Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности динамики быстрых изменений показателей содержания фосфатидилхолинов печени и крови при воздействии экзогенных факторов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности динамики быстрых изменений показателей содержания фосфатидилхолинов печени и крови при воздействии экзогенных факторов"

ТВЕРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ Г Б О А На правах рукописи

1» ДЕК 1398

Быковская Наталья Геннадьевна

ОСОБЕННОСТИ ДИНАМИКИ БЫСТРЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СОДЕРЖАНИЯ <ЮСФЛТНДИЛХ(ШНОВ ПЕЧЕНИ И КРОВИ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ЭКЗОГЕННЫХ ФАКТОРОВ

03.00.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Тверь 1998

Работа выполнена на кафедре общей и биоорганической химии Тверской медицинской академии

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Каргаполов А.El.

Официааьнне оппоненты: доктор биологических наук,

Ребров Л.Б.

кандидат биологических наук, доцент Илоншенко Д.П.

В*ду«И* организация: Государственное унитарное предприятие научно исследовательский институт синтетических волокон, Г. Tfepti

Г.еицитн состоится "22" jCKatpx ___1998Г. в №______

ни яаседннии диссертационного совета К (J63.97.09 в Тверском государственном университете по адресу: 17000?!, г. Тверь, пр. Чайковского, 70"а", корп. Ь, ауд. Я18.

к'. диссертацией moäho ознакомиться в библиотеке Тверского государственного университета.

Автореферат разослан "21"____ 1998г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук,

доцент

А.Н. Панкрушина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Фосфатдилхолины (ФХ)-являются основными наиболее распространенными липидными компонентами биологических мембран и и в значительной мере обуславливают протекание различных биохимических процессов,обеспечивающих функционирование клетки (AriSfell G,В..Hawthorne J.N.,1973). Установлено „что уровень содержания ФХ в биологических структурах связан с интенсивностью протекающих в них данных процессов,многие из которых происходят в короткие интервалы времени (Nelson G.,1972;Ягужинский Л.С.,1978). Поэтому представляет интерес изучить характер быстрых изменений основного липидного компонента биологических мембран.В настоящее время подобные исследования проведены для высоколабильной фракции фосфолипидов (ФЛ)-фосфоинозитидов (ФИ) и сфинго-миелинов (СФШ (Каргаполов А.В и соавт.1988-1997 ). Наиболее перспективным для решения данной задачи является использование инфракрасной спектроскопии (ИКС),в комплексе с тонкослойной хроматографией (ТСХ),что позволит быстро и эффективно регистрировать параметры динамики уровня ФХ.При количественном изучении ФХ с помощью ИКС необходимо учитывать,что присутствие значительных количеств белка и других биохимических компонентов в тканях организма оказывает влияние на показатели спектра.Однако стабильность ковалентных связей белковых молекул дает возможность предполагать,что динамика изменения показателей в областях спектра,включающих частоты поглощения карбоксильных,фосфатных групп,четвертичного азота,сложноэфир-ных группировок,в значительной мере определяется липвдным компонентом.Поэтому в условиях эксперимента параллельно проводилось определение уровня содержания ФХ с использованием метода тонкослойной хроматографии.

ДЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.Изучить особенности динамики уровня ФХ гомогенатов печени крыс и цельной крови человека,в норме и патологии,под влиянием экзогенных факторов.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.Изучить показатели быстрых изменений ФХ и ФИ гомогенатов печени крыс при действии ряда экзогенных факторов:ги-

потонии,ионов кальция,фосфат-ионов,АТФ.сукцината,малага и нитрогуминового стимулятора (НГС).которые оказывают существенное влияние на липидный компонент биологических мембран.

2.Исследовать спектральные характеристики водно-лецити-новых систем с использованием специально разработанной аппаратно-программной системы.

3.Установить параметры динамики количественного содержания ФХ в образцах цельной крови здоровых людей и лиц с заболеваниями сердечно-сосудистой системы (инфаркт миокарда).

4.Провести сравнительный анализ методов ТСХ и ИКС при определении количественного содержания ФХ в стандартных препаратах, а также модельных системах,содержащих смеси липидов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.В результате проведенных исследований впервые обнаружены быстрые обратимые изменения уровня содержания ФХ в ткани печени и крови.возникающие под влиянием исследуемых факторов.Выделены параметры,характеризующие данные изменения:амплитуда колебания уровня содержания ФХ и его продолжительность,время появления максимальных и минимальных отклонений,период стабилизации уровня анализируемых веществ.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.Разработана методика, позволяющая быстро и эффективно определять количество ФХ в"крови здоровых и больных людей,что может быть использовано для прогнозирования и диагностики заболеваний.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1.Результаты анализа параметров быстрых изменений свидетельствующие о том,что в гомогенатах печени при воздействии экзогенных факторов возникают быстрые обратимые изменения уровня содержания ФХ и ФИ,продолжающиеся через каждые 30 секунд,в течение 3-х минутного интервала.

2.Данные,показывающие,что ив исследуемых факторов (ионы кальция,фосфата,АТФ,гипотония,сукцинат,малат,НГС) наиболее выраженный эффект влияния на динамику быстрых изменений ФХ оказывают фосфат-ионы,АТФ и ионы кальция.

3.Результаты анализа параметров быстрых изменений ФХ в

крови здоровых и больных людей.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ. Результаты исследований рассмотрены на межкафедральном заседании с участием сотрудников кафедр общей и биоорганической химии,биологической химии, медицинской биологии и генетики,фармакологии и науч-но-исследователького центра Тверской государственной медицинской академии (1998).По теме диссертации опубликовано 7 научных работ,получено авторское свидетельство за N1802341, внедрено 2 рацпредложения.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ.Диссертация изложена на 13? страницах машинописного текста и состоит из введения,обзора литературы, материалов и методов исследования,результа- . тов собственных исследований,обсуждения результатов и списка литературы, включающего 244 источника.Работа иллюстрирована 9 таблицами,34 рисунками и графиками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведено 820 анализов.В работе использовали гомогенат печени белых крыс,а также кровь 110 здоровых и больных людей. Гомогенат готовили по стандартной методике (Прохорова М.И. 1982.).В качестве экзогенных факторов использовали АТФ, нитрогуминовый стимулятор,ионы кальция,фосфата,тонич-ность среды,сукцинат.малат-агенты,активно влияющие на основные Функции клетки:изменение ее объема,процессы окислительного ФосФорилирования,через метаболизм липидов. В процессе эксперимента к пробам тканевого гомогената добавляли:ионы кальция-50мкМ/мг белка,фосфат-ионы-5мМ/мг белка,АТФ -20мМ/мг белка,равный объем бидистиллированной воды,сукцинат-5мМ/мг белка,малат-5 мМ/мг белка,нитрогуминовый стимулятор-8х10~3% Далее,с интервалом в 30 секунд,в течение 3 минут после воздействия каждого из исследуемых агентов, отбирали пробы, содержащие 0,1 мг белка в 3-5 мкл (150-200 мкг липида) и наносили их на х роматог рафическую пластинку с тонким слоем си-ликагеля,непосредственно в среде выделения. Для выделения ФХ использовали метод проточной тонкослойной хроматографии в камерах оригинальной конструкции.Количественное содержание

липида определяли денситометрически(Ка:ргаполов A.B., 1981). Экстракцию липидов осуществляли по методу Влайя и Дайера (Bligh E.G..Dyer W.J.,1959),а также в подкисленных смесях растворителей для извлечения прочносвязанных липидов(Ягу-жинский Л.С.с соавт.1990).

Инфракрасную спектроскопию образцов проводили с помощью спектрофотометра модели 270-30 ( фирма"М1асМ", Япония), а также отечественного 9-ти канального инфракрасного анализатора,входящего в состав аппаратно-программной системы.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью персонального компьютера Сх 486 ДХ2-66 по стандартной MeTOBMKe"Statgraphics".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ параметров динамики быстрых изменений фосфатидилхолинов гомогенатсш печени под влиянием экзогенных факторов

Анализ результатов исследований (рис.1) показал,что наибольшие изменения уровня ФХ наблюдаются при воздействии фосфат -ионов. При исследовании воздействия фосфат-ионов было выявлено обратимое изменение уровня содержания ФХ.от его повышения(167,64+5,7 мкг/мг белка,р<0,001), по сравнению с исходным уровнем,на 30 с. воздействия ,до снижения в 2 раза (55,21+4,4 мкг/мг белка,р<0,001) ко времени окончания эксперимента. Интересно отметить,что в отличие от всех исследуемых нами экзогенных агентов,при добавлении фосфата содержание ФХ 4 остается достоверно выше на 30,60 и 90 сек. воздействия,составляя соответственно(167,64+5,7 мкг/мг белка,р<0,001), (129,38+4,4 мкг/мг белка, р<0,05),(136,07+6,5 мкг/мг бедка, р<0,05).

Через 60 с. после воздействия АТФ,который является важнейшим компонентом энергопродуцирующих и энерготранспортных систем клетки, уровень ФХ снижается в 3 раза(39,38+2,5 мкг/мг белка,р<-0,001), по сравнению с исходным уров-нем(114,62+3,8 мкг/мг белка).Через 2 минуты количество ФХ

Яиаодъй дать

Вфхфноы

В/ТО

Вюыюпдо ■тсммссь

Рис.1 Уровень содержания ФХ (мкг/ыг белка) через 30 (а) и 60 (б) секунд после воздействия факторов¡фосфат-ионов ( 5 мМ ),АТФ (20 мМ ),ионов кальция (50 мкМ ), уменьшение тоничности среды в 2 раза; р-достоверность различий по сравнению с исходным уровнем 0,05- *

- б -

повышается в 2 раза (75,16+3,5 мкг/мг белка,р<0,01),по сравнению с уровнем минутного временного интервала.Далее, до окончания времени воздействия, фактора содержание ФХ остается достоверно ниже исходного уровня.

В результате проведеннных экспериментов обнаружено, что уменьшение тоничности среды в 2 раза,приводит к снижению уровня содержания ФХ на всех временных интервалах.Наибольшие колебания уровня содержания ФХ компонента гомогенатов печени наблюдаются в течение 1,5 мин.после воздействия агента.

Исследование колебаний уровня содержания ФХ при введении в тканевый гомогенат ионов кальция также выявило характерные особенности воздействия агента.Показано,что через 30 с. после добавления раствора,содержащего ионы кальция к взвеси гомогената печени,количество липида незначительно повышается. В дальнейшем, до 3 мин. воздействия агента .наблюдается падение количества ФХ.Минимальный уровень ФХ составил (46,53+6,1 мкг/мг белка,р<0,001) через 1,5 мин. от начала эксперимента.

Полученные результаты находятся в соответствии с ранее опубликованными данными (Мацуль В.М.,1988;Зубарева Г.М., 1997) .свидетельствующими о том, что высоколабильная фрак-ция-ФИ,а также СФМ претерпевают существенные изменения в аналогичные временные интервалы.

Таким образом,результаты проведенных исследований свидетельствуют о выявленном ряде особенностей динамики быстрых изменений ФХ в гомогенатах печени в условиях эксперимента. Фиксируемые колебания являются ответной реакцией исследуемого тканевого гомогената на действие экзогенных факторов.Вероятно, это обусловлено тем,что указанные агенты оказывают влияние на многочисленные метаболические процессы,связанные с уровнем содержания различных форм ФЛ и протекающие на структурно-динамическом матриксе биомембран.

Возможными механизмами увеличения или уменьшения количества ФХ являются .по-видимому,процессы взаимоперехода данного липида ь ФЭА,СФМ,что находится в соответствии с данными литературы (Dawson R.М.,1973;Gurr М.I.,1988;Kent С.,1990). Существенную роль может играть распад ФХ до дизолроизвод-ных и последующе« реацилирование ( Врокерхоф Х,.Дженсен Р.,

1378;Hailma M..Raivio K.,1974;5ato T.,1973;Schmitz M.G.,1990)

Для выяснения возможности наличия колебания уровня ФХ в результате изменения прочности белковолипидных комплексов , проводилась дополнительная экстракция с использованием смесей подкисленных смесей растворителей,которая показала присутствие в экстрагируемой фракции от 5 до 8% ФХ.Установленный факт не позволяет принять данный механизм,обеспечивающий колебания ФХ,в качестве основного, но и не исключает - его из предполагаемых.

Учитывая то,что в 3-х минутном интервале конкретные временные промежутки выбраны произвольно,представляло интерес построить графическую аппроксимирующую зависимость,которая могла максимально отображать исследуемое явление и допускать точную интерполяцию .Это позволило бы выявить максимальную амплитуду динамических колебаний,частоту обнаруженных быстрых изменений,а также другие скрытые закономерности этого явления.Для решения поставленной задачи был использован метод сплайновой аппроксимации (Завьялов Ю.С.,Квасов Б.И., 1980 ).

Данная интерпретация полученных результатов позволяет охарактеризовать процесс быстрых изменений количественного содержания ФХ с использованием определенных параметров: начального и конечного уровня,максимальной амплитуды колебаний, времени выхода на максимальный и минимальный уровень.

Результаты,используемой нами математической обработки экспериментально полученных значений позволили установить, что воздействие фосфат-ионов вызывает наиболее значительные колебания уровня количественного содержания ФХ(максимальная амплитуда колебаний составляет 127,19+8,8 мкг/мг белка,р<0,05).Несколько ниже значение максимальной амплитуды при воздействии ионов кальция и АТФ,соответственно 79,62+6,3 мкг/мг белка(р<0,05) и 75,24+5,8 мкг/мг белка (р<0,05). .Минимальные колебания содержания ФХ зафиксированы при действии такого экзогенного фактора как гипотония 67,49+5,4 мкг/мг белка (р<0,05).

Обнаружено, с использованием полученных графических зависимостей, что минимальное значение содержания ФХ.как в слу-v чае добавления раствора,содержащего ионы кальция,так и при'

понижении тоничности среды,наблюдается через 90 с. от начала эксперимента.Наибольшее значение такого параметра,как время выхода на минимальный уровень содержания ФХ зафиксировано при действии фосфат-ионов (180 с.),а наименьшее (60с. ) -при действии АТФ. Установлено,что достижение максимального значения содержания ФХ наиболее быстро ( через 18 с.) происходит при действии фосфат-ионов,более медленно при действии ионов кальция ( через 28 с.).

Таким образом, приведенные данные .обработанные методом сплайновой аппроксимации, убедительно доказывают,что исследуемые нами экзогенные факторы :тоничность,фосфат-ионы,ионы кальция,АТФ вызывают характерные быстрые обратимые изменения основного фосфолипшшого компонента клеток-ФХ.Этот факт может быть использован для объяснения различных биохимических процессов в клетке.

В следующей серии опытов модель быстрых изменений ФЛ компонента была использована для изучения механизма действия природного биостимулятора роста-нитрогумата аммония, препарата, полученного на основе гуминовых кислот (Круглов В.П.,19~5;Адманене Л.И.,1981;Лещинский А.Ф..Чернецкая Е.В., 1982) .который обладает высокой биологической активностью, участвуя в разнообразных биохимических процессах,связанных с функционированием клетки.

На данном этапе исследования представлялось целесооб-• разным выявить характерные особенности динамических изменений не только ФХ.но и ФИ,являющегося вторичным мессендке-ром,обеспечивающим протекание одного из фундаментальных клеточных процессов-процесса пролиферации (табл.1,2 )

В экспериментах использовали сухой препарат НГС,свободный от компонентов, растворимых в бензоле,ацетоне и вод-но-этанольной смеси в концентрации 8х10-3%

На первом этапе работы представляло интерес исследование изменения показателей динамики ФХ и ФИ при индивидуальном воздействии экзогенных факторов.

При введении ионов кальция в среду,содержащую тканевый гомогенат .уровень ФХ и Фй-Фракции ,в основном,остается ниже исходного в течение всего 3-х минутного интервала..

При изучении влияния метаболитов цикла Кребса-сукцината

Таблица 1

Уровень содержания (М+ш мкг/мг белка) фосфатндишхолинов гомагенатов печени после воздействия экзогенных факторов в период до трех минут

Время 30 с. 1 мин. 3 мин.

Факторы +6,5 64,46 +3,6 ** 75,13 +4,8 **

Ьйоны кальция 50 мкМ/мг белка

2.Фосфат-ионы 5 мМ/мг белка 167,64 +5,7 ** 129,38 +4,4 * 55,21 +4,4 ***

З.Сукцинат 5 мМ/мг белка 53,11 +4,2 ** 79,65+ +5,6~ * 85,55 +6,4 *

4.Малат 5 мМ/мг белка 56,32 +3,8 ** 81,22 +7,3 * 54,01 +2,9 **

5.НГС _ 8x10 % 58,15 +4,2 ** 88,21 +6,8 * 70,18 +6,4 **

5.Ионы кальция и НГС (v/v=l:1) 68,23 +3.6 ** 49,91 +2,9 ** 40,11 +2,1

7.Сукцинат и НГС (v/v=l:l) 59,48 +2,9 * 76,29 +3,3 ** 55,39 +3,6 **

8.Малат и НГС (v/v=l:l) 64,49 +3,8 * 92,13 +3,8 * 55,84 +2,4 **

9.Фосфат-ионы и НГС (v/v=l:1) 86,61 +5,4 ** 60,22 +4,6 ** 113,38 +6,4

Исходный уровень ФХ-114,6+5,76 мкг/мг белка,р-достоверность различий по сравнению с исходным уровнем:р<0,05-*; р<0,01-**-, р<0,001-*** В каждом варианте опыта проведено 15 анализов

и малата на липидный состав гомогената печени не выявлено существенных различий основных параметров процесса колебания уровня содержания исследуемых ФЛ.При определении количества ФЛ в случае инкубации в среде сукцината как для ФХ.так и для ФИ на 30 с. воздействия наблюдалось резкое уменьшение их содержания в 2 раза (р<0,01).Далее по истечении минуты воздействия фактора количество холин- и инозитсодержащих ФЛ повышается соответственно в 1,5 (р<0,05) и 1,3 раза (р<0,05) сохраняясь на данном уровне до окончания эксперимента.Анализ влияния малата на количество ФХ и ФИ показал наличие выраженной периодичности изменений,сопровождающейся последовательным чередованием повышения и понижения уровня содержания исследуемых липидов.

Установлено,что в случае действия фосфат-ионов на начальной стадии эксперимента ( через 30 с.) количество ФХ превышает исходный уровень в 1,5 раза (р<0,05),при отсутствии достоверных изменений содержания инозитсодержащих ФЛ. На 180 с. воздействия обнаружен выраженный эффект снижения количества ФХ и ФИ, в среднем,в 2 раза (р<0,01), по сравнению с начальным контрольным значением.

Для выяснения деталей механизма действия нитрогумата аммония,являющегося стимулятором ряда биохимических процессов, была проведена следующая серия,включающая комплексное воздействие экзогенных факторов и НГС.

Опыты показали,что введение НГС (8х10_3%) в среду инкубации , содержащую ионы кальция,не меняя общей динамической картины способствует повышению максимальной амплитуды колебания ФХ в 1,2 раза(р<0,05).Изучение показателей количественного содержания ФИ при совместном действии НГС и ионов кальция выявило аналогичное незначительное повышение амплитуды колебания лабильного компонента.

В дальнейших исследованиях было изучено совместное действие НГС и сукцината на уровень содержания ФХ и ФИ.Добавление НГС не вызвало существенных изменений параметров динамики ФХ.Обнаружено,что по истечении минуты от начала эксперимента в среде ' инкубации,содержащей биостимулятор в смзги с гукдкнатом,количество основной ФЛ фракции осталось ¡тактически • без значимых изменений.Результаты проведенных

Таблица 2

Уровень содержания СМ+т мкг/мг белка) фосфатидилинозитов гомогенатов печени после воздействия экзогенных факторов в период до трех минут

Время 30 с. 1 МИН. 3 мин.

Факторы 10,5 +0,53 * 8,85 +0,92 Ус 7.06 +0,34 **

1.Ионы кальция 50 мкМ/мг белка

2.Фосфат-ионы 5 мМ/мг белка 12,15 + 1,32 9,30 +0,56 * 6.89 +0,33 ж*

З.Сукцинат 5 мМ/мг белка 7,31 +0,72 УсУсж 10,33+ +0,9? Ус 10.81 +1,11 Ус

4. Маяат 5 мМ/мг белка 7,47 +0,55 *** 11,21 +1,24 Ус 6,81 +0,75 **Ус

5.НТО „ 8x10" % 7,18 +0,51 Wok 4,80 +0,45 *** 8,48 +0,98 Ус

б.Ионы кальция и НГС (v/v=l:l) 7,64 +0,4 ж* 5,04 +0,35 xitck 8,02 +0,45 **

7.Сукцинат и НГС (v/v=l:1) 7,43 +0,32 ж* 9,22 +0,21 Ус 4,96 +0,24 УсУсУс

8.Малат и НГС (v/v=l:1) 6,40 +0,45 ** 12,03 +0,64 * 4,58 +0,26 Ус**

9.Фосфат-ионы и НГС (v/v=l:l) 8,19 +0,41 * 10,76 +0,51 * 8,63 +0,53 *

Исходный уровень ФИ-15,85+0,8 мкг/мг белка,р-достоверность различий по сравнению с исходным уровнем:р<0,05-*; р<0,01-**;р<0,001-*** В каждом варианте опыта проведено 15 анализов

исследований свидетельствуют о наличии выраженных колебаний уровня содержания лабильного ФЛ компонента-ФИ,которые проявлялись в увеличение максимальной амплитуды в 1,4 раза (р<0,05) и наблюдались при совместном действии НГС и сукци-ната. В аналогичных экспериментах по изучению совместного влияния малата и НГС следует отметить повышение максимальной амплитуды колебания уровня содержания ФИ в 1,2 раза (р<0,05) а также выявленное отсутствие зависимости характера динамического процесса изменения уровня ФХ от наличия НГС в системе.

В работе также изучалось влияние действия фосфат-ионов, в сочетании с НГС,на ФЛ состав гомогенатов печени .Следует отметить,что. эффект воздействия неорганического фосфата,в сочетании с НГС,на количественное содержание ФЛ фракций варьирует внутри исследуемого трехминутного интервала для основной и минорной фракции. При добавлении НГС в среду инкубации с фосфатам наблюдается понижение в 2 раза (р<0,01) амплитуды колебания уровня содержания ФХ. Характеризуя параметры процесса быстрых изменений количественного уровня ФИ при совместном воздействии фосфата и НГС, следует указать на снижение амплитуды колебания уровня минорного липида в присутствии НГС в 1,2 раза,а также зафиксированное изменение временного интервала (30 с.) .соответствующего минимальному количеству ФИ.

Таким образом,доказано,что в тканевых гомогенатах печени крыс воздействие НГС на фоне экзогенных факторов оказывает влияние на уровень содержания исследуемых ФЛ в короткие временные интервалы,поэтому показатели быстрых изменений ФХ и ФИ могут быть использованы для оценки эффективности воздействия НГС на организм человека.

2. Определение фосфатидкдхотнов в растворах липосом и цельной крови

Значительный интерес представляло изучение возможности определения ФХ непосредственно в крови. Учитывая ,что природные смеси являются сложными многокомпонентными системами, содержащими близкие по химическому составу соединения

(Балаховский И.С..Лебедев Ю.Б.,1982;Nelson G.,1972) была предложена комплексная методика,сочетающая метод ИКО с классическим, основанным на использовании ТСХ.

В ходе эксперимента были приготовлены экстракты,извлеченные из 1,2,3,4 и 5 мл цельной крови и упаренные в токе азота.Полученный сухой остаток растворяли в смеси хлороформ-метанол (2:1).Часть полученного экстракта использовали при хроматографическом анализе.Для инфракрасной спектроско-пии-экстракты снова упаривали,остаток растворяли в химически чистом,перегнанном перед употреблением,обезвоженном хлороформе и помещали в кювету объемом 20 мкл.Далее проводилось измерение показателей поглощения с помощью аппаратно-программной системы.Полученные данные показывают на возможность достаточно точного (ошибка метода+7,2%) определения содержания ФХ в природных комплексах с использованием аппаратно-программной системы.

Особый интерес представляет выяснение возможности определения ФХ в водных растворах,так как это позволит измерить их количество непосредственно в крови.

Известно (Верболович В.П.,1977;Кендал Д.,1970;Wallach D.F..Zahler P.N.,1968;Williams A.D.,1993),что при ИКС водных ! растворов значительная часть показателей определяется водным компонентом.Поэтому на данном этапе эксперимента изучались особенности показателей ИКС воды с помощью специальной аппаратно-программной системы. Установлено,что минимальная величина пропускания (7,0+0,48%) наблюдалась в области частот 3500-3100 см-1,соответствующих зоне 1 канала,максимальная величина пропускания(80,0+4,2%)-в области частот 2120-1880 см-1 (область 3 канала).Следует также отметить уменьшение пропускания до 30,3+2,4% в области 1729-1533 см-1 (зона 5 канала).

Использование метода классической инфракрасной спектроскопии при регистрации ИК-спектра воды на спектрофотометре модели 270-30 (фирма "Hitachi"),в кюветах из фторида кальция, показало идентичность выявленных спектральных характеристик воды:наличие широкой инфракрасной полосы поглощения в области 3200-3600 см-1 и слабого сигнала на частоте 2200 см"1 обусловленных валентными колебаниями О-НЛассоциированные группы -ОН,водородные связи),а также интенсивного поглощения

на частоте 1640 см-1,отнесенного к деформационному колебанию связи 0-Н.

Таким образом,результаты проведенного эксперимента дают основание для возможности анализа показателей спектра воды,а также других компонентов исследуемой системы с использованием 9-канального спектрофотометра.

Представляло интерес исследовать воздействие различных компонентов биологических систем на показатели инфракрасного спектра воды. В последующей серии опытов проведен анализ влияние ФХ на спектральные характеристики воды. Изучение спектральных характеристик водных растворов фосфатидилхоли-нов было выполнено на модельных системах.

В качестве экспериментальной модели были выбраны фосфа-тидилхолиновые липосомы. Нами были получены мультиламелляр-ные липосомы сферической формы,диаметром от 30 до 100 мкм, с концентрацией ФХ 2%, 1%,0,IX,0,05%.

С целью изучения особенностей показателей ИКС липосо-мальных препаратов проводилась их спектрофотометрия(кюветы из фторида кальция,объем пробы 30 мкл) с использованием инфракрасной спектроскопии.

Установлено,согласно литературным данным (Williams A.D., 1993;Карякин A.B.,1973;Сорокина 3.А.,1978 ),что вода оказывает существенное влияние на спектр лецитина.Анализируя спектральные кривые липосомальных препаратов можно указать, что они более приближены к спектру воды,чем к спектру лецитина. Однако следует отметить,что в спектрах липосом.по сравнению со спектром воды,наблюдаются определенные изменения, как в высокочастотной области (смещение максимума широкой полосы поглощения в области 3200-3600 см-1 ) и в низкочастотной (уменьшение интенсивности полосы поглощения в области 1580-1620 см-1).Полученные результаты можно интерпри-тировать с использованием эффекта перевода некоторой части молекул воды в связанную форму,вследствии взаимодействия ее с молекулами ФХ и образованием водородных связей.

Результаты,полученные с помощью 9-канального спектрофотометра выявили изменение спектральных показателей структурированной воды в растворах фосфатидилхолиновых липосом с различной концентрацией фосфолипида. Исследования показа-

ли,что максимальное отклонение в 2,8 раза (р<0,001) ив 1,5 раза (р<0,05) зарегистрировано в области 8 канала (1270-1070 см-1).соответственно для 2% и 1% раствора ФХ ли-посом,включающего частоты валентных колебаний Р=0 и Р-0~ (группа 0=Р-0~ ) . Минимальные изменения спектральных показателей в 1,6 раза (р<0,05) для 2Z липосомального раствора и в 1,27 раза (р<0,05) для 1% раствора наблюдалось в области 3 канала, (2120-1880 см-1) который характеризуется водным компонентом системы (Юхневич Г.В.,1973;Kisner Н..Brown C.W.,1982).

На следующем этапе исследования были изучены спектральные характеристики лецитиновых липосом,приготовленных на водноспиртовых системах,с варьируемым соотношением этих компонентов. В этой серии опытов ставилась задача изучить степень влияния различных концентраций гидрофильного агента в липосомальной системе на ее спектральные характеристики,т.к. известно по литературным данным (Кочнев И.Н.,1970;Юхневич Г.В., 1973),что добавки к воде различных гидрофобных и гидратирующих агентов существенно влияют на ее показатели спектра.

При исследовании 2Z раствора ФХ липосом обнаружено,что наиболее существенные изменения коэффициента пропускания происходят при использовании системы спирт-вода,содержащей 40 o6Z спирта.Установлено,что в области 2 канала (3085-2732 см-1) .поглощение в котором можно отнести за счет валентных колебаний метальных и метиленовых групп,а также в зонах с 6 по 8 канал (1543-1070 см"1) наблюдаются изменения спектральных характеристик липосомальных растворов, с высокой степенью достоверности, при содержании спирта в системе от 30 до 90 об %.

В ходе работе обнаружено ,что характер изменений показателя пропускания 0,1% раствора ФХ липосом в водносниртоких системах,в целом,идентичен 2%. липосомальным растворам.Амплитуда колебаний спектрального показателя наиболее высока i ри содержании спирта в системе 30%, 50% и 70 об%.

Изучение спектральных характеристик цельной крови и ее смесей с водно- спиртовыми системами, используя аппаратно -программную систему .позволило выявить особенности влияния спиртового компонента системы на показатели спектра кро-

ви.т.к. согласно литературным данным (Сидорова А.И..Халои-мов А.И.,1970;Kisner Н..Brown С.W.,1982) водно-спиртовые системы с различным соотношением их составных частей,неодинаково влияют на белковый и липидный компонент биологических систем в т.ч. крови.

Обнаружено,что в высокочастотной области спектра,с 1 по 4 канал (3500-1723 см-1) .колебания спектральных показателей крови более выражены,что по-видимому объясняется тем,что присутствие спирта вносит свой вклад в изменение интенсивности наиболее сильных полос поглощения крови,связанных со структурированной водой и белковыми компонентами,что подтверждается данными литературы (Верболович В.П.,1977;). Отмечено,что на 1 (3500-3100 см-1) и 2 канале (3085-2732 см"1) уровень пропускания максимально падает, соответственно, в 1,8 (р<0,01) и 1,9 раза (р<0,01) при содержании 70 об.%. спирта в системе. Найдено,что в области 3 (2120-1880 см-1) и 4 канала (1833-1723 см-1) при увеличении количества спиртового компонента пропускание возрастает в 1,3-1,4 раза (р<0,05) .

Проведенные исследования показывают,что ФХ,являющийся компонентом биологических систем,и спирт,оказывают существенное влияние на показатели ИКС воды.При этом имеется возможность количественного определения ФХ в указанных диапазонах.

Выявленные нами различия спектральных показателей крови в варьируемых водно-спиртовых системах подтверждают факт существования быстрых обратимых изменений ряда основных компонентов крови в т.ч. и липидов.Представляло интерес выяснить характер этих изменений при одном из самых распространенных заболеваний-инфаркте миокарда .т.к. согласно литературным данным (Чазов Е.И.,Климов А.Н.,1980;Леви Р.И..Климов А.Н., 1983;Галлер М..Ганефельд М. .Яросс В.,1979) при ишемической болезни сердца наблюдаются значительные изменения показателей липидного обмена.

В ходе исследований (рис.2) выявлено,что наблюдается существенная разница всех параметров динамики у здоровых лиц и больных,находящихся в стадии острого периода инфаркта (от момента диагностирования заболевания до 3 суток).Так, сниже-

Рис. Й Динамика бьютрнх изменений количественного содержания ФХ (ммоль фосфора ФХ/л крови) у больнмс инфарктом миокарда:а-острый период заболевания,6-15 сутки, в-30 сутки

I.Здоровые лица, 2,Больные

ны б 3,2(р<0,001) и 3,8 раза (р<0,001) соответственно,начальный и конечный уровень содержания ФХ.по сравнению с этими же показателями у здоровых лиц (1,86+0,04 ммоль фосфора ФХ/л крови,2,15+0,03 ммоль фосфора ФХ/л крови).Время выхода на максимальный уровень у здоровых лиц составляет 180 с. тот же показатель у больных снижен на 40 с. Время выхода на минимальный уровень составляет 145 и 180 с..соответственно у здоровых и больных лиц.Максимальная амплитуда колебаний количественного содержания ФХ снижена в 2,6 раза (р<0,01) по сравнению с этим же показателем у здоровых лиц(О,57+0,00? ммоль фосфора ФХ/л крови).

Общий вид динамической кривой изменения уровня ФХ у больных на 15 сутки от момента диагностирования заболевания, а также показатели ее описывающие,приближен к аналогичной Функциональной зависимости у здоровых лиц : одинаковое время выхода на максимальный уровень(180 е.), незначительно сдвинуто (на 5 с.) время выхода на минимальный уровень.слабо понижена амплитуда колебания количественного содержания ФХ (0,44+0,006 ммоль фосфора ФХ/л крови).

По истечении 30 суток у больных инфарктом миокарда происходит дальнейшее приближение параметров динамики к показа--телям у здоровых лиц.Так, начальный и конечный уровень количественного содержания ФХ составили соответственно 1,32+0,06 ммоль фосфора ФХ/л крови и 1,94+0,02 ммоль фосфора ФХ/л крови. Наблюдается идентичное,этому показателю у здоровых лиц, время выхода на минимальный уровень-145 с.Однако следует отметить следующие особенности-максимальная амплитуда колебаний уровня ФХ составляет 1,23+0,03 ммоль фосфора ФХ/л крови, что в 2,2 раза (р<0,01) превышает данный показатель у здоровых лиц .время выхода на максимальный уровень составляет 90 с. против 180 с. у здоровых лиц.

Полученная информация,характеризующая динамику быстрых изменений показателей крови,дает возможность построить эталоны .отражающие специфику быстрых изменений основных связей липидов,белков и других фундаментальных компонентов крови в контрольной группе и при данном виде патологии -инфаркте миокарда.

Таким образом,в отличие от традиционных методов биохи-

- 1У -

мического анализа,в условиях проведенных исследований, оценивается система в целом,что позволяет регистрировать изменения ее функционального состояния при различных воздействиях, при зтом наиболее точная интерпритация полученных результатов возможна при комплексном использовании методов ТСХ и ИКС.

выводы

1.В гомогенатах печени при воздействии экзогенных факторов, оказывающих существенное влияние на метаболизм липидов: гипотонии,ионов кальция,фосфат-ионов,АТФ, сукцината.малата и нитрогуминового стимулятора возникают быстрые обратимые изменения уровня содержания ФХ и ФИ,продолжающиеся в течение 3 минут.

2.Воздействие фосфат-ионов вызывает наиболее значительные колебания уровня количественного содержания ФХ при слабо выраженной динамике ФИ ,по сравнению с контрольной серией (максимальная амплитуда колебаний составляет 127,19 мкг/мг белка и 8,96 мкг/мг белКа соответственно). Несколько ниже значение максимальной амплитуды при воздействии ионов кальция -79,62 мкг/мг белка и АТФ-75,24 мкг/мг белка. Минимальные колебания содержания ФХ зафиксированы при действии гипотонии (амплитуда колебания- 67,49 мкг/мг белка) .аналогичное незначительное воздействие на уровень содержания ФХ оказывают метаболиты цикла Кребса-сукцинат и малат.

3.Введение НГС в среду инкубации,содержащую ионы кальция, незначительно,в 1,2 раза повышает максимальную амплитуду колебания ФХ и ФИ.При добавлении малата и сукцината в среду инкубации с НГС наблюдается повышение амплитуды колебания ФИ соответственно в 1,2 и 1,4 раза и отсутствие существенных изменений параметров динамики ФХ. Эффект воздействия неорганического фосфата в сочетании с НГС проявляется в уменьшении, соответственно, в 2 и 1,2 раза амплитуды колебания уровня ФХ и ФИ.

4.При анализе показателей ИКС с использованием специальной аппаратно-программной системы установлено, что для количественного определения липида можно использовать диапазоны частот 1270-1070 см-1 и 1087-963 см'1. Показано что в

модельных смесях липидов сохраняется выраженная зависимость оптической плотности от концентрации ФХ.

5.Исследования спектральных характеристик водных растворов ФХ,выполненных на липосомах с различной концентрацией лецитина,показали,что максимальные отклонения в 2,8 раза и в 1,5 раза соответственно для 2% и IX растворов ФХ липосом, зарегистрированы в области 1270-1070 см-1 что дает возможность проводить количественное определение ФХ в данных условиях.

5.На основе результатов анализа цельной крови больных и здоровых людей с помощью специальных программ сформированы эталоны .отражающие особенности функционального состояния организма.По разработанным эталонам в комплексе с другими методами проведена оценка состояния организма в различные сроки постинфарктного периода

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Способ диагностики инфаркта миокарда/Авторское свид.N1802341 от 9.10.1992.(в соавт.Слюсарь Н.Н.,Лопина Н.П., Каргаполов А.В.,Аникин В.В.)

2.Разработка высокоэффективного метода определения фос-фатидилхолинов для регистрации быстрых изменений этих соединений/ Материалы научной конференции"Современные вопросы диагностики и лечения".-Тверь,1994.-С.7-8(соав.Никитина И.Н.)

3.Специфика фосфоинозитольного ответа больных с острым периодом инфаркта миокарда/Тез.докладов конф." -Тверь,1990.-С.65-66.(соавт.Мацуль В.М. ,Лопина Н.П.)

4.Метод определения динамики фосфатидилинозита у больных инфарктом миокарда/Лаб.дело.-N3.-1991.-С.22-24. (соавт. Каргаполов A.B..Ястребов Г.Н.,Аникин В.В.)

5.Динамика изменения уровня содержания общих липидов у больных инфарктом миокарда/Тер.архив.-N12.-1991.-С.38-39. (соавт.Каргаполов A.B..Аникин В.В..Лопина Н.П..Ястребов Г.Н.)

6.Исследование динамики содержания фосфатидилинозита у больных инфарктом миокарда/Вопр.мед.химии.-N3.-1992.C.10-11. (соавт.Каргаполов A.B..Аникин В.В..Ястребов Г.Н.)

7.Одновременное определение содержания фосфатидилхолина и фосфатидилинозита в плазме крови методом инфракрасной спектроскопии/Тез.докладов конф."Ученые института практическому здравоохранению"-Тверь.1992.-О.19.

¡.¡.Особенности изменения уровня содержания фосфатидилхо-линов у больных крупноочаговым инфарктом миокарда/Тез.докладов. конф."Новые направления в диагностике,лечении и профилактике заболеваний у населения Тверской области" .Тверь,1996.- С.153-154.

РАЦИОНАЛИЗАТОРСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1.Рационализаторское предложение N 1447.Способ изучения фосфатидилинозитои плазмы крови у оольных в остром периоде инфаркта миокарда. - Тверь,1990.

2.Рационализаторское предложение N ¡ЯГО.Метод определения количественного содержания фоофатидилходиноъ ь тканевых гомпгннатах и крови с использованием тонкослойной хроматографии и спектроскопии.-Тверь,199».

Подписано в печать 20.11.98.Усл.печ.л.1,65 Уч.-изд.л.1,35 Тираж 100 экз.Заказ 117

Отпечатано на ротапринте ТвГУ

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Быковская, Наталья Геннадьевна, Тверь

У1 а а. /""' - &

/ • (У %/ «и,,/ х ^^ /

ТВЕРСКАЯ'ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

БЫКОВСКАЯ Наталья Геннадьевна,

ОСОБЕННОСТИ ДИНАМИКИ БЫСТРЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СОДЕРЖАНИЯ ФОСФАТИДИЛХОЛИНОВ ПЕЧЕНИ И КРОВИ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ЭКЗОГЕННЫХ ФАКТОРОВ

03.00.04-Биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук профессор А.В.Каргаполов

Тверь 1998

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ,ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ

АТФ-аденозинтрифосфат, Ацетил-КоА-ацетилкофермёнт (коэнзим) А, Ацил-КоА-ацилкоэнзим А, ДГ-диацилглицерины,

ВЭЖХ-высокоэффективная жидкостная хроматография,

ИКС-инфракрасная спектроскопия,

ЖК-жирные кислоты,

КЛ-кардиолипины,

ЛФЛ-лизофосфолипиды,

ЛФХ- л изофосфатидилхолины

МТСХ-микротонкослойная хроматография,

НГС-нитрогуминовый стимулятор

СФМ- сфингомиелины,

ТГ-триацилглицерины,

ТСХ-тонкослойная хроматография,

ФИ-фосфатидилинозиты,

ФК-фосфатидные кислоты,

ФЛ-фосфолипиды,

ФРХ-фосфорилхолин,

ФС-фосфатидилсерины,

ФХ-фосфатидилхолины(лецитины),

ФЭА-фосфатидилэтаноламиныСкефаяшы),

ХС-холестерин,

ЦМФ-цитидинмонофосфат,

ЦДФХ- цитидиндифос(|юхолин,

ЦТФ-цитидинтрифосфат,

ЭХ-эстерифицированный холестерин (эфиры холестерина),

СОДЕРЖАНИЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.....................6

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1- Строение и физико-химические свойства фосфатидилхолинов.......................9

2. Метаболизм фосфатидилхолинового компонента в биологических мембранах................14

3. Использование хроматографических методов анализа для количественного определения фосфатидилхолинов........................22

4. Применение инфракрасной спектроскопии для анализа фосфатидилхолинов......... ......32

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Метод проточной тонкослойной хроматографии.....................................>38

2. Способ регистрации быстрых изменений количественного содержания фосфатидилхолинов в нативных препаратах печени и экстрактах крови..............'.....43

3. Метод инфракрасной спектроскопии

47

3.1. Анализ инфракрасных спектров стандартных препаратов фосфатидилхолинов____47

3.2. Методика определения количественного содержания фосфатидилхолинов с помощью 9-ти канального спектрометра, входящего в состав аппаратно-программной системы................................47

4. Методика получения фосфатидилхолиновых липосом..................................49

5. Методика получения нитрогуминового стимулятора.....................................51

6. Статистическая обработка результатов исследований..................................52

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.Использование инфракрасной спектроскопии для определения показателей динамики быстрых изменений фосфатидилхолинов...............54

1.1.Количественное определение фосфатидилхолинов в модельных системах..........54

I.E.Определение фосфатидилхолинов в раст-

ворах липосом и цельной крови.........65

2.Анализ параметров динамики быстрых изменений фосфатидилхолинов гомогенатов печени под влиянием экзогенных факторов .............84

3.Особенности показателей быстрых изменений фосфатидилхолинов крови в постинфарктном периоде...................................104

Глава IV.ВЫВОДЫ...................................108

Глава V.ЛИТЕРАТУРА

110

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.Фосфатидилхолины (ФХ)-являются основными, наиболее распространенными, липидными компонентами биологических мембран и в значительной мере обуславливают протекание различных биохимических процессов,обеспечивающих функционирование клетки (3,113,141,148). Установлено ,что уровень содержания ФХ в биологических структурах связан с интенсивностью протекающих в них данных процессов, многие из которых происходят в короткие интервалы времени (58,61,82,87,111). Поэтому представляет интерес изучить характер быстрых изменений основного липидного компонента биологических мембран. В настоящее время подобные исследования проведены для высоколабильной фракции фосфолипидов (ФЛ)-фос-фоинозитидов (ФИ) и сфингомиелинов (СХЕМ) (51,111). Наиболее перспективным для решения данной задачи является использование инфракрасной спектроскопии (ИКС) в комплексе с тонкослойной хроматографией (ТСХ),что позволяет быстро и эффективно регистрировать параметры динамики уровня ФХ.При количественном изучении ФХ с помощью ИКС необходимо учитывать,что присутствие значительных количеств белка и других биохимических компонентов в тканях организма оказывает влияние на показатели спектра. Однако стабильность ковалентных связей белковых молекул дает возможность предполагать,что динамика изменений показателей в областях спектра,включающих частоты поглощения карбоксильных,фосфатных групп,четвертичного азота, сложноэфирных группировок,в значительной мере определяется липидным компонентом.Поэтому в условиях эксперимента параллельно проводилось определение уровня содержания ФХ с ис-

пользованием метода ТСХ.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.Изучить особенности динамики уровня ФХ гомогенатов печени крыс и цельной крови человека,в норме и патологии,под влиянием экзогенных факторов.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.Изучить показатели быстрых изменений ФХ и ФИ гомогенатов печени крыс при действии ряда экзогенных факторов: гипотонии, ионов кальция,фосфат-ионов,АТФ,сукцината,малата и нитрогуминового стимулятора (НГС),которые оказывают существенное влияние на липидный компонент биологических мембран.

2.Исследовать спектральные характеристики водно-лецити-новых систем ФХ с использованием специально разработанной аппаратно-программной системы.

3.Установить параметры динамики количественного содержания ФХ в образцах цельной крови здоровых людей и лиц с заболеваниями сердечно-сосудистой системы(инфаркт миокарда).

4.Провести сравнительный анализ методов ТСХ и ИКС при определении количественного содержания ФХ в стандартных препаратах, а также модельных системах,содержащих смеси липидов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.В результате проведенных исследований впервые обнаружены быстрые обратимые изменения уровня. содержания ФХ в ткани печени и крови под влиянием исследуемых факторов.Выделены параметры,характеризующие данные изменения:амплитуда колебания уровня содержания ФХ и его продолжительность,время появления максимальных и минимальных отклонений-,период стабилизации уровня анализируемых веществ.

' ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Разработана методика, позволяющая быстро и эффективно определять количество ФХ в крови здоровых и больных людей,что может быть использовано

для прогнозирования и диагностики заболеваний.

)

ПОЛОЖЕНИЯ,ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1.Результаты анализа параметров быстрых изменений свидетельствующие о том,что в гомогенатах печени при воздействии экзогенных факторов возникают быстрые обратимые изменения уровня содержания ФХ и ФИ,продолжающиеся через каждые 30 секунд,в течение 3-х минутного интервала.

2.Данные,показывающие,что из исследуемых факторов(ионы кальция,фосфата,АТФ,гипотония,сукцинат,малат,НГС) наиболее выраженный эффект влияния на динамику быстрых изменений ФХ оказывают фосфат-ионы,АТФ и ионы кальция.

3.Результаты анализа параметров быстрых изменений ФХ в крови здоровых и больных людей.

- 9 -

ГЛАВА I.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1..Строение и физико-химические свойства фосфатидилхолинов.

Специфичность строения и физико-химических свойств ФЛ является причиной их полифункциональной и фундаментальной роли в метаболизме клетки(3,26,70,140,156,208,244).. ФХ-наиболее распространенные липиды в мембранах клеточных органелл животных клеток (30,46,52,57,110,131,160,206)(табл.1).

Таблица 1

Содержание (весовой процент) ФХ в клеточных мембранах [110].

%ФХ Вид мембраны

58 Эндоплазматический ретикулум (печень крыс)

56 Плазматическая мембрана (печень крыс )

45 Митохондриальная внутренняя (печень крыс )

50 Митохондриальная внешняя (печень крыс )

55 Ядерная (печень крыс )

11 Мозг крысы миелин

31 Эритроциты крысы

23 Эритроциты человека

1 Эритроциты овцы

ФХ-( лецитины) можно рассматривать как холиновые эфиры фосфатидных кислот,

СН2-0-С0-К1

I

1?2-С0-0-НС

I О ' +

л

СН2-О-Р-О-СН2-СН2-Н (СН3) з

I

О"

где Р?1-ацил,алкил или алкенил^-ацил

Лецитины -являются цвиттерионами (166) в широкой области значений рН от 3,5 до 10: отрицательный заряд фосфатной группы уравновешивается положительным зарядом, возникающим на атоме азота , так,что общий заряд оказывается равным нулю. Такая структура молекул способствует хорошей растворимости в хлороформе,в спиртах и слабой -в ацетоне,диэтиловом и петролейном эфирах (166,167,213,234). Установлено,что природа жирнокислотных остатков лецитинов оказывает влияние на их растворимость.При этом ФХ,содержащие цепи с высокой степенью насыщенности,нерастворимы в ацетоне и эфирах,а ФХ,имеющие насыщенные жирнокислотные остатки с числом атомов от 4 до 8 хорошо растворимы в ацетоне. Обращает на себя внимание тот факт, что ФХ ,имеющие двойную связь между Сц-С12,С15-С1б и С17-С18 очень хорошо растворимы в диэтиловом эфире(234).

Рядом исследований (17,18,100,132,222) показано, что жирнокислотный состав ФХ большинства тканей представлен насыщенными кислотами (стеариновая ,пальмитиновая)в положение и ненасыщенными кислотами (олеиновая,линолевая,арахидоно-

вая в положение R2.B природных объектах отмечают многообразие молекулярных форм лецитинов,связанное с особенностями жирнокислотного состава. Так,в эритроцитах и плазме крови обнаружено свыше 60 различных видов ФХ, из которых около 30 % содержится в концентрации не^более 1%.(209).В последние годы большое внимание уделено лизофосфатидилхолинам (ЛФХ) содержащим,по сравнению с основными формами,один остаток жирной кислоты,соответственно в первом или во втором положении. Показано, что ЛФХ присутствуют в клетках (2,172,178,216, 221) и на субклеточном уровне (155,203,237), являясь веществами, которые определяют подвижность мембран,их проницаемость. Данные соединения участвуют в регуляции активности ферментов,влияют на многие физиологические процессы(37).

Интересно отметить,что интенсивность обмена ФХ тесно связано с характером жирных кислот в их молекулах.Так,в работе Trewhella М.и Collins F.(231),отмечено,что низкая скорость обновления ФХ,содержащих арахидонат во втором положении, коррелирует с прочностью фиксации арахидоноил-ФХ мембранами, и по мнению авторов свидетельствует о том -,что скорость обновления отдельных ФЛ существенно зависит от степени прочности их связей с тканевыми белками ,что в свою очередь определяется жирнокислотным составом ФЛ.В этой же работе показано, что ФХ,содержащие арахидоновую кислоту,взаимодействовали с митохондриаяьными белками намного медленнее,чем фос-фатиды,содержащие другие кислоты 0(20:3,18:1,18:2). При этом наличие высоконенасыщенных жирных кислот в ФЛ мембран придает последним наибольшую подвижность^.

Установлено (162,163),что лецитины обладают способностью к мицеллообразованию,при этом критическая концентра-

-Л

ция в бензоле составляет 0,78 г/л.В водных растворах отмечена большая склонность ФХ к агрегации в бимолекулярные слои, а не в сферические или цилиндрические мицеллы.Это,по-видимому, связано с наличием сил электростатического отталкивания между головными группами и углеводородными цепями (141).

Было обнаружено (194,199,241 ),что биологические мембраны обладают относительной функциональной ассиметрией ,что отражается в различном распределении липидов и других компонентов мембраны между двумя поверхностями двойного липидного слоя. Изучение (168,181,242 ) ассиметрии липидов были произведены с помощью зондов(непроникающих через мембрану соединений) .модифицирующих свободные аминогруппы.Результаты,полученные при проведении химической модификации ФЛ и их ферментативном расщеплении,показали, что в мембранах эритроцитов ФХ находятся,в основном,во внешней половине бимолекулярного липидного слоя мембран (85,190).

ФХ проявляют довольно большую подвижность в плоскости двойного слоя,однако их флип-флоп переход просходит более медленно.При этом на цитоплазматической мембране целого эритроцита период трансмембранного перехода с одной стороны мембраны на другую составляет для лецитинов от 3 до 14 ч (212).

Доказано,что межмебранный перенос ФХ ускоряется специальными ФХ-переносящими белками, однако следует отметить,что специфичность и активность липидпереносящего белка существенно зависят от объекта.Например,выделенные из печени,чистые липидпереносящие белки обладали не более чем 10 % липид-переносящей активности цитозоля,а ФХ- переносящий белок,полученный из клеток эмбриональной печени хомяка,содержал всю

ФХ- переносящую активность(243).Методом флуоресцентной метки установлено (145) , что ФХ- переносящий белок из печени быка представляет собой полипептид из 213 аминокислот с двумя ди-сульфидными мостиками. При этом ФХ образует комплекс с белком в молярном соотношении 1:1, а ацильные группы ФХ иммобилизованы в гидрофобной области переносчика, причем ацильная группа у -углеродного атома расположена параллельно длинной оси симметрии,у £ -углеродного атома - под углом в 60-90°. Установлено (146), что активность ФХ-переносящего белка из печени быка стимулируется фосфатидной кислотой и резко возрастает по мере уменьшения размеров везикул.

Физиологическая активность ФХ находит применение в создании на их основе липосом,широко использующихся в качестве солюбилизаторов различных липофильных лекарственных средств, а также носителей иммунномодуляторов, цитостатических,противогрибковых препаратов .широко применяемых в терапевтической практике при лечении ряда заболеваний (15,158,159,175).В частности ,введение посредством ФХ-липосом некоторых активных при остром лейкозе антибиотиков,способствовало успешному лечению этого заболевания (13). Предполагают (42,113),что с помощью препаратов липосом из ФХ можно устранить одну из причин развития ишемического синдрома у больных сердечно-сосудистым заболеванием, а именно способствовать уменьшению микровязкости эритроцитарных мембран и возрастанию активности АТФаз.Согласно данным работы (90) наблюдалось отчетливо проявляющееся стимулирующее действие ФХ на активность креа-тинкиназной системы,которая играет центральную роль в регуляции сократительной способности сердечной мышцы.Отмеченный факт, по-видимому,представляет особый интерес для прогнозист

рования ряда заболеваний сердечно-сосудистой системы.Отмечена ( 31,99,114) перспективность использования ФХ для восстановления липидного слоя мембран клеток печени при их повреждении.

2.Метаболизм фосфатйдилхолинового компонента в биологических мембранах

Биосинтез ФХ в различных тканях (35,161,192,205) организма осуществляется с разной интенсивностью и представляет собой сложный процесс,который характеризуется большим числом предшественников синтеза,промежуточных продуктов ,наличием альтернативных путей.Отмечено (71,107),что интенсивно протекают процессы биосинтеза ФЛ в печени ,почках, мышечной ткани. При этом наибольшая интенсивность биосинтеза ФЛ наблюдается в период миелинизации и таким образом зависит от возраста организма.

Биосинтез de novo ФХ начинается фосфорилированием холи-на за счет молекулы АТФ под влиянием фермента холинкина-зы.Затем ЦМФ переносится от ЦТФ на молекулу ФРХ с образованием цитидиндифосфохолина( ЦДФ-холина). Реакцию катализирует холинфос-фат -цитидилилтрансфераза, локализованная в митохондриях. Далее ЦДФ-холин взаимодействует с 1,2 диацил sn- глицерином, в результате чего образуется молекула ФЛ (71,161) (рис.1).

Установлено(4),что пути образования ФХ из цитидинфосфо-холинов находятся под контролем многих факторов (гормоны, желчные кислоты, углеводы и др.),при этом эстрогены ускоряют появление лецитинов в результате реакции метилирования кефа-линов,а желчные кислоты стимулируют синтез ФХ и подавляют

нн

ООО

I. (СН31ЙСНг СН2ОН * НО р О-^О &ОСН ^

он 6н 6н

9 р

ь-о-ь _

4н ¿Н

он он

ноФо^чхн^ У (сн^м снгсн;0^0н

он

о

Б О онОНо о о о^я

(с'н,)зйсн2сн20 ^он + но о>от

он ¿Н ОН ОН '

нл

•о

. 0 0 о^чц

1 он 6м

ш.

ЫНг

о о

он он

+ он & О Е он

ОН 6н

(Г* НХгО?0^ОСНгСмЖсНз)* + й'соос А

сносок

онон

он он

СНгОСОЯ о 0

*Ъоо ¿-н о ., х + он ¿нго^оснгсн2ы(сн^ он

СНгОН НН2

он

ЦУЙ

ОНОН

Рис Л. Биосинтез ФХ с участием цитидиновых нуклеотидов (71)

образование кефалинов.

Биосинтез ФХ может осуществляться по пути переметилирования ФЭА за счет универсального донора метильных групп ЗАМ,промежуточными продуктами являются монометил-и диме-тил-ФЭА (71) (рис. 2 ). Помимо печени,ФХ синтезируется по этому пути в ряде других органов-легких,мышцах,почках, аорте(157,165,219).Доказано,что такой путь биосинтеза менее эффективен,чем цитидиновый.

Существенное место в процессах поддержания уровня ФХ в мембранах играют реакции,связанные с переносом ацильного остатка, катализируемого ферментами трансацилазами.Обнаружено (229),что под влиянием фермента ацил-КоА-фосфатидилхолина-цилтрансферазы происходит реацилирование ФХ.При этом механизм реакции можно представить следующей