Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Форболовые эфиры - модификаторы системы перекисного окисления липидов в норме и при опухолевом росте

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Форболовые эфиры - модификаторы системы перекисного окисления липидов в норме и при опухолевом росте"

Д РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

... ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им. Н.Н.СЕМЕНОВА

На правах рукописи

ПЫНЗАРЬ Елена Ивановна

ФОРБОЛОВЫЕ ЭФИРЫ - МОДИФИКАТОРЫ СИСТЕМЫ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В НОРМЕ И ПРИ ОПУХОЛЕВОМ РОСТЕ

03.00.02 - биофизика -

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995 г.

Работа выполнена в Отделе кинетики химических и биологических процессов Института Химической Физики им. Н.Н.Семенова РАН. и Институте Биохимии Бергенского Университета (Норвегия)

Научный руководитель: доктор биологических наук,

■ Н.П.Пальшша

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Л.Б.Горбачева

кандидат биологических наук доцент

И.М.Пархоменко

Ведущая организация: Институт Биохимии им.

А.Н.Баха РАН

гс

Защита состоится "Л?" ¿3^*3^1995 г. в //час.

на заседании Диссертационного Совета Д.002.26.07 в Институте Химической Физики РАН по адресу: 117977, Москва, ул.Косыгина,4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Химической

Физики РАН._________■----

Автореферат разослан 1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук'

М.А.Смотряева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Возникновение и рост злокачественных новообразований связаны с нарушением регуляции многих метаболических процессов, разбалансировкой важнейших физико-химических реакций и выходом из-под контроля организма таких функций как размножение и дифференцировка клеток, их контактные взаимодействия. В связи с этим опухолевый рост классифицируется как "болезнь регуляции" (Кавецкнй 1977, Шапот 1983, Burlakova et al. 1991).

Мембранный уровень регуляции включает в себя несколько систем, важнейшими из которых являются системы циклических нуклеотидов, фосфоинознтидный цикл и ПОЛ. Уже в силу своей общей локализации в мембране, эти системы не могут не взаимодействовать, а их метаболические пути - не пересекаться. К настоящему моменту накоплен большой фактический материал о влиянии различных "сигнальных" веществ на системы вторичных посредников (Yoshimasa et al. 1987, Okajima et al. 1995), однако, крайне малочисленны сведения о взаимосвязи и взаимном влиянии системы ПОЛ и двух других регуляторных систем (Пальмина и др. 1995).

Действие канцерогенных веществ, многих биологически активных соединений существенно модифицирует работу систем регуляции. Для появления опухоли важны не только возмущения, вызываемые воздействием самих, канцерогенов, но и эффекты, так называемых, опухолевых промоторов. К таким веществам относятся форболовые эфиры, в последнее время широко изучаемый класс промоторов опухоли. Достаточно убедительно показано действие^, данных агентов на систему циклических нуклеотидов (Summers et al. 1988) и фосфоинознтидный цикл (Nishizuka 1984), однако, значительно меньше сведений об их влиянии на систему ПОЛ.

В связи с этим важным и актуальным как для определения механизма взаимосвязи трех важнейших метаболических систем клетки, так и для определения роли форболовых эфиров в опухолевой промоции, является

исследование влияния данных соединений на параметры системы ПОЛ в клеточных мембранах в норне и при росте опухоли.

Цель работы. Цель настоящей работы заключалась в определении характера действия форболовых эфиров на процесс спонтанного ПОЛ в биологических мембранах in vitro в норме и при опухолевом росте.

Основные задачи исследования:

1. Изучение изменения параметров системы спонтанного ПОЛ в мембранах эндоплазматического ретикулума печени и плазматических мембранах мозга без опухоли, в мембранах эндоплазматического ретикулума опухоли АРЭ (асцитного рака Эрлиха) и микросомальных фракциях клеток опухоли Krebs II in vitro.

2. Исследование действия форболовых эфиров: 12-о-тетрадеканоилфорбол-12-ацетата - ТФА и его неактивного аналога 4-а-дидеканоатфорбола - ДДФ в широком спектре концентрации на параметры системы ПОЛ: накопление первичных продуктов окисления - диеновых конъюгатов (ДК) и расход ненасыщенного субстрата окисления - двойных связей (ДС) в биологических мембранах нормальных и опухолевых клеток.

3. Проведение исследований по определению механизма дейстыи форболового эфира при изучении его влияния на ПОЛ в мембранах нормы и опухоли. Изучение влияния ТФА, его рецептора протеинкиназы С (ПК С) и совместного действия ТФА и ПК С на ПОЛ в плазматических мембранах. .

4. Изучение изменения микровязкости лнпидной компоненты плазматических мембран клеток печени и мозга под влиянием форболовых эфиров в широком спектре концентраций in vitro.

Научная новизна работы. Впервые обнаружено антиокислительное действие ТФА в супернизких концентрациях (10"^.ю-9м) на спонтанное ПОЛ в мембранах клеток без опухоли; показан полимодальный двойственный эффект влияния ТФА на окисление липидов мембран опухолевых клеток in vitro.

Впервые установлен ингибируюгций ПОЛ в плазматических мембранах мозга эффект ПК С в интервале концентраций (10"16-Ю-12м) ; обнаружен

синергический эффект при совместном действии ТФА и ПК С в ультранизких концентрациях 10"^ ц Ю-'^М, соответственно.

Получены данные о разнонаправленном изменении микровязкостн лишшных кластеров плазматических мембран под действием ТФА в супернизких концентрациях:

Практическая ценность работы. Спонтанное ПОЛ в мембранах эндоплазматического ретикулума и плазматических мембранах, охарактеризованное кинетическими константами накопления ДК и расхода ДС, может бьггь использовано в качестве чувствительной кинетической модели, позволяющей производить скрининг биологически активных веществ, действующих в ультранизких концентрациях.

Обнаружение дополнительного пути действия опухолевого промотора ТФА на клеточный метаболизм посредством модификации системы ПОЛ существенно для разработки методов антиканцерогенеза и антиоксидантотерапии опухолей.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены: на конференции молодых ученых ИХФ РАН, г.Москва, 1992, 1993 г.; на Международном конгрессе "Ультранизкие дозы", г.Бордо (Франция), 1993 г.; на конференции "Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации", г.Москва, 1993 г.; на XI-ом Международном Биофизическом конгрессе, г.Будапешт (Венгрия), 1993 г.; на И-ом Международном симпозиуме "Механизмы действия сверхмалых доз", г.Москва, 1995 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных

работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы исследований", "Результаты и обсуждение", "Заключение", "Выводы", "Список литературы". Список литературы включает 205 наименований. Работа изложена на 160 страницах, иллюстрирована 2 схемами, 30 рисунками и 5 таблицами.

МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ

Мембраны эндоплазматического ретнкулума клеток печени и опухоли (АРЭ) получалп согласно методу, описанному в работе (Hosteller et al., 1976). Плазматические мембраны мозга выделяли по методу Грэя и Виттакера с небольшими модификациями (Gray, Whittaker 1962). Выделение 3-х фракции: S, LR, HR мембран эндоплазматического рстикулума клеток опухоли Krebsll проводили с помошью дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (Svardal, Ргуше 1978).

Белок определяли методом Лоурн (Lowry et al. 1951). Экстракцию липидов проводили методом Блайя и Дайера (Bligh, Dyer 1959). Степень развития ПОЛ определяли по накоплению первичных продуктов, конъюгированных перекисей (Каган и др. 1986) и вторичных продуктов (МДА) окисления (Fleisher et al. 1978).

Суммарную ненасыщеиность липидного субстрата определяли методом озонирования, разработанных! в ИХФ РАН (Разумовский и др. 1975).

Анализ фосфолипидов 3-х фракций эндоплазматического ретикулума клеток Krebsll, проводили методом двумерной тонкослойной хроматографии (Esko et al. 1980).

Микровязкость плазматических мембран клеток печени и мозга исследовалась методом спиновых зондов; в качестве зондов были использованы стабильные иминокснльные радикалы: 2,2;6,6 - тетраметил 4 каприлонлоксипиперидин - 1 - оксил (зонд I) ; 5,6 - бензо - 2,2;4,4 тетраметил - 1,2,3,4 -—тетрапщро^-карболин— оксил (зонд II);—2,2,6,6-тетраметил-4-пальмитоилоксипиперидин-1 -оксил (зонд III) (Кузнецов 1976).

Протеинкиназа С, выделенная по методу Киккавы (Kikkawa et al.I982) из плазматических мембран мозга, была любезно предоставлена Курнаковой Н.В.

На рисунках_ представлены средние значения, полученные в 3-6 независимых экспериментах с 3-5 параллельными определениями в одном эксперименте. Статистическая обработка данных (определение достоверности

по сравнению с контролем; положение максимумов на кривых; построение прямых методом наименьших квадратов) осуществлялась при использовании компьютерных программ STATGRAF u Sigma Plot.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что форболовые эфиры модифицируют работу регуляторных систем клетки при использовании в достаточно низких концентрациях (10~9-10" 7М) (Nishizuka 1994, Irvine et al. 1986). Поэтому для оценки их возможного влияния на ПОЛ необходимо было выбрать чувствительную и количественно охарактеризованную модель ПОЛ. На наш взгляд, такой моделью могло бьгть спонтанное (без внесения дополнительных инициаторов) ПОЛ в биологических мембранах in vitro при 37°С и продувании воздуха. Так как данный тип ПОЛ не бьи изучен в кинетическом плане, мы поставили перед собой задачу его количественной оценки в биологических мембранах на основании изучения изменения первичных продуктов окисления - диеновых конъюгатов (ДК) (одна из распространенных характеристик ПОЛ) и суммарной ненасыщенности липидного субстрата - ДС (двойные связи) (показатель, который раньше не использовался в кинетических исследования процесса ПОЛ). Так как форболовые эфиры являются опухолевыми промоторами, то в качестве модели были выбраны мембраны нормальных и опухолевых клеток.

На рис.1 и 2 представлены типичные кривые изменения ДК (рис.1) и ДС (рис.2) в процессе спонтанного ПОЛ в микросомах клеток печени мышей без опухоли (кривые 1), в микросомах печени опухоленосителя (кривые 2) и микросомах асцитного рака Эрлиха (АРЭ) (кривые 3). Видно, что по мере окисления происходит накопление ДК и расходование ДС во всех типах мембран. Как по накоплению продуктов окисления липидов, так и по расходованию субстрата окисления эти кривые отличаются: в микросомах опухоли характерно появление достаточно длительного периода индухции (т), составляющего 30-40 минут (кривая 1), в то время как для микросом

опухоленоснтеля он составлял всего 5-10 минут (кривая 2), а в микросомах нормы - отсутствовал (кривая 1).

Рис.1. Изменение содержания ДК в микросомальных мембранах из клеток печени (кривая 1), печени опухоленоснтеля (кривая 2) и

-клето1Сопухолн АРЭ (кривая 3) в процессе спонтанного ПОЛ и их

полулогарифмические анаморфозы. Максимум на кривой окисления липндов микросом опухоли сдвинут во

времени и наблюдается на 160 мин после начала окисления. Для нормы он

приходился на 30 мин, для опухоленоснтеля - 40-50 мин. Для микросом

опухоли (рис.2, кривая 3) уменьшение ДС в сроки от 0 до 90 минут окисления

идет гораздо медленее, чем для мембран опухоленоснтеля и нормы, в данные

сроки окисления еще не наблюдается значительного возрастания ДК, то есть уменьшение ДС фиксируется ранее, чем накопление продуктов окисления.

и.З -1 | | | | [— О 40 80 120 160 ^ МИН

Рис.2. Изменение суммарной ненасыщенности лишщного субстрата (в относительньи единицах) в процессе ПОЛ в микросомах печени (кривая 1), микросомах печени опухоленосителя (кривая 2) и микросомах опухоли АРЭ (кривая 3) и их полулогарифмические анаморфозы. Начальные участки кривых на рис.1 и 2 удовлетворительно

аппроксимируются уравнением первого порядка и спрямляются в

полулогарифмических координатах (рис.1,2). Эффективные константы скорости

накопления ДК (Кдк) и расходования ДС (Кдс) и другие характеристики ПОЛ,

1.1 1.0

-1.5

0 40 80 120 160 1, МИН

представленные в таблице I, различаются и свидетельствуют о том, что ПОЛ в

опухоли протекает в несколько раз менее интенсивно, чем в норме п печени

опухоленосителя. Так как микросомы опухоли отличались от микросом печени

здоровых животных и опухоленосителей не только величиной Кдс, но и

начальным уровнем ДС в их лишщах (таблица I), мы оценили взаимосвязь

между этими величинами. Она представлена на рнс.З, из которого видно, что

зависимость носит экпоненциальный характер и описывается уравнением: 3 7

у=17.59ехр(-45.14х )+0.4, где у=Кдс/дс*, х - ДС молек./мг липидов. То есть, чем более насыщен субстрат, тем меньше скорость его окисления. Тот факт, что все точки, относящиеся к норме и опухолевому росту, легли на одну экспоненциальную кривую позволяет полагать, что во всех изученных мембранах имеется в принципе одна и та же взаимосвязь состав липидов-окисляемость липидов при окислении in vitro.

14

12 -

'4

Рнс.З.Зависимость констант

10 -

расходования ДС от начального уровня ДС в мембранах опухоли (1), микросомах печени опухоленосителя (2), микросомах

Г8-

= 6-

4 -

о

^ 0 ~

печен» (3) и плазматических

0 1 2 3 4 5 мембранах мозга (4).

ДС*1017/мг лип.

17

Таблица I. Физико-химические характеристики процесса спонтанного ПОЛ в различных мембранах.

мембраны 1 мин (А2/А1)о Кдк*102 МИН"1 ДСо*10-'7 Кдс*102 мин"'

микросомы печени 0 0.20+/-0.01 6.3+/-0.7 2.5+/-0.3 4.5+/-0.3

плазматические мембраны 0 0.24+/-0.03 4.7+/-0.4 3.5+/-0.2 12.0+/-0.5

микросомы печени опухоленосителя 5-10 0.22+/-0.02 2.5+/-0.3 2.0+/-0.2 1.0+/-0.1

микросомы АРЭ 3040 0.16+/-0.03 1.4+/-0.1 0.8+/-0.1 0.38+/-0.01

Подтверждение этого положения было получено при изучении ПОЛ в 3-х фракциях микросомальных мембран клеток опухоли КгеЬэ II: гладкого эндоплазматического ретикулума - 5, шероховатого легкого - ЬЯ и шероховатого тяжелого - НИ.. Фракция НК. обнаружена только в трансформированных клетках и клетках, обработанных опухолевым промотором ТФА (Ргуте е1. а1. 1981) и существенно отличается по целому комплексу биохимических и физико-химических характерчстик от фракций и 5.

ПОЛ в Б, ЬЯ и НК. фракциях микросомальных мембран клеток КгеЬэ II исследовали в липидных пленках, полученных из выделенных липвдов, при температуре 25°С, без постоянной подачи кислорода и добавления инициаторов ПОЛ.

При определении первичных продуктов окисления было получено, что липиды этих фракций отличались по скорости накопления в них ДК. В липидах фракции НЯ накопление ДК статистически достоверно (р<0.05) превышало соответствующие показатели для фракций Б и в течение всего времени наблюдения (9 часов окисления). Кдк во времени составляют для 5 фракции - (0.44+/-0.003) час'1, для 1Л (0.80+/-0.001) час'1 и для НЯ - (1.20+/-

0.005)час"'. Из сравнения этих констант следует, что накопление ДК во фракции НЯ протекает с более высокой скоростью по сравнению с и 5.

Причины наблюдаемого отличия в ходе процесса окисления скорее всего следует искать в исходном составе окисляющегося липидного субстрата.

Используя метод двумерной хроматографии было установлено, что для 5, из. и НЯ фракций микросомальных мембран клеток КгеЬБ II характерно наличие трех основных классов фосфолипидов: ФХ, ФЭА и ФИ. Причем относительное содержание ФЭА, наиболее легхоокнеляемого фосфолипкда, резко увеличено (в 2.5-3 раза) во фракции НЯ. Учитывая, что для характеристики способности липидов биологических мембран к окислению в литературе используются отношения содержания ненасыщенных фракций фосфолипидов к насыщенным или параметр окисляемости б, определяемый с учетом коэффициентов, характеризующих способность каждого фосфолипида к перекисеобразованию (Аристархова и др. 1976), мы сопоставили значения Кдк для липидов 3-х фракций мембран с параметрами "окисляемости", вычисленными различными способами (таблица II) и обнаружили между ними прямую взаимосвязь.

Таблица 11. Способность фосфолипидов к окислению (ФЭА/ФХ; (ФЭА+ФИУФХ; s) и значения констант накопления ДК в трех фракциях (S, LR, HR) микросомальных мембран клеток Krebs IL

S LR HR -

ФЭА/ФХ 0.52 1.53 2.73

(ФЭА+ФИУФХ 1 2.13 3.20

s 22 59 100

Кдк (час-') 0.44+/-0.003 0.80+/-0.001 1.20+/-0.005

Вне зависимости от того, каким образом характеризовалась окисляемость, ее большему значению соответствует большая Кдк. Эта корреляция позволяет объяснить наблюдаемые различия в процессе ПОЛ фракций Б, И* и НЯ.

Таким образом, можно заключить, что спонтанное ПОЛ может быть удовлетворительно охарактеризовано Кдк и Кдс и может быть использовано в качестве кинетической модели.

2. Влияние форболовых зфиров в широком спектре концентраций на параметры ПОЛ в биологических мембранах нормальных и опухолевых клеток.

Эта модель была использована нами для изучения влияния ТФА и ДДФ в широком спектре концентраций (10"^-Ю-4м) на ПОЛ в микросомальных мембранах печени, а также в мембранах опухолевых клеток.

Было установлено, что в интервале концентраций 10-1б-1(Им ТФА тормозит ПОЛ в микросомальных мембранах клеток печени мышей. Дозовая зависимость процента ингибирования ПОЛ от концентрации ТФА, определяемая как по накоплению продуктов окисления, так и по расходованию ненасыщенного субстрата имеет одинаковый экстремальный характер со статистически достоверным (р<0.05) эффектом от Ю-14 до 10"*М и максимумом в области концентраций 10"13-1()-9м (рис.4). Неактивный структурный аналог ТФА - ДДФ, подобным эффектом не обладал.

Рис.4. Иншбирование окисления липидов в микросомах печени мышей через 10 минут после введения различных концентраций ТФА (Ю"'б-10-4 М). Концентрация белка в мембранах - 1 мг/мл.

Для концентрации ТФА 10"' ^М (оказывает средний ингибирующин эффект) определены Кдк н Кдс (таблица III), свидетельствующие о существенном влиянии ТФА на ПОЛ в столь низкой концентрации. Таким образом, действие ТФА имеет свои особенности и характеризуется собственными физико-химическими константами и зависимостью доза-эффект, при этом, наличие ингибирующего эффекта ТФА, в том числе в супернизких концентрациях не вызывает сомнения.

Необходимо подчеркнуть также, что ТФА тормозил окисление липидов только в биомембранах. Проведение аналогичных экспериментов на метнлолеатноп модели при 37°С и скорости зарождения свободных радикалов, сопоставимой с таковой в микросомальных липндах (М=1.27 х 10"'® М/л х сек) показало, что ТФА в интервале доз 10"^-10"Зм не влиял на окисление, следовательно, не проявлял свойств аитиоксиданта. Тот факт, что ингибирующин эффект ТФА наблюдался при использовании его в ультранизких концентрациях при спонтанном ПОЛ является весьма существенным. Известно, что ингибиторы свободнорадикальных реакций жидкофазного окисления органических веществ проявляют свою активность в концентрациях 10'^М и более высоких. Из проведенных экспериментов следует, что ТФА обладает способностью ингибнровать ПОЛ в концентрациях на 4-9 порядков ниже, чем классические антиоксиданты, что дает основание для заключения об особенностях его влияния на ПОЛ в биомембранах.

На модели микросомальных мембран АРЭ было показано, что ТФА

обладает свойством как ингибнровать. так_и_активировать ПОЛ, причем

активирующий эффект преобладает (рис.5). То есть, в отличие от нормы, на опухолевых мембранах ТФА, в основном, проявляет свойства активатора ПОЛ. Это может быть связано с тем, что исходный уровень ДС в опухолевых мембранах в 3 раза ниже, чем в норме, а, как известно из литературы , антиокнслительные свойства некоторых биологически активных соединений, таких как фосфолипиды, витамины, зависят от используемого субстрата окисления: на более ненасыщенном субстрате эти вещества работают как

антиоксиданты, а на насыщенном - как активаторы ПОЛ (Бурлакова, Храпова 1985).

lg [ТФА]

Рис.5. Влияние ТФА в интервале концентраций (10"'б-10"^М) на спонтанное ПОЛ в микросомальных мембранах клеток опухоли АРЭ мышей. Для концентраций 10" 15, 10"13, 10"12, 10"6М р<0.01, для 10"16,

10-15,10- Н-10-7и10-5м р<0.05.

Вероятно, двойственный эффект ТФА в зависимости от используемой концентрации является характерным для его влияния .на трансформированные клетки, поскольку аналогичное действие наблюдалось как при введении ТФА в суспензию мембран in vitro, так и при его влиянии в концентрации 10"7 и 10" на клетки опухоли Krebs П и изучении ПОЛ мембранных фракций микросом, выделенных из этих клеток. На рис.6 на примере действия ТФА на ПОЛ в фракции HR микросомальных мембран клеток Krebs II показано, что добавление ТФА в концентрации

имеет сатистически достоверньш (р<0.005) ингибирующин ПОЛ эффект; в то время как концентрация 10"'^М ускоряет окисление липидов в этом же промежутке времени (jx0.005). Аналогичные зависимости при действии на ПОЛ ТФА получены и для S и LR фракций.

Из полученных данных по влиянию форболовых эфиров на ПОЛ в микросомальных мембранах опухоли, можно заключить, что ТФА способен как тормозить, так и ускорять процесс окисления в зависимости от используемой концентрации в микросомах опухоли в отличие от нормы, где эффект был однонаправленным. Таким образом, ТФА модифицирует ПОЛ в биологических мембранах как нормальных, так и опухолевых клеток, причем действует при этом в ультранизких концентрациях.

Рис.б.Изменение содержания ДК в процессе ПОЛ из фракции HR микросомальных мембран клеток опухоли Krebs II (кривая 1), при введении ТФА в концентрации 10'^М (кривая 2) и 10"14М (кривая 3).

3. О механизме действия ТФА на ПОЛ

Так как ТФА был эффективным ингибитором ПОЛ в концентрациях на 4-9 порядков ниже, чем "классические" антиоксиданты, совершенно закономерно возникает вопрос о механизме этого уникального явления. В первую очередь, нас интересовал вопрос о том, на какую стадию процесса ПОЛ действует ТФА, в частности, реагирует ли он с гидроперекисями. Для этого ТФА в концентрации, оказывающей средний ингибирующин эффект -35% (10" вводили в микросомальные мембраны клеток печени с различным уровнем окнсденности (глубина окисления 0.26; 0.45; 0.64) и следили за

динамиком изменения содержания пщроперекисей. Во всех случаях введение ТФА не оказывало влияния на начальный уровень ДК, в течение первых 5 минут не происходило разрушение гидроперекисей. Окисление несколько замедлялось, появлялся период индукции, отмечался сдвиг максимума на кривой накопления ДК.

Изменения в. степени окисленностн до 0.2-0.3 не сказывались на эффективности ингибирующего действия ТФА, определяемой по первичным продуктам.

Полученные данные могут свидетельствовать о том, что ТФА не реагирует с гидроперекисями, а увеличивает время их превращения в МДА, причем этот эффект возрастает по мере увеличения исходной окисленностн липидов.

ТФА является одним из немногих веществ, оказывающих действие на ПОЛ в сверхмалых дозах. Из имеющихся в литературе сведений можно заключить, что подобными свойствами обладает лишь еще одно вещество: ганглиозид-ОМ], который также ингибирует ПОЛ в биомембранах в весьма низких концентрациях (10"Ч-10"9м) и не действует на окисление в липосомах (Туиппа е1 а1. 1993). Вопрос о механизме ингибирующего действия как ганглнозида-СМ], так и ТФА в столь низких концентрациях, остается пока открытым. Высказаны предположения о возможном первичном взаимодействии этих веществ с рецепторами, находящимися на мембране, с образованием комплексов и последующем вступлении в реакцию именно этих комплексных соединении. Однако даже в случае подтверждения этих предположений не снимается вопрос о принципиальном механизме ингибирования ПОЛ супернизкими концентрациями каких-либо веществ.

Очевидно надо искать какое-то нетривиальное объяснение действия ТФА на процесс ПОЛ. Одним из них является предположение о том, что, возможно, ингибирующим действием обладает комплекс ТФА с его рецептором - ПК С. Известно также, что ПК С важна для функционирования некоторых комплексов антиокислительных ферментов (Сштшие е( а1. 1994). Проверка

данного предположения была осуществлена нами при изучении влияния ТФА, ПК С , а также ТФА и ПК С совместно на ПОЛ в плазматических мембранах мозга (в которых содержание рецепторов по сравнению с микросомами различается более, чем на порядок) (Моша1 « а1. 1990). В экспериментах использовался фермент, выделенный из тех же плазматических мембран, на которых изучалось ПОЛ.

0.7 -| 0.6 -0.5 -^ 0.4

о.з ч 0.2 0.1

и

©

£ 0.5

э

-0.5

10 20 30 40 50 60 70 Ъ МИН

"1-1-1-г

0 5 10 15 20 25 I, МИН

о

Рис.7. Кривые накопления ДК в процессе ПОЛ в плазматических мембранах мозга (кривая 1), при добавлении ТФА в концентрации (кривая 2), ПК

С в концентрации (кривая 3) и одновременном применении ПКС (10"

•6М) и ТФА (10'12М) (кривая 4) и их полулогарифмические анаморфозы.

На рнс.7 н 8 представлены типичные кинетические кривые спонтанного ПОЛ в плазматических мембранах мозга крысы при определении ДК и ДС в контроле (кривые 1) и при действии ТФА в концентрации 10"^м (кривые 2), свидетельствующие о высоких антиокислительных свойствах ТФА, что подтверждается также и соответствующими значениями эффективных констант скоростей накопления ДК и расхода ДС (таблица III).

Таблица III. Кинетические константы накопления ДК и расхода ДС в процессе ПОЛ в биологических мембранах под действием ТФА (lO'l^M) и ПКС(10'1бМ).

мембраны Кдк*102 мин'1 Кдс*102 мин"1

микросомы 6.3+/-0.7 4.5+/-0.3

микросомы + ТФА 3.1+/-0.2 1.8+/-0.1

плазматические мембраны 4.7+/-0.4 12.0+/-0.5

плазматические мембраны + ТФА 2.3+/-0.2 3.9+/-0.5

плазматические мембраны + ПК С 2.3+/-0.2 1.5+/-0.4

плазматические мембраны +ТФА+ ПК С 0.44+/-0.02 0.11+/-0.03

Концентрационная зависимость процента ингибирования ПОЛ ТФА, полученная- при определении уровня ДК через 15 минут после начала окисления, представленная на рис.9 (ТФА), отличается от аналогичной зависимости , полученной на мембранах эидоплазматического ретикулума клеток печени (рис.4) как по форме, так и по величине эффекта.

Ингибирующее действие ТФА на ПОЛ в плазматических мембранах мозга более значительно: средний ингибирующий эффект составлял 40-45%, максимальный - 65%, что превышает соответствующие характеристики, полученные для микросом печени (25-30% и 50%). Кривая на рис.9 (ТФА) имеет два статистически достоверньи как по отношению к контролю (р<0.005), так и соседним точкам (р<0.05) максимума для концентраций 10"^ и 10'^М, в отличие от одного экстремума на кривой для микросом (рис.4), что может

объясняться как количеством рецепторов (молекул ПК С) в этих мембранах, так и особенностями взаимодействия рецептора с лигандом.

1.1 1.0 0.9 * 0.8

О о.б

^ 0.5 0.4 0.3 0.2

-о.б Ч -0.8

1 I I I | 0 10 20 30 40 50 _1:,мин_;_

1-1-г

4 8 12 16 ^ МИН

Рис.8. Изменение содержания ДС в липидах плазматических мембран мозга (в относительных единицах) в процессе ПОЛ (кривая 1),при добавлении ТФА "в концентрации (кривая 2), ПК С в концентрации 10"'^М (кривая 3) и

одновременном применении ПКС (КИ^М) и ТФА (10~'2м) (кривая 4) и их полулогарифмические анаморфозы.

ПК С также проявляла антиокислительный эффект на ПОЛ при введении в плазматические мембраны мозга крысы, как видно из рис. 7 и 8, гае приведены типичные кривые изменения ДК (рис.7) и ДС (рнс.8), при использовании ПК С в весьма низкой концентрации (кривые 3). ПК С

оказывает такой же эффект на ПОЛ по критерию изменения ДК, как и ТФА в концентрации КН^М (рис.7) и превосходит его по критерию изменения ДС (рис.8), что подтверждается и величинами соответствующих кинетических констант (таблица III). Необходимо подчеркнуть, что инактивированная нагреванием ПК С не тормозила, а даже ускоряла окисление липидов.

Концентрационная зависимость процента иншбирования ПОЛ под влиянием ПК С также, как и для ТФА имеет бимодальный характер с двумя статистически достоверными (р<0.05) максимумами при концентрациях 10" 16 и 10"13м (рис.9, кривая ПК С). Вид обеих кривых является типичным для закономерностей, описывающих действие веществ в супермалых дозах: максимум в области относительно высоких концентраций, резкое снижение эффекта или его отсутствие ("молчащая зона") и второй максимум в области сверхнизких концентраций (Богатыренко и др. 1989).

Рис.9. Изменение процента ингибирования ПОЛ в плазматических мембранах мозга по накоплению ДК в зависимости от концентрации ТФА и ПК С.

-20 -18 -16 -14 -12 -10 -8

18 С

Таким образом, из экспериментов по действию ТФЛ на ПОЛ в плазмал1ческих мембранах мозга следует, что в данном случае наблюдается совершенно уникальный н еще более выраженный, по сравнению с микросомами, эффект ТФЛ в ультранизкнх дозах. Необходимо подчеркнуть, что в настоящий момент изучение влияния различных физических и химических агентов в ультранизких концентрациях на живые системы находится в самом начале своего развития и пока не существует общепринятой точки зрения относительно механизма этого явления. Некоторые физические аспекты этой проблемы описаны в работе ВЬтепГеМ е1 а1. (1991), где на основе теории вероятности были проведены вычисления возможного влияния одной или двух частиц на сообщество частиц в специфических термодинамических условиях системы. Было также предложено несколько биохимических гипотез объяснения влияния малых доз веществ: селективное увеличение концентрации лиганда вблизи рецептора; существование эффективных систем усиления сигнала (Сазанов, Зайцев 1992). Несмотря на предпринятые попытки объяснения данного явления, нужно заметить, что проблема действия веществ в супермалых дозах остается неразработанной. Из полученных нами данных об антиокислительном действии ТФА на ПОЛ нормальных мембран очевидно существование эффекта этого агента на ПОЛ в супермалых концентрациях.

Как уже указывалось выше, одним из предположений тормозящего ПОЛ эффекта ТФА является образование комплекса с ПК С, рецептором ТФА. В связи с данным предположением мы провели эксперименты по совместному введению ТФА и ПК С в плазматические мембраны мозга крысы и выяснению их влияния на ПОЛ. Было установлено, что при совместном введении в концентрациях, оказывающих равноэффективное действие на ПОЛ (65% ингибирование) ТФА (10"'^М) и ПК С . (10"5бм), наблюдалось весьма значительное торможение ПОЛ (кривые 4) как по критерию накопления ДК (рис.7), так и по расходу ДС (рнс.8). Через 15 минут после начала окисления ПК С + ТФА полиостью тормозили окисление, константа накопления ДК, отличалась для таковой в контроле на порядок (таблица III). Выход из периода

индукции на кривой 4 накопления ДК наблюдался только через 45-50 минут; уменьшения ДС не наблюдалось до 30 минут окисления (рис.8, кривая 4), то есть совместное использование ТФА и ПК С весьма эффективно задерживает расходование ненасыщенного лнпндного субстрата окисления (таблица III).

Если учесть, что увеличение периода индукции т для отдельно взятых ПК С и ТФА на кривой накопления ДК составляет 12-15 мин, то при совместном использовании, т равно 38-45 мин, и превышает сумму т для индивидуальных веществ, т (ПК С+ТФА) > тПК С + тТФА,

Это позволяет сделать заключение о синергическом эффекте ПК С и ТФА на накопление ДК в плазматических мембранах мозга.

Полученные нами данные, в общем, не противоречат предположению о том, что антиокислительным действием обладает комплекс ТФА с ПК С, однако при этом в полной мере не находят объяснения эффекты ТФА и ПК С в ультранизких концентрациях (эффективность комплекса должна быть выше эффективности отдельно взятого вещества на несколько порядков).

Поскольку ТФА является мембранотропным агентом, были основания полагать, что он оказывает влияние и на стуктурное состояние липидного бнслоя. С целью определения возможности такого влияния, нами была изучена микровязкость липидной компоненты мембраны при действии ТФА в широком спектре концентраций. Эти исследования показали, что, действительно, ТФА неспецифически модифицирует плазматическую мембрану в трех местах локализации парамагнитных зондов, погруженных в поверхностный (зонд I и II) и более гидрофобный (зонд 1П) слои липидов мембран. Он увеличивает текучесть в области локализации зонда III и уменьшает ее в области локализации зондов I и II (рис. 10), причем максимальный эффект наблюдался при использовании ТФА в дозах 10"'6-]0'12м, то есть в тех концентрациях, для которых был установлен его антиокислительный эффект. Так как известно, что повышение "структурированности" липидной фазы мембраны приводит к

торможению ПОЛ, не исключено, что этот фактор вносит свой вклад в антиокислительную активность ТФА.

Тот факт, что в ответ на биологически активный препарат"^ зондов I и II изменяется однонаправленно является необычным. Как правило в норме мембраны реагируют на действие синтетических и природных физиологически активных соединений: антиоксидантов, гормонов, антибиотиков, противофазным изменением % зондов I и II.

зонд i

ЗОЦД 2

« в

ж

ё

й) 4

Г)

X

ЬЛ

0

ЗОВД 3

£ 4

Ж

1 8 Ж

vi 12

-14

Log

n3°

-14 -ТО Los jTPAj

0.4

0,3

0,2

1,90 1,85

1,60 1.75

г(.-1010,сек. ---(0,98_

D,94 3,90 0,86

Рис. Ю.Изменение времени вращательной корреляции зондов I-III в плазматических мембранах печени от концентрации ТФА in vitro (через 10 мин _ после введения ТФА).

_Содержаниебелка в—

препарате - 1.7 мг/мл.

-18 -14 -10 Los [ГРА]

Однонаправленный характер изменения этих величин отмечен лишь для мембран опухолевых клеток, причем именно это отличие является одним из признаков изменений системы регуляции ПОЛ при опухолевом росте. Так как форболовые эфиры являются сильными опухолевыми промоторами, то можно высказать предположение, что наблюдаемые однонаправленные изменения зондов I и II являются важными именно для проявления этого качества данных соединений.

В целом, рассматривая вопрос о концентрационных закономерностях действия ТФА на ПОЛ в биологических мембранах, следует иметь ввиду, что он избирательно концентрируется в липидах. В пересчете на липиды действующие концентрации ТФА возрастут на 3 порядка. Тогда антиокислительный эффект ТФА в интервале доз от 10"^ до (10"2-10"^М на липиды) может быть

объяснен в обычных рамках свойств антиоксидантов, следующий интервал от 10-" до 10"13м (10~8-10-Юм на липиды) находит свое рассмотрение с точки зрения роли "структурного" фактора в ПОЛ и лишь в интервале более низких концентраций действие ТФА на ПОЛ требует пинципиально новой оценки.

Совокупность следующих данных: отсутствие влияния ТФА на ПОЛ в искусственных безбелковых системах (метилолеат, лнпосомы); проявление ПК С антиокислительных свойств, синергическое действие ТФА и ПК С; потеря ПК С антиокислительных свойств после инактивации; более высокий процент ингибирования ПОЛ при добавлении ТФА к плазматическим мембранам, чем в микросомальных при сопоставимом влиянии на Кдк и Кдс , привели нас к заключению о том, что ТФА в этом интервале доз действует через ПК С, а ПК С наряду со своими основными функциями (катализ фосфорилирования белков) обладает дополнительно и свойствами "антиокислительного" фермента. Можно полагать, что во взаимодействии ТФА с ПК С вносят вклад две компоненты: 1) специфическая - ТФА активирует "антиокислительные" свойства фермента; 2) неспецнфнческая, за счет влияния на структуру мембраны (микровязкость липидного бислоя) таким образом, что создаются благоприятные условия для перехода дополнительных молекул ПК С из цитозоля' в мембрану и

закрепляется конформацнонное состояние фермента, которое наиболее выгодно для взаимодействия с субстратом и эффектором. Обе компоненты взаимодействуя синергическц, увеличивают активность ПК С н ее антиоксидантные способности.

Результаты, полученные в работе, на наш взгляд, свидетельствуют о существовании определенной взаимосвязи в функционировании трех важнейших регуляторных систем, локализованных в клеточной мембране: ситем вторичных посредников и ПОЛ.

Выводы.

1. Показано, что количественно охарактеризованное ПОЛ в биологических мембранах in vitro может бьггь использовано в качестве кинетической модели, а параметр ДС в качестве одной из ее характеристик.

2. Впервые установлен антиокислительный эффект ТФА от Ш'^М вплоть до ультранихких концентраций (10'^М) и определены кинетические константы изменения ДК и ДС при его влиянии на ПОЛ в мембранах клеток без опухоли. В мембранах опухолевых клеток показан двойственный эффект влияния ТФА на ПОЛ. Физиологически неактивный аналог ДДФ не проявлял активности по отношению к ПОЛ в исследованных мембранах.

3. ПК С проявляет антиокислительные свойства при действии на ПОЛ в плазматических мембранах мозга. При совместном добавлении ТФА И ПК С показан синергический эффект в действии на ПОЛ как по изменению Кдк, так и Кдс._______

4. Определены концентрационные зависимости влияния ТФА и ПК С на ПОЛ в различных типах мембран в норме и при опухолевом росте.

5. ТФА разнонаправленно изменяет микровязкость липидных кластеров бислоя плазматических мембран in vitro: поверхностные слои лнпидов становятся более жесткими; более гидрофобные слои липидов увеличивают свою текучесть. Однонаправленные изменения зондов I и II являются важными для проявления промотируюших опухоль свойств ТФА. ДДФ подобным эффектом не обладал.

6. Установлено, что ТФА не реагирует с перекисями и влияет на стадию превращения гидроперекисей в МДА. Антиокислительный эффект ТФА осуществляется за счет его влияния на структуру мембраны и на ПК С, которая, по-видимому, обладает свойствами "антиоксидантного" фермента. Список научных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Pynzar E.I., Bogdanova N.G., Palmina N.P. Changes in lipid peroxidation in cell membranes under the effect of ultra low doses of phorbol esters// Abstracts of the International Congress on Ultra Low Doses. Bordeaux, France -1993,- p.20.

2. Palmina N.P., Maltseva E.L., Pynzar E.I., Bogdanova N.G. Ultra low doses of phorbol esters can modify the structure of biological membranes// Abstracts of International Congress of Ultra Low Doses. Bordeaux, France-1993.- p.19.

3. Пынзарь Е.И., Богданова Н.Г., Пальмина Н.П. Форболовые эфцры -модуляторы системы ПОЛ в биологических мембранах.// Тезисы конференции "Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сингализашш". Москва-1993,- с.60-65.

4. Пальмина Н.П., Мальцева Е.Л., Богданова Н.Г., Пынзарь Е.И. Форболовые эфиры - модификаторы структуры биологических мембран.// Биол.мембраны,-1992,- T.9.- N8.- с. 810-820.

5. Palmina N.P., Bogdanova N.G., Maltseva E.L., Pynzar E.I. Modification of cell membranes structure by phorbol esters// Abstracts of 11 -th International Biophysics Congress. Budapest, Hungary- 1993.- C2.43.- p.123.

6. Пынзарь Е.И., Богданова Н.Г., Пальмина Н.П. Влияние форболовых эфиров на спонтанное ПОЛ в мембранах эндоплазматического ретикулума in vitro// Биол.мембраны.- 1995.- т. 12.- N3.- с.279-286.

7. Пальмина Н.П., Пынзарь Е.И., Богданова Н.Г., Курнакова Н.В. Особенности действия форболового эфира и протеинкиназы С в сверхмалых дозах на перекисное окисление липвдов в биологических мембранах// Тезисы 2-го Международного симпозиума "Механизмы действия сверхмалых доз". Москва-1995,- с. 103.