Л., Иванов И.И. Два пути гидроксилирования полгщшиичеаких углеводородов в лелбранах эндо-плазлатического ретикулула.// Биологические науки 1988,J6 4,с.37-41

15. Дмитриев Л.Ф..Иванова М.В.,Иванов И.И. Синтез АТР в лшохонд-риях печени ложно стпилулировстъ и ингибировать, генерируя супероксид с полощью УФ-облучения.// Биол. мембраны 1990, 7,с.961-965

16. Дмитриев Л.Ф. .Иванова М.В. .Иванов И.И. Синтез АТР б литохонд-риях: взаимодействие редокс-цепей внешней и внутренней лелбран.// ЦАН СССР, 1990,312,0.985-989

17. Дмитриев Л.Ф. Возложная роль лалонового диалъдегида в регуляции клеточного деления.// Мол. биология 1990, 24, с.566-571

18. Дмитриев Л.Ф. Преобразование энергии в лштохондриях. Активная роль лелбраны.// Биофизика 1990, 35, с.685-687

19. Дмитриев Л.Ф., Вэрховский М.И. О лехаяизле взаилодействия поксферола с перекисныли радикалали.//Биохимия 1990,55,с.2025-2030

20. Дмитриев Л.Ф. Фосфорииирование в литохонвриях и хлоропластах: сходство и различие.// Виол, мембраны 1991, 8, 0.341-360

21. Дмитриев Л.Ф.»Иванова М.В. Взаилодействие токоферола с переки-гньии радикалали б лтоаолах не ведет к образованию гидроперекисей 1окл.РАН 1992,324,с.459-464

12. Дмитриев Л.Ф. Мсиоковый диалъдегид лохет контролировать кле-ючное деление ш стадии репликации ДНК.// Журнал эвол. биохимии и физиологии 1992, 28, с.720-730

!3. Дмитриев Л.Ф. Участие лилидов в реакциях переноса заряда и ьреобразования энергии в лшохондриях и хлоропластах.// Биологиче-:кие мембраны 1992, 9, с.281-289

!4. Dmltriev L.F. On the mechanism of tocopherol Interaction with leroxyl radicals.// Excerpta Medica, ser. Int.Congress,1992, J6 998 i.183-185

:5. Дмитриев Л.Ф..Иванова M.B., Давлетшина Л.Н. Создание на внутренней лелбране лтохондрий равной 250 лВ является необходи-ш, но не досгкточшл условиел синтеза АТР.// Биохимия 1993,58, 255-260

6. Dmitriev L.F., Iyanora M.V. Interaction of tocopherol with eroxyl radicals does not lead to the formation of lipid hydrope-oxidea in liposomes.// Chemistry and Physics oi Lipids 1994, 69, .35-39

27. Дмитриев Л.Ф.// Механизмы энергетических превращений при дыхании и фотосинтезе: роль фосфолипидяой мембраны.

Биофизика 1995,40, 74-85

28.Дмитриев Л.Ф..Иванова М.В Л Аналог пробукола защищает липо-протеиды от окисления лучше, чем пробукол.

Бюллетень эксп. биологии и медицины 1995, N 5, 491-493

29.Dmitriev L.F.// A novel enzymatic mechanism ofprotective effect of tocopherol in biological membranes. Redox Report 1995,1,299-301

30. Дмитриев Л.Ф.,Иванова M.В.,Лебедев А.В.// Влияние рН и глута-тиона на перекисное окисление липидов в микросомах, обогащенных токоферолом. Бюллетень эксп. биологии и медицины 1995, N 9, 268-270

31. Дмитриев Л.Ф.// Биохимические аспекты атерогенеза: роль анти-оксидантов. Терапевт, архив 1995, N 12,73-77

32. Дмитриев Л.Ф.,Иванова М.В.,Давлетпшна Л.Н.,Иванов И.И.// Контроль свободных радикалов в биологических мембранах: роль цепи NADH-цитохром bj. Доклады РАН 1997 (в печати)

33. Dmitriev L.F.// Biological membranes: lipid peroxidation, lipid-radical cycles and imaginary temperature. Free Radical Research (in press).

Информация о работе

Дмитриев, Леонид Федорович
доктора биологических наук
Москва, 1997
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы