Особенности динамики быстрых изменений показателей инфракрасного спектра крови при действии экзогенных факторов

Никитина, Ирина Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности динамики быстрых изменений показателей инфракрасного спектра крови при действии экзогенных факторов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности динамики быстрых изменений показателей инфракрасного спектра крови при действии экзогенных факторов"

А'ЛУ

11 I!

и ' ТВЕРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ А

„^ ^ На правах рукописи

•ч*

НИКИТИНА Ирина Николаевна

ОСОБЕННОСТИ ДШШМКИ БЫСТРЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИЯРАКРАСНОГО СПЕКТРА КРОВИ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЭКЗОГЕННЫХ «АКТОРОВ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Тверь 1997

Работа выполнена на кафедре общей и сшоорганической химии Тверской медицинской академии

Научный руковолитель: доктор биологических наук, профессор

Каргаполов А. В-

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Пахомов 11. М.

Ведущая организация: Московский государственный университет

на заседании диссертационного совета К 063.9*7.09 в Тверском государственном университете по адресу: 170002, г. Тверь, пр. Чайковского, 70"а", корп. Ь, ауд. 318.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тверского государственного университета.

Автореферат разослан " " __ 1997г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук,

доцент А.Н. Панкрушина

кандидат биологических наук, доцент С.В.Карпова

Защита состоится

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Актуальность работы определяется тем, что исследуемые экзогенные факторы ( ионы кальция, фосфата, водорода, тоничность среды) являются важнейшими биорегуляторами биохимических процессов ( Ягужинский Л.С., 1978). В последнее время появились работы, указывающие на то, что данные агенты вызывают в биологических мембранах различных тканей быстрые обратимые изменения уровня содержания отдельных представителей одного из основных компонентов клеточных структур - липидов ( Каргаполов A.B., 1988-1996; Stoffel W., 1989; Gunderman K.J., 1993; Ansell G.B., 1993). Известно, что липиды выполняют в организме важную биорегуляторную роль (Dawson R.M.С., 1973). Эти соединения, в отличие от белков (главных компонентов биологических мембран), характеризуются лабильностью и способностью к взаимной трансформации (Ansell G.B., 1993; Грибанов Г.А., 1979). Установлено, что разрыв химических связей, составляющих основу структуры данных веществ, под действием липаз и других ферментов, сопряжен с важнейшими биохимическими процессами ( Dawson R.M.C., 1973). Поэтому изучение параметров динамики колебания содержания ли-пидных компонентов различных тканей и органов в короткие временные интервалы дает принципиально новую информацию, которая может быть использована для оценки особенностей функционального состояния организма в норме и патологии.

Для определения быстро меняющегося уровня липидов могут быть использованы различные методы. Однако наиболее перспективным является метод ИКС, так как в данном случае одновременно количественно может контролироваться совокупность основных химических связей, принимающих участие в образовании липидных молекул.

При изучении липидов с помощью ИКС необходимо учитывать, что присутствие значительных количеств белков в тканях организма, в частности крови, существенно влияет на показатели в характеризующих липиды областях спектра. Однако, стабильность ковалентных связей белков дает возможность предполагать, что динамика изменений показателей в областях спектра, соответствующих сложиоэфирным связям, карбонильным и фосфатным группам, четвертичному азоту, в значительной мере определяется липидным компонентой. Для доказательства зтого в условиях

- г -

эксперимента параллельно проводилось определение уровня содержания основных липидов с использованием метода ТСХ.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Изучить особенности динамики быстрых изменений показателей ИКС цельной крови под влиянием экзогенных факторов.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Провести сравнительный анализ показателей степени поглощения в следующих областях ИК спектра - 3500-3300, 3085-2732, 1831-1623, 1729-1533, 1543-1396, 1470-1330, 1170-1057, 1087-963 см-1, характеризующих химические связи, участвующие в образовании липидных молекул.

2. Выбрать наиболее информативные показатели, временной интервал и область инфракрасного спектра, характеризующие динамику быстрых изменений спектра цельной крови сразу после ее взятия.

3. Изучить особенности параметров быстрых изменений исследуемых показателей ИКС крови ( амплитуда, время максимального и минимального значений, конечный и исходный уровень) в областях спектра, характеризующих карбоксильные и фосфатные группы липидов и других компонентов крови ( 3085-2732, 1831-1623, 1170-1057,1087-963 см-1), возникающие под влиянием экзогенных факторов ( уменьшение тоничности среды, изменение рН среды, добавление ионов фосфата в виде соли ЫаНРОд).

4. Разработать способ регистрации быстрых изменений исследуемых показателей ИКС с использованием специальной аппаратно-программной системы, основанной на 9-ти канальном спектрометре.

5. Изучить особенности динамики быстрых изменений показателей ИКС крови больных со злокачественными новообразованиями грудной железы и желудка по сравнению с контрольной группой лиц.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. В результате проведенных исследований впервые обнаружена динамика быстрых изменений показателей ИКС крови, возникающих после вв>тия крови под влиянием экзогенных факторов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Показатели динамики

быстрых изменений ИКС крови могут быть использованы при диагностике онкологических и других заболеваний.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Существование быстрых обратимых изменений показателей ИКС цельной крови и ее компонентов в области 3500-963 см-1.

2. Результаты влияния экзогенных факторов на динамику быстрых изменений показателей ИК-спектра крови в диапазонах, регистрирующих липидные компоненты.

3. Возможность использования выбранных параметров динамики быстрых изменений показателей ИКС крови для диагностики заболеваний.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ. Результаты исследований рассмотрены на меякафедральном заседании с участием сотрудников кафедр общей и биоорганической химии, биологической химии, медицинской биологии и генетики, фармакологии и научно-исследовательского центра Тверской государственной медицинской академии (1996). По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, получены удостоверения на 4 рационализаторских предложения.

МАТЕРИАЛЫ И ЖТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведено 996 анализов. В работе использовалась цельная кровь, плазма и эритроцитарная масса 118 здоровых и больных людей. Кровь подвергалась различным видам доаналитической обработки - экстракция, высушивание (Рапопорт Ж.Ж., Балуева Г.Р.,1963; Балаховский И.С., 1995).Плазму и эритроцитарную массу готовили по стандартным методикам . При изучении влияния экзогенных факторов на цельную кровь, плазму и эритроцитарную массу действовали различными экзогенными агентами. В качестве факторов воздействия были выбраны: уменьшение тонич-ности и рН среды, влияние ионов кальция и фосфата в виде солей СаС1г и ИаНР04. В ходе эксперимента к анализируемой пробе крови, плазмы или эритроцитов добавляли СаС1г в расчете 50 мкМ кальция на 1 ыг белка, равный объем бидистиллированной воды, 2Ы раствор НС1 до рН равного 6, МаНР04 в расчете 5 ММ фосфата на 1 мг белка. Затем, через каждые 30 секунд в течение 3-х минут после воздействия каждого из исследуемых агентов отбирали пробы, содержащие 0,1 мг белка в 3-5 ыкд

(150-200 мкг липида).

Экстракция липидов осуществлялась по методу Блайя и Да-йера (Bligh E.G., Dyer W.J., 1959).

Инфракрасная спектроскопия образцов проводилась с помощью спектрофотометра модели 270-30 ( фирма "Hitachi", Япония), а также отечественного 9-ти канального инфракрасного анализатора, входящего в состав аппаратно-программной системы. Возможность использования ИКС для количественного определения липидов была показана с помощью построения калибровочных кривых в следующих областях ИК-спектра: 3085-2732 , 1831-1623 , 1543-1396 , 1470-1330 , 1170-1057, 1087-963 см-1 (рис. 3,4). В тех временных интервалах, где наблюдались наибольшие изменения показателей ИК-спектра крови, проводили параллельное определение липидов методом ТСХ для выяснения характера биохимических механизмов ( Каргаполов A.B. и соавт., 1972-1995). Исследуемые пробы наносили непосредственно в среде инкубации на хроматографическую пластинку с тонким слоем силикателя. Для выделения липидов использовалась проточная тонкослойная хроматография в камерах оригинальной конструкции ( Каргаполов A.B., 1972). Количественное содержание липидов определялось денситометрически . Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью персонального компьютера С 486 ДХ2-66 по стандартной программе "Statgraphics".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ особенностей показателей ИКС крови в исследуемых диапазонах в различные временные интервалы после ее взятия

На первом этапе работы представляло интерес исследование изменения показателей ИК спектра цельной крови в областях, наиболее характерных для липидов, в различные временные интервалы после взятия крови, так как именно эти соединения, согласно ранее проведенным исследованиям, наиболее подвержены быстрым обратимым изменениям ( Каргаполов A.B. и соавт., 1988-1996).

Исследование динамики быстрых изменений в течение 60 с через каждые 6 с показало, что в области 3500- 3100 см"1 максимальное увеличение оптической плотности (ОП) наблюдалось на

18-ой с на 2,1 условные единицы (у.е.) (р<0,01 ) от исходной величины , причем к 24 с показатели ОП возвращались к первоначальному уровню и до 60 с больше не изменялись. Необходимо отметить, что сходные колебания ОП ( в пределах 2,0 у.е.) (р<0,01) наблюдались на 18 с и в других областях спектра -3085-2732 , 1831-1623 , 1729-1533, 1543-1396 , 1470-1330 , 1170-1057 и 1087-963 см-1. Следует отметить диапазон 3085-2732 см-1, где к 18-ой с ОП увеличивалась на 3,0 у.е. (р<0,05), на 48-ой с наблюдалось увеличение оптической плтности на 2,2 у.е. (р<0,05), затем к 54-ой с ее значение вернулось к исходному уровню и к 60 с снизилось на 2,1 у.е. (р<0,05) (рис. 1-А).

Отмечено, что колебания показателей в области 1831-1623 см-1 носят тот же характер, что и в диапазоне 3500-3100 си'1 (р<0,01). При этом обнаружено, что помимо увеличения на 18-ой с оптической плотности на 2,1 у.е. (р< 0,05) в области 1729-1533 см-1 наблюдается такке повышение показателей ОП на 36-й с на 2,8 у.е. (р<0,05), затем к 48-й секунде ее значение снижается до исходного уровня (р<0,05) и к 60-й с повышается на 1,9 у.е. (р<0,05) выше первоначального значения (рис. 1-Б). Установлено, что характер изменений в интервале 1470-1330 см"1 отличается от аналогичных показателей в других исследованных областях: так, начиная с 48-й секунды'уровень ОП понижается на 2,2 у.е. (р<0,05) по сравнению с исходным уровнем, а к 60-й секунде превышает исходный уровень на 2,0 у.е. (р<0,05) (рис. 2-А). Исследование фосфатной части спектра (1170-1057 см-1 и 1087-963 см-1) показало увеличение ОП на 2,0 у.е. (р<0,05) на 18 , 48 и 60-й секундах эксперимента (рис. 2-Б).

Таким образом, изменение показателей динамики в 60 секундном интервале дает возможность утверждать, что колебания величины показателей происходит не менее чем через 20 секундный интервал. При этом наибольшие сдвиги происходят на 18-ой сек и на 40-60 секундах в большинстве исследуемых областей спектра. Полученные результаты находятся в соответствии с опубликованными данными, свидетельствующими о том, что карбонильные и фосфатные группы фосфапипидов претерпевают существенные изменения в определенные времонны^ интервалы ( Зубарева Г.М., 1996; Лопина Н.П.. МНШ.

Исследование динамита быстрых изменений в течение

25 В

2С

1С

.....к...........

Л А / \Л

.........i.........

, ,. . . .......

.............А.

Л / \ ..... ........^......... ..........

Рис. I . Динамика быстрых изменений ИКС цельной крови в диапазонах : а - 3085-2732 см"1 в - 1729-1533 см-1 ( время - 60 сеч1 ( по оси эбсписс -Бремя в секундах , по оси ординат. -оптическая плот-кость в условных единицах^.

от

сек

2С Э

А fv f í ... \ J..........

...

сек

20i It-

It-.

M IS 1С

a 6 4 2 0

■f

\ i

Рис. 2 . Динамика бмстрых изменений ИКС цельной крови в диапазонах : а - 1470-1330 см-1 в - I170-1057 см-1 ( время - 60 се;0 ( по оси абсписс -время в секундах , по оси ординат -оптическая плот -ность е условных единицах).

сек

180 с (черев каждые 12 с) показало следующее: в области 3500-3100 см"1 произошло увеличение оптической плотности в

2.1 рааа (р<0,01) к 54-й секунде по сравненгаэ с исходным уровнем, затем интенсивность поглощения постепенно снижалась и стабилизировалась к 126-й секунде. По-видимому, уменьшение поглощения в этом диапазоне говорит об ослаблении водородных связей и увеличении количества гидроксильных групп (Верболо-вич В.П., 1977). В области 3085-2732 см"1 отмечены небольшие колебания уровня оптической плотности с незначительной тенденцией с ее увеличением к 180-й секунде на 5-7 % . Как мы уже отмечали выше, этот диапазон поглощения формируется валентными и деформационными колебаниями =СНг и -СНз групп. Показатели в этой области характеризуют основныех компоненты мембран (Wallach D.F., Zahler Р.Н., 1968). Установлено, что значения ОП в области 1831-1623 см"1 ( колебания -С=0 связей в эфирах жирных кислот фосфолипидов) (Abramson М., 1965: Флеров М. А., ЗуберВ.Л., 1971), где интенсивность поглощения связана с лабильностью фракций жирных кислот), практически не изменялись. При 1729-1533 см-1 к 40-й секунде наблюдалось увеличение ОП в 1,45 раза (р<0,05) , затем плавное понижение ее уровня в 1,43 раза (р<0,05 1 от исходной величины к 100-й секунде, и последующее повышение к 120-й секунде до исходного уровня (рис. 6-А). Обнаружено, что при 1570-1396 см"1 к 30-й секунде происходит увеличение ОП в 1,2 раза от исходного уровня (р<0,05), затем к 70-й секунде ОП снижение в 1,3 раза (р<0,05), к 180-й секунде возвращается к исходному уровню (р<0,05). Показано, что поглощение в области 1470-1330 см"1 увеличивается к 50-й секунде в 1,2 раза (р<0,05), к 70-й секунде уменьшается в 1,2 раза от исходной величины (р<0,05) и к 100-"й секунде возвращается к исходному уровню (рис. 5-Б). Обнаружено, что динамика изменения ОП в фосфатной части спектра (1170-1057 см-1 имеет следующий характер: уровень оптической плотности к 20-й с уменьшается в 1,2 раза (р<0,05), до 100-й секунды остается на этом уровне и к 180-й секунде возвращается к исходной величине (рис. 6-Б). В области 1087-963 см-1 обнаружено увеличение к ОП к 180-й секунде в

1.2 раза (р<0,05 ) по сравнению с исходным уровнем.

Таким образом, в 180-секундном диапазоне кроме 30-60-секундного интервала отмечаются существенные изменения оптической плотности через 110-120 с. В данных временных интервалах

параллельно проведены анализы с использованием ТСХ по определению количественного содержания дипидных компонентов крови. Установлено, что наиболее выраженные изменения показателей в диапазонах 1831-1613 см-1 и 1170-1057 см"1, по-видимому, связаны с уменьшением фракций фосфолипидов, что соответствует изменению ОП в области фосфатных групп и увеличением ТГ и зфиров ХЛ , что сопровождается возрастанием показателей, характеризующих карбонильные группы (ркс. 3).

Исследование динамики быстрых изменений исследуемых показателей ИКС крови в более широком временном диапазоне -после 180 секунд показало, что в течение последующих восьми минут уровень оптической плотности показателей ИК-спектра цельной крови остается стабильным и не имеет достоверных изменений, что находится в соответствии с опубликованными научными данными (Каргаполов А.В. и соав., 1988-1996).

Таким образом установлено, что в цельной крови сразу после ее взятия происходят быстрые обратимые изменения показателей ИК-спектра в диапазоне 3100-1000 см"1. Причем, наиболее значимыми являются сдвиги в областях 1831-1613 1729-1533 , 1470-1330 , 1170-1057 см-1. Доказано, что колебания показателей ИК-спектра продолжаются до 180 сек.

2. Анализ динамики быстрых изменений показателей ИК-спектра цельной крови под влиянием гипотонии, ионов фосфата, уы°нь.тения значения рН среды

В качестве экзогенных факторов были выбраны гипотония, изменение рН среды, а также воздействие ионов фосфата (в виде соли NaHP04), так как, по данным литературы (Ягужинский Л.С. и соав., 1986 ) эти факторы способны вызвать быстрые обратимые изменения уровня содержания отдельных компонентов биологических мембран, в том числе и липидов.

Обнаружено, что под влиянием гипотонии в диапазоне 3500-3100 см"1, характеризующей поглощение структурированной воды и колебание -ОН связей, наиболее существенные изменения показателей оптической плотности происходят в первые 50 с от начала эксперимента, а затем в период 126-180 с. К 30-й с величина ОП уменьшается, уровень ее в этом временном интервале становится в 3 раза (р<0,001) меньше исходного. Затем к 60-й с происходит постепенное возвращение к исходному значения.

| }- исходной уровень

УШг через 50 с {ШГ чеРеэ Ю0 с к h через 180 с

Рис. 3-А. Результаты изменения уровня содержания триглипери-дов и эфиров холестерина через 50, 100 и Г80 с пос-

МКГ

30 ■■ 25 •• 20 15 10 ' 5 '

Рис. 3-Б. Результата изменения уровня содержания фосфолипи-дов через 50, 100 и 180 с после взятия крови

Начиная со 120-й с наблюдается уменьшение ОП в 2,1 раза (р<0,01) и к 180-й сек ОП возрастает до исходного уровня. Наиболее вероятно, что обнаруженные колебания обусловлены изменениями структурированной воды таких липидных компонентов, как фосфатидилхолины, сфингомиелины, которые, согласно литературным данным , вносят существенный вклад в спектр в этой области (Атанасов А.Г., Козлов Ю.П., 1971; Верболович В.П., 1977). Кроме этого, имеет значениев поглощение в данном диапазоне спиртовых гидроксильных групп холестерина (Wallach D.F., 1968).

В области 3085-2732 см"1 максимально выраженная динамика наблюдается в первые 90 с эксперимента, при этом к 12-й с уровень ОП снижается в 1,2 раза (р<0,05), а к 50-й с возрастает на 3,0 у.е. (р<0,05) по сравнению с исходным. Затем колебания носят недостоверный характер (рис. 4-А).

В диапазоне 1831-1623 см-1 в первые 30 с эксперимента ОП снижается до минимального уровня (в 1,25) (р<0,05), затем к 70-й с возвращается к исходному значению. В этом интервале определяются довольно стабильные сложноэфирные и -С=0 связи, таске присутствующие во всех липидных компонентах ( Lamba O.P., Borchman D., 1993).

Максимальные изменения в интервале 1729-1533 см-1 происходят в первые 60 с. Уровень оптической плотности к 30-й снижается до 8,2 у.е. (р<0,05), к 60-й с повышается до 10,1 у.е. (р<0,05) и до 180-й с остается неизменным .

Обнаружено, что в области ИК-спектра 1543-1396 см-1, которая характеризует -С-Н-С связи метиловых и метиленовых групп (Кейгс М., 1981), содержащихся во всех компонентах мембран, изменения уровня ОП носят недостоверный характер, что свидетельствует о стабильности этих групп в исследуемом временном интервале.

Данные эксперимента показали, что в диапазоне 14701330 см-1, поглощение в котором зависит от ионизированных карбоксильных групп, отмечаются изменения величины ОП на 15 , 100 и 180-й секундах. Максимальные отклонения происходят на 15 и 100-й секундах (рис. 4-Б).

Установлено, что изменения в фосфатной части спектра (1170-1057 см-1 и 1087-963 см-1) происходят к 36-й с от начала эксперимента, где оптическая плотность снижается в 1,5 раза по сравнению с исходным уровнем (р<0,05) и к 126-й с, ког-

35 30 25 20 15 10

5 0

............. :Чг

100

Л Чг-*' . \ п /вг "\ / Г \.......*г......

Рис. 4. Динамика бчсттлос изменений ИКС нельноЯ крови при уменьшении тоничности среды в диапазонах : а - 5085-2732 см"1 в - 1470-1330 см-1 ( I - уменьшение тоничности,

2 - контзольнан группа)

100

200 сек

да значение ОП, возвратившейся к 54-й с к исходному уровню, снова снижается в 1,6 раза (р<0,С5) а к 180-й с (р<0,01) возвращается к исходному.

Таким образом, установлено, что уменьшение тоничности среды в 2 раза оказывает на динамику быстрых изменений показателей ИК-спектра цельной крови воздействие, наиболее ярко выраженное в областях 3085-2732 см"1 и 1470-1330 см"1. Анализ результатов позволил выделить наиболее информативные параметры: амплитуда колебаний уровня ОП, время выхода на максимум, время выхода на минимум, продолжительность изменений. В области 3085-2732 см-1 амплитуда составляет 7,0 у.е. (р<0,01), время выхода на максимум - 50 с, время выхода на минимум - 12 с, продолжительность изменений 162 с. В области 1470-1330 см-1 размах колебаний составил 4,0 у.е., время выхода на минимум 15 с, продолжительность изменений 180 с.

В отличие от фактора тоничности уменьшение рН среды до 6 вызывает особые изменения исследуемых параметров динамики. В диапазоне 3500-3100 см""1 отмечаются довольно устойчивые значения (~4,5 у.е.) и изменения уровня ОП носят недостоверный характер. Отмечено, что в области 3085-2732 см-1 колебания отличаются крайне малой интенсивностью ( около 5%) . В этой части спектра интенсивным поглощением характеризуются функциональные группы зфиров холестерина и триглицеридов (Кейгс М., 1981), так что отсутствие колебаний может свидетельствовать о стабильности этих компонентов в условиях изменения рН среды.

Обнаружено, что в диапазоне 1831-1623 см"1 с 140-й с начинается резкое увеличение уровня оптической плотности, которое продолжается до 160-й с, а затем, к 180-й с ее показатели снижаются практически до исходного уровня ( 11,5 у.е.). Зона максимальных изменений - 160 с, что составляет около 14,11% (р<0,05) ( Исаков А.В., 1980 ) (рис. 5-А).

Установлено, что изменения в области 1729-1533 см-1 ( -С=0, -N-H группы) имеют несколько сходный характер с изменениями в области 1831-1623 см-1. При этом максимальные изменения ( увеличение показателей ОП) выражены на 160-й с (р<0,05). В области поглощения =СНг и -СНз группировок уровень ОП в течение первых 20 с не изменяется (р<0,01). Как уже было отмечено, область ИКС 1470-1330 см-1 зависит от присутствия ионизированных карбоксильных групп. В этом диапазоне отмечено повышение уровня ОП на 40 с до 9,3 у.е., т.е. в 1,2

í >

/"t

Too"

-t

сек.

200

12 10

т>

.......А........ ............

......т.....V.....

Л .........^....... ,Тй у 1

100

Рис. 5 . Динамика быстры* изменений ИКС цельной крови при понижении оН до 6,0 в диапазонах: а - 1331-1623 в - 1470-1330 см"1 ( I - понижение оН,

2 - контрольная группа)

200

сек

раза вше исходного уровня (р< 0,05), после чего показатели остаются стабильными до 130-й с и к концу эксперимента увеличиваются выше исходного в 1,3 раза (р<0,05) (рис. 5-Б). Колебания уровня ОП в фосфатной части спектра и в области 1087-963 см-1 статистически не подтверждаются.

Следовательно, характер динамики при уменьшении рН среды отличен от колебания уровня ОП при гипотонии, что позволяет сделать вывод о существовании особенностей в механизмах действия данных агентов.

Необходимо отметить, что при воздействии на цельную кровь фосфат ионов ( в виде соли МаНР04) на 40-й с от начала эксперимента во всех исследуемых областях спектра происходит увеличение показателей ОП на 15% (р<0,01) от исходного уровня.

Наиболее ярко динамика быстрых изменений показателей ИК-спектра проявляется при 1170-1057 см-1 и 1729-1533 см-1. В области 1729-1533 см-1 происходит подъем уровня ОП на 40-й с и снижение на 100-й с (р<0,05), максимальный уровень отмечен на 40-й с , продолжительность изменений составляет 110 с (р<0,01). ' Амплитуда колебаний составляет 3,8 у.е. (р<0,05) (рис. 6-А). В фосфатной части спектра пики расположены на 30 и 120 с. Время максимальных изменений 30 - с, продолжительность колебаний составляет 180 с (рис. 6-Б). Обнаруженные результаты находятся в соответствии с ранее полученными данными (Каргаполов А.В. с соав., 1995; Зубарева Г.М., 1996).

Таким образом, можно сделать вывод о том, что в цельной крови под влиянием экзогенных факторов ( уменьшение тоничнос-ти среды, уменьшение рН среды, действие ионов фосфата ) возникают быстрые обратимые колебания уровня ОП. Воздействие каждого из агентов на исследуемые показатели имеет как общие, так и специфические характеристики. Доказано, что достоверно выраженные колебания уровня ОП при действии экзогенных факторов наблюдаются в различных исследуемых областях. Так, при действии гипотонии в области 3085-2732 и 1470-1330 см"1, при уменьшении рН среды - 1831-1623 и 1470-1333 см"1, при добавлении ионов фосфата 1729-1533 и 1170-1057 см"1. Отмечено, что максимальная амплитуда колебаний уровня ОП наблюдается при изменении тоничности среды (р<0,01), а минимальная при воздействии на кровь ионов фосфата (р<0,05). При этом время выхода на максимум и минимум различно при воздействии исследуе-

.....д............

Л 4 т Л..!.1.......

' р'чу 2 /

100 в

Рис. б. Динамика бнстркк изменений ИКС цельной крови под влиянием ионоз :*се?юоа в диапазонах а - 1729-1533 см"1 -в - 1170-105? см-1 ( I - влияние ионов фосфата

2 - контрольная группа)

■ь

аоо

сек

ст>

мых факторов. Продолжительность динамики при воздействии исследуемых факторов составляет 140-180 с.

На следующем этапе работы была исследована динамика быстрых изменений уровня оптической плотности отдельных компонентов крови таких, как плазма и эритроциты.

В результате проведенных исследований установлено, что при воздействии на отдельные компоненты крови ( эритроциты, плазма) экзогенными факторами также наблюдается динамика быстрых изменений показателей ИК-спектра в исследуемых диапазонах, однако амплитуда колебаний значительно меньше, чем при исследовании цельной крови . По-видимому, это связано с тем, что процедура выделения фрагментов крови влияет на их натив-ные свойства.

3. Сравнительный анализ показателей динамики быстры? изменений цельной крови здоровья людей и больных со злокачественными новообразованиями молочной железы и желудка

На данном этапе исследования была сделана попытка выявить особенности динамики показателей ИК-спектра крови онкологических больных в исследуемых областях ИКС.

Установлено, что в цельной крови больных со злокачественными опухолями желудка в отличие от здоровых в диапазоне 3500-3100 см-1 не происходят значительные колебания показателя степени поглощения. При этом уровень оптической плотности практически не изменяется от 18 до 170-й с. Установлено, что только со 170-й с начинается небольшое снижение уровня ОП (р<0,05), которое продолжалось до конца эксперимента. Отмеченная максимальная степень поглощения приходится на 1.' ю с, минимальное значение - на 180-ю с. При этом амплитуда сестав-ляет 1,1 у.е. (р<0,05).

В области 1729-1533 см-1 обращают внимание следующие особенности: максимальная степень поглощения приходится на 2-3-ю с( у здоровых на Ю-ю с), минимальное значение отмеча ется на 180-й с ( у здоровых на 125-й). Амплитуда составляла 2,1 у.е.(р<0,05). В отличие от этого установлена, что в области 1470-1330 см-1 изменения более выражены . При этом зона максимальных изменений 150-180 с, а максимальная степень поглощения происходила на 140- й с, минимальная - на 30 с, и амп-

литуда равнялась 3,1 у.е. (р<0,05). Получение результаты находятся в соответствии с данными литературы ( Раппопорт К.К., Балуева Г.Р., 1963; Каргаполов A.B., ЛопинаН.П., 1995).

Обнаружено, что в областях 1170-1057 см-1 и 1087-963 см-1 колебания исследуемых показателей крайне незначительны. На 140-180-й с эксперимента отмечено сначала повышение, а затем понижение уровня ОП ниже исходного (р<0,05) . Установлено, что у доноров к 180-й с уровень ОП повышается и остается выше исходного, при этом амплитуда колебаний у онкологической группы составляет 2,2 у.е.(р<0,05) .

Таким образом, характерными особенностями для больных злокачественными новообразованиями желудка следует считать: низкую амплитуду показателя поглощения по сравнению с донорами в исследуемых зонах (р<0,05), максимальное значение поглощения на 170-й с, и снижение уровня ОП ниже исходного уровня к 180-й с, что может служить отличительными признаками.

Установлено, что у больных со злокачественными новообразованиями молочной железы изменения поглощения в исследуемых зонах сходны с группами больных с опухолями желудка, но одновременно выявлены некоторые отличия.

. Оказа ось, что в области первого канала 3500-3100 см-1 при низкоп амплитуде колебания уровня ОП время максимальных изменений составляет 18-70 с от начала эксперимента. При этом максимальное значение поглощения наблюдается на 70-й с, а минимальное :шачение - на 35-й с. Найдено, что в области 3085-2732 см-1 динамика быстрых изменений исследуемых показателей похо;ка на динамику, происходящую в крови у доноров. Однако, максимальный уровень ОП отмечен не на 180-и с, а на 70-й с, хотя к . концу эксперимента происходит возрастание уровня ОП, как и у доноров. Установлено, что в области 1831 1623 см-1 и в 1729-1533 см-1 динамика более выражена , чем у больных со злокачественными новообразованиями желудка, хотя характер изменений сходен. Особенно отчетливы изменения в области 1729-1533 см-1. При атом амплитуда колебаний составляет 3,3 у.е.(р<0,01), время максимальных изменении -18-70 с. Минимальный уровень ОП отмечен на 30-й с, максимальный - на 70-й с. Обнаружено, что в области 1543-1396 см-1 , в отличие от доноров динамики исследуемых показателей практически не наблюдалось. Отмечены изменения в зоне 1470-1330 см-1, сходные с показателями при заболевании желудка.

В фосфатной части спектра у больных имеются отличительные особенности: в области 1170-1057 см-1 время максимальных изменений составляет 18-70 с, максимальный уровень поглощения был обнаружен на 70-й с, минимальный уровень - на 30-й с.

Значит, у исследуемых групп онкологических больных имеются общие и отличительные параметры динамики быстрых изменений показателей ИК-спектра крови. При этом каждая форма заболевания имеет наиболее выраженные особенности по амплитуде колебаний ОП и времени выхода на минимальное значение.

На основании полученных результатов построены пространственные модели и их 10 кратные горизонтальные профили, отражающие специфику динамики быстрых изменений содержания липи-дов и других компонентов крови (рис. 7,8). Приведенные рисунки показывают отчетливую разницу в динамике показателей быстрых изменений крови у больных злокачественными новообразованиями по сравнению с контрольной группой, что мотет быть использовано при прогнозировании и диагностике заболеваний.

Рис.7.а) Пространственные модели динамики быстрых изменений показателей ИКС цельной крови в диапазоне 3300 - 800 см-1 б) 10-ти кратные горизонтальные профили моделей

1 - контрольная ' группа, 8

2 - больные раком 1 желудка

( по оси абсиисс-время в секундах, по оси оцдинат-диапазоны ИК спектра)

Ркс. 8. а) Простиа-нственнне модели динамики быстоых изменений показателей ИКС цельной крови в диапазоне 3300-800 см"1 б^10_ти кратные горизонтальные профили моделей

1 - контрольная группа,

2 - больные раком молочной железы

( по оси абссисс-время в секундах, по оси ординат -диапазоны ИК спектра)

вывода

1. В цельной крови сразу после ее взятия происходят быстрые обратимые изменения показателей инфракрасного спектра в диапазонах 3500-3100 см"1. 3085-2732 см"1, 1831-1623 см-1, 1729-1533 СМ-1, 1543-1396 см-1, 1470-1330 см"1, 1170-1057 см"1, 1087-963 см"1, определяющих следующие функциональные группы: -СН, -СН2, -СНз, -C=C-, ~С=0, -N-H, -Р-0, -Р-О-С, -Р-ОН, H-N= . Установлено, что наиболее информативными параметрами являются: амплитуда колебаний, время выхода на максимальное и минимальное значения, исходный и конечный уровень показателей.

2. Результаты инфракрасной спектроскопии цельной крови подтверждаются данными тонкослойной хроматографии, с помощью которой анализировался липидный спектр крови во временные интервалы, характеризующиеся наибольшими колебаниями показателей ИК-спектра. Отмечены выраженные изменения со стороны фракций фосфолипидов, триглицеридов и эфиров холестерина.

3. Под влиянием экзогенных факторов динамика показателей ИК-спектра крови сразу после ее взятия существенно изменяется. При этом проявляются отличительные особенности действия каждого исследуемого агента, однако во всех случаях минимальный интервал изменений составляет 10-20 секунд, период колебания показателей 180 секунд, после чего происходит стабилизация их значений в течение последующих 10 минут.

4. Под влиянием гипотонии наибольшие изменения происходят в диапазоне 3085-2732 см-1 и 1470-1330 см"1. При этом в области 3085-2732 см"1 амплитуда составляет 7,0+08 у.е., время выхода на максимум - 50 с, время выхода на минимум - 12 с, продолжительность изменений 162 с. В диапазоне 1470-1330 см"1 время выхода на минимум - 15 с, продолжительность изменений 180 с.

5. В отличие от гипотонии при уменьшении рН наибольшие сдвиги показателей наблюдаются при 1831-1623 и 1470-13Э0 см"1- При атом в области 1831-1623 см"1 размах колебаний составляет 4,0+0,37 у.е., время выхода на максимум - 160 с, продолжительность колебаний 180 с. В области 1470-1330 см-1 амплитуда составляет 1,9+0,2 у.е., время максимальных изменений 180 с.

6. Под влиянием фосфат ионов показатели ИКС существенно

изменяются в следующих диапазонах: 1729-1533 и 1170-1057 см"1. При этом в диапазоне 1729 -1533 см-1 амплитуда составляет 3,8 у.е., время максимального и минимального значения равнялось соответственно 40 с и 100 с. В области 1170-1057 см-1 при амплитуде 3,0+0,34 у.е., максимальные изменения наблюдались на 30 с.

7. Разработан способ регистрации быстрых изменений исследуемых показателей ИКС с использованием специальной аппаратно-программной системы, основанной на 9-ти канальном спектрометре.

8. На основании полученных результатов сформированы пространственные модели и их горизонтальные профили, отражающие особенности динамики быстрых изменений показателей ИКС крови онкологических больных со злокачественными новообразованиями грудной железы и желудка, а также контрольной группы лиц.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Разработка высокоэффективного метода определения фос-фатидилхолииов для регистрации быстрых изменений этих соеде-нений / Материалы научной конференции " Современные вопросы диагностики и лечения". - Тверь, 1994. - С. 7-8 (соав. Быковская Н.Г.).

2. Разработка способа количественного определения сфин-гомиелинов с помощью инфракрасной спектроскопии / Материалы научной конференции "Современные вопросы диагностики и лечения". - Тверь, 1994. - С. 32-33 (соав. Зубарева Г.М.).

3. Исследование влияния эмоционального стресса на ИК-спектроскопические характеристики смешанной слюны / Тез. докладов конференции "Организационно-методические и дифференциально-диагностические вопросы клинической медицины". -Тверь, 1995. - С. 74-75 (соавт Смирнова Т.И., ЛопинаН.П.).

4. Использование ИК-метод i для диагностики алкоголизма / Тез. докладов конференции "Орг шизационно-методические и (иф-ференциально-диагностические вопросы клинической медицины'. -Тверь, 1995. - С. 76-77 (соавт. Каргаполов A.B., Руднев И.Е.).

5. Использование метода инфракрасной спектроскопии для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и сахарного диа-

бета / Тез. докладов конф. " Новые направления в диагностике, лечении и профилактике заболеваний у населения Тверской области". Тверь., 1996. - С. 156-157 ( соавт. Каргаполов A.B., Зубарева Г.М.).

6. Определение динамики быстрых изменений сфингомиелинов с помощью инфракрасной спектрофотометрии / Тез. докл. конф. "Новые направления в диагностике, лечении и профилактике заболеваний у населения Тверской области". Тверь., 1996. -С. 154-156. ( соавт. Зубарева Г.М.).

РАЦ. ПРЕДЛОЖЕНИЯ:

1. Рационализаторское предложение N 1801. Способ количественного определения сфингомиелинов крови с помощью инфракрасной спектроскопии. - Тверь., 1996.

2. Рационализаторское предложение N 1817. Способ диагностики сахарного диабета. - Тверь., 1996.

3. Рационализаторское предложение N 1853. Способ дифференциальной диагностики опухолей желудка. - Тверь, 1997.

4. Рационализаторское предложение N 1854. Способ диагностики рака молочной железы. - Тверь., 1997.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Никитина, Ирина Николаевна, Тверь

// ! /

-Л

„у/-

№

ТВЕРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

НИКИТИНА Ирина Николаевна

ОСОБЕННОСТИ ДИНАМИКИ БЫСТРЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИНФРАКРАСНОГО СПЕКТРА КРОВИ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЭКЗОГЕННЫХ ФАКТОРОВ

03.00.04 - Биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук профессор А.В.Каргаполов.

Тверь

- г -

СОДЕРЖАНИЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ............................5

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Факторы, определяющие уровень содержания липидов в тканях..............................9

2. Анализ возможностей метода инфракрасной спектроскопии при исследовании компонентов биологических мембран........................19

3. Особенности ИК спектра крови в норме и при заболеваниях ................................26

Глава 11. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Метод определения показателей динамики быстрых изменений ИК-спектра крови.......33

1.1. Определение показателей ИК спектров цельной крови, плазмы, препаратов липидов стандартным методом.............33

1.2. Метод определения показателей ИК спектров с помощью 9-ти канального спектрометра............................35

1.3. Методика анализа динамики быстрых изменений показателей ИК спектра крови и ее компонентов..................38

2. Анадиз липидов методом проточной тонкослойной хроматографии.......................41

2.1. Проведение хроматографического анализа, идентификация и количественное определение липидов ...................41

2.2. Способ регистрации быстрых изменений

количественного содержания липидов

в экстрактах крови.....................47

2.3. Определение содержания общих белков ....48

3. Метрологическая оценка способа...............48

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ

1. Данные анализа особенностей инфракрасного спектра цельной крови....................... .50

2. Результаты использования метода ИКС для количественного определения общих липидов и фосфолипидов в различных областях спектра......................................56

3. Применение аппаратно-программной системы для исследования показателей быстрых изменений инфракрасного спектра липидов цельной крови и ее компонентов...............57

3.1. Результаты анализа показателей быстрых изменений инфракрасного спектра липидного компонента крови с помощью

9-ти канального спектрометра............57

3.2. Особенности показателей ИКС цельной крови после ее взятия в диапазонах, характерных для липидов в различные временные интервалы...................59

3.3. Результаты анализа динамики быстрых изменений показателей ИК спектра цельной крови под влиянием гипотонии, уменьшения значения pH среды, ионов фосфата................................69

3.4. Данные по изучению показателей дина-

мики быстрых изменений ИКС плазмы и эритроцитов под влиянием гипотонии, уменьшения значения рН среды, ионов

кальция и фосфата......................78

4. Сравнительный анализ показателей ИКС цельной крови здоровых людей и больных со злокачественными новообразованиями молочной железы и желудка.........................89

Глава IV. ВЫВОДЫ....................................99

Глава V. ЛИТЕРАТУРА...............................101

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Липиды выполняют в организме важную биорегуляторную роль (133). Эти соединения, в отличие от белков (главных компонентов биологических мембран), характеризуются лабильностью и способностью к взаимной трансформации (25, 108). Установлено, что разрыв химических связей, составляющих основу структуры данных веществ, под действием липаз и других ферментов, сопряжен с важнейшими биохимическими процессами ( 133). Поэтому изучение параметров динамики колебания содержания липидных компонентов различных тканей и органов в короткие временные интервалы дает принципиально новую информацию, которая может быть использована для оценки особенностей функционального состояния организма в норме и патологии.

Для определения быстро изменяющегося уровня липидов могут быть использованы различные методы. Однако наиболее перспективным является метод инфракрасной спектроскопии (ИКС), так как в данном случае одновременно количественно может контролироваться совокупность основных связей липидных молекул.

При изучении липидов с помощью ИКС необходимо учитывать,

что присутствие значительных количеств белка в тканях организма, в частности крови, существенно влияет на показатели в характеризующих липиды областях спектра. Однако, стабильность ковалентных связей белков дает возможность предполагать, что динамика изменения показателей в областях спектра, соответствующих сложнозфирным связям, карбонильным и фосфатным группам, четвертичному азоту, в значительной мере определяется липидным компонентом. Для доказательства этого в условиях эксперимента параллельно проводилось определение уровня содержания основных липидов с использованием метода тонкослойной хроматографии (ТСХ).

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Провести сравнительный анализ показателей степени поглощения в следующих областях инфракрасного (ИК) спектра -3500-3300, 3085-2732, 1831-1623, 1729-1533, 1543-1396, 1470-1330, 1170-1057, 1087-963 см"1.

3. Изучить особенности параметров быстрых изменений исследуемых показателей ИКС крови (амплитуды, времени максимального и минимального значений, конечного и исходного уровня) в областях спектра, характеризующих карбоксильные и фосфатные

группы липидов и других компонентов крови ( 3085-2732,1831-1623, 1170-1057,10870-963 см"1), возникающие под влиянием экзогенных факторов ( уменьшение тоничности среды, изменение рН среды, добавление ионов фосфата.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. В результате проведенных исследований впервые обнаружена динамика быстрых изменений показателей ИКС крови, возникающих после взятия крови под влиянием экзогенных факторов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Показатели динамики быстрых изменений ИКС крови могут быть использованы при диагностике онкологических и других заболеваний.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

3. Возможность использования выбранных параметров дина-

мики быстрых изменений показателей ИКС крови для диагностики заболеваний.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Факторы, определяющие уровень содержания липидов в тканях.

Среди химических компонентов крови и других тканей организма важное место занимают липиды, что позволяет выполнять данным соединениям особую роль ( 19, 57, 106, 108, 111, 117, 118, 138, 141).

Уровень содержания отдельных липидов в различных тканях определяется процессами их биосинтеза и распада, а также реакциями их взаимопревращений (144, 158, 174, 205).

Существенным фактором в поддержании определенного липид-ного состава тканей является обмен и миграция как отдельных частей, так и целых молекул липидов клеточных мембран (137, 165). Липидные молекулы не являются структурами строго локализованными в определенном участке биомембраны, а способны мигрировать(129, 130, 134, 195, 203, 207, 212). Установлено также, что между различными клеточными мембранами происходит обмен фосфолипидными молекулами (43, 134). Реакции переноса специфичны, и существуют системы, обеспечивающие этот межмембранный транспорт фосфатидов (203).

Обнаружено, что между митохондриями и микросомами происходит интенсивный обмен фосфолипидами, причем с наибольшей скоростью обменивается лецитин, с меньшей фосфатидилзтанола-мины, кардиолипины (64, 131).

Аналогичные данные были получены авторами (134), показавшими. что обмен ФХ и ФИ между митохондриями и микросомами происходит быстрее, чем обмен ФЭА и ФК.

При сравнении скорости переноса ФИ и ФХ, показано, что

интенсивность транспорта фосфатидилинозита липид-переносящим белком в 18 раз выше, чем фосфатидилхолина (203). Известно, что главным источником синтезируемых липидов в клетке является эндоплазматический ретикулум, а митохондрии и другие субклеточные структуры ряда органов (сердце, мозг, печень и др.) не способны к синтезу de novo ФХ, ФЭА, ФИ и других ФЛ. При этом предполагается, что перераспределение синтезированных в разных органеллах клетки фосфолипидов является основным механизмом в процессах обновления липидного компонента биомембран. Вещество, стимулирующее перенос фосфолипидов, является высокомолекулярным полимером-белком, представляющим в активной форме липопротеидный комплекс, получивший название фосфо-липидобменивающий белок (ФОБ) (135). По данным литературы (7), относительное количество свободно обмениваемых и связанных липидов на наружной и внутренней поверхностях цитоплазма-тических мембран неодинаково. Наличие большого количества связанных липидов на внутренней поверхности цитоплазматичес-ких мембран обусловлено тем, что на ней расположена большая часть мембранных белков. Обнаружено, что сродство фосфолипидов к белку определяется не спецификой белков, а особенностью липидных молекул (17).

При изучении липид-белковых взаимодействий методом спектроскопии электронного парамагнитного резонанса было показано существование слоя липидов, прочно связанного с белком. Кроме того, было продемонстрировано, что для проявления ферментативной активности необходимо существование пограничного (связанного) слоя, состоящего из 50 липидных молекул на молекулу белка (56). Биохимические исследования показали, что пограничный липидный слой регулирует активность кальций-

зависимой АТФ-азы из саркоплазматического ретикулума (114). Эти данные позволяют предположить, что активность белков в мембранах зависит от наличия пограничного слоя липидов, ассоциированных с белком.

Установлено, что на каждую молекулу интегрального белка приходится 600 липидных молекул, 130 из них прочно связаны с белком (181). Липиды, непосредственно примыкающие к интегральным белкам мембраны (связанные), часто называют аннуляр-ными липидами. Прочносвязанные липиды по своему поведению и подвижности отличаются от суммарного липидного бислоя.

Использование спин-меченых фосфолипидов позволило измерить скорость обмена молекул ФЛ между аннулярным слоем и окружающими подвижными липидами. Время обмена "прочносвязанных" липидов с соседними молекулами составляет величины порядка 10-4 - 10-5 с. Это несоизмеримо меньше продолжительности одного ферментного цикла. Следовательно, аннулярные липиды могут многократно обмениваться с общей липидной фазой уже в течение одного реакционного цикла.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что в биологических мембранах различных тканей , в том числе и крови,происходит постоянный обмен между подвижными и аннулярными фос-фолипидами. Кроме этого, в клетках существуют многочисленные ферментные системы, определяющие уровень содержания отдельных фосфолипидных фракций ( 17, 56, 114).

Фосфолипиды различных тканей образуются при участии жирных кислот и диглицеридов, которые используются и для синтеза триглицеридов (23, 25, 35, 183). Пути метаболических превращений нейтральных липидов и фосфолипидов можно отобразить схемой (рис.1).

Рис. 1. Метаболические взаимоотношения различных групп фосфолипидов и нейтральных липидов . Где: ШЭБ-КоА-ацил-КоА, СНзСОЗКоА-ацетил-КоА [253

Распад фосфолипидов протекает под воздействием фосфоли-паз-энзимов, гидролизующих различные сложноэфирные связи молекул фосфосодержащих липидов. Эти энзимы присутствуют во всех клеточных органеллах и обеспечивают катаболизм фосфоли-пидного компонента биологических мембран (106, 144, 167', 193). Данные, полученные различными авторами, свидетельствуют о том, что фосфолипазы принимают непосредственное участие в регуляции уровня содержания отдельных фосфолипидов и изменения в их функциональном состоянии ведут к развитию патологии (18, 154). Основными ферментами, необходимыми для деградации многих глицерофосфолипидов и сфингомиелинов, являются: фосфо-липаза (А1, А2, В, С и 10, лизофосфолипаза, плазмалогеназа, монофосфоэстераза, инозитолфосфатаза, сфингомиелиназа и цера-мидаза (. 35, 57, 167, 211).

Установлено, что уровень содержания фосфолипидов в био-

логических мембранах также связан с реакциями их взаимопрев-■ ращений. Эта группа реакций протекает с переносом азотсодержащих групп фосфолипидов. Подобные взаимопереходы необходимы для изменения соотношения мембранных фосфолипидов в тех участках клетки или биологической мембраны, где отсутствует синтез того или иного фосфатида (25, 219). Наиболее изучены биологические трансформации фосфатидилхолина, фосфатидилзта-ноламина и фосфатидилсерина. В различных тканях происходит процесс прямого обмена азотистых оснований между молекулами фосфолипидов, т.е. имеют место взаимопревращения, которые можно представить следующей схемой (рис.2).

С02

ФОСФАТИДИЛСЕРИН —-— ФОСФАТИДИЛЭТАНОЛАМИН

серин

СН3

- З-аденозилметионин

ФОСФАТИДЙЛМОНОМЕТИЛЭТАНОЛАМИН

сн3

- 8-аденозилметионин

ФОСФАТИДИЛДИМЕТИЛЭТАНОЛАМИН

СНз

- Б-аденозилметионин

ФОСФАТИДИЛХОЛИН

Рис.2. Схема взаимных переходов азотсодержащих фосфолипидов [25]

Превращения фосфолипидов имеют циклический характер, где главными связующими звеньями выступают азотистые основания (рис.3). Метаболизм фосфолипидов характеризуется ярко выра-

женной спецификой, так как многообразные пути взаимопревращений ФЛ и их метаболитов способны образовывать самостоятельные циклические процессы, имеющие большое физиологическое значение.

Несмотря на многочисленность факторов, влияющих на уровень содержания липидов, количество их поддерживается постоянным и при изменении его нарушаются те или иные функции биомембран (78).

ЛЕЦИТИН ФОСФАТИДИЛСЕРИН

Рис.3. Циклические превращения азотсодержащих фосфолипи-дов С25]

В связи с этим, большой интерес представляют работы, в которых говорится о быстроте реагирования уровня содержания ФЛ на различные стимулирующие и дестабилизирующие агенты(48, 49, 50) . В последнее время появились данные, свидетельствующие о том, что изменения количества ФЛ в ответ на воздействия происходят в течение нескольких секунд и тесно связаны с транспортом метаболитов, рецепторной и энергетической функциями клетки (77, 154). Было обнаружено (32), что скорость обновления фосфолипидов резко возрастает в течение всего лишь

нескольких секунд после начала стимуляции клеток соответствующими агентами. Это наблюдалось на некоторых кровяных клетках ( лимфоцитах) и на секреторных клетках различных типов. Было также обнаружено, что в ответ на стимуляцию клеток происходит мгновенное возрастание скорости обновления фосфолипидов в клетках различных типов. При стимуляции тромбоцитов АДФ время проявления первых изменений колеблется от 2 сек до 3 мин. Первые изменения обмена при стимуляции лимфоцитов фитогемагг-лютинином появляются через 3 мин. Кинетика изменения уровня в клетках различных фосфолипидов в ответ на действие различных стимулирующих агентов исследовалась в ряде экспериментов (160, 161, 169, 189, 220). Особого внимания заслуживают работы, в которых исследована динамика изменения уровня содержания фосфолипидов в короткие промежутки времени после воздействия какого-либо фактора, отличающегося специфичностью и определяющего функциональное состояние биологических мембран (62, 63, 66, 78). Из литературных данных можно заключить, что существуют явления быстрых изменений содержания липидов, происходящие в промежуток времени активного функционирования биологической мембраны. Наибольший интерес представляет исследование характера динамики липидного компонента биологических мембран крови, как специфичной и наиболее легко доступной для анализа ткани, тесно взаимосвязанной с другими систе

Информация о работе

Никитина, Ирина Николаевна
кандидата биологических наук
Тверь, 1999
ВАК 03.00.04

Диссертация

Особенности динамики быстрых изменений показателей инфракрасного спектра крови при действии экзогенных факторов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы