Мембраны и ферменты как мишени действия модуляторов систем вторичных посредников

Мальцева, Елена Львовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Мембраны и ферменты как мишени действия модуляторов систем вторичных посредников
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Мембраны и ферменты как мишени действия модуляторов систем вторичных посредников"

Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

И -2

3364 На правах рукописи

Мальцева Елена Львовна

Мембраны и ферменты как мишени действия модуляторов систем вторичных посредников

03.01.02 -биофизика

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2011

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, академик РАН Островский Михаил Аркадьевич

доктор биологических наук, член - корреспондент РАН Бачурин Сергей Олегович

доктор биологических наук, профессор Воейков Владимир Леонидович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится 22 июня в 12 часов на заседании Диссертационного

совета Д 002.039.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН по адресу: 119334 Москва, ул. Косыгина 4.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте химической физики

им. H.H. Семенова РАН.

Диссертация в виде научного доклада разослана « » мая 2011г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 002.039.01 кандидат химических наук

Л.И. Мазалецкая

, ; ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Проблема клеточной регуляции - одна из центральных в биофизике и биохимии клетки. Известно, что в клеточных мембранах существует несколько систем регуляции, изучение взаимосвязи между которыми представляет собой важный аспект данной проблемы. Системы вторичных посредников, такие как циклические нуклеотиды и фосфоинози-тидный цикл, получают сигналы через клеточные мембраны, в липидах которых локализуется и система перекисного окисления липидов (ПОЛ). Между данными системами ведутся «переговоры», обеспечивающие их согласованную работу в норме, а возникающие патологические состояния сопровождаются «сбоями» в их работе. Важнейшим ферментом фосфоинозитидного цикла является липидзавпсимая иротеимкииаза С (ПКС). фосфорилируюшая целый ряд мембраносвязанных и цитоплазматических белков [Takai. 1979; Nishiziika, 1986; Rosse, 2010]. Действие вторичного посредника в данном цикле и активатора Г1КС - 1.2-дпаци.1-глицерола (ДАГ) пролонгировано мимик-рируется синтетическим форболовым эфиром - 12-О-тетрадеканоил-форбол-13-ацетатом (ТФА). Открытый как опухолевый промотор ТФА является универсальным модулятором и других систем вторичных посредников [Castanga, 1982; Fisher, Yanagimoto. 1989]. в том числе и ПОЛ [Пальмина, 1998].

Гипотеза о сопряжении трансдукции сигнала, идущего через ПКС. с клеточной пролиферацией и активацией при канцерогенезе и опухолевом росте, высказанная ранее [Nishizuka, 1984], в настоящее время находит свое подтверждение [Mackay. 2003: Koivunen. 2005] и развитие во взаимосвязи с окси-дативным стрессом и апоптозом [Gopalakrishna. 2000; Kagan. 2008]. Система ПОЛ играет при этом важную регуляторную роль. Значительно раньше была высказана и гипотеза «о свободно-радикальном механизме регуляции размножения клеток» [Бурлакова. 1967. 1968], в которой гидроперекисям отводилась роль ингибиторов, а природным антиоксндантам (АО) - активаторов клеточной пролиферации.

Среди большого количества эффекторов ПКС и ферментов «запуска» систем циклических иуклеотидов - аденилатциклазы (АЦ) и гуанилатцпклазы (ГЦ) и функционально взаимосвязанных с ними рецепторов, в частности -опиоидных (ОПР). наше внимание привлекли ненасыщенные фосфолпгшды (ФЛ) и свободные жирные кислоты (СЖК). участвующие в системе ПОЛ в качестве субстратов окисления.

Для функционирования и взаимосвязи систем вторичных посредников важно физико-химическое состояние клеточных мембран и такие свойства как кооператпвность и гетерогенность, которые в значительной степени определяются лппидным бислоем. в частности, такими его структурными характеристиками как микровязкость и жесткость различных его областей. Современные представления о рафтах и микродоменах в плазматических мембранах (ПМ) подтверждают, что такие структуры могут обладать уникальными свойствами и усиливать действие сигнальных веществ на клеточные мембра-

мы [Quinn. 2004; Muniz, 2001]. Вероятно, что в них локализуются ферменты и рецепторы, в том числе и ПКС [Pike, 2003].

Известно, что л и пилы клеточных мембран постоянно подвергаются окислению. Изменения параметров ПОЛ могут приводить к модификации активности ферментов и рецепторов in vivo и in vitro. Природные АО, основноП из них - а-токоферол (ТФ) и синтетические АО. в частности - калиевая соль фенозана (ФК). регулируют ПОЛ в мембранах [Kagan. 1991: Папьмина, 2003], влияют на структурное состояние липидов путем встраивания ТФ в мембраны [Quinn. 1995] и активность ферментов как эффекторы [Бурлакова, 1982; Azzi, 1992].

С точки зрения клеточной регуляции особое значение приобретают концентрационно-зависпмые эффекты сигнальных веществ и модуляторов систем вторичных посредников и ПОЛ в мембранах. Кинетические особенности их действия создают мембранный уровень регуляции.

Одной из «пограничных» проблем современной биологии является обнаружение эффектов сверхмалых доз (СМД- менее 10""-10'I2M) химических веществ различной природы [Бурлакова, 1999, 2001]. полученных на разных иерархических уровнях биологических объектов. Развитие этой области открывает новые перспективы в решении фундаментальных вопросов клеточной регуляции, а также имеет практическую направленность для создания лекарственных препаратов в СМД.

Таким образом, исследование действия модуляторов систем вторичных посредников в широком диапазоне концентраций на клеточные мембраны и ферменты является актуальным: во-первых, для понимания механизмов их действия: во-вторых, для установления роли ПОЛ во взаимосвязи систем вторичных посредников; в-третьих, для развития нового научного направления - биологических эффектов СМД химических веществ на мембранном уровне.

Цель н задачи исследования. Цель настоящего исследования заключалась в выяснении роли кинетических изменений основных параметров ПОЛ -концентрации продуктов окисления и АО. микровязкости липидов клеточных мембран в регуляции активности ключевых ферментов систем вторичных посредников и рецепторов, в особенности - лппидзависимой ПКС.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить изменение активности ПКС при действии ФЛ и СЖК различной степени окпсленностн in vitro и выявить кинетические закономерности изменения активности фермента от продуктов ПОЛ.

2. Исследовать влияние природного АО - ТФ в широком диапазоне концентраций на активность ПКС in vitro. Описать кинетический механизм действия "ГФ на ПКС в больших концентрациях и СМД.

3. Изучить влияние ТФ в широком диапазоне концентраций, включая СМД, на мнкровязкость и термопндуцированные структурные переходы (ТСП) клеточных мембран. Выявить роль полярности растворителя. Выяснить взаимосвязь изменений микровязкости липидов мембран и активности Г1КС.

4. Исследовать действие синтетического АО из класса экранированных фенолов -(3-(4-гидрокси-3.5-дитретбутилфенил) пропионовой кислоты (фенозана) в его водорастворимой форме - калиевой соли (ФК) в широком диапазоне концентрации на активность ПКС в ПМ мембранах нормальных и опухолевых клеток, растущих в культуре.

5. Изучить влияние ФК и СЖК на активность ферментов систем циклических нуклеотидов - АЦ и Г Ц. а также микровязкость липидов ПМ in vitro.

6. Изучить влияние 4-метил-2.6-дитрет-бутилфенола (ионола) in vivo на активность АЦ, уровень ПОЛ. микровязкость и ТСП в липидах ПМ. Выявить характер взаимосвязи между этими параметрами.

7. Изучить действие форболового эфира (ТФА) в широком диапазоне концентраций вплоть до СМД in vitro на микровязкость различных областей липидов клеточных мембран в печени и мозга, а также опухоли - асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ). Сравнить действие ТФА и его неактивного аналога - 4-сл-форбол-12,13-дидеканоата (ДДФ).

8. Исследовать изменения микровязкости и ТСП в липидах различных фракций мембран эндоплазматического ретикулума (ЭР) при действии ТФА на трансформированную линию клеток, растущих в культуре.

9. Исследовать влияние СЖК разной степени ненасыщенностн, жиро- и водорастворимых АО на микровязкость сннаптических мембран (СМ) головного мозга in vitro. Выяснить роль микровязкости в инактивации ОПР.

10. Изучить кинетические закономерности действия гормонов различной природы: белковых (инсулина и глюкагона) и стероидного (простагландина Е:). стимуляторов G-белков - гуанииловых нуклеотидов и АО (ионола) на микровязкость липидов IIM in vitro.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. ПКС - пероксилиппдзависимый фермент. Кинетические закономерности действия продуктов ПОЛ - ингибиторов ПКС как новый механизм регуляции активности основного фермента фосфоинозитидного цикла.

2. Бимодальная зависимость «доза - эффект» при действии АО в широком диапазоне концентраций: ТФ как природного ингибитора активности ПКС и синтетического ФК как суперактиватора фермента в мембранах нормальных и опухолевых клеток. Кинетическая схема действия ТФ на активность ПКС.

3. Полимодальная зависимость «доза-эффект» действия ТФ на структуру липидов клеточных мембран in vitro. Роль полярности растворителя в эффектах СМД.

4. Универсальный модулятор систем вторичных посредников и опухолевый промотор - ТФА как модификатор структурного состояния липидов клеточных мембран нормальных и опухолевых клеток в широком диапазоне концентраций.

5. Синтетические АО (ФК и иоиол) как модуляторы активности ключевых ферментов системы циклических нуклеотидов - АЦ и ГЦ in vitro н in vivo.

Разнонаправленность изменении активности ферментов в мембранах клеток мозга и печени.

6. Корреляция изменении микровязкости (пли жесткости) поверхностных областей липидов мембран с активностью ферментов систем вторичных посредников (ПКС и АЦ) и инактпвациеП ОПР при действии АО и СЖК.

7. Кинетические закономерности действия различных гормонов и стимуляторов G-белков на микровязкость липидов ПМ. 11еспецифичекое связывание лигандов на мембране как косвенное доказательство существования липидных центров (рафтов).

Научная новизна. Впервые обнаружено, что ПКС - это перокснлипид-завпснмый фермент, для которого продукты ПОЛ по кинетическим критериям являются аллостерпческими ингибиторами, обладающими положительной кооперативностыо и высоким сродством к ферменту. Обнаружено антагонистическое взаимодействие между окисленными формами эффекторов (ФЛ и АК). которое представляет собой механизм «демпинга».

Впервые обнаружено бимодальное действие АО (ТФ и ФК) на активность фермента в широком диапазоне концентрации с максимумами при концентрациях. эквивалентных физиологическим, н СМ Д. Предложена кинетическая схема, описывающая бимодальную зависимость «доза - эффект» (на примере ТФ). Установлено, что ТФ - аллостерический ингибитор активности ПКС. а ФК - суперактиватор фермента в ПМ нормальных и опухолевых клеток. Показано, что опухолевые клетки обладают дополнительными возможностями для активации мембраносвязанной ПКС.

Показано противоположное действие синтетических АО (ФК и ионола) на ферменты «запуска» систем циклических нуклеотидов - АЦ и ГЦ, имеющее разнонаправленный характер в мембранах клеток печени и мозга in vivo и in vitro.

Впервые показано полимодальное действие ТФ и универсального модулятора систем вторичных посредников - ТФА в широком диапазоне концентраций вплоть до СМД на микровязкость и жесткость клеточных мембран in vitro. Установлено, что ТФА является двойным модификатором структурного состояния липидов клеточных мембран, проявляющим свойство опухолевого промотора на мембранном уровне.

Впервые выявлена роль полярности растворителя (воды) при действии СМД (на примере ТФ) на клеточные мембраны in vitro.

Установлена корреляция между изменениями активности основных ферментов систем вторичных посредников, а также связанных с ними рецепторов на примере ОПР. и микровязкости поверхностных областей липидов липидов клеточных мембран при действии модуляторов системы ПОЛ АО и СЖК in vitro и in vivo.

Впервые продемонстрированы кинетические закономерности действия различных гормонов: белковых (инсулина и глюкагона) и стероидного - ПГЕ2, а также стимуляторов G-белков на микровязкость липидов ПМ in vitro.

Предложена феноменологическая модель и вычислены кинетические

параметры связывания гормонов и стимуляторов с мембраной, на основании которых покачано наличие их неспецифического связывания с ПМ.

Сопокупность проведенных исследований позволяет сформулировать создание нового научного направления «взаимосвязь систем вторичных посредников и ПОЛ».

Научно-практическая значимость работы. В результате проведенных в работе фундаментальных исследований по выяснению физико-химических и кинетических закономерностей в регуляции ключевых ферментов систем вторичных посредников и рецепторов было установлено, что изменения их активности взаимосвязаны с изменениями параметров ПОЛ. такими как содержание продуктов ПОЛ, концентрация АО и микровязкость (или жесткость) липидов клеточных мембран.

Полученные кинетические закономерности действия различных модуляторов на мембраны и ферменты могут быть использованы при разработке новых схем применения лекарственных препаратов, влияющих как на системы вторичных посредников, так и ПОЛ. Установленные в работе дозовые зависимости полимодального типа и эффекты СМД при действии АО на мембраны и ферменты, позволяют разрабатывать комбинированные лекарственные препараты на основе АО в СМД. Это может уменьшать побочное влияние (токсичность, структурные и морфологические повреждения и другие) обычно применяемых для лечения доз препаратов, а также усиливать или ослаблять действие других лекарственных веществ в комбинированной терапии различных патологий. В частности. применение ТФ при лечении сердечнососудистых патологий, а также онкологических заболеваний для снятия кар-диотоксичности противоопухолевых препаратов может быть не менее эффективным в СМД н более щадящим для организма в целом.

Результаты, полученные на лабораторных животных, дают основание для дальнейшей разработки комплексной терапии с направленной модификацией мембран различных органов и изменением активности основных ферментов систем вторичных посредников, являющихся мишенью действия ряда препаратов сердечно-сосудистого типа и противоопухолевого действия.

Обнаруженное в работе ннгибпрование продуктами ПОЛ и ТФ активности ПКС дает принципиально новое объяснение важной роли данного природного АО в регуляции пролиферации клеток в норме и опухолевом росте, основанное на концентрационно-зависнмом эффекте изменения активности данного фермента.

Диссертационная работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН в соответствии с планом научно-исследовательских работ Отделения химии и наук о материалах РАН. Экспериментальные исследования, вошедшие в состав данной диссертационной работы, были поддержаны на разных этапах: Всесоюзной программой «Биоантпоксидант». Программой СЭВ «Биофизика», двусторонним сотрудничеством с Институтом биофизики Болгарской Академии наук, персональным грантом ЮНЕСКО в области фундаментальных работ по

молекулярном и клеточноП биологии. Биохимическим Обществом Норвегии, грантами Президиума РАН «Биомолекулярная п медицинская химия».

Личный вклад соискателя состоял в разработке методологии исследования, определении задач и выборе методов их решения, проведении экспериментов. обобщении, анализе и трактовке полученного экспериментального материала, формулировании положении и выводов работы. Основные результаты. изложенные в автореферате, получены при определяющем вкладе автора. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель участвовал во всех этапах исследовании - от постановки эксперимента до обсуждения, оформления и публ икации результатов.

Апробация диссертации. Основные результаты исследования по теме диссертации представлены в 126 печатных работах, из них 64- научные труды, 53 из которых в рецензируемых российских и международных журналах.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на 70-ти Международных и Российских симпозиумах, конференциях, съездах и конгрессах: 4. 5i4 Всесоюзн. Конф. «Биология клетки» (Тбилиси, 1985, 1987); Всесоюзн. Спмп. по биохимии липидов (Алма-Ата. 1987): Intern. Symp. "Membrane lipids - metabolism and organization" (Varna. Bulgaria, 1987); 6th CMEA Symp. ESR spectroscopy in Biochemistry. Molecular Biology and Medicine" (Smolenia, Slovakia J 988): Conf. on Bioelectronics (Frankfurt, Germany. 1988); 2nd Soviet-Swiss Symp/'Biological Membranes (Riga, Latvia. 1988): 4-:|И Всесоюзн. Симп. «Липи-ды биологических мембран» (Киев. 1994) 3.4ая Всесоюзн. Симп. «Бноантиок-сиданты в биологии, химии и медицине» (Москва, 1989, 1998): 2nd Soviet-Spain Syrup. "Biological Membranes: structure and function" (Kiev, 1990); 7, 8ой Всесоюзн. Симп. «Магнитный резонанс в биологии и медицине» (Звенигород, 1989. 1991); Intern.Conf. on Biomembranes (Kaunas. Litva. 1991): Intern. Symp. "Biochemistry of receptor systems1" (Tallinn. Estonia. 1991): 8th. 9'\ 10th Intern. Congresses on Prostaglandins and related compounds (Montreal, Canada, 1992; Florence. Italy. 1994: Vienna. Austria, 1996): 20lh, 22"J FEBS Meeting (Budapest, Hungary. 1990; Stockholm, Sweeden. 1992): 11th Intern. Biophysics Congress (Budapest, Hungary , 1993); 34lh Intern. Conf. on Biochemistry of Lipids (Nooykerwij-kerhout, Netherland.1993): 2nd Intern. Congress On Ultra Low Doses (Bordeaux. France. 1993); 3rd Intern. Conf. "Eicosanoids and Bioactive Lipids in Cancer, In-flamation and Radiation Injury" (Washington. USA. 1993): 35th, 37th, 38th Intern. Conf. Biochemistry of Lipids (Aberdeen. Scotland, 1994: Antwerpen, Belgium, 1996: Assisi. Italy. 1997): 5lh Intern. Congress on PAF and Lipid Mediators (Berlin. Germany, 1995); 1st Eur. Congress of Pharmacology (Milan. Italy. 1995); 4,h Conf. on Essential Fatty Acids (Edinburg. Scotland, 1997): 6.7,8й* Междунар. Конф. "Биоантиокспдант" (Москва. 2002, 2006, 2010); G.I.R.I. Meeting (Brussels, Belgium. 2000); Intern. Symp."Anno 2000: Lipid Milestone*' (Utrecht, Netherlands. 2000): 11^ Междунар. Конф. «Магнитный резонанс в химии и биологин» (Звенигород, 2001): I4'h Intern. Symp. on Drug Affecting Lipid Metabolism (New York, USA, 2001): 5, 9,h ISSFAL Congress (Montreal. Canada. 2002: Maastricht, Holland ); 2nd Intern. Conf. "Non-1 inear dose-response relations in Biology, T'oxi-

cology and Medicine" (Amherst, USA, 2002); 8th Intern.Congr. on Phospholipids (Vienna. Austria, 2002); Intern. Symp.''Lipids and Biomembranes" (Davos, Switzerland, 2002); 3, 4"и Междунар. симп. «Механизмы действия СМД» (Москва, 2002. 2008); Зий Съезд Биофизиков России (Воронеж, 2004); 42 - 46,h, 48 - 52!,d Intern. Conf. on Bioscience of Lipids (Bergen, Norway, 2001; Graz, Austria. 2002: Oxford, UK, 2003; Ioannina, Greece. 2004: Ajachi, France. 2005: Turku, Finland, 2007; Maastricht, Holland, 2008: Regensburg, Germany, 2009; Bilbao, Spain; 2010); WCDA Paul Ehrliclvs Conf. (Nurenberg, Germany, 2004); Г FEBS Workshop of Lipids (Dijon, France, 2005); Intern. Symp.'"Lipids, Liposomes and Biomembranes 2005: New Technologies" (Vancouver, Canada, 2005): Workshop "Pro-tein-Lipid Interactions" (Dubrovnik, Croatia. 2005); 8. 9lh Intern. Schools on Biophysics "Supramolecular structure and functions" (Rovinj. Croatia, 2003. 2006); 4th - 8th Euro Fed Lipid Congresses (Madrid, Spain. 2006; Gotheburg, Sweden. 2007: Athens. Greece, 2008; Graz. Austria. 2009; Munich, Germany. 2010); Междунар. Конф. «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пушимо, 2009): 4, 5-м Междунар. Конгрессах «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург. 2006. 2009): FEBS Advanced Course "Lipid Signaling and Disease" (Ortona. Italv.2009).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Объекты, материалы и методы исследования Работа с животными. В работе использовали мышей массой 18-20 г линий F[(C57X DBA2), Balb и SI IK. крыс линии Вистар и кроликов. Животных забивали декапнтацней и выделяли органы: печень, мозг и сердце. При работе с животными-опухоленоснтелями с асцитнон карциномой Эрлиха (АКЭ) мышей забивали на 8-е сутки роста опухоли. Пассирование АКЭ проводили путем последовательной перевивки опухоли на 5-е сутки ее роста. Работа с меточимми культурами. Да я определения активности мембра-носвязанной ПКС были пспользовапы культуры гладкомышечных клеток аорты крысы (VSMC) ~А7г5 клопа DB1X и остеосаркомы человека (Saos-2). растущие в Dulbecco. Eagles (DMEM) среде, [Ashihara, Baserga. 1979]: эксперименты проводили серийно на синхронизированных клетках на границе Gi S по методу [Azzi. 1992] в Институте биохимии и молекулярной биологии Университета г. Берн (Швейцария). Для изучения микровязкости были использованы трансформированные клеточные линии: асцитные клетки Krebs II и лейкозные L-929 [Fjose. Pryme. 1983], выращенные в Институте биохимии Университета г. Берген (Норвегия).

Выделение меточных мембран. Плазматические мембраны (ПМ) из клеток печени мышей выделяли по метод}1 [Loten, Redshow-Loten. 1986] с модификациями с применением перколла и 2М сахарозы двухкратным центрифугированием при 35000 g в течение 20 мни. н 45000 g -30 мин. на центрифуге L-65 ("Beckman", Австрия). ПМ из клеток печени крыс выделяли по методу [Wisher, Evans. 1975].

Синаптосомы и синоптическиемембраны из клеток головного мозга мышей и крыс - по методу [Глебов. 1978]. Микросомачьные мембраны из клеток печени и мозга, а также АКЭ выделяли по методу [Hostetier, 1976]. Фракции :зндо-плазматического ретикулума (гладкий S. легкая - LR н тяжелая - HR фракции шероховатого ретикулума - HR) клеток Krebs II и L-929 выделяли методом нитрогеинои кавитации, разработанным в Институте биохимии Университета г. Берген (Норвегия), с последующим разделением HR и S путем центрифугирования в ступенчатом градиенте сахарозы [Pryте, 1986]. Экстракция лнпидов из мембран проводилась по методу [Bligh, Dyer, 1959]. Количественное определение белка проводили по методу [Lowry, 1951]. Интенсивность ПОЛ оценивали по содержанию: первичного продукта ПОЛ - диеновых коиъюгапюв (ДК). спектры растворов лнпидов измеряли в УФ-области и рассчитывали индекс окисленпостп по соотношению оптических плотностей при 210 и 232 (ДК) нм [Slater, 1984]. Количество вторичного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) определяли спектрофото-метрически в видимой области rio реакции с тиобарбитуровой кислотой [Каган и др.. 1988]. Регистрацию спектров поглощения проводили на автоматическом спектрофотометре DU-50 фирмы Beckman (Австрия). Гидроперекиси (ГП) и гидроокиси (ГО) получали в чистом виде из АК с помощью фермента липокспгеназы по методу [Осис, 1984] в Кардиологическом центре РАМН.

Выделение ПКС проводили из сердец кроликов (3-5 шт.) по методу [Wise, 1982]. который включал в себя четыре стадии очистки фермента: высаливание сульфатом аммония, ионообменную хроматографию на DE А Е-целлюлозе ДЕ-52 фирмы "Sigma''' (США), сорбцию па пористом стекле и гель-фичыпрацто на сефакриле S-200 фирмы "Serva'" (Германия). Степень очистки фермента составляла 80-90°ó, что контролировалась с помощью гель-электорофореза с последующим сканированием на автоматическом денситометре Cromoscan фирмы "Joyce-Loeble" (Англия).

Определение активности ПКС in vitro и в культуре клеток проводили радио-изтопным методом с помощью метки [у"-Р]АТФ по методам [Kikkawa 1982. Boscoboinik. 1991]. Включение радиоактивного фосфора измеряли в сцинцил-ляторе Unisolv-100 фирмы "Chenarol" (Чехия) на счетчике Beckman-7000 (Австрия). Субстратом реакции для выделенной ПКС служил гистон Н-1. для мембраносвязанного фермента в клетках, растущих в культуре -проникающий в мембрану пептид Pro-Leu-Ser-Arg-Thr-Leu-Ser-Val-Ala-Ala-Lys-Lys фирмы Bachem (Швейцария) [Alexander. 1989].

Onpede.ie/iue активности АЦ и ГЦ в мембранах клеток проводили использованием радиоактивных меток [а-~2 Р]АТФ и [а-2Р]ГТФ соответственно по методу [Tkachiik, 1981]. Активность АЦ определяли также по методу [Tovey, 1971] с применением стандартного набора реактивов фирмы "Amersliam*' (Англия), содержащего метку [S-H-cAMP], и специальной компьютерной программы в Институте биофизики БАМ (г. София, Болгария).

Применение метода ЭПР для изучения липидов мембран. В работе использовали спиновые зонды - стабильные нитроксильные радикалы: 2,2,6,6-niempaMeimui--f-i<anpiL'ion;ioi<cununepu()uH (зонд I); 5,6-бензо-2,2,4.4-mempa\ienm:i-4-na;tb.\tiimuwtoKcunitnei)uöitii-I-oKcii:i (зонд II); 2,2.6,6-тетра-.\iemiL:t-4-na:ib.\iiimoiaoKcummepndun-I-oh-cwi (зонд III) [Кузнецов, 1976], синтезированные в ИХФ им. H.H. Семенова РАН, и 5- и 16- доксилстеариновые кислоты (зонды 5- и 16-ДСК) фирмы "Sigma" (США). Спектры ЭПР регистрировали на компьютеризованных радиоспектрометрах ''Bruker 200D"' и "'Bruker-ГМХ" (Германия), точность термостатирования составляла соответственно ± 0,05°С и 0.01ÜC. Величину микровязкости липидов мембран оценивали по времени вращательной корреляции - тс зондов I, II и III и 16-ДСК по формуле для быстро-вращающих радикалов: жесткость липидов - по параметру упорядоченности - S зонда 5-ДСК [Griffith. Jost, 1979]. Конечная концентрация зондов в мембране составляла 5х 10"5 -10"4 М. Концентрация белка - (3-4) мг мл. Приготовление растворов СМД химических веществ проводили методом последовательного разведения на порядок концентрации 10"'М соответствущими растворителями (водой, этиловым спиртом, вазелиновым маслом). Статистическая обработка результатов производилась с помощью компьютерных программ STAT1STICA и Microsoft Excel с использованием методов непараметрической статистики со статистической надежностью 95%. На рисунках и таблицах приведены рассчитанные таким образом значения параметров с указанием среднеквадратичного отклонения или стандартной ошибки. Исходные данные были получены в 3-5 независимых экспериментах in vivo и не менее 5-7- in vitro.

1. Протеинк'иназа С - пероксплппидзависимын фермент.

ПКС - ключевой фермент фосфоинозигидного цикла, открытый Нпши-зукой с соавторами, был охарактеризован как Ca" -зависимый и липид-требующий фермент [Takai, 1977; Nisliizuka. 1980, 1983]. Известно, что ПКС фосфорилирует белки и участвует в трансмембранном переносе сигналов, регулирующих различные клеточные процессы, в том числе пролиферацию в норме, трансформацию клеток и опухолевый рост [Makamura. 1995: Kuo. 1994; Guold, Newton, 2008]. Активация ПКС в фосфоннознтпдном цикле осуществляется вторичным посредником - ДАГ. а также ненасыщенными СЖК (в цис-конформацип). действующими как в присутствии, так и в отсутствии (степень активации меньше) главных активаторов фермента - ФЛ и иона Ca2".

Особенность Г1 КС состоит в том, что фермент в общей фракции выделяется как момомерный белок с молекулярным весом около 80 кД из различных органов и тканей. В настоящее время известно семейство изоферментов ПКС, число которых составляет 12 и более [Koivunen. 2005]. Большинство из них требует присутствия ненасыщенных ФЛ: фосфатндилсернна (ФС). в наибольшей степени активирующего фермент, фосфатдилинозита (ФИ), фосфа-тплнлэтанолампна (ФЭА) и других [Way. 2000; Mackay. Twelves. 2003].

Константы активации (К;1) ПКС составляют десятки микромолей (в основном, 20-30 мкМ) и располагаются для ФЛ в следующем порядке: ФС>ФЭА >ФИ.

Среди множества найденных в настоящее время регуляторов ПКС необходимо выделить форболовые эфиры и основной из них ТФА, который активирует ПКС в присутствии ФЛ подобно ДАГ. Кроме этого, ТФА является опухолевым промотором на тканевом и клеточном уровнях, а также модулятором систем вторичных посредников.

Поведение фермента зависит от состояния его основных эффекторов -ФЛ и СЖК. которые в условиях in vivo постоянно подвергаются окислению. Для липидзависнмых ферментов была обнаружена кинетическая кооператив-ность по липидам-эффекторам. которая для ферментов, обладающих четвертичной структурой, объяснялась аллостерическими взаимодействиями. В то же время для ряда мембраносвязанных ферментов выявлена чувствительность не только к лппидам как эффекторам, но п ПОЛ in vivo и in vitro; показано изменение их активности в зависимости от продуктов ПОЛ. в частности, гидроперекисей. Это позволило ввести термин «перокснлнпидзависимые» ферменты [Farias. 1980: Freedman. 1981; Бурлакова, 1982].

1.1 Кинетический анализ ингпбнроваппя актнвностн ПКС при действии окисленных ФЛ и АК in vitro.

Ввиду одновременного изменения параметров in vivo достаточно сложно выявить вклад каждого эффектора в регуляцию фермента, поэтому была поставлена задача определить активность ПКС in vitro при окислении ненасыщенных ФЛ (ФС, ФИ. ФЭА) и СЖК - арахидоновой кислоты (АК) для обнаружения определенных закономерностей между степенью окисления этих эффекторов и изменением активности фермента. Нами было изучено изменение активности выделенной ПКС в зависимости от концентрации первичных продуктов ПОЛ - ДК, образующихся при окислении ФЛ и АК с учетом того, что в системе in vitro их уровень достаточно адекватно отражает степень окисленности ненасыщенных алифатических цепей.

Было показано,что во всех случаях относительная активность фермента уменьшается при увеличении содержания ДК (рис.1). Единообразная зависимость изменения активности ПКС от концентрации ДК как для ФЛ, так и АК дает основание предполагать, что основной вклад в этот эффект вносит ненасыщенная жирнокислотная цепь. Падение ферментативной активности с увеличением уровня ДК не может быть связано с простым уменьшением концентрации эффектора, так как при степенях окисления ФЛ на 30-40% активация ПКС поддерживалась на прежнем уровне. Таким образом, продукты окисления ФЛ и АК являются ингибиторами ПКС, и пнгибированне носит обратимый характер: степень его не зависит от времени инкубации окисленных эффекторов с ферментом (10-80 мин.).

Учитывая то, что для ряда липидзависнмых ферментов ранее была обнаружена кинетическая кооперативность от эффекторов, то для пероксилп-пидзавпенмой ПКС она может проявляться от концентрации продуктов ПОЛ.

Так как критерием кооперативных взаимодействий между ферментом и эффектором служит уравнение Хилла, с помощью его классической формулы для ингибиторов (I) была проведена кинетическая обработка полученных результатов в координатах Хилла, с вычислением его коэффициента - Пц, который является показателем знака и степени кинетической кооперативности.

(I) Л0-Л,= (А о -Л„т) [I] "Н/( [1 oJ'H + Ш"И),

где Ah,n= 0 при [1]—.-in и А, - активное™ фермента в отсутствие и присутствии ингибитора, [I] и [1 o.j] - дебетующая копией фация ингибитора и даюшая 50% ингибпрование. Пц- коэффициент Хилла.

Для графического построения была использована формула (1) преобразованная в логарифмических координатах:

(2) log !(Ли -Л J / Л, = пн /log [I] - bgflo.,]}

Полученные зависимости для ДК из ФЛ, приведенные на рис.1а. представляют собой две параллельные прямые, одна из которых относится к ФС, а другая к ФЭА и ФИ. Коэффициент Хилла - тангенс угла наклона прямых в этих координатах одинаков и равен (1,75±0,15). что указывает на одинаковую степень положительной кинетической кооперативности. Для АК получена большая степень кооперативности (рис. 1.6) с тангенсом наклона прямой ДК -пи = 4,6±0.1. Вычисление величины - [10имеющей смысл сродства фермента к ингибитору, показало, что она составляет для ДК ФЭА и ФИ - (4.51 ± 0,04) мкМ. ФС (10.9± 0,03) мкМ. АК - (50,1± 0,1) мкМ. что означает уменьшение сродства фермента к эффекторам в ряду: ФЭА=ФИ > ФС > АК.

Более детальный анализ взаимодействия фермента с эффектором был проведен нами по «разностному методу» Курганова, в котором коэффициент Хилла (q ) рассчитывается по формуле (3):

(3; ц = log {1/(А„ -Л',)- // (Л,-Л,)} / // ¡(Ло- Л,) - // (An -Л ",)} /logх

где А,. А', и A"j - величины активности фермента при соответствующих копией фациях ингибитора: [PJ. [Г] = 11 ~J / х и [1"| = х II"]: X =1-?-

Произведенные построения в координатах - q V5 (1- Ai/A„) для трех ФЛ. (рис. 2а), показали постоянство коэффициента q в координатах Курганова, а расчет дал величину q=( 1.75±0.25). совпадающую со значением - пи. вычисленным по уравнению (1). Из этого следует, что уравнение Хилла выполняется. Такой тип зависимости наблюдался ранее для ферментов, имеющих пространственно разделенные центры. Для АК изменения коэффициента q от 1 до 4 в тех же координатах представляет собой S-образную кривую (рис.26). Это указывает на невыполнимость уравнения Хилла на всем интервале, что было отмечено и для других аллостерических ферментов [Курганов. 1978]. Положительная кинетическая кооператпвность с коэффициентами Хилла около 2 и более 4 при действии окисленных ФЛ и АК на ПКС указывает на то, что на ферменте имеется несколько центров связывания, доступность которых. по-видимому, является пространственно затрудненной и поэтому оказывается выше для более простой молекулы - АК.

г:]

Рис. I Зависимость активности ИКС в относительных елиницах - А/А0 от концентрации ДК как- ингибиторов [I]: а - ФЛ: 1 - ФС. А,,=950. 2 -ФЭА. Ац= 600. 3 - ФИ (вверху).

А,, = 450 п.моль Р1/мин на 1 мг белка): б - А К, А(( = 1750 имоль Р1/мин на 1 мг белка; в логарифмических координатах: я - 1-ФС. 2 - ФЭА и ФИ. б - АК (внизу).

Поскольку ПКС не обладает четвертичной структурой, а состоит из двух доменов - регуляторного и каталитического, то такими «центрами» могут быть места связывания эффекторов на регуляторном домене [Сора1а-ктНпа, 2002]. При этом кинетическая кооператнвность может феноменологически не отличаться от ее проявления при классической аллостерии, характерной для белков с четвертичной стру ктурой, поэтому для ее анализа может быть применен арсенал обсчета, разработанный для аллостерических ферментов.

Такая точка зрения находится в соответствии с современными представлениями о ИКС [Тау1о1\ 2011] впервые высказанными Кошландом, как уникальном «многоцентровом» ферменте с различной аффинностью к эффекторам и липидсвязываюшнми «сайтами» или центрами [МосЫу-ЯоБеп, Ко51апс1, 1987; №\уюп. 2001].

Представление о взаимосвязи степени кооперативное™ и окисленности эффектора дает зависимость коэффициента я от концентрации ДК. Для АК она имеет также Б-образныи вид, при этом наибольший рост q, то есть усиление кооперативности происходит в очень узком интервале изменения степени окисленности АК - от 15 до 22%, при 30% кривая выходит на плато (рис.2, в). Наличие такой 5-образной кривой является важным для «переключения» активности фермента при окислении эффектора. Для ФЛ как более сложных молекул определенной взаимосвязи между этими параметрами получено не было.

Рис. 2 Зависимость коэффициента Хилла рассчитанного разностным метолом

для ДК как пIп ибторои |1|: а- Ф.1. о - АК и и- о! аспепп окпслеипосш АК п по.

й-/Г I-

! '4 - А - )

» О I >

Рис. 3 Определение величины По.?] - сродства ПКС к ДК ФЛ по уравнению (4) при пц=1,75 по тангенсу наклона прямых: 1-ФС. 2-ФЭА. 3-ФИ.

1Ч-Ю '

1,1¡0

Этот анализ подтвердил и 2 уточнил величины сродства

фермента к эффекторам, полученные из уравнения Хилла (2): ДК- ФЭА и ФИ (параллельные прямые) имеют одинаковое сродство:

[1о.5М6,2 ± 0,2) мкМ; ДК ФС Под] =(11,48± 0,15) мкМ.

/о ю за

//[I] ',15

В рамках разностного метода Курганова было произведено также вычисление величин сродства ПКС к ингибиторам, используя уравнение:

Таким образом, было установлено, что, во-первых, сродство ДК ФС ~ в 2 раза меньше, чем ФЭА и ФИ. что соответственно в 5-10 раз меньше, чем продуктов окисления АК; во-вторых, оно выше, чем у неокисленных ФЛ как активаторов: в-третьих, степень положительной кооперативности для ДК АК в 2 раза выше. Интересен тот факт, что те эффекторы, которые имеют более высокое сродство к ПКС как активаторы (АК и ФС). в окисленной форме обладают меньшим сродством. Иными словами, при таких степенях окисления (30-40%) продолжает действовать активация фермента, которая препятствует проявлению его ингпбнрования.

Обнаруженная нами кинетическая кооператпвность вне зависимости от ее природы расширяет диапазон возможностей регулирования активности ПКС. поскольку переключение работы фермента с помощью эффекторов происходит в клетке именно через его кооперативные свойства. Таким образом, в схему регуляции активности ПКС, в которой ФЛ и ненасыщенные СЖК являются активаторами фермента и одновременно - субстратами ПОЛ, добавляются ингибиторы - продукты окисления этих эффекторов, к которым фермент проявляет даже большее сродство и высокую чувствительность. Это и позволяет отнести ПКС к пероксилипидзавпсимым ферментам.

1.2 Кинетический подход при оценке совместного действия ФЛ и АК различной степени окисленности на ПКС.

Кинетический подход был применен и при изучении комбинированного действия ФЛ и АК различной степени окисленности. Имевшиеся в литературе данные по совместному влиянию этих эффекторов в неокисленной

(4)

1/(Ап - А,) = ¡/(Ло - АЬт) + [I] "И / (А0 - АЫп) 1/ [I]

пН

форме на фермент содержали данные как об аддитивности, то есть независимости их эффектов, так и о взаимодействии, приводящем к синергизму. С учетом этого были сделаны следующие предположения, если имеется: а) одно место связывания, то преимущество получат окисленные ФЛ, обладающие более высоким сродством к ферменту; б) несколько мест связывания, то ФЛ и АК могут действовать как независимо, так и взаимодействуя синер-гетически или антагонистически.

Полученные результаты по действию различных комбинаций АК и ФЛ (ФС, ФЭА, ФИ) представлены в табл.], для обсчета применялось соотношение для эффекторов фермента: А '¡¿/А ¡2 V.? А '//А, А '2/А:, где А, 2 и А\: -активность фермента при совместном добавлении неокисленных и окисленных (в различной степени) ФЛ и АК соответственно; А] и А2 в присутствии неокисленных, А'| и А': окисленных в различной степени АК и ФЛ.

Табл. 1 Совместное действие ФЛ и АК как эффекторов различной степени окисленности на активность ПКС.

Эффекторы А,, (Л2) (рто! Р1 /т° тш) л\(А2) (|)ПЮ1 1*1 /тц тт) Д1\, цМ А,д (рп»о1Р|/ ш" тш) А' 1,2 (рто1 РУ т£ тш) Л'1.2 А 1,2 л, л.

0 группа

АК 1500+40 0

ФС 950±30 0 2500150

ФЭА 700+20 0 2250130

ФИ 450±20 0 1950130

1 группа

АК-1 640±30 43.9=1.5

ФИ-1 308±25 5.5=0.2 601+22 0.31 0.26

ФС-4 410±20 12.1=0.4 609118 0.25 0.19

2 группа

АК-2 523115 53.1=2.1

ФЭА-1 310±10 6.2=0.3 570120 0.26 0.16

ФЭА-2 218112 10.1=0.3 469117 0.20 0.12

ФЭА-3 120110 25.7=2.1 200+10 0.09 0.06

3 группа

АК-3 403113 60.1=4.1

ФС-1 666127 5.510.2 1025+45 0.41 0.19

ФС-2 461117 12.5=0.5 600125 0.25 0.12

ФС-3 427112 13.5 0.7 570+20 0.24 0.11

Критерием оценки взаимодействия эффекторов служит соотношение левой и правой частей формулы. В наших экспериментах А, 2 = (А, - А:). то есть при совместном действии неокисленных ФЛ и АК эффекты их суммируются, что указывает на существование по крайней мере 2-х мест связывания. Все комбинации эффекторов были разделены на четыре группы (0, 1.2 и 3). каждая из которых представляет собой совместное действие АК 0%. 10° о. 15% и 20% окисленности соответственно и ФС. ФЭА и ФИ с различным

содержанием ДК. Во всех случаях было получено неравенство: А\2/А |>2 > А'| /А, х А'; /А:, что означает антагонистическое взаимодействие между ингибиторами - продуктами окисления ЛК и ФЛ. Произведенные вычисления соотношения левой и правой частей неравенства для этих групп дали величины: I- (1.25±0.05). 2- (1,6±0.1), 3 - (2.2+0,1), которые показывают, что степень антагонизма определяется ДК АК. Антагонистические взаимодействия между продуктами окисления ФЛ и АК могут служить механизмом «демпинга», уменьшающим общий ингибирующий эффект на ПКС. Это проявляется при средних степенях окисления АК (15-25%). при которых обнаружена S-образная зависимость индекса кооператпвностп (q) от концентрации ДК.

Для того чтобы выяснить, какие именно проду кты окисления влияют на активность ПКС нами были получены гидроперекиси и гидроокиси АК с помощью липокспгеназы в чистом виде и изучено их действие на фермент.

Рнс.4 Влияние различных концентрации гидроперекисей (ROOM) Л К на активность ПКС (Л), активированную ФС, (в % от контроля-1); данные работы (О'Brian, 19SS) показаны белыми точками (2).

Показано, что гидроперекиси АК ингибпруют активность ПКС до 40% в концентрациях 10"6- 10'5 М, а при 54О'5-10"* М - активируют, что согласуется с литературными данными; при 10 JM - эффект отсутствует. Гидроокси АК ингибпруют ПКС на 40% в данном интервале концентраций. Таким образом, концентрации продуктов ПОЛ, влияющие на активность фермента, достаточно малы и близки к их величинам in vivo [Каган, 1986]. Можно полагать, что регуляция активности фермента продуктами ПОЛ, обнаруженная in vitro, имеет место и в клетке.

1.3 Кинетические параметры субстратной зависимости активности ПКС при действии ФС как эффектора различной степени окпсленности.

Одной из базовых характеристик фермента является зависимость его активности от концентрации субстрата, для ПКС основным субстратом реакции фосфорнлирования in vitro является гистон Н-1. Нами было изучено влияние различной степени окисленности (0, 10 и 30%) ФС на зависимость активности ПКС от концентрации гистона Н-1. Полученные результаты, приведенные на рис.5, показывают, что во всех трех случаях кривые во всех трех случаях кривые имеют колокообразную форму с максимумом при одной и той же концентрации гистона Н-1. Обработка этих кривых в координатах

Хилла не выявила кооперативности ПКС по отношению к субстрату', поэтому полученные зависимости были оппсаны методами ферментативной кинетики неаллостерического типа. Проведенный анализ собственных и литературных данных позволил остановиться на схеме односубстратной реакции фосфори-лирования гистона Н-1. поскольку второй субстрат - АТФ (в комплексе с ионом присутствовал в насыщающей концентрации (достаточным условием является соотношение АТФ/гистон Н-1 больше 1). Необходимый для реакции Са2+, облегчающий взаимодействие фермента с ФЛ и гомотропные взаимодействия между молекулами ФЛ, можно рассматривать как кофактор в фермент-субстратном комплексе. Активность ПКС не зависела от порядка и способа добавления компонентов реакции (субстрата, эффектора, фермента), то есть не было прямого взаимодействия между гистоном Н-1 и ФЛ.

Рис. 5 Зависимость активности ПКС от концентрации субстрата [Я] -гистона Н-1 в прямых (а) и логарифмических координатах (б), мри добавлении ФС: неокисленного (кривая I). окисленного на 10% (кривая 2) и 30% (кривая 3).

В случае добавления неокисленного ФС как эффектора ПКС схема реакции выглядит следующим образом 0схема 1).

I к кит

Схема (1) Е + Э ~ ^ - Е + Р

пБ I К1Ш..

т.

[ЕБп-ы]" - Е+Р

где Е, [ЕЯ] и Р - концентрации соответственно фермента, субстрата (гистона Н-1). фермент-субстратного комплекса и продукта реакции. АГЛ/. Кш. и I.™ - эффективные кои-сташы Михапнса-Ментон. дпссопиашш и каталитическая, п - количество молекул субстрата. И - иокачатс. п. активной и ферме!п субстратного комплекса [ГЯ„-,]:

Показано, что субстратная зависимость в координатах Л vs log [SJ характеризуется асимметричностью «колокола» (рис.56) для неокисленного ФС, анализ которой показал, что В^О, т.е. комплекс [ESn+1] неактивен. В этом случае уравнение скорости реакции, определенной по изменению активности фермента (5). было трансформировано в (6) с учетом уравнения (7):

(5) А = AMi,KÍ,[S]/(Kx¡ + [SJ + [SJ" 1/К<шс.)

(6) Á/[SJ + [SJn / Ku ■ Á'),/t4= (AmukJKki 1/A) - 1/KM

(7) S0I„„. = (Ksf K0uc/n)

Построение в координатах 1/[S] + [S]n / Кs, Кы vs 1/A (рис. 6) и применение метода итеративной линеаризации - поиска п, при котором эта зависимость превращается в прямую, показывает, что п=2, то есть неактивный фермент-субстратный комплекс имеет вид [ES:].

Рис. 6 Применение метода итеративной линеаризации для идентификации

фермент-субстратноого комплекса [Е5П].

Применение нескольких методов обсчета субстратной зависимости фермента, в том числе и графических - Лайниувера-Берка, Корниш-Боуден в модификации Эйзенталя, Диксона и других, позволило определить ряд кинетических параметров, а также выявить тип ингибирования. При добавлении неокисленного ФС, действующего как активатора Г1КС получены следующие эффективные (кажущиеся) константы: Км = (0,08±0.01) мкМ; Кдис = (25.1+ 4,1) мкМ; ккэт = (2,02 ± 0.34)х10|0имп/мин М.

1/Л'Ю (имп/мин)'

г'

■ ./

АМо-' ///

ими мин / / /.

!S|. „кМ

Рис.7 Зависимость активности ПКС (А) от концентрации гнстона Н-1 (Б) в двойных обратных коордннагах Ланниувера-Берка (а) и «прямого графика» ЭГпенталя и Корниш-Боудена (б) с неокисле!шым (1) и окисленным на 10 % (2) и 30 % (3) ФС.

Нами также установлено, что с увеличением степени окисленности ФС. АМакс уменьшается, а Км-увеличивается, что наряду с другими признаками указывает на то, что ДК являются ингибиторами смешанного типа.

При небольшой степени окисления ФС - на 10% и ряде допу щений (в частности, отсутствие гетеротропных взаимодействий - между субстратом и эффектором на ферменте) может быть рассмотрена следующая схема:

Кинетический анализ данной колоколообразной субстратной зависимости показал, что в этом случае 0<6<1. то есть комплекс ES: обладает ферментативной активностью. Для определения константы диссоциации -К'лис. были вычислены К:)фф= А/Е и ккат= А.ык-С /Е0 и построена зависимость (1- k\„;¡;¡, кЫт. ) ' V5 I/ S. из которой были получены значения В и К'лис. В итоге были определены значения кинетических констант: KN1 = (0.7± 0.1) мкМ. ккзт=(2,17± 0,14)х 1010ими/мпп М, К\1МС.=(1.7±0.1) мкМ. параметра 6=0.06± 0.01.

При 30% степени окисленности ФС детальный кинетический анализ невозможен из-за падения активности фермента и. как следствие этого, недостаточного количества точек в области малых концентраций субстрата: приблизительная оценка Кмдала величину 1.25 мкМ.

k:\mi

Схема (2) E-S «-> [ES] — Е + Р

nS 1 K'Ú¡:.K':

Таким образом, при окислении ФС - эффектора, показано, что, во-первых. константа Км увеличивается, причем в 10 раз уже при небольшой степени окисления (на 10%). что означает уменьшение сродства ПКС к гис-тоиу Н-1. Во-вторых, соотношение констант Клис kK;lI и Вккат меняется в сторону снижения образования продукта реакции - Р. На основании полученных расчетов можно сделать заключение о снижении эффективности фосфори-лпрованпя при окислении ФС - эффектора фермента.

2. Особенности регуляции активности ПКС антиоксидантами.

2.1 ТФ как ингибитор активности ПКС в широком диапазоне концентрации in vitro.

Один из основных природных АО - ТФ входит в систему регуляции ПОЛ в мембранах как ингибитор окисления липпдов н структурный фактор [Бурлакова. 1975]. Помимо этого, было показано, что ТФ в большой концентрации. эквивалентной физиологической in vivo (10"' -10° М) ингибирует активность ПКС in vitro [Azzi. 1988. 1992].

Проведенное нами исследование действия ТФ на активность выделенной ПКС in vitro в широком диапазоне концентраций позволило выявить, что дозовая кривая имеет бимодальный характер с двумя максимумами: остром при ÍO'^M и более широком - при СМД ÍO ^-IO"'3 М, процент ингибиро-вання составляет 60-80% (рис.8, кривая 1). Между максимумами находится зона, охватывающая пять порядков концентраций, с пониженным эффектом -ингпбирование активности фермента составляет 20%. Такой же характер носит и концентрационная кривая (рис.8. кривая 2) после предварительной активации фермента с ТФА (10"' М) - стандартного приема получения максимальной активности ПКС. При этом наблюдалось снижение процента ин-гибирования на всем исследованном диапазоне концентраций ТФ, что указывало на то. что ннгибирующее действие АО превалирует над активирующим, это особенно проявляется в области СМД. Принимая во внимание то. что ТФА связывается с определенным центром активации на ферменте, вероятно, ТФ присоединяется к другому - ингибиторному центру. Можно предполагать. что между этими центрами имеются пространственно-кинетические взаимодействия. Существование такого центра связывания для природного АО представляется вполне вероятным, гак как ПКС обладает множественными местами связывания эффекторов [Gopalakrishna. 2002]. Показано, что неактивный аналог ТФА - ДДФ не влиял на кривую зависимости активности ПКС от концентрации ТФ.

Важно отметить, что форма полученной зависимости является типичной для кривых «доза-эффект», описывающих действие биологически активных веществ (БАВ), проявляющих свою активность в СМД: максимум в области высоких концентраций, более или менее резкое снижение эффекта или его отсутствие («молчащая» или «мертвая» зона) и второй максимум в области СМД (менее 10"11 - 10"12 М).

Таким образом, на примере ТФ впервые было обнаружено действие СМД в простой модельной системе на уровне фермент-эффектор. Ранее эффекты СМД биологически активных веществ были получены на клеточных уровнях, на которых возможен сложный каскадный механизм усиления сигнала [Ашмарин, 1999].

PllC. 8 Ингибированне активности ИКС (в %) в 'зависимости от концентрации ТФ in vitro: кривые: 1- нативный фермент: 2 - фермент, активированный ТФА в лозе 10" М.

Важным результатом работы является обнаружение экстремальной зависимости ингибирующей активности ТФ в области концентраций, эквивалентных физиологическим. В этой концентрационной области показано различие между ингибирующим эффектом ТФ в отсутствии и в присутствии ТФА, который образует прочный комплекс с ИКС. Из этого следует, что реализация механизма действия ТФА через активацию ПКС in vivo может быть опосредована уровнем ТФ в мембранах.

Нами было высказано предположение о возможности влияния данного природного АО на клеточную пролиферацию посредством изменения активности ПКС. Так как концентрация ТФ в органах и тканях колеблется в достаточно узких пределах (10°- 5 10° М). что попадает в область первого максимума. то вследствие его «остроты» даже незначительный сдвиг по шкале концентрации в ту пли иную сторон) приводит к существенному изменению активности ПКС. В нормальных клетках концентрация ТФ в ПМ выше, чем в цнтозоле, и составляет 10""' М. а с учетом неравномерного распределения по мембране и кластерных образовании в ней достигает 10" М.

Эти концентрации 'ГФ дают в 2 раза меньший ингибирующий эффект на фермент, чем 10° М (рис.8. кривая 1), что может быть одной из причин более высокой, что может быть одной из причин более высокой активности ГЖС в мембраносвязанной форме.

В литературе рассматривался вопрос о связи параметров системы ПОЛ - содержания природных АО. основным из которых является ТФ, и гидроперекисей липпдов (или перекпсных радикалов) с регуляцией клеточной пролиферации, при этом основная роль ТФ состояла во влиянии на уровень гидроперекисей липпдов и структурное состояние мембран [Бурлакова, 1967,1975,1991].

Полученные нами результаты указывают па возможную связь увеличения содержания ТФ и понижения концентрации перекисей липидов с пролиферацией клеток путем воздействия па ПКС. При развитии ряда патологий, в частности, опухолевого роста, колебания содержания ТФ в клетках выходят за пределы вышеуказанного интервала. Из литературы известно, что ПКС способствует активации пролиферации, и интенсивно размножающиеся клетки, прежде всего - опухолевые, обладаю! более высоким уровнем активности этого фермента [kuo. 1994]. Кроме того, концентрация ТФ в опухолевых клетках близка к Ю-4 - 5 10° [Kagan, 1991]. и это область соответствует снижению ингибпрования ПКС с ТФ (рис.8) по сравнению с уровнем активности фермента в интактных клетках и тканях приблизительно в 2 раза. Следовательно. повышенное содержание ТФ может быть одной из причин активации ПКС и клеточной пролиферации при опухолевом росте. Таким образом. наличие острой экстремальной зависимости ингибирования ПКС в области концентраций ТФ. эквивалентных физиологическим, позволяет высказать предположение о важной и нетривиальной роли этого природного АО в регуляции процессов в норме и при опухолевом pocie.

С другой стороны, влияние на клеточную пролиферацию оказывают и гидроперекиси, являющиеся продуктом ПОЛ. С нашей точки зрения, как и в случае ТФ. наиболее важен экстремум в области их физиологических концентраций. Известно, что диапазон концентраций гидроперекисей липидов в тканях животных достаточно узок и составляет (2-4)ч10~1 М [Kagan, 1991; Tritton. Hickman. 1990]. Как было нами показано, при этих концентрациях гидроперекиси оказывают либо незначительный активирующий эффект, либо не влияют на активность ПКС. Однако, в литературе имеются данные как об ингибировании, так и активации ПКС гидроперекисями и другими продуктами ПОЛ. Как следует из рис. 4 влияние гидроперекисей АК на активность ПКС носит двойственный характер: есть как стадии ингибирования фермента. так и его активации.

Известно, что в опухолевых клетках резко снижено содержание гидроперекисей, а в некоторых типах опухолей они вообще не обнаруживаются [Cheeseman, 1986]. Концентрация продуктов ПОЛ в опухолевых клетках по сравнению с нормой снижена в 10 - 15 раз и составляет для различных опухолей (2-7)40° М, что соответствует области активации ПКС.

Таким образом, относительно влияния на фермент со стороны компонентов системы ПОЛ опухолевые клетки находятся в уникальной ситуации, когда повышенное содержание ТФ и резко сниженное гидроперекисей способствует увеличению активности ПКС и тем самым усилению клеточной пролиферации; не исключена также возможность и синергетического эффекта этих агентов.

2.2 Кинетический механизм действия ТФ в большой и сверхмалой концентраций на активность ПКС.

С целью обнаружения различий в кинетике действия больших и СМД ТФ была изучена зависимость активности фермента от концентрации субстрата - гистона Н-1 при добавлении концентраций одинаково - на 50% ин-гибирующих фермент: 10"' и 10'" М ТФ. Показано, что при действии этих двух доз ТФ субстратная зависимость имеет колоколообразный вид с максимумом при той же концентрации субстрата (1мкМ). что и без ингибитора; для 10"* М этот максимум острый, а для 10"м М достаточно широкий (рис. 9). Следует отметить, что при избытке гистона Н-1 (10 мкМ) активность фермента под действием этих доз ТФ одинакова и соответствует 50% инги-бированию. Обработка субстратных зависимостей (по восходящему участку) была произведена с использованием уравнения Хилла для субстрата (8):

(8) 1/А = /.vf,„„; + [S,J"H/A Ul„,c, 1/[S] "н где А и А - активное! и фермента. S и S,¡ < - копией грации субстрата, соответсвуюише А н Л .„„„ /2, пн - коэффпинеш Хнлла.

Путем построения в координатах Хилла 1/А vs 1/S были получены две прямые (рис. 9). тангенс угла наклона которых равен: пи= 1 для 10""* М и около 2 для 10"ы М. Проверка уравнения Хилла разностным методом показала его выполнение при 10'14 М. коэффициенты составили пн = q = 1.9.

Таким образом, при действии СМД ТФ нами выявлена положительная кинетическая кооперативное^ по субстрату с коэффициентом Хилла около 2. При большой дозе коэффициент Хнлла равен 1. что означает отсутствие кинетической кооперативности. которая не обнаруживалась и при действии других ингибиторов - ДК ФЛ в концентрации порядка 10 ó М.

Другой важной характеристикой субстратной зависимости фермента является его сродство к субстрату. Характеристикой сродства является кажущаяся Км при действии большой концентрации ТФ (104 М) и при его отсутствии, а при СМД (1014 М) ее аналог в уравнении Хилла - So.s. Рассчитанные кинетические константы, приведенные в табл. 2. показывают, что сродство ПКС к гпстопу Н-1 одинаково в отсутствие ТФ и при действии его в СМД - 10'14 М (S,,0. тогда как при большой концентрации (10"J М) оно уменьшается (Км увеличивается в 2 раза). Учитывая также и то. что при добавлении ТФ в 10"4 М А„.1КС значительно уменьшается (в 7 раз), следует, что ТФ в большой концентрации действует как неконкурентный ингибитор, а в СМД как аллостерическнй эффектор, увеличивающий чувствительность фермента к субстрату.

Рис.9 Субстратная зависимость активности ИКС в контроле и при добавлении большой (Ю^М) и СМД (10"ы М)'ГФ:

а - от концентрации субстрата (S) - гпстона Н-1: в контроле (I -правая шкала); при добавлении ТФ в концетрациях 10ыМи Ю^МСг и 3-левая шкала);

б - графическое представление уравнения Хнлла по субстрату (8) в обратных координатах при действии ТФ: 10 ЫМ (прямая 1): у = 3.09 + 0.02х; г = 0,92, р<0.05; и 10"4 М (прямая 2): у - 4,44+0,68х, 1=0,91, р<0,05 для определения Пн по тангенсу наклона прямых: 1-пн=1,9;2-пн=1; в - зависимость коэффициента - q (рассчитанного разностным методом) от концентрации субстрата при действии ГФ в СМД 10"мМ.

j_I_I_J_

0,4 0,6 5

Табл. 2 Влияние сверхмалой и высокой концентраций ТФ на кинетические параметры ПК С in vitro.

Концентрация ТФ, М Коэффициент Хнлла по субстрату (Пц5) Сродство ПКС к субетрату-Км или (So^l, мкМ Максимальная активность ИКС (Дмакс.), нмоль/мг'мнн A0 J л макс' Ащисс. (отн.ед.)

0 (контроль) 1,0 0,08+0,01 1700130 -

КГ1 1.0 0,1710.03 240110 7

10 м 1,9 ± 0,2 0,0810.04 320110 5

Примечание: мольное соотношение фермента и его эффекторов (ПКС : а-ТФ : ФС) составляло для 10"4 М с/.-ТФ - 1: 4NI()": 3 41 (): и 10'14 М - 25ч 10:: 1: 8ЧI О5.

Для выяснения механизма действия ТФ на ПКС был применен формально-кинетический подход. Учитывая, что малые концентрации субстрата приводят к увеличению скорости ферментативной реакции, а превышающие 1 мкМ - к уменьшению, то этому процессу теоретически могут отвечать две схемы ингнбирования фермента:

U 0

?.о- , ьМ-

продуктом реакции:

Схема (3):

E + S< >ES ES-^E + P

Е+Р<г^ЕР или ES + P<r

избытком субстрата:

Схема (4):

л—>ES

-у ESP

E + S<r ES-±->E+P ES + S^-^ES,

где £— фермент (Г1КС), S — субстрат (гиетон HI), ES — фермент-субстратный комплекс. P — продукт ферментативной реакции, ЕР, ESP, ES? — нереакцнониоспособные фермент-продуктные и двойной фермснт-субстратный комплексы.

Поскольку в наших экспериментах не наблюдалось смещение максимума активности изучаемой ферментативной реакции в сторону более низких концентраций гистона Н-1 из-за накопления продукта с течением времени, то схема (3) не реализуется. В литературе также отсутствуют данные об инги-бировании активности ПКС каким-либо из продуктов ферментативной деградации гистона Н-1, тогда как есть данные о том, что субстрат может выступать в качестве регулятора активности данного фермента.

Таким образом, схема (4) представляется более вероятной, чем схема (3). Исходя из этого, нами была произведена идентификация параметров для схемы (-4) с помощью метода сопряженных градиентов. Они составили: к:Е„ -2200 пмоль/(мг мин). Км- 0.081 мкМ. К, - 2,5 мкМ: точность аппроксимации 98%, где Ео — начальная концентрация ТФ.

Поскольку максимум активности ПКС на субстратной зависимости не изменялся при разных концентрациях ТФ (рис.9), и. принимая во внимание существование пространственно независимых сорбцнонных участков для субстрата и эффекторов на ПКС. можно предположить неконкурентный тип

регуляции активности фермента.

ESi

К,

ELS:

EL+

Е+

К'т

ад

+ELS-

K't

К"п

На аллостерическую регуляцию активности ПКС указывает тот факт, что ТФ (10"М) вызывает не только супрессию, но и повторную активацию фермента (рпс.9 а. кривая 3).

В простейшем случае такой регуляции отвечает Схема (5): где Е - фермент (1ЖС). ¿'-субстрат. /. лиганд (ТФ).

Расчет кинетических параметров для схемы 5 показал хорошую аппроксимацию экспериментальных данных с коэффициентом

корреляции г=97-98 % (р<0,02). Для полной идентификации этой схемы были подобраны необходимые параметры в следующих приближениях: К]= 9 10"'"' М. К: = 2 10"6 М, а- 0.2: р- 0.6 (рис 10).

а б

Рис. 10 Компьютерная аппроксимация экспериментальных данных по схеме (4) субстратной (от гистона Н-1) зависимости активности ПКС (пмоль/мгмин.) с параметрам», приведенными в табл. 3.

При указанных соотношениях между параметрами на кривой «доза-эффект» влияния ТФ на активность ПКС должно наблюдаться два максимума при концентрациях ингибитора, соответствующих величинам Kj и К2, что подтверждается экспериментальными данными (рис.8.а): максимальное инги-бирование активности ПКС под влиянием ГФ наблюдается в диапазоне его концентраций 10"'4 - 10"13 M и 5х 10"5 М.

Табл. 3 Кинетические параметры взаимодействия ПКС и гистона Н-1 при действии различных концентрациях ТФ in vitro.

[а-ТФ]. M Kilioi пмоль/мгмин Км, мкМ Kj, мкМ Коэффициент корреляции,%

0 2200=401 0.081 ±0.012 2.5±0.5 98

10ы 368±]10 0.061 ±0.016 1 1,7±2.3 98

ю-4 205±75 0.086±0.026 41,3-Ы.2 97

Как следует из данных таблицы 3, добавление ТФ практически не меняет величину Км, определяющую сродство фермента к первой молекуле субстрата. что также указывает на неконкурентный тип регуляции активности ПКС и подтверждает правильность схемы (5). Можно отметить уменьшение на порядок величины к:Е0 при добавлении как физиологической концентрации ТФ, так и СМД. Таким образом, имеется хорошее совпадение кинетических параметров и констант, полученных по уравнению Хилла и схеме (5), отдельные расхождения (Км при 10"4 М ТФ. 5от= л'КмК-кониетрацня субарата при Л макс) вполне допустимы при различии в значениях констант Км и К, на 2 порядка и широком диапазоне концентраций субстрата - гистона Н-1 (0.1 - 10 мкМ).

Подводя итог можно сказать, что при изучении ряда дозовых зависимостей активности ПКС в широком диапазоне концентраций эффектора - 'ГФ от 10° до 10"17 М и гистона Н-1 от 0,01 до 10 мкМ были установлены следующие факты. Во-первых, данный природный АО является ингибитором ПКС в широком диапазоне концентраций от 10"2 до 10"16 М; во-вторых, ингибирование носит неконкурентный характер; в-третьих, кривая доза-эффект имеет бимодальный характер с двумя максимума при 10"1 и Ю'14 М ТФ, степень ингнби-рования достигает 80%: в-четвертых, произведена идентификация системы с 98% аппроксимацией экспериментальных данных; в-пятых, предложена формально-кинетическая схема, удовлетворительно описывающая данную ферментативную реакцию при действии ингибитора в указанном диапазоне концентраций, а также рассчитаны соответствующие кинетические параметры и получено хорошее соответствие между экспериментальными и теоретическими константами.

Необходимо отметить, что предложенная кинетическая схема - один из возможных механизмов действия СМД и является объяснением бимодальной кривой на примере влияния ТФ на активность ПКС in vitro. В настоящее время в литературе имеется несколько гипотез, удовлетворительно описывающих экспериментально получаемые эффекты СМД, основанные на разных физико - химических представлениях: появившаяся первой «аллостерическая гипотеза» [Бурлакова. 1990. 1991. 1999]. «параметрического резонанса» [Блюменфельд. 1993. 1999]. «флуктуационная» с использованием уравнения Смолуховского [Блюменфельд. Гросберг. Тихонов, 1991]. модель «рецептор-ной адаптации» [Зайцев. Сазанов, 1992, 1999] построенная на принципе «клеточной памяти» [Koshland. 1988] и «кинетическая модель лиганд-рецептор-ного взаимодействия» с использованием цепей Маркова [Варфоломеев. Гу-ревич, 1999]. Все перечисленные гипотезы и модели фактически не противоречат друг другу, гак как описывают бимодальную зависимость «доза-эффект» и появление максимума при СМД. Однако, гипотеза аллостериче-ской регуляции активности ферментов, обладающих центрами с различной аффинностью, в наибольшей степени подходит для объяснения эффектов ТФ на активность ПКС. В частности, рассмотренная в рамках данной гипотезы гипотетическая ситуация, при которой величины констант для двух предполагаемых центров связывания лпганда (пли субстрата) на ферменте отличаются на 5 порядков и составляют 10"'"' М и 10 s М. совпадает с константами, рассчитанными для схемы (5) соответственно К|= 9х 10"1"' М и К;= 2Ч10";: М. различие между которыми около 6 порядков. Таким образом, предложенная нами кинетическая схема может рассматриваться как одно из конкретных реализаций аллостерпческой гипотезы действия веществ в СМД.

2.3 ФК как суперактнватор активности ПКС в мембранах

нормальных н опухолевых клеток, растущих в культуре.

Следующим этапом работы было изучение действия синтетического АО из класса экранированных фенолов - калиевой соли фенозана (ФК) в широком

диапазоне концентрации на активность мембраиосвязанной ПКС. Выбор АО был обусловлен, во-первых, его водорастворимостью. во-вторых, широким спекгром биологического действия [РоЬеёпшку, Виг1ако\;а. 1991], в-третьих, было показано, что ФК активировал данный фермент, полученный в очищенном виде [Хохлов, 1988].

Принимая во внимание взаимосвязь активности данного фермента и клеточной пролиферации, исследование влияния ФК в концентрационном диапазоне от Ю-4-КГ4' М на активность ПКС было проведено на мембранах нормальных и опухолевых клеток, растущих в культуре. При этом учитывалось. что эффекты природного АО - ТФ на выделенную и мембраносвязан-ную ПКС в культуре клеток были аналогичны [Аггк 1992, 1993].

Эта часть диссертационной работы была выполнена Мальцевой Е.Л. во время стажировки в лаборатории проф. Ашш (Институт биохимии и молекулярной биологии Университета г. Берн. Швейцария). В качестве экспериментальных моделей были выбраны две культуры клеток: гладкомышечные клетки аорты крыс (\'5МС). на которых в данной лаборатории в течение ряда лет проводилось изучение действия ТФ на ПКС. и клетки остеосаркомы человека ($ао5-2). характеризующиеся высокой степенью злокачественности.

Было установлено, что ФК в широком диапазоне концентраций действует как активатор данного фермента как в мембранах нормальных, так и опухолевых клеток (рис.10). Показано, что концентрационная зависимость активности ПКС в У5МС клетках имеет выраженный бимодальный характер с двумя острыми максимумами при 10" и 10'^ М ФК при приблизительно одинаковой (около 400%) степени активации фермента. Между этими максимумами находится так называемая "мёртвая зона", охватывающая примерно пять порядков концентрации эффектора: от 10"к' до 10"14 М, в которой активация фермента близка к нулю.

Для оценки влияния ФК. мы сравнили его эффект с ТФА как наиболее сильным из известных активаторов ПКС. Показано, что ТФА, добавленный к УЗМС клеткам в наиболее стимулирующей концентрации - 10'7 М, повышал активность фермента до 170% (см. рис. 3_). что примерно в 2.5 раза ниже, чем эффект ФК на максимумах действия (10" и Ю'^М). В случае действия ФК в диапазоне концентраций от Ю"4 до 10'1" М на опухолевые клетки - 8ао5-2 была получена дозовая кривая, подобная бимодальной. Степень активации фермента составляла 500% при высокой концентрации ФК и 300% при СМ Д. Показано, что в этом случае эффект ТФА (10' М) не превышал 140%.

Таким образом, ФК является суперактпватором ПКС при большой и сверхмалой концентрациях как в нормальных, так и опухолевых клетках. Сравнение полученных дозовых зависимостей в нормальных и опухолевых клетках выявило следующие различия. Во-первых, максимум при больших концентрациях в клетках остеосаркомы сдвинут в область более высоких концентраций - на три порядка (10"4 и 10"' М соответственно). Во-вторых, в клетках 5ао$-2 между двумя максимумами находятся две области: первая - от 10" до 10"'" М ФК, в которой поддерживается относительно высокая активация ПКС - 140-220% (эффект ТФА не превышал 140%), и вторая - от Ю'ь до 10"1' М, в которой эффект равен нулю, то есть «мертвая зона». В-третьих, кривая «доза-эффект» в опухолевых клетках как бы растянута по шкале концентраций ФК.

Рис. 10 Изменение пропета активации ПК С в зависимости от действующей концентрации ФК. добавленного к кулылре клеток: а - гладкомышечные клетки аорты крыс - линии У8МС и б - остеосаркомы человека - линия 5ао$-2.

Примечание: штриховой линией показано Осйствие ТФА в Оозе 10' XI

Было также изучено совместное действие двух активаторов и показано, что добавление ТФА и ФК в концентрациях 10"7 М и 10'5 М (соответственно дающих половину максимального эффекта), не меняла величину активации фермента, полученную при их раздельном действии, и составляла около 160% (табл. 4). Из этого следует, что в мембранах У5МС клеток имеется либо один «центр» связывания, на который в силу конкуренции действует только один из этих активаторов, либо два, связываясь с которыми данные активаторы могут всту пать в антагонистическое взаимодействие.

Табл. 4 Совместное действие ФК и ТФА на активность ИКС в ПМ клеток Х^МС и $аоБ-2, растущих в культуре.

Активаторы, Максимально эффективные концентрации Активность ПКС, j % активации ПКС пмо./ь/'мип 10*taeniOK \ SMC Saos-2 ! VSMC Saos-2

Контроль 51±7 212+15

ФК, 10°М 81±9 - | 160±10

ФК, 10"' М 376±27 177+12

ТФА, 10"7М 70±10 462±32 140±10 141+12

ФК, 10"5М + ТФА, 10"7М 78±12 156±13

ФК, 10"' М + ТФА. 10"7М 891±63 | | 300±20

В противоположность этому на опухолевых клетках была установлена адаптивность эффектов ТФА и ФК в концентрациях - 10'7 М, при которой эффект каждого из них также составлял половину максимального. Возможно, в клетках остеосаркомы имеется два места связывания этих активаторов на ферменте, также нельзя исключить и участие различных изоформ ИКС в сложении эффектов данных активаторов. Такое существенное отличие от нормальных клеток говорит о том, что мембраносвязанная ПКС в клетках остеосаркомы обладит дополнительными возможностями стимуляции своей активности, что. безусловно, может играть важную роль в регуляции пролиферации клеток- при опухолевом росте.

Сравнивая полученные нами результаты по влиянию ТФ и ФК на активность Г1КС. необходимо еще раз отметить сходства и различия их действия. Установлено, что ТФ является достаточно сильным ингибитором ПКС, что показано нами на выделенном ферменте и имеет свое подтверждение в литературе и на культурах клеток; при этом нпгпбпрующий эффект ТФ выше на очищенном ферменте. ФК является суперактиватором ПКС в ПМ нормальных и опухолевых клеток, растущих в культуре: на выделенном ферменте было также показано активирующее влияние ФК на ПКС, но эффект его был ниже, чем ТФА. Несмотря на противоположный "знак" этих эффекторов и способ их действия на фермент, можно отметить аналогию их дозо-вых зависимостей, которые в общих чертах совпадают с типом кривых, полученных на других биологических объектах при исследовании действия разнообразных БАВ. Это проявляется, во-первых, в определенном типе бимодальных кривых с характерными максимумами при высоких концентрациях и СМД: ¡ю-вторых. в наличии между ними так называемой "молчащей зоны" в области малых концентраций БАВ. которая включает в себя 4-5 порядков концентраций АО. Однако, степень ее выраженности различна: если при действии ТФ - "лачн 1елыюе снижение эффекта, то при ФК его исчезновение ло нуля (ocoóeinu в опухолевых клетках), что позволило охарактеризовать ее как "мертвая зона". В-третьих, в существовании острого максимума при высоких концентрациях (в пересчете in vivo, близких к физиологическим) АО как ТФ, так и ФК вне зависимости от действия на выделенный фермент в модельной системе пли в мембранах клеток, растущих в культуре.

Таким образом, полученные в работе результаты рассматриваются нами как новый подход к регуляции активности фермента эффекторами - АО. А именно: АО, контролирующие ПОЛ в мембранах и косвенно влияющие на регуляцию активности ПКС путем уменьшения уровня гидроперекисей, сами являются эффекторами этого фермента. При этом эти пути регуляции активности ПКС могут быть разнонаправленными. Так. природный ТФ в одном и том же диапазоне концентраций 10"J-10"16 М, с одной стороны, ингибирует активность Г1КС как эффектор, а. с другой стороны, понижает количество гидроперекисей, пнгибируюших фермент. Синтетический ФК активирует ПКС при большой дозе (КГ1 М) и СМД (10"1SM), но ингибирует ПОЛ только при низких концентрациях и СМД. В то же время ФК в больших концентра-

циях влияет на ПОЛ сложным образом, проявляя и прооксидантный эффект [Пальмина, 2001]. Таким образом. ФК в СМД - это двойной активатор ПКС.

3. Природный антиоксидант ТФ как модификатор структу ры клеточных мембран в широком диапазоне концентраций.

Как уже отмечалось, природный ТФ является незаменимым компонентом биологических мембран. Во-первых, ТФ выполняет важную функцию по сохранению их целостности, участвуя в регуляции ПОЛ в качестве эффективного природного АО, во-вторых, непосредственно воздействует на структуру липидного бислоя мембраны [Govil, 1992; Traber, 2007]. вязкость которого является параметром системы ЛОЛ. В связи с этим, нами исследовано влияние ТФ на структурное состояние лнпидов мембран в широком диапазоне концентраций, включая СМД. а также ультранизкие разведения (<10'"° М). при которых вероятность содержания хотя бы одной молекулы вещества в мембранной суспензии близка к нулю.

3.1 Влияние ТФ на структурные характеристики лнпидов мембран; взаимосвязь с активностью ПКС.

В качестве объектов для изучения влияния ТФ были взяты два типа клеточных мембран. Прежде всего, это ПМ, в которых функционируют и «ведут переговоры» системы вторичных посредников. Для сравнения с ними - мембраны ЭР. отличающиеся по своим биохимическим и функциональным характеристикам и являющихся распространенным объектом изучения ПОЛ и влияния на него АО.

5-доксилстеариновая кислота (зонд 5-ДС.К)

/ 6-доксилстеариновая кислота (зонд 16-ДСЮ

5 = 1.66- Амакс '4л'"" 4 + 2 А

•'макс

г =6.5 ДЯ„( --1)-10""'.с г =6.65-Д//,.! 1--И-К ' ' IL \i

S = (Vl(/I+ -l)/(\'Io/I--l)

PllC. 11 Типичные спектры ЭПР спиновых зондов - 5- и 16-ДСК, полученные в клеточных меморанах. м соответствующие формулы расчета [Верлппср. 1979].

С этой целью было проведено изучение структурных состояния различных областей липидов методом ЭПР с помощью спиновых зондов: 5- и 16-ДСК, локализующихся в лппидном бислое мембран на различной глубине, S и 20А° соответственно. Выбор этих зондов был обусловлен, во-первых. широким использованием их при исследовании природных и искусственных мембран; во-вторых, различными параметрами, рассчитываемыми из спектров ЭПР: упорядоченности - S зонда 5-ДСК или «жесткости» поверхностных областей липидов и времени вращательной корреляции - тс зонда 16-ДСК, характеризующего микровязкость глубоколежащих гидрофобных областей липидов мембран. Это дает более полную информацию о структурном состоянии липидов мембран.

Установлено, что действие ТФ in vitro в диапазоне концентраций от 10'М - при которой обычно исследуются эффекты БАВ, до СМД и ультранизких разведений на микровязкость глубоколежащих слоев липидов мембран как ПМ. так и ЭР носит полимодальный характер (рис. 12а). Показано, что на данной концентрационной кривой имеется подъем при 10"4 М и три «волны» повышения величины тс 16 ДСК в диапазоне средних концентраций - Ю-0, - 10"' М, соответствующих тем. в которых ТФ обычно действует в организме. в области СМД при 10"ь - К)"1" М и \льтранизких разведении 10"18-10":1 М.

Необходимо отметить, во-первых, что эффекты ТФ на липиды мембран Г1М и ЭР сравнимы между собой по величине, во-вторых, между обозначенными «волнами» находятся так называемые «мертвые» зоны, в которых эффект равен нулю. Иными словами. ТФ действует на структурные характеристики липидов мембран по типу БАВ. проявляющих эффект в СМД (ниже 10""- 10"': М).

Увеличение вязкости (или снижение текучести) липидов при встраивании ТФ в больших концентрациях было показано и другими авторами на естественных и искусственных мембранах различными методами, в том числе и методом ЭПР со спиновыми зондами (Wassail. 1991). Упорядочивание различных областей липидиого бпелоя мембран при введении в них ТФ in vitro в концентрациях 10"4-10" М, соответствующим «физиологическим», обусловлено прежде всего ограничениями при упаковке углеводородных цепей липидов вблизи молекулы ТФ, что снижает их конформационную подвижность. Эти процессы могут быт ь связаны с взаимодействием ТФ с молекулами ФЛ, приводящим к образованию комплексов с определенной стехиометрией (Gomez-Fernandez, 1989).

Изменение жесткости в поверхностных областях липидов мембран ЭР и ПМ имеет менее выраженный полимодальный характер: подъем при высокой концентрации - 10"4 М и «волна» увеличения эффекта в интервале от 10*9 до (10"!6- 10"ISM) ТФ (рис.126). Как и в случае изменения микровязкости в глубоколежащих областях липидов мембран ЭР, в отличие от ПМ, наблюдается колебательный эффект со сменой «знака» при ультранизких разведениях (менее 10"1S М).

Известно, что клеточные мембраны относятся к гетерогенным системам, в которых имеются субмезофазы. Поэтому, наряду с изменениями их вязкостных свойств важными характеристиками структурных изменений в липидном бислое. являются количество и качество ТСП, а также эффектив-

мая энергия их активации (Л£*). Для выявления ТСП и определения полученные концентрационные кривые были статистически обработаны и представлены в Аррениусовых координатах -Ь§ те или 8 от 1/Т (рис. 13).

8 -

б -

Н 4 -ы

С->

О --2 -

-4 -

Рис. 12 Концентрационная зависимость эффектов ТФ на (а) микровязкость глубоко-лежащих и (б) жесткость поверхностных областей липндов клеточных мембран (ИМ, ЭР).

Показано, что при тех концентрациях ТФ, которым соответствуют максимумы и минимумы на дозовых кривых (рис. 12), в лип идах мембран появляются дополнительные ТСП по сравнению с контролем, (а в глубоко-лежащих областях липидов мембран ЭР также и более кооперативные ТСП с пониженной величиной дЕ^). При этом большинство дополнительных перестроек в липидном бислое ПМ (табл. 5, заштрихованы) обнаруживается в области физиологических температур 307-314°К (34-41°С).

-1^[альфа-токоферол]

i«7 -j

-♦— контроль -•«- 1<HM 1 c-7M ••■»•.....lc-IOM

3 12 3 17 3.22 3.27 3.32 3.37 3.42 3 47 3.52

1АГ*103(К'к

\f Г

[|3(К'')

Рис. 13 Температурные зависимости тс (вверху) и S (внизу) в диапазоне 285-319°К в контроле и при действии различных концентраций ТФ на ИМ in vitro.

Табл. 5 Положения ТСП и Д(кДж/моль) в глубоколежащих областях липидов ПМ в контроле и при действии различных концентраций ТФ in vitro.

т.°к контроль 10"4М 10"7М ю10м 10"14М 10|8М 1(Г22М

289

291 9.2±0.6

293

295 6.5±0.3 7.6±0.4 6.2±0.2

297 6.3±0.3

299 5.8±0.1

301 8.4±0.9 7.3±0.2 7.2±0.4

303 8.8±0.6 7.0±0.8

305 5.8±0.5

307 //////

309 /±и. Г J Vssssj

311 ////// /б.0±0.7> 'SSSS// WA J6.3i0.6i 'А^уяА 'SSSSA

313 /////^ /////У

315 '/////, '/////>

317

3.12 3 17 3.22 3.27 3.32 3 37 3.42 3.47 3.52

1/ТЧО3 (К1)

3 12 3 22 3.32 3.42 3.52

1/Т*103 (К"1)

—♦— К01Пр0Л1.

--«•- 1е-14М 1 е-18М --*•.....1С-22М

Это может быть связано с образованием микродоменных структур в липидах мембран. Принимая во внимание большое значение ТСП и фазовых переходов в липидах мембран для жизнедеятельности клетки (С^бо, 1996; Харакоз, 2001) и корреляцию между активностью ПКС и фазовым поведением мембран (Мюо1, 1999) этот факт может иметь важное регуляторное значение при действии ТФ в широком диапазоне концентраций.

Одним из объяснений эффектов СМД ТФ на вязкостные свойства клеточных мембран может быть его специфическое взаимодействие с предполагаемыми связывающими центрами на мембране. Таким центром может быть мембраносвязанная ПКС, для которой, как было описано выше, обнаружена кинетическая кооперативность при взаимодействии с ТФ т у/У го. Проведенное сравнение показало, что изменения жесткости поверхностных областей липи-дов как ПМ, так ЭР (микросомальных) мембран, хорошо коррелируют с активностью ПКС (рис. 14). Однако, в ПМ, как известно, количество фермента значительно выше и изменения параметра Б (жесткости) по величине больше. Вероятно, наличие данной корреляции обусловлено такими причинами, которые не зависят от количественных показателей. В частности, в работах других авторов было показано, что вещества, стабилизирующие липидный бислой или повышающие жесткость липидов, являются ингибиторами ПКС [Ерап<± 1988]. Влияние ТФ на активность данного фермента и структурное состояние липидов клеточных мембран является именно таким.

Рис. 14 Изменение жесткости (Б зонда 5-ДСК) поверхностных областей липидов мембран и степени ннгмбирования ИКС в зависимости от концентрации ТФ: А - микросомальных ( р<0.0001, г=0,95) и Б - в плазматических (р<0,0047, г = 0.87)

Следует отметить, что максимум действия ТФ приходится на 10~14 М -концентрацию, при которой наблюдаются максимальные эффекты СМД практически всех изученных БАВ на различных иерархических уровнях, в том числе мембран и ферментов [Бурлакова, 2007]. Иными словами, эффект концентрации 10"14 М не зависит от природы растворенного вещества и его

биообъекта, то есть является универсальным. Для объяснения этого феномена можно выдвинуть два предположения: во-первых, это свойство раствора данной концентрации БАВ, и если оно не зависит от природы самого вещества, то может зависеть от растворителя; во-вторых, это свойство биообъекта, обладающего гиперчувствительностыо к действию БАВ в 10"14 М Для проверки первого предположения было проведено исследование роли полярности растворителя на эффекты ТФ на мембраны.

3.2 Роль полярности растворителя в эффектах ТФ на структурные характеристики липидов мембран.

Рис. 15 Действие ТФ в полярном (/) и неполярном (2) растворителях на микровязкость (а) и жесткость (о) различных областей липндов мембран ЭР при температуре 25°С. Примечание: эффекты мене 2% для зонда 16-ДСК принято считать находящимися в пределах ошибки метода (заштрихованная область).

Для объяснения полученных эффектов ТФ в области СМД и ультранизких разведениях (<10"'8М) имело смысл обратиться к свойствам растворителя, в частности его полярности, поскольку в настоящее время в литературе обсуждается роль воды в проявлении эффектов СМД [Ьо, 1999]. Для выяснения вопроса о важности полярности растворителя для проявления эффекта

ТФ в различных концентрациях на микровязкость и жесткость липидов мембран ЭР нами было проведено сравнительное изучение действия ТФ, приготовленного в полярном (спирто-водные растворы) и неполярном (вазелиновое масло) растворителях.

В результате проведенных экспериментов для обоих растворителей были получены полимодальные стадийные дозовые зависимости (рис.15). Установлено. что если в областях больших концентраций (10"4—10"9 М) и СМД (10" -10"'в М) статистически достоверными (р<0.05) эффектами обладают растворы ТФ в обоих растворителях, то в области ультранпзких разведений (10' 18-10-25 М) только растворы ТФ в воде. Это говорит о существенной роли полярности растворителя в передаче «информации» о веществе, в данном случае ТФ, в том или ином виде в процессе приготовления растворов. Полярные свойства воды связаны, прежде всего, со способностью ее молекул образовывать водородные связи друг с другом, что приводит в итоге к формированию короткоживущих водных кластеров небольшого размера (Saykallv. 1993: Liu, 1996). Следует отметить смену «знака» эффекта, регистрируемого в глубо кол ежащих областях липидов мембран в неполярном растворителе по сравнению с полярным при концентрации 10"14 М ТФ, и противоположную направленность в изменении жесткости в поверхностных слоях липидов ЭР в обоих растворителях.

4. Универсальный модулятор систем вторичных посредников - ТФА как модификатор структуры мембран в широком диапазоне концентрации.

Как уже отмечалось, ТФА не только обладает свойствами опухолевого промотора, но и является универсальным модулятором систем вторичных посредников - циклических нуклеотидов и фосфоинозитидного цикла [Nishi-zuka, 1989. 1992]. Кроме этого, ТФА влияет и на систему ПОЛ, ингибпруя этот процесс: дозовая зависимость носит при этом экстремальный характер с широким максимумом при низких концентрациях 10~ь-10~'J М ТФА в микросомах и полимодальный характер - в ПМ. при этом его неактивный аналог-ДДФ не дает эффекта [Пальмина, 1997. 1999]. Поскольку микровязкость липидов мембран является одним из параметров системы ПОЛ было изучено изменение различных областей липидов мембран под действием ТФА.

4.1 Изменения мнкровязкостн липидов клеточных мембран клеток печени и мозга под действием ТФА in vitro.

Для того, чтобы установить, может ли ТФА непосредственно воздействовать на мембрану, было исследовано действие форболовых эфиров - ТФА и его биологически неактивного аналога - ДДФ в широком спектре концентрации на микровязкость липидов различных клеточных мембран печени и головного мозга мышей) in vitro. Как уже отмечалось выше, ПМ представляют особый интерес, так как в них находится ПКС, которая под воздействием ТФА переходит из цитозольной в мембраносвязанную форму и становится его рецептором. С другой стороны, мембраны ЭР также играют важную роль в функционировании систем вторичных посредников, так как они являются депо для ионов Са2", но содержат меньшее количество ПКС рецепторов ТФА. Поэтому было проведено сравнение влияние ТФА на ПМ и ЭР.

Для картирования мембран были использованы три нитроксильные стабильные радикалы - зонды I-JII, локализующихся в различных областях липидного бпслоя и характеризующиеся разной степенью погруженности в мембрану: зонд I на 2-4 А0, зонд II-7-8 А0, зонд III - около 15А (рис.16).

Было показано, что добавление ТФА не влияло на изотропную константу -А1Ш,_, характеризующую локализацию зонда в мембране: эта величина находилась в пределах (16,1 ±0,3) Гс - для зонда I, (15,6±0,2) Гс -зонда II, О 5,2+0,2) Гс - зонда III во всех изученных типах мембран в контроле и обработанных ТФА (для сравнения Аи30.= (14,2±0,3) Гс в неполярных растворителях, а в воле - (17т4±0.2) Гс._

5нс. 16 Типичные спектры ЭПР и структурные формулы спиновых зондов 1, II и III.

в мембранах ПМ. ЭР и СП. выделенных из клеток печени и мозга мышеи.

При изучении кинетики действия ТФА на мембраны клеток головного мозга и печени мышей была выявлена экстремальная зависимость изменения времени вращательной корреляции -тс зондов 1-111 с максимумом эффекта на 10-15мин. В качестве примера на рис. 17 приведены кривые зависимости эффекта ТФА в различных концентрациях от времени для мембран, выделенных из клеток печени; для мозга были получены аналогичные кривые.

Таким образом, ТФА вызывает кратковременное повышение микровязкости различных областей липидов мембран, поэтому в качестве характеристики воздействия ТФА использовали величину максимального отклонения от контрольного значения. Было установлено, что неактивный аналог -ДДФ в том же диапазоне концентраций не влиял на величину тс зондов 1-111.

Рис. 17 Типичные кинетические кривые нзменепня тс зонда II в ПМ (а) и ЭР (б) под действием форболо-вых эфиров (ТФА. ДДФ) в различных концентрациях: а -1нМ (1). 0.1 пМ (2),1 ОпМ <3)ТФА, 10 нМ и I нМ ДДФ (светлые точки); 6-0.01 пМ (1). 1 пМ (2). 0,1 пМ(3) ТФА, 1 мкМ и 1пМ - ДДФ (светлые знаки)

Нами показано, что действие ТФА приводит к однотипным изменениям микровязкостн различных областей липидов мембран ПМ и ЭР: тс зондов III возрастает, а тс зонда III-уменьшается (рис. 18). Наибольшие отклонения от нормы получены при концентрациях ТФА от 10"8 до 10"18 М с максимумом при 10"м М. Это означает, что ТФА. во-первых, является двойным модификатором клеточных мембран, так как под его влиянием поверхностные слои липидов становятся более жесткими, а гидрофобные области - более жидкими. Во-вторых, важно отметить, что в обоих типах мембран клеток печени и мозга под действием ТФА величины тс зондов I и II меняются однонаправлено (увеличиваются). Такой характер изменений ранее был отмечен только для опухолевых клеток, в то время как в норме при действии различной веществ (АО, гормоны и другие) ранее наблюдались противофазные изменения. При действии ТФА это может быть проявлением его основного свойства как опухолевого промотора на мембранном уровне.

Аналогичные изменения в микровязкости липидной компоненты под действием ТФА были получены нами в микросомальных и СП мембранах головного мозга мышей, при этом максимальный эффект наблюдался для концентраций ТФА от 10"'° до 10"м М.

Для получения более полной картины изменения микровязкости липи-дов мембран были использованы также доксильные спиновые зонды (5-ДСК и 16-ДСК), локализующиеся в других областях липидного бислоя, по сравнению с нитроксильными радикалами (зонды Т-Ш), и применявшиеся при изучении влияния ТФ на мембраны.

<Сс>Л

го

1,99

¡0

~1Ц

-10 -6

40 -6 1д[тФА](м)

Рис.18 Изменение (тс) зондов 1 (а). II (б) и III (в) - правая шкала и в % - левая шкала в ИМ (слева) и ЭР (справа) клеток печени в зависимости от концентрации ТФА.

С помощью этих зондов было подтверждено увеличение жесткости в поверхностных и уменьшение микровязкости в более гидрофобных областях липидов клеточных мембран под действием ТФА, несмотря на то, что концентрационные зависимости изменения этих параметров имели иной характер. В области СМД и при биологически активных концентрациях ТФА 10~6-10'" М наблюдались разнонаправленные изменения микровязкости (тс 16-ДСК) и жесткости (S - 5-ДСК)липидов мембран клеток мозга.

Таким образом, произведенное с помощью пяти спиновых зондов картирование липидного бислоя клеточных мембран позволило установить, что. во-первых, изменения в различных его областях под действием универсального модулятора - ТФА существенно различаются, что еще раз говорит о сложной картине гетерогенных изменений в липидах мембран. Во-вторых, количественные и качественные изменения структурных параметров в одних и тех же областях липидов сравнимы как в различных мембранах, так и органах - печени и головном мозге. В-третьих, показано, что неактивный аналог -ДДФ в том же концентрационном диапазоне не влиял на величину микровязкости различных областей липидов мембран.

4.2 Роль изменения микровязкости липидов мембран под действием ТФА как опухолевого промотора во взаимосвязи с активностью ПКС.

Однотипные качественные и количественные изменения микровязкости липидов в различных мембранах как клеток печени, так и мозга позволяют высказать предположение о неспецифическом характере изменений этого параметра под влиянием ТФА. Обнаруженные изменение микровязкости липидов не является прямым следствием рецепторного акта, так как количество рецепторов ТФА значительно различается в ПМ и мембранах ЭР как в головном мозге, так и печени [Кио, 1980]. Показано, что действующие концентрации ТФА - это низкие и СМД для всех изученных типов мембран, их интервал составляет 10"lü- 10~16 М. в то время как обычные рецепторные концентрации ТФА, активирующие процессы дифференцировки и размножения клеток - порядка Ю"7 -10"9 М [Kraft, Anderson, 1983; Jaken. 1987]. С одной стороны, это может быть объяснено тем, что мембрана является более чувствительной системой, чем клетка. С другой стороны, при неспецнфической реакции липидной компоненты мембран разумен и пересчет добавленной концентрации ТФА на 1 мг липидов. В этом случае действующие концентрации ТФА как модулятора структурного состояния липидов мембран сравнимы с эффективными реиепторными - 10~9-10~" М в системах вторичных посредников. Возможно, что такие неспецифические изменения, как микровязкость различных областей липидов мембран, лежат в основе взаимосвязи систем вторичных посредников.

Физико-химическое состояние липидного бислоя ПМ весьма важно не только для функционирования ПОЛ, но и систем вторичных посредников. Так, изменения микровязкости отдельных участков мембраны может существенно влиять на степень погруженности рецептора в липидный бислой и эффективность взаимодействие лиганда с рецептором, то есть изменение структуры мембраны может влиять на рецепторный акт. Помимо этого липиды являются средой распространения информационного сигнала и свойства этой среды оказывают неспецифическое воздействие на скорость этого процесса. Поэтому неодинаковый характер изменения микровязкости липидных кластеров может существенно менять отдельные стадии проведения информационного сигнала в клетку. На основании полученных нами результатов высказано предположение о том. что более жесткое состояние поверхностных слоев липидов (локализация зондов 1 и II) способствует такой ориентации рецепторов ТФА - молекул ПКС в мембране, или их конформационного состояния, которые способствуют взаимодействию фермента с лигандом, то

есть созданию «активной конформации» мембраносвязаниой ПКС. В то же время уменьшение микровязкости липидов в глубине липидного бислоя (локализация зонда 111), может способствовать проникновению цитозольной формы фермента и связыванию с ПМ, что увеличивает в ней число молекул ПКС, что, в свою очередь должно приводить к возрастанию ее активности и увеличению фосфорилирования белков, то есть усиливать первоначальный сигнал. Подобные рассуждения подкреплены литературными данными о том, что, во-первых, при действии ТФА на клетку происходит активация ПКС и перераспределение фермента из цитозоля в мембрану, при этом его мембраносвязанная форма более активна и связана с ПМ настолько прочно, что эта связь не разрушается даже хелаторами [Shoyab, 1981]. Во-вторых, увеличение жидкостности липидого бислоя приводит к разрушению доменов ФС, освобождает дополнительные молекулы этого эффектора для контакта с ферментом, изменяет конформацию ПКС и создавая структуру, также способствующую наиболее эффективному взаимодействию фермента, эффектора и субстрата. Количественные изменения микровязкости, обнаруженные нами в глубоколежаших слоях липидов мембран (зонд III), находятся в тех же пределах, и не превышают 10%, что и в цитируемой работе. С нашей точки зрения оптимальная активация ПКС определяется как взаимодействием ТФА с соответствующим центром фермента, так и липидным окружением, которое играет определяющую роль в создании «активной конформации» фермента. Подобное предположение высказывалось также и для объяснения эффектов ТФА, полученных на искусственных мембранах [Epand, 1988, Lester, 1990].

Для наглядной демонстрации свойства ТФА как опухолевого промотора на мембранном уровне нами были проведены эксперименты по имитации промотирования опухоли in vitro, а именно: исследовано влияние последовательных

0,80 -

С.£5

aso

1П

добавок ТФА в СМД (10"14 М) к мембранам. Результаты, приведенные на рис.19, показывают, что неоднократные введения ТФА приводят к пролонгированному увеличению микровязкости поверхностных областей липидов мембран.

Рис.19 Изменение тс зонда I в мембранах ЭР клеток печени во времени после 1, 2-х (2) и 3-х -кратных (3) воздействий ТФА в СМД -10"ы М: время добавления ТФА обозначены стрелками.

V MUH

4.3 ТФА как модулятор структуры липидов мембран опухолевых клеток в широком диапазоне концентраций in vitro.

Поскольку ТФА не только вызывает трансформацию нормальных клеток (канцерогенез), но и способствует продвижению опухолевой клетки по пути злокачественной прогрессии, было исследовано действие ТФА в широком диапазоне концентраций на опухолевые мембраны т vitro. Моделью опухолевого роста служил асцитный рак Эрлиха (АРЭ).

Рис. 20 Изменение структурных характеристик глубоколежащих областей лииидов опухолевых (АКЭ) мембран ЭР в зависимости от концентрации ГФА in vitro: а - времен вращательной корреляции - tci ( I ) и тс2 (2) зонда 16-ДСК (микровязкости ). б - структурно-чувствительного параметра (£) и фактора анизотропии (tci/tc:).

В предварительно поставленных нами экспериментах было показано, что кривые изменения времен вращательной корреляции (xci и тС2) зонда 16-ДСК и параметра упорядоченности (S) зонда 5-ДСК в зависимости от времени после добавления ТФА выходят на стационарный уровень (через 1520 мин.), на котором значения тс усреднялись для каждой из концентраций ТФА: полученная средняя величина этого параметра использовалась для построения концентрационных зависимостей, представленных на рис. 20.

Показано, что величина микровязкости гидрофобных областей липи-дов мембран АКЭ, рассчитанная по tci и тс2 зонда 16-ДСК, под действием ТФА меняется стадийно относительно контрольного уровня (необработанные мембраны) во всем исследованном диапазоне концентраций от 10"4 до разведения 10"24 М. При этом «волны» изменения микровязкости как бы растягиваются по мере уменьшения концентрации ТФА до ультранизких разведений. Особо резкие изменения, усиливающиеся в диапазоне СМД, отмечены для так называемого структурно-чувствительного параметра (е), в наибольшей степени отражающего глубинные изменения в липидном бислое, и фактора анизотропии спектра ЭПР зонда 16-ДСК - соотношения хс1/тс2.

Рис. 21 Изменение жесткости поверхностных областей лппидов ЭР-мембран АКЭ: а - параметра упорядоченности (Б) зонда 5-ДСК, б - структурно-чувствительных параметров (соотношения интеисивностен линий спектра ЭПР). Контрольные значения параметров обозначены штриховой линией.

Установлено, что изменения жесткости поверхностных областей липи-дов мембран клеток АКЭ, определенные по параметру упорядоченности 8 зонда 5-ДСК, характеризуются увеличением данного параметра относительно контроля в интервале концентраций ТФА КГ^-КГ'6 М и стадийными изменениями выше СМД (более 10'" М) и ниже 10"" М. При этом кривая, описывающая эти изменения, имеет «зеркальную» симметрию с осью около 10'ь М ТФА - концентрации, близкой к границе, отделяющей область СМД (10'" - 10"!" М). Диапазон изменений величины Б - более 6%, что для данного параметра весьма значительно, обычно они составляют 2-4%. Обнаружены также стадийные изменения структурно-чувствительных параметров, характеризующих вращательную диффузию зонда 5-ДСК в липидах мембран, наиболее резкие при СМД (рис.21).

Таким образом, действие ТФА \п \itro вызывает концентрационно-зависимые стадийные изменения всех изученных структурных параметров липидов мембран опухолевых клеток. Наибольший эффект ТФА обнаружен в области СМД (менее 10"16М). Важно отметить, что по изученным параметрам опухолевые мембраны оказались более чувствительными к действию ТФА, чем мембраны, выделенные из нормальных клеток (печени здоровых мышей), в которых изменения менее резкие и меньшие по масштабу.

Рис. 22 Взаимосвязь величины микровязкости (тс2), параметра упорядоченности (Я) и концентрации ТФА, представленная в 3-х-мерном пространстве, в мембранах ЭР, выделенных из клеток печени здоровых мышей (слева) и опухоли - АКЭ (справа).

Это отличается от типичной реакции опухолевых клеток на различные воздействия, называемой «глухотой». Возможно, это связано с тем, что ТФА является опухолевым промотором. Повышенная чувствительность липидов мембран опухолевых клеток к ТФА может приводить к значительным изменениям в функционировании систем вторичных посредников и их взаимосвязи, которая осуществляется на мембранном уровне.

Для большей наглядности изменения структурных характеристик липидов мембран под действием ТФА представлены в трехмерном пространстве (рис.22). Показано, что полученные поверхности для нормы и опухоли, во-первых, описываются различными уравнениями и качественно отличаются друг от друга. Во-вторых, симметричность данных поверхностей позволяет установить ось симметрии при СМД 10'ь-]0"14 М.

4.4 Действие ТФА на микровязкость липидов различных фракций микросо.мальных мембран клеток Krebs IL

Ранее было показано, что опухолевые клетки, а также клетки здоровых органов после обработки их ТФА содержат не две, как в норме, а три фракции мембран ЭР: гладкую (SR), легкую (LR) и специфическую для опухоли тяжелую (HR) [Pryme, 1996, 1999]. Учитывая это, нами было проведено картирование липидного бислоя мембран лейкозных клеток - L-929, растущих в культуре. С помощью нптроксилытых радикалов I-III, использованных при изучении мембран клеток печени и головного мозга мышей, нами было показано, что три выделенные фракции ЭР клеток L-929 различаются по величине микровязкости различных областей липидов мембран, и в каждой из них значения тс зондов I-11I по мере уменьшения располагаются в ряду: SR >LR>HR.

Нами показано, что фракция SR с наибольшей величиной микровязкости липидов характеризуется и наибольшим колтеством ТСП, а наименее вязкая опухолевая фракция - HR отсутствием низкотемпературных и общего ТСП в липидах, что характерно для мембран опухолевых клеток различи о го происх ожден ия.

Принимая во внимание выявленные различия между фракциями ЭР и нетипичность лейкозных клеток как опухолевых, влияние ТФА было изучено на трансформированных растущих в культуре клетках - Krebs II. Но и в этом случае наибольшие различия по микровязкости различных областей липидов мембран также были отмечены между фракциями SR и HR.

Обнаружено, что обработка клеток Krebs II с помощью ТФА приводила к повышению величины микровязкости (тс зондов 1 и II) различных областей липидов мембран ЭР, особенно выраженное в специфической для опухоли фракции HR, в которой достигалось 3-х кратное увеличение (тс зондов I) в поверхностных слоях липидов (рис.23).

Повышение микровязкости липидов, обнаруженное во фракции HR, характерно, как отмечалось выше, для опухолевых мембран (кроме лейкозных). Дальнейшее повышение величины микровязкости под действием ТФА подтверждает его мембранотропное действие как опухолевого промотора.

"Lc-iOfc

<?e-SO?c

HR..

ie so и w so t° С

Рис. 23 Изменение микровязкости различных областей липидов ЭР мембран, выделенных из обработанных ТФА (S7 HRT) и необработанных (Sa,HR,\) клеток Krebs II: изменение времени вращательной корреляции (тс) зонда I (А) и зонда И (Б).

6Г,

-S0.1-

-т ■ -/0,6 -/о,й ■

40,0

-ю.г -io> -10,6

11 3.2 5,i 5,-f 3,f i/T 4D*'K~

Zi 5,2 3-3 V i/T

У /

л иг.

•аь

-3.S

-Ю.0

№ -il

-HS

-JO.Z

г /

» 20 Ю t'С

V£/ за -П

Рис. 24 ТСП в мембранах ЭР клеток Krebs 11 в координатах Аррениуса для зондов I (слева) и II (справа). Обозначения те .нее, что п на рис. 23.

Изучение 'ГСП в клетках Krebs У/, проведенное нами, показало, что после обработки культуры клеток с помощью ТФА, во-первых, значительное повышение микровязкости в HR-фракции не сопровождается увеличением числа ТСП; во-вторых, понижается температура ТСП в липидах мембран и, в-третьих, происходит сближение качественной картины ТСП между фракциями ЭР.

Необходимо отметить, что в такой сложной гетерогенной системе как клеточная мембрана, так называемый «портрет ТСП» лишен строгого физического смысла и не связан с термодинамическимим параметрами так, как в случае простых систем. Однако, с нашей точки зрения, «портрет ТСП» является своеобразным индикатором процессов, происходящих в липидном бис-лое мембран, и, в данном случае, указывает на дальнейшую опухолевую прогрессию в мембранах под действием опухолевого промотора - ТФА. Как следствие этого, может изменяться функционирование рецепторно-ферментных комплексов, в частности ПКС, учитывая, что на искусственных мембранах показано, что ТФА как активатор фермента также увеличивает формирование гексогональных структур и понижает температуру ТСП [Epand, 1988]. Таким образом, ТФА действует на клетки, растущие в культуре также как \п vitro.

5. Взаимосвязь систем ПОЛ и циклических нуклеотидов на уровне ферментов и рецепторов в клеточных мембранах.

5.1 Влияние параметров ПОЛ на активность АЦ в мембранах клеток печени и мозга после введения АО in vivo.

Взаимосвязь систем ПОЛ и циклических нуклеотидов на мембранном уровне была изучена нами при изменении таких параметров системы ПОЛ, как микровязкость и окисленность липидов, и активность одного из ключевых ферментов циклических нуклеотидов - АЦ путем модификации мембран in vivo - введение животным (крысам) синтетического АО: 4-метил-2,6-дитрет-бутплфенола (ионола) в дозе 20 мг/кг. Ранее было показано, что при внутри-брюшинной инъекции ионола эта доза выводится из организма через 18 часов, сохраняя при этом так называемый эффект «последействия» на антиокислительную активность (АОА) различных органов и липидзависимые ферменты [Бурлакова, 1975; Молочкина, 1991].

Нами показано, что в СМ мозга, выделенных из контрольных животных, активность АЦ значительно выше, чем в ПМ клеток печени, что совпадает с литературными данными. Обнаружено, что после введения ионола (через 18 часов) различие в активности АЦ между мембранами мозга и печени значительно увеличилась, так как в СМ головного мозга она повышалась примерно в 4 раза, а в ПМ печени во столько же раз понижалась (рис.25).

Разнонаправленные изменения активности АЦ в этих мембранах были отмечены нами и при добавлении другого АО - ФК in vitro (см. 4.2). Учитывая, что активность АЦ зависит от концентраций ФЭА и ФС [Ткачук, 1983], мы провели такое сопоставление. Оказалось, что, если базальную активность

данного фермента в контроле в определенной степени можно сопоставить с содержанием этих ФЛ, то в опыте (после действия ионола) такая корреляция не наблюдалась. Было предположено, что столь значительные изменения активности АЦ могут быть обусловлены физико-химическим состоянием ли-пидов мембран, в частности, уровнем ПОЛ и микровязкости. При изучении параметров ПОЛ нами обнаружено, что такие его показатели, как индекс окисленности, показывающий долю ДК, повышался как в мембранах головного мозга (в большей степени), так и печени, а МДА - только в мозге; причем во всех случаях увеличение было примерно 2-х кратным (рис.25). Таким образом, разнонаправленные изменения активности АЦ в мембранах мозга и печени нельзя объяснить влиянием продуктов ПОЛ.

При исследовании микровязкости различных областей липидов мембран с помощью нитроксильных зондов I и II удалось установить, что изменения этого параметра в печени и мозге (через 18 часов после ведения ионола) носят противоположный характер, а именно, в ПМ печени наблюдалось 3-х кратное уменьшение тс зонда I (поверхностные слон липидов) и увеличение тс зонда II, тогда как в СМ мозга, наоборот, повышение тс зонда I и понижение тс зонда II (рис.26). Температурные зависимости изменений тс зондов I и II, представленные в координатах Аррениуса, наглядно демонстрируют, что во-первых, «портрет» ТСП мембран мозга отличается от печени. Во-вторых, более жесткая структура ПМ клеток печени меняется в большей степени.

0.10

контроль 00 опыт □ контроль опыт

печень

мозг

печень

мозг

Рис. 25 Показатели ПОЛ: индекса окисленности (/гзтю) и МДА (нмоль/мг лнпида) в мембранах контрольных и подопытных мышей (через 18 часов после введения ионола).

-100 -

-ЗАО -

V 3.2 3.3 1W3K-1.

** V±.rff*K"

üO

-ЗЛ5

-zss

-365

20 —Г"

tX i—

3,2 J.3

J>< Jr-fO

J u-1

PllC. 26 Изменение времени вращательной корреляции (тс) зондов I (а, в) и II (б, г) в координатах Арреииуса: а, б - в ПМ клеток печени; в, г - в СМ головного мозга крьгс в контроле (1) н опыте (2) - через 18 ч после введения ионола в дозе 20 мг/кг in vivo.

Сопоставление изменений микровязкости поверхностных областей липндов мембран и активности АЦ позволило выявить их однонаправленность. А именно, 4-х кратное уменьшение активности фермента в опыте сопровождается 3-х-кратным понижением тс зонда I в ПМ печени, а столь же значительное возрастание активности АЦ в СМ мозга происходит при увеличении тс зонда 1 на 20%. Одним из вероятных объяснений масштабных, но разнонаправленных изменений активности АЦ при неодинаковых и противоположных изменениях микровязкости липидов мембран может быть различное структурное состояние данного фермента в виде олигомерных комплексов в ПМ клеток печени и в тетрамерной форме в СМ мозга [Rodbell, 1981].

Используя регрессионный анализ была получена экспоненциальная зависимость изменения активности АЦ от величины тс зонда I для мембран печени и мозга в контроле и опыте, которая в обратных координатах преобразуется в прямую (рис.28). Полученная корреляция указывает на взаимосвязь изменений микровязкости поверхностных областей липидов мембран и активности АЦ, что может быть важным для регуляции и согласуется с общими представлениями о взаимосвязи активности интегральных ферментов и вязкостных свойств мембраны [Stubbs,Smith, 1984; Salesse,Gamier, 1984].

Рис. 27 Активность АЦ в контроле и опыте (18 ч после введения ионола в дозе 20 мг/кг) в мембранах клеток печени и мозга.

Рис. 28 Взаимосвязь изменений активности АЦ с микровязкостыо липидов мембран в (а) прямых и (б) двойных обратных координатах

у- -п.34 1.2.x г 0.998 (,У 0.002) (точки 1.2- клетки печени: 3.4 - мозга крыс в контроле (1.3) и опыте (2.4).

Суммируя полученные результаты можно сказать, что после введения ионола in vivo разнонаправленные изменения активности АЦ, коррелирующие с величиной микровязкости поверхностных областей липидов мембран клеток печени и мозга, происходят на фоне интенсификации ПОЛ, особенно выраженной в СМ мозга.

5.2 Влияние ФК и СЖК на активность АЦ и ГЦ в мембранах клеток печени и мозга in vitro.

Взаимосвязь изменений системы ПОЛ и циклических нуклеотидов была изучена при действии ФК и ненасыщенной СЖК на примере олеиновой кислоты на ПМ клеток печени, и СМ головного мозга мышей in vitro. С одной стороны, СЖК являются субстратами и АО ингибиторами окисления, а с

другой - могут непосредственно воздействовать как на мембраны, так и на мембраносвязанные ферменты систем циклических нуклеотидов - АЦ и ГЦ.

Показано, что базальная активность этих ферментов в мембранах мозга более чем в 2 раза больше, чем в печени. При этом активность АЦ примерно в 3 раза превосходит ГЦ, что объясняется прежде всего тем, что мембрано-связанная форма ГЦ составляет лишь часть общего количества этого фермента в клетке, другая находится в цитозольной форме.

Было обнаружено, что добавление ФК к СМ мозга приводила к значительному (примерно в 2,5 раза) снижению активности АЦ и не влияло на активность этого фермента в ПМ печени. В то же время активность ГЦ достоверно повышалась в мембранах клеток мозга и понижалась в печени.

В противоположность действию ФК олеиновая кислота увеличивала активность АЦ в мембранах мозга и понижала ее до нуля в мембранах клеток печени. В то же время в опыте активность ГЦ достоверно уменьшалась в СМ клеток мозга и повышалась в ПМ клеток печени.

Табл. 5 Эффекты ФК и олеиновой кислоты (ОК) на активность АЦ и ГЦ в СМ клеток мозга и ПМ клеток печени крыс in vitro.

Эффектор (Ю-4 М) Активность АЦ в мол е Активность АЦ в нечепп Активность ГЦ в мозге Активность ГЦ в печенн

Контроль 4.99 ± 0,03 2,11 ± 0,04 1,52 ± 0,07 0,72 ± 0,03

ФК 1,81 ±0,06** 2,01 ± 0,08 1,81 ± 0,03* 0,64 ± 0,02*

О К 6,14 ±0,02** 0.00 ** 1,31 ±0,05* 0,95 ± 0,02*

Примечание: достоверность** р< 0,02, * р<0,05 при п=5.

Активность АЦ, нмоль ц-АМФ/мг белка/мин и ГЦ - нмоль ц-ГМФ/мг бслка/'мын.

Таким образом, было установлено, что, во-первых, ФК и ОК противоположным образом влияют на активность каждого из изученных ферментов системы циклических нуклеотидов в мембранах клеток мозга и печени; во-вторых, изменения активностей АЦ и ГЦ между собой как в мембранах печени, так и мозга были также разнонаправленными. В-третьих, если ФК более эффективно воздействовал на активность ферментов (в особенности АЦ) в СМ клеток мозга, то СЖК производила наибольший эффект в печени.

Проведенное нами изучение микровязкости поверхностных областей липпдов мембран с помощью зонда I показало, что при действии ФК происходило уменьшение ее величины (тс) как в СМ мозга, так и ПМ печени (данные не приведены). Иными словами, в этом случае мы не обнаружили взаимосвязи активности ферментов и микровязкости липидов.

Поскольку противоположные изменения активности ферментов не удалось объяснить соответствующими изменениями микровязкости липидов мембран, мы попытались связать их с другим параметром ПОЛ - степенью окисляемости. Величина окисляемости липидов оценивачась как отношение содержания легкоокисляемых ФЛ (ФЭА, ФИ, ФС) к содержанию трудноокис-ляемых (фосфатидилхолин, сфингомиелин, холестерин) с учетом коэффици-

ентов, характеризующих способность каждой фракции липидов к перекисеоб-разованию (Аристархова, 1976).

Показано, что СМ мозга отличаются от ПМ клеток печени содержанием отдельных фракций липидов, выраженным как в процентах от суммарного количества липидов, так и в расчете на 1 мг белка; последнее соотношение коррелирует с активностью мембраносвязанных ферментов (Бурлакова, 1977). Особенно хотелось бы выделить повышенное содержание в мембранах мозга таких ФЛ как ФЭА (почти в 2 раза) и ФС, которые активируют АЦ.

Показано, что величина окисляемости липидов в СМ мозга примерно в 1,5 раза выше, чем в ПМ печени, что совпадает с литературными данными о способности этих мембран к окислению (Birnbaumer, 1973; Mattew, 1981). Возможно, что базальная активность АЦ и ГЦ в определенной степени зависит от величины окисляемости, а именно, чем она больше, тем выше активность ферментов циклических нуклеотидов, то есть в мембранах мозга.

Действие ФК и на липидзавнепмые АЦ и ГЦ также может быть опосредовано системой ПОЛ, в которой эти эффекторы выступают в разных качествах, соответственно как ингибитор и субстрат окисления. Такая точка зрения имеет подтверждение и в работе (Baba. 1981). в которой показано, что ингибитор ПОЛ подавлял активность АЦ до исходного уровня только в мембранах, выделенных из мозга. На основании проведенных нами экспериментов показано, что, во-первых, скорость накопления вторичного продукта ПОЛ -МДА в процессе ферментативной реакции в СМ мозга в 2-3 раза выше, чем в ПМ печени. Во-вторых, ФК значительно подавляет процесс накопления МДА именно в мембранах клеток мозга, в то время как ОК - повышает в мембранах клеток печени (данные не приводя гея). Из этого можно предположить, что перекиси липидов в мембранах мозга выступают в роли активаторов АЦ, а в печени - ингибиторов. Однако, нельзя исключать и непосредственного взаимодействия фермента и эффектора, а также различной чувствительности к ним АЦ, находящейся в печени и головном мозге, как отмечалось выше, в различных структурных состояниях.

5.3 Взаимосвязь изменений микровязкости СМ головного мозга с инактивацией ОПР при действии СЖК и АО in vitro.

Известно, что семейство ОПР сопряжено с АЦ - системой передачи гормонального сигнала внутрь клетки через семейство G-белков (Rodbell, 1980). Значительную функциональную роль в регуляции активности ОПР играют SH- и СООН-группы, находящиеся в центре связывания данных рецепторов, которые подвергаются окислению (Pasternak, 1975). Поэтому физико-химические свойства липидного окружения рецепторов - уровень ПОЛ и микро-вязкость, могут существенно влиять на свойства ОПР, в частности, на их связывающую активность с лигандами. Как было показано ранее, скорость накопления МДА в среде инкубации близка к скорости потери активности рецептором. Были также найдены эффекторы, стабилизирующие связывающую активность высоко-аффинных центров р- и Ô-ОПР с лигандами - это ненасы-

щенные СЖК, в то время как АО проявляли либо слабый эффект - ионол, либо противоположный - ФК (Белоконева, 1991).

Для того, чтобы выяснить роль изменений микровязкости липидов мембран в инактивации рецепторов, нами было исследовано влияние СЖК различной степени ненасыщенности и АО -ионола на СМ, выделенные из головного мозга крыс в тех же концентрациях (104 -10"8 М), в которых они производили стабилизирующий эффект при связывание ц-ОПР с лигандом -антагонистом налаксоном.

ПИ

1_|_

20 «

$9 С.ицн

А Б

Рис. 29 Изменение микровязкости различных областей липидов СМ головного мозга крыс (в относительных единицах-тс/тс0 зондов I (А) и II (Б) в зависимости от времени инкубации (при 37°С) 1 - в контроле и при добавлении различных эффекторов: 2-ионол; 3- пальмитиновая, 4-арахидоновая, 5-линолевая СЖК, 6-ФК.

Показано, что данные эффекторы по-разному влияют на микровякость различных областей липидов мембран (рис.29). А именно, СЖК повышали величину микровязкости в приповерхностных областях липидов (тс зонда II) относительно контроля в различной степени: линолевая - на 20%, арахидоновая и пальмитиновая - на 10%. В противоположность этому ионол понижал, хотя и незначительно (не более, чем на 10%) тс зонда II в процессе инкубации мембран, в то время как ФК оказывал двойственное влияние. В поверхностных слоях липидов (тс зонд I) СЖК, и в наибольшей степени ненасыщенные, также сдерживали падение тс зонда I: линолевая - на 40%, арахидоновая - на 30% и

насыщенная пальмитиновая - менее чем на 20%. Влияние АО было также различно: ионол повышал, а ФК понижал тс зонда I примерно на 10%.

Таким образом, несмотря на видимые различия в характере изменении тс зондов I и II, наибольшее и стабилизирующее влияние на микровязкость различных областей липидов мембран, как и на связывающую активность ОЛР, оказывали ненасыщенные СЖК: линолевая и арахидоновая.

Обнаружено, что качественно вид зависимостей уменьшения величины тс зонда I аналогичен уменьшению уровня связывания налаксона с ц-ОПР в зависимости от времени инкубации, так что количественно их можно описать одноэкспоненциальной функцией. При этом эффекторы, снижающие скорость уменьшения связывания антагониста рецептором, уменьшают и скорость падения величины микровязкости. Уменьшение тс зонда I в контроле и при действии данных эффекторов можно описать с помощью функции:

Хс = т°ехр (~кУ1), где к,- константа скорости уменьшения вязкости.

цепторов. Взаимосвязь констант скорости этих процессов описывается эмпирической формулой: Kin=0,018^K^

Таким образом, изменения микровязкости поверхностных областей липидов мембран головного мозга важны для связывающей активности (i-ОПР с лигандами: понижение микровязкости приводит к инактиваци, а повышение -к стабилизации рецепторов.

6. Влияние гормонов различной природы, активаторов G-белков и нонола на микровязкость липидов ПМ in vitro.

Для того, чтобы выяснить роль изменений микровязкости липидов в механизме действия эффекторов других рецепторных систем, в том числе и вторичных посредников, были изучены полипептидные гормоны - инсулин (IMS)

Рис.30 Корреляция Kin=0.018VKw (r=0693; р<0,05) б логарифмических координатах между константами скоростей падения микровнзкостп липидов (Kv) и инактивации ц-ОПР (К|П), в СМ клеток мозга: 1- контроль, 2- поиол, 3 - пальмитиновая, 4-арахидоновая и 5-линолевая СЖК.

2,0 2fi 2,0-lgyV)

Установлена корреляция межу константами скоростей уменьшения микровязкости липидов мембран (Ку) и константами скоростей инактивации (К]П) мест связывания (/Н]-налаксона на (.1-ОПР в присутствии данных эффекторов. Показано, что снижение величины микровязкости происходит быстрее уменьшения активности ре-

и глюкагон (GLU), действующие через такие мембраносвязанные рецептор-иые системы как тирозинкиназа и АЦ соответственно [Blether, Goldstein, 1976; Gilman, 1987], стимуляторы G-белков - гуаниловые нуклеотиды - Gpp(NH)p и GTP, а также стероидный гормон - простагландин Е2 (PGE2) и жирорастворимый АО - ионол, не имеющие специфических рецепторов в ПМ. С этой целью было исследовано изменение микровязкости поверхностных слоев липи-дов ПМ клеток печени крыс, которые были охарактеризованы по составу ли-пидов, и степени окисленности, которая по критерию Кляйна составляла величину, равную 0,069.

На основании изучения кинетики изменения величины микровязкости -тс зонда I (или обратной ей величины текучести - F по уравнению Фрида F~1/tc) от времени при действии каждого из перечисленных эффекторов показано, что эффект насыщения во всех случаях достигается во временном интервале от 20 до 40 мин (рис.31).

! ОМ INS

1.0 X

X р

(I.:

: х ¡<rsM gti!

ij.i

/Ч—О-Q_

-, 6 5

.4 3

и Л! :0 30 40 51) 0 10 20 30 40 50

время, мин

Рис. 31 Изменение микровязкости - тс зонда I (о-точки. левая шкала) и текучести -1/тс (х-точки, правая шкапа) поверхностных областей липидов ПМ в зависимости от времени инкубации мембран с различными гормонами, стимуляторами й-белков и АО (ионолом).

Установлено, что величина тс зонда I при инкубации с этими эффекторами значительно ниже, чем в контроле (п=4, р<0.05), в процентном отношении результаты представлены в табл. 6. Это говорит о том, что действие данных гормонов, стимуляторов и ионола приводит к уменьшению микровязкости поверхностных областей липидов ПМ. Показано что по степени влияния на микровязкость липидов мембран изученные эффекторы располагаются в следующем ряду: Gpp(NH)p > GTP >PGE2>AO >FNS >GLU.

Учитывая, что лаг-периоды при гормональном воздействии составляют 1-4 мин. в отсутствии гуаниловых нуклеотидов и несколько секунд в присутствии стимулирующих их концентраций [Rodbell 1974; Ciaraldiand, Olefsky, 1979], можно сделать вывод, что изменения микровязкости (или текучести) липидов в поверхностном слое происходят значительно позже (более 20 мин.). Следовательно, вязкостные свойства не могут играть существенной роли в активации соответствующих ферментных комплексов и первичном рецептор-ном акте, но могут влиять на последующих стадиях гормональной индукции.

Для выявления взаимосвязи рецепторных систем через изменение микровязкости липидов мембран было изучено совместное действие данных эффекторов в различных комбинациях. Полученные результаты представлены в правой половине табл.6. Показано, что добавление стимуляторов G-белков (Gpp(NH)p и GTP) после инкубации ПМ с белковыми гормонами (INS и GLU), а также этих гормонов после инкубации с ионолом (АО) увеличивает падение тс зонда I на 10-20%, то есть еще больше уменьшает величину микровязкости липидов.

Табл. 6 Влияние различных эффекторов на микровязкость поверхностных областей липидов плазматических мембран крыс in vitro.

1 -й эффектор уменьшение тс зонда I, % 1-й (инкубация) + 2-ой (инкубация) эффекторы уменьшение те зонда 1, %

контроль 0,00 INS flQ-" M) + G TP(iaJ M) 60,4 ± 3,3

INS, 10'b M 51,1 ±2,6 INS (1 (Г6 M) + Gpp(NH)p (la'M) 66,6 ± 5,5

GLU; Wb M 41,7± 2,5 G LU (la" M) + INS (10'" M) 46.5 ± 4,5

GTP, i a' M 69,7+ 4.3 GLU (1 a" M) + GTP (10'3 M) 60,4 ± 3,3

Gpp(NH)p, 10~4M 81,1+ 3,2 GLU (10~(> M) + Gpp(NH)p (Ior4M) 62.1 ±2,2

PGE2, 10" M 61,7+2,1 АО, 10-" M + INS (10-° M) 34.8 ± 6,3

АО, IGT* M 18,5±0,4 АО, 10-'-' M + GLU (1 a6 M) 30,2 ± 1.7

Показано, что, во-первых, для усиления совместного действия двух эффекторов второй из них должен в большей степени снижать микровязкость липидов, чем первый. Во-вторых, не происходит простого сложения их эффектов: совместное действие при последовательной инкубации с двумя лигандами меньше, чем сумма их эффектов при раздельном добавлении к

мембранам. Это указывает на сложную взаимосвязь между данными рецеп-торными системами на мембранном уровне, на котором липидный бислой и его микровязкость играют роль своеобразной матрицы.

Изучение дозовых зависимостей изменений тс зонда I показало, что GLU достигает максимума, a INS половины максимального эффекта на микровязкость липидов при концентрациях близких к их физиологически эффективным - 10~9 M [Simpson and Gushman, 1986]. Стероидный гормон PGE2 максимально снижал микровязкость липидов при той же концентрации (10"9 М), что на три порядка выше, чем его физиологически значимые дозы - Ю-'3 M [Samuelsson, 1972]. Гуаниловые нуклеотиды - Gpp(NH)p и GTP оказывали максимальный эффект по снижению микровязкости липидов при тех же концентрациях, при которых они активировали АЦ in vitro 10~7- 10"6М.

° и -

2.Û

1.5

1.0

0.5 0.4 IU 0.2

ол Û

G LU

1 О X

О.

о Л р V 0 3 j-

ü.: г

<u i-

""Si G TP %

ч г-'*-*-* -

H О

—' i p

D.'S

j 7r !H h

п.: f—

C'.l U

РОВ,

Ч-

ч/

гН

1(1 i fi>-S uH

iD"'- НГШ 1ГП 1(TB 10'

10"* ИГ6 11Г4

концентрация веществ, M

Рис. 32 Зависимость изменения микровязкости - тс зонда 1 (о-точки, левая шкала) и текучести- 1/тс (х-точки. правая шкала) от концентрации гормональных веществ и АО (нонола).

Таким образом, показано, что те вещества, которые имеют рецепторы в ПМ - это белковые гормоны (GLU, INS) и гуаниловые нуклеотиды Gpp(NH)p и GTP, достигали своего максимального эффекта на микровязкость липндов при своих физиологически активных концентрациях. А вещества, не имеющие рецепторов - не совпадали на несколько порядков: PGE2 - в сторону увеличения, а ионол -уменьшения по сравнению с обычными дозами как АО (104 М).

Для объяснения полученных временных и дозовых зависимостей изменения микровязкости была предложена феноменологическая модель, основанная на линейной взаимосвязи текучести липидов и связывания эффектора на мембране, которая подчиняется следующей схеме:

(1)0+ Р (ОР) = В,

где Q- концентрация свободно-связывающих мест на мембране, Р - концентрация эффектора. К, и К2- константы скорости.

Изменения концентрации комплексов от времени - B(t) описывается кинетикой второго порядка:

(2) dB/dt = ki(P0 -BjCQo-Bj - k2B. где Qo и P0-общая концентрация кажущихся мест связывания и эффектора.

На основании линейной зависимости между текучестью - F(t) и связывания эффектора с мембраной - B(t):

(3) B(t)=bF(t)

и подстановки этого уравнения в (2) было получено уравнение:

(4) dF/dt =k, b f(P,/b -Fo (Qo -Fa)] - k2F, представляющее собой изменения во времени текучести липидов в процессе связывания эффектора с мембраной, которое позволило вычислить кажущиеся константы скорости K|=K|7b и К2, а также кажущееся число мест связывания эффектора на мембране Q0 =bQ0'.

Решение дифференциального уравнения (4) было произведено с помощью компьютерной программы на основе модификации Гилла алгоритма Рунге-Кутта. Путем подстановки в (4) экспериментальных данных по временной и дозовой зависимости F(t) были получены значения кажущихся параметров: константы ассоциации Ka=k]/k2 и мест связывания эффекторов- Q0. Полученные результаты суммированы в таблице 6.

Табл. 6 Кинетические параметры связывания эффекторов с ПМ

клеток печени in vitro.

Эффектор Ka ßf') Qo (M) С(М)

INS 2.3 x 10ö 1,1х ю-7 10"6

GLU 2.3 х 10° 1,1х 10"У

gtp 5.0 х 10- 1,2 х 10° 10"

Gpp(NH)p 1,4 х 10' 6.0х 10"'' 10°

pge2 3,2 x 10 2.2х 10"8 10"*

АО 5,0 х 10 1.6х 10"' 10"у

Примечание-^ Ко и О0- константа ассоциации и количество связывающих мест: С - концентрация эффектора, при которой достигается максимум действия.

Установлено, что значения констант ассоциации данных эффекторов с мембраной располагаются в ряде: Gpp(NH)p>GTP>INS=GLU>PGE2>AO, а по степени убывания связывающих мест в мембране в следующем порядке: GTP >Gpp(NI l)p>AO>INS ^GLU>PGE2. Из этого следует, что гуаниловые нуклео-тиды. и особенно GTP, в наибольшей степени связываются с мембраной, что в первую очередь обусловлено количеством G-белков в ПМ, являющихся их рецепторами. В то же время действие стероидного гормона (PGE2) и ионола, не имеющих белковых рецепторов в мембране, по нашей оценке тоже характеризуется достаточным количеством кажущихся мест связывания с мембраной (Qo), что указывает на наличие «липидных сайтов». Это предположение подтверждается и тем фактом, что величина Q0 для стероидного гормона на порядок ниже, чем у АО - липидного эффектора. Обращает на себя внимание и гот факт, что Ка у них одного порядка. Это свидетельствует в пользу гипотезы о так называемой «липидной рецепции» или наличия «липидных сайтов» в мембране, которых у ионола как липидоподобного вещества их больше.

Проведенное сравнение кинетических параметров с литературными данными, полученными радиоизотопными методами [Gilman, 1987] по связыванию белковых гормонов - инсулина и глюкагона с соответствующими рецепторами, выявило, что определенные нами величины Q0 и Ка на 2-3 порядка больше. Такое же различие с литературными данными [Blecher, Goldstein, 1976] можно отметить и при действии стимуляторов G-белков. Это можно объяснить тем, что гормоны и стимуляторы взаимодействуют не только со своими белковыми рецепторами (специфическое связывание), но и с «липид-ными сайтами». Таким образом, совокупность полученных нами результатов говорит в пользу того, что в ПМ могут существовать так называемые «липид-ные» места связывания эффекторов, которые наряду с белковыми специфическими рецепторами являются мишенью их действия. Можно высказать предположение о том, что в роли таких «липидных центров» могут выступать домены и рафты, в которых способны локализоваться многие белки и рецепторы, участвующие в передаче сигналов в клетке [Pike, 2003]. Кроме этого, в настоящее время известно, что под влиянием лигандов отдельные рафты могут объединяться и в более крупный домен, что усиливает эффект. В частности, такая ситуация может реализовываться и при действии гуаниловых нуклео-тидов - стимуляторов G-белков, что делает их наиболее эффективными по всем изученным кинетическим параметрам.

Список основных сокращении ИКС - протсинкиназа С ПМ - плазматические мембраны

АЦ- аденилатциклаза ЭР - эндоплазматический ретикулум

ГЦ - гуанилатциклаза СМ - синаптические мембраны

01 IP - огпюпдные рецепторы ПОЛ - перекисное окисление липидов

'ГФА - 12-0-тетрадеканоил-форбол-13-ацетат ФЛ - фосфолипиды ДДФ - 4-а-форбол-12,13-дидеканоат СЖК - свободные жирные кислоты

ТФ - а-токоферол АК - арахидоновая кислота

ФК- феиозан калия ДК - диеновые коныогаты

АО - аитиок'сидаит(ы) ТСП - термоиндуцированные структурные переходы

Основные выводы

1. Установлено, что ИКС является пероксилнпидзависимым ферментом:

- продукты окисления эффекторов - ФЛ и АК действуют как ингибиторы активности фермента, проявляющие положительную кинетическую кооперативность и высокое сродство к ПКС;

- взаимодействие между окисленными ФЛ и АК по кинетическому критерию носит антагонистический характер;

- на основании расчета кинетических констант и параметров показано, что эффективность реакции фосфорилирования гистона Н-1 уменьшается при небольших степенях окисления фосфатиднлсерина - основного эффектора ПКС.

2. Обнаружена бимодальная зависимость изменения активности ПКС от АО в широком дозовом диапазоне с максимумами при больших и сверхмалых концентрациях: ТФ (10"' -10° М и 10'14 М) как ингибитора и ФК (10"4 -1СГ7 М и 10'18-10"19 М) как суперактиватора фермента в мембранах нормальных (1\$МС) и опухолевых клеток, растущих в культуре. Показано сложение эффектов ФК и ТФА при совместном их действии на активность ПКС в мембранах опухолевых клеток, приводящее к повышенной активации фермента.

3. Предложена кинетическая схема бимодального действия ТФ на активность ПКС и произведена ее идентификация с 98% аппроксимацией экспериментальных данных.

4. Обнаружена однотипная зависимость изменения микровязкости различных областей липидов мембран (ПМ, ЭР, СМ) клеток печени и мозга при действии эффекторов ПКС в широком диапазоне концентраций:

- уменьшение микровязкости глубоколежащих и повышение жесткости поверхностных областей липидов клеточных мембран при действии ТФА; неактивный аналог - ДДФ неэффективен.

- стадийное увеличение микровязкости гидрофобных и жесткости поверхностных областей липидов ПМ и ЭР (полимодальная зависимость) при действии ТФ, выявлена роль полярности растворителя для проявления эффектов ТФ при СМД:

- показано, что различные концентрации ТФ (104 -10"18 М) вызывают появление дополнительных 'ГСП в липндах мембран (ПМ, ЭР) по сравнению с контролем в интервале физиологических температур.

5. Показано действие ТФА в широком диапазоне концентраций как опухолевого промотора на клеточные мембраны и обнаружено:

- однонаправленные изменения микровязкостн определенных областей липидов (тсзондов I и II) клеточных мембран (ПМ, ЭР, СМ) печени и мозга под влиянием ТФА, характерные для опухолевых клеток; пролонгированное повышение микровязкости поверхностных областей липидов мембран при неоднократных воздействиях ТФА в СМД (10"14 М);

- высокая чувствительность опухолевых (АКЭ) мембран к действию ГФА, особенно при СМД;

- структурные изменения в липидах мембран АКЭ описываются в трехмерном пространстве иными закономерностями, чем в норме; повышение микровязкости липидов ЭР мембран в опухолевой фракции (HR) и нивелирование различий по ТСП между фракциями ЭР при действии ТФА на культуру трансформированных клеток Krebs 11.

6. Показано, что действие синтетических АО: водорастворимого ФК

in vitro и жирорастворимого - понола in vivo приводит к разнонаправленным изменениям активности ферментов систем циклических нуклеотидов - АЦ и ГЦ в мембранах клеток печени и мозга.

7. Установлена корреляция изменения структурных характеристик поверхностных областей липидов мембран с активностью ферментов систем вторичных посредников и рецепторов под действием АО и СЖК:

- жесткости липидов ПМ и ЭР с активностью ПКС при действии ТФ in vitro;

- микровязкости липидов ПМ клеток печени и СМ головного мозга (крыс) с активностью АЦ при действии ионола in vivo;

- микровязкости липидов СМ головного мозга (крыс) и связывающей активности ОПР при действии ненасыщенных СЖК in vitro.

8. Обнаружено, что действие различных гормонов: белковых (инсулина и глюкагона) и стероидного (простагландина Е2), стимуляторов G-белков (гуаниновых нуклеотидов), а также ионола на мембраны in vifro характеризуются однотипными изменениями микровязкости липидов ПМ независимо от наличия специфических рецепторов. Показано, что гуаниловые нуклеотиды в наибольшей степени уменьшают микровязкость поверхностных областей липидов мембран и имеют наивысшие показатели кажущихся мест связывания и константы ассоциации.

Список научных трудов, опубликованных по теме диссертации

1. Мальцева ЕЛ., Бурлакова Е.Б. Различие в ответе мембран клеток мозга и печени на действие антиоксидаита и жирной кислоты in vitro (по изменению активности циклаз и вязкости). // Биологические мембраны. 1986. Т.З. N8. С.773-780.

2. .Ylal'tscva E.L.. Kumakova N.V., Burlakova Е.В., Pal'mina N.P. Modification of the information signal at the protein kinase С level by peroxidation products in vitro.

// Studia Biophysica.1989. T.I32. N1-2. P.69-76.

3. Мальцева E.L.. Курнакова H.B., Бурлакова Е.Б., Пальмина Н.П. Кинетическая коопера-гивпость при ингибнроваиии активности протеиикииазы С диеновыми коиъюгатами из фосфолппидоп и арахпдоновой кислоты in vitro. // Биохимия. 1990. Т.55. N3, С.471-480.

4. Maltscva E.L., Knrnakova N.V.. Burlakova Е.В., Patmina N.P. Kinetic cooperativity in the inhibition of the activity of protein kinase with diene conjugates from phospholipids and arachidonic acid in vitro. //'Biokhimiya. 1990. V.55. N3. P. 348-354.

5. Burlakova E.B.. Palmina N.P., Maltscva E.L. Pliysico-Chemical System Regulating Lipid Peroxidation in Biomembranes during Tumor Growth. // In: Membrane Lipid Oxidation III. 1991. / Ed. C. Vigo-Pcriley. Boca-Raton-Ann Arbor-Boston. CRC Press Inc. P. 209-238.

6. Пальмина Н.П., Богданова Н.Г., Мальцева ЕЛ. Влияние форболовых эфиров на микровязкость липидпоп компоненты ПМ клеток печени и мозга мышей. // Биологические мембраны. 1991. Т.8. N11. С. 1J 47-1149.

7. Мальцева ЕЛ., Белоконева О.С., Зайцев С.В.. Варфоломеев С.Д. Роль изменения микровязкости СМ в процессе инактивации связывания лигапдов с ОПР мембран головного мозга крыс. // Биологические мембраны. 1991. Т.8. N8. С.830-836.

8 Maltseva E.L., Palmina N.P.. Pryme Y.F. The mapping of three subfraetions of ER

membranes isolated from L-929 cells by the use of spin-probes. //Molecular and.Celllular Biochemistry. 1991.V. 106. P. 49-54.

9. Maltseva E.L.. Palmina N.P., Pryme Y.F. The effect of a phorbol ester on lipid micro-viscosity of two endoplasmic reticulum membrane fractions isolated from Krebs II ascite cells. // Journal of Cellular Biochemistry. 1991. V.46. N3. P. 260-265.

10. Maltseva E.L., Kumakova N.V., Palmina N.P., Burlakova E.B. Kinetic behavior of protein kinase С as dependent on the extent of effecter oxidation. // Journal of Chemical and Biochemical Kinetics. 1991. V.I. N2. P. 93-109.

11. Pal'minaN.P.. Mal'tscva E.L., Burlakova E.B. Studies on the interaction between phospholipids and membrane-bound enzymes. Kinetic properties of glucose-6-phosphatase in nuclei of hepatic and tumor cells.//Journal of Chemical and Biochemical Kinetics.1991 V.l.N2.P.47-57.

12. Belokoneva O.V., MaFtscva E.L., Pal'mina N.P., Zaitsev S.V. Physicochemical pattern of spontaneous loss of binding activity by the opioid receptors of rat brain membranes. // Journal of Chemical and Biochemical Kinetics. 1992. V.2. N3. P. 183-192.

13. Пальмина Н.П., Богданова Н.Г., Мальцева ЕЛ.. Пынзарь Е.И. Форболовые зфиры -модификаторы структуры мембран//Бнологические мембраны. 1992.T.9.N8.C.810-820.

14. Мальцева ЕЛ.., Пальмина Н.П. Изменение вязкостных характеристик липидов мозга мышей под действием форболовых эфпров с использованием доксильных зондов. // Биологические мембраны. 1992. Т.9. К110-11. С. 1023-1025.

15. Мальцева ЕЛ.. Курнакова Н.В.. Пальмина Н.П. Различие в действии большой и сверхмалой доз а-токоферола на ПКС по кинетическим параметрам субстратной зависимости. // Биологические мембраны. 1992. Т..9. N 10-11. С. 1028-1030.

16. Palmina N.P., Bogdanova N.G., Maltseva E.L.. Pinzar" E.I. Phorbol esters as modifiers of structure of biological membranes. // Biological Membranes. 1993. V.6. N8. P. 1077-1092.

17. Maltseva E.L., Palmina N.P. A study of the effect of phorbol esters on lipid mieroviscositv of cell membranes isolated from mouse brain using doxy] spin-probes. // Biological Membranes. 1992. V.9. N10-11. P.1318-1320.

18. Mal'tseva E.L., PaPmina N.P. Effect of high and ultra low doses of «-tocopherol on the kinetic parameters of PKC. //Biological Membranes. 1992.V.9.N 10-11 .P. 1324-1326.

19. Белоконева O.C., Мальцева ЕЛ., Зайцев С.В.. Пальмина Н.П. Инактивация связывания налаксона с оппоидными рецепторами мембран головного мозга крыс. // Биохимия. 1993. Т.58. N12. С. 1945-1958.

20. Zlatanov I., Maltseva Е., Borovok N.. Spassov V. Effect of insulin and glucagon on the mobility of ESR-probes incorporated in rat liver plasma membranes. // International Journal of Biochemistry. 1993. V.25. N7. P. 971-977.

21. Мальцева ЕЛ., Боскобойнпк Д. Особенности активации ПКС в нормальных и опухолевых клетках синтетическим антиокепдантом - ФК. // В Со: Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации. П/ред А.А. Карелина. Изд-во «Инженер». Москва. 1993. С.45-47.

22. Мальцева ЕЛ., Златанов И., Боровок Н.В. Активность аденплатциклазы. вязкость различных областей липидов и степень окнслениости мембран мозга и печени после введения понола. // В Сб.: Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации. П/ред А.А. Карелина. Изд-во «Инженер». Москва. 1993. С. 47-50.

23. Пальмина Н.П., Мальцева ЕЛ., Курнакова Н.В.. Бурлакова Е.В. Влияние ТФ

в широком спектре концентрации на активность ПКС. Связь с пролиферацией и опухолевым ростом. // Биохимия. 1994. "Г.59. N2. С. 193-200.

24. Pal'mina N.P., Mal'tscva E.L., Kumakova N.V., Burlakova E.B. Effect of a-tocopherol in a wide concentration range (10"17 - 10"2 M) on protein kinase С activity.// Biokhimiya. 1994. V.59. N 2. P. 135-139.

25. Мальцева Е.Л., Боровок 11.В., Златанов И. Взаимосвязь изменений вязкости и степени окислениостп лигшдов с активностью аденплатциклазы в плазматических мембранах клеток печени и мозг а после введения антиоксиданта. // Биологические мембраны. 1995. Т. 12. N6. С.591-598.

26. Пальмина Н.П.. Мальцева Е.Л.. Бурлакова Е.Б. Протеинкпиаза С - пероксилипид-зависимый фермент. // Химическая физика. 1995. Т. 14. N11. С.47-60.

27. Palmina N.P.. Maltscva E.L., Burlakova E.B. Protein kinase С - a peroxyl-lipid-dependent enzyme. // Physical Reports. 1995. V.14. N11. P. 1753-1767.

28. Maltscva E.L., Borovok N.V.. Zlatanov 1. The relation between the changes in viscosity.

lipid peroxidation indices and adenylate cyclase activity in plasma membranes of liver and brain cells alter injection of antioxidant. // Membrane Cell Biology.l996.V.9. N6. P.621-630.

29. Mal'tscva E.L. The role of lipid peroxidation products in the regulation of protein kinase С activity in vitro. // Advances of Experimental Medicine and Biology. 1997. N400. P.339-348.

30. Mal'tscva E.L. Arachidonic acid and phospholipids oxidation products as the regulators of PRC activity in vitro. // Prostaglandins and other lipid mediators. 1997.V.57.N2. P.261-262.

31. Мальцева Е.Л., Пальмина Н.П.. Бурлакова Е.Б. Природный (а-ТФ) и синтетический (калиевая соль фенозана) АО как регуляторы активности ИКС в широком диапазоне концентраций (Ю-1 - 10"2" М). // Биологические мембраны. 1998. Т.15. N2. С. 199-212.

32. Maltscva E.L., Palmina N.P.. Burlakova E.B. Natural (a-tocopherol) and synthetic (phenozan potassium salt) antioxidants regulate the protein kinase С activity in a broad concentration range (10~l - I0*:o M) // Membrane Cell Biology. 1998. V.12. N2. P.251-268.

33. Пальмина Н.П.. Мальцева Е.Л.. Пыизарь Е.И .Бурлакова Е.Б. Модификация активности ПКС лнгаидамн в СМД. Роль ПКСи ее эффекторов в процессах пероксидиого окисления. // Российский химический журнал. 1999. Т. 28. С.55-63.

34. Mal'tscva E.L., Pal'mina N.P., Burlakova E.B. The effect of ultra low doses of antioxidants on the enzyme activity - protein kinase C. // Proceedings of G.I.R.I. Meeting. Brussels. Belgium. 2000. P. C. 1-14.

35. Maltscva E.L.. Zlatanov 1, Spassov V. The influence of a number of hormones and effectors on lipid microviscositv of liver plasma membranes. // Chemistry and Physics of Lipids. 2001. V. N2. P. 114-115.

36. Maltscva E.L., Palmina N.P., Burlakova E.B. Lipid peroxidation products inhibit PKC activity: kinetic analysis. // Chemistry and Physics of Lipids. 2002. V.l 18. N1-2. P. 100-101.

36. Бурлакова Е.Б.. Конрадов A.A., Мальцева ЕЛ. Действие СМД биологически активных веществ и нпзконмтенсивиых физических факторов. // Химическая физика. 2003. Т.22. N2. С. 21-40.

38. Мальцева ЕЛ., Пальмина Н.П.// Действие форболового эфира в широком диапазоне концентраций на структуру лигшдов микросомальных мембран опухолевых клеток in vitro // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.23. N3. С.301-305.

39 Белов В.В., Мальцева Е.Л., Пальмина Н.П. Влияние а-ТФ в широком спектре концентраций на структурные характеристики мембран ЭР клеток печени мышей in vitro. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.23. N3. С. 306-309.

40. Мальцева Е.Л., Гуревич К.Г.. Пальмина Н.П. Возможный механизм бимодального действия а-токоферола на активность ПК С in vitro /7 Вопросы биологической, меди цпиской и фармацевтической химии. 2003. N4. С.44-48.

41. Burlakova Е.В., Konradov A. A. and Maltscva E.L. Effect of supersmall doses of biologically active substances and low-intensity physical factors //Journal of Advances in Chemical Physics. 2003. V.2. N2. P.140-162.

42. MaPtseva E.L. The changes of lipid oxidation, microviscosity and adenylate cyclase activity in liver and brain plasma membranes induced by ionol in vivo // Chemistrv and Phvsics of Lipids. 2004. V. 130. NI. P. 54-55.

43. Пальмина Н.П., Киедова JI.В., Майкова Т.В., Мальцева Е.Л., Белов В.В., Жерновков

B.Е. Действие биологически активных веществ в сверхнизких концентрациях на физико-химические сво)"1ства мембран in vitro. //Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2004. Т.4. С. 31-37.

44. Belokoneva O.S., Satake II., Mal'tseva E.L., PaPmina N.P., Villegas Т., NakajimaT.. Corzo G. Preformation of phospholipids membranes by the action of two hemolytic ar achnid peptides of different size // Biochimica et Biophysica Acta. 2004. V. 1664. N2. P. 182-188.

45. Белов B.B., Мальцева Е.Л., Пальмина Н.П.. Бурлакова Е.Б. Роль полярпости растворителя в механизме действия биологически активных веществ в СМД/У Доклады Академии Наук. 2004. Т.399. N4. С. 548-550.

46. Бурлакова Е.Б., Конрадов А.А.. Мальцева ЕЛ. «Сверхслабые воздействия химических соединений и физических факторов на биосистсмы »//Биофизика. 2004. Т.49. N3.

C. 551-564.

47. Belov V.V., Mal'tseva E.L.. PaPmina N.P.. Burlakova E.B. The role of solvent polarity in the mechanism of action of biologically active compounds at ultralow concentrations

// Doklady Biochemistry and Biophysics. 2004. V.399. P.362-364.

48. Burlakova E.B., Konradov A.A., and Maltseva E.L. Effect of extremely weak chemical and physical stimuli on biological systems // Biofizika. 2004. V. 49. N3. P.522-534.

49. Mal'tseva E.L.. Pynzar Е.1., PaPmina N.P. Lipid microviscosity and related peroxidation in tumor (EAC) membranes treated by phorbol ester an a wide range of concentration // Chemistry and Physics of Lipids. 2005. V.136. N2. P. 139-140.

50. Palmina N.P., Belov V.V., Maltseva E.L. Modification of microsomal lipid domains by a-tochopherol in a wide concentration range in vitro // Chemistry and Physics of Lipids. 2005. V.136. N 2. P. 141-142.

51. Мальцева ЕЛ. Спиновые зонды в изучении биологических мембран // В Со: Применение электронного парамагнитного резонанса для исследования биологических систем. 2005. П/ред Коварского А.Л. Москва. МАКС Пресс. С.102-121.

52. Мальцева ЕЛ., Белов В.В., Носков В.Н., Пальмина I I.П. «Действие 2.5-дпфеипд-1,3-оксазола и его производного - йод-метилата на вязкость липпдов микросомальных мембран клеток печени мышеи in vitro» // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2005. Т. 2. С. 31-36.

53. Бурлакова Е.Б., Конрадов А.А.. Мальцева Е.Л. Действие СМД биологически активных веществ и низкоинтеиенвных физических факторов //В Со: Проблемы регуляции в биологических системах. 2006. П/ Ред. Рубина А.Б. Москва-Ижевск:11ИЦ Регулярная и хаотическая динамика». С.390-424.

54. Palmina N.P., Belov V.V., Maltseva E.L. Modification of lipid domains in liver plasmatic membranes by a-tocopherol in a wide concentration range in vitro//Chemistry and Physics of Lipids. 2007. V. 149 (Suppl.). P. 37-38.

55. Mal'tseva E.L.,_Belokoneva O.S. The role of lipid microviscosity changes in inaclivalion of the opioid receptors of brain synaptic membranes // Chemistry and Physics of Lipids. 2007. V. 149 (Suppl.). P.33-34.

56. Belov V.V.. Mal'tseva E.L., PaPmina N.P., Burlakova E.B. The role of solvent polarity in the mechanism of action of biologically active compounds at ultra low concentrations /7 In: New aspects of Biochemical Physics. Pure and Applied Science ./ Eds.Varfolomeev S.D., Burlakova E.B., Popov A.A.. Zaikov G.E. Nova Science Publishers Inc. New York. 2007. P. 11-18.

57. Burlakova E.B., Konradov A.A.. MaTlseva E.L. The effect of ultra low doses of biologically active substances and low rate physical factors // In: Life and Mind - in search of physic-cal basis. Paradoxical observations./F.d. Savva S. Trafford Publishing.USA. 2007. P.79-113.

58. Белов В.В., Мальцева ЕЛ.. Пал ьмм па Н.П. Действие сх-ТФ в широком cneicrpe кон-цен грации на структуру микросомальных мембран // Бпофнзика.2007.Т.52.Ж.С.75-83.

59. Mal'tseva E.L., Belov V.V., РаГпипа N.P., Burlakova Е.В. An influence of ex-tocopherol on the membrane lipids depending on the solvent polarity. Ultra-Low Doses-effects. //Chemistry and Physics of Lipids. 2008.V.154. P. 26-27.

60. Пальмина I I.П.. Белов В.В., Жерновков В.Е.. Мальцева ЕЛ. О механизмах действия биологически активных веществ в сверхнизких концентрациях //

В Сб.: Состояние воды в биологических и модельных системах. Из-во Тверской медицинской академии. Тверь. 2008. С. 151-158.

61. Пальмина II.П.. Белов В.В.. Мальцева ЕЛ. Структурные изменения влипидах

ИМ. индуцированные а-ТФ. ингибитором ИКС // В Сб.: Рецепция и внутриклеточная сигнализация. П/ред. Зинченко В.П., Колесникова С.С., Бережнова А.В. Пушимо. Пн-т Биофизики клетки. 2009. С.90-94.

62. E.L.Martscva, K.G. Gurevich, N.P. PaTmina The effects of a-tocopherol at the physiological and ultra-low concentrations on the activity of protein kinase С in vitro. // In: Handbook of Chemistry. Biochemistry and Biology: New Frontiers. Nova Science Publishers Inc. New York. 2010. CIl 9. P. 81-89.

63. E.L. Maltseva. V.V. Belov, N.P. Palmina The changes of lipid microviscosity and rigidity in the different regions of microsomal membranes as affected oxazoles in vitro. Chemistry and Physics ofLipids. 2010. V. 163. P. 20-21.

64. E.L.Mal'tseva, K.G. Gurevich, N.P. Pal'mina. A kinetic approach to explain the effects of a-tocopherol at the physiological and ultra-low concentrations on the activity of protein kinase C." Oxidation Communications. 2010. N3. P. 524-532.

65. V.V. Belov. E.L. Maltseva. N.P. Palmina. A-tocopherol as modifier of the lipid structure of plasma membranes in vitro in a wide range of concentrations studied by spin-probes. In: Chemical Reactions an Gas, Liquid and Solid Phases. Synthesis, Properties and Application. Nova Science Publishers Inc. New York. 2011. Ch. 4. P. 29-43.

Список тезисов и трудов конференций, симпозиумов и Конгрессов

]. Мальцева E.JI. Активность цикл аз и микровязкость клеток мозга и печени после действия АО и СЖК in vitro /У Груды 4-ой Всесоюзной Конференции «Биология клетки,,.. ТГУ. Тбилиси. 1985. С. 417-4*19.

2. Боровок Н.В.. Мальцева ЕЛ. Влияние ионола на состав липидов и вязкость плазматических мембран клеток печени и мозга мышей in vivo // Труды 4-ой Всесоюзной Конференции «Биология клетки». ТГУ. Тбилиси. 1985. С.416-418.

3. Мальцева ЕЛ., Курнакова Н.В. Влияние липидов различной степени окисленности на активность протепнкпиазы С из сердца кролика//Труды 5-ой Всесоюзной конференции «Биология клетки». ТГУ. Тбилиси. 1987. С.518-519.

4. MaPlseva E.L., Burlakova Е.В. The difference in brain and liver cells membrane response to antioxidant and fatly acid effects in vitro // Book of abstracts of International Symposium "Membrane lipids-melabolism and organization". Vama. Bulgaria. 1987. P. 43.

5. Курнакова H.B., Мальцева ЕЛ., Бурлакова Е.Б. Влияние степени окисленности липидов па активность активность протепнкпназы С in vitro. // Тезисы докладов Всесоюзного Симпозиума по биохимии липидов. Алма-Ата. 1987. С. 193.

6. Мальцева ЕЛ. Состояние липидов и активность АЦ в мембранах клеток мозга и печени после действия антноксидапта // Тезисы докладов Всесоюзного Симпозиума по биохимии липидов. Алма-Ата. 1987. С.54.

7. Mal'tseva E.L., PaFmina N.P., Pryme Y. The mapping of different microsomal membranes from L-cells with spin-probe technique //Book of absr.6lh СМЕЛ Symp.ESR Spectroscopy in Biochemistry. Molecular Biology& Medicine. Smolcnia Casle. Czechoslovakia. 1988. P.37.

8. MaPtseva E.L., Kumakova N.V.. Burlakova E.B., PaPmina N.P. Modification of the

information signal at PKC by peroxidation products in vitro // Book of abstracts of СМЕЛ Conference on Bioelectronics. Frankfurt (Oder). Gcmiany. 1988. P. 19

9. Мальцева E.JI., Злаганов И., Боровок Н.В. Антиоксиданты как модификаторы актив-

ности аденилатцнклазы и структуры плазматических мембран in vivo и in vitro. // Сб. тезисов доicn. HI Всесоюзн. С'имп. «Биоантиоксидант». Москва. 1989.Т. С.71-72.

10. Мальцева е.л., Курнакова Н.В., Пальмина Н.П., Бурлакова Е.Б. Модификация активности ИКС продуктами ПОЛ in vitro Н Сб. тезисов докладов Всесоюзн. Симпо зиума «Биохимия рецепторных систем». Таллинн. Эстония. 1990. С.38-39.

11. MaPtseva E.L., Kumakova N.V.f PaPmina N.P., Burlakova E.B. Modification of PKC activity by lipid peroxidation products and antioxidants // Book of abstracts of 20lh FEBS Meeting. Budapest. Hungary. 1990. P.43.

12. MaPtseva E.L., PaPmina N.P., Pryme 1. Phorbol esters change the structure of the different microsomal membrane fractions in cultured tumor cells // Book of abstracts of 2nd Soviet-Spanish Symposium on Physico-Chemical Biology. Kiev. 1990. C.23.

13. Богданова Н.Г.. Мальцева Е.Л., Пальмина Н.П. Модификация микровязкости лиии-дов биологических мембран форболовыми эфпрами/7 Сб.тезисов докладов 8-ii Всесоюзн. Конф. «Магнитный резонанс в биологии и медицине». Звенигород. 1990.С.86.

14. Мальцева е.л.. Пальмина Н.П.. Прайм Я.Ф. Спиновые зонды в изучении фракции микроеомальиых мембран опухолевых клеток при действии форболовых эфиров /У Сб. тезисов докладов 8-ой Всесоюзн. Конф. «Магнитный резонанс в биологии медицине». Звенигород. 1990. С.86.

15. Мальцева е.л., Пальмина Н.П., Прайм Я. Спиновые зонды в изучении структуры бномембран после действия форболовых эфиров // Сб. тезисов докладов Междунар. Конференции «Мембранная биофизика». Каунас. Литва. 1991 .С'. 15.

16. Mal'tseva e.L., Kumakova N.V., PaPmina N.P. Arachidonic acid and phospholipids peroxidation products: a role in the regulation of PKC in vitro // Book of abstr.8'1, International Congress on Prostaglandins and Related Compounds. Montreal. Canada. 1992.P.134.

17. MaPtseva E.L. Lipid peroxidation products as modifiers of PKC activity: kinetics in vitro // Book of abstracts of 22th FEBS Meeting. Stockholm. Swcedcn. 1993. P. 153.

18. Mal'tseva E.L., Kumakova N.V., PaPmina N.P., Burlakova E.B. The role of lipid peroxidation products in the regulation of PKC activity // Book of abstracts of 1 llh International Biophysics Congress. Budapest. Hungary. 1993. P. 123.

19. MaPtseva E.L., Kumakova N.V., PaPmina N.P.. Burlakova E.B. LPO products in the regulation of PKC activity in vitro // Book of abstracts of 34lh International Conference on Biochemistry of Lipids. Noodvvijkerhout. Netherland. 1993. P. 107.

20. MaPtseva e'.L., Kumakova N.V., Boscoboinik D.. PaPmina N.P.. Burlakova E.B. Effect of natural and synthetic antioxidants at ultra low concentration on PKC activity in normal and tumor cell cultures // Book of abstracts of 2nd International Congress on Ultra Low Doses. Bordeaux. France. 1993. P.26.

21. PaPmina N.P., MaPtseva e.l., Bogdanova N.G.. Pynzar E.l. Ultra low doses of phorbol ester can modify the structure of biological membranes /7 Book of abstracts of 2nd International Congress on Ultra Low Doses. Bordeaux. France. 1993. P. 19.

22. MaPtseva E.L. The role of lipid peroxidation products in the regulation of PKC activ ity // Book of abstracts of 3rd Intern. Conference "Eicosanoids and other Bioactive Lipids in Cancer, lnflamalion and Radiation Injury". Washington. USA. 1993. P.194.

23. Mal'tscva E.L., Kurnakova N.V., Pal'mina N.P. Effect of hydroperoxides of arachidonic acid in combination with phospholipids on protein kinase С activity in vitro. // Book of abstr. of 9lh Intern. Conference on Prostaglandins and Related Compounds". Florence. Italy. 1994. P.87.

24. Mal'tscva E.L.. Kurnakova N.V.. Pal'mina N.P. The effect of hydroperoxides of lipids on PKC activity in vitro //Book of abstracts of 35lh Intern. Conference on the Biochemistry of Lipids. Aberdeen. Scotland. 1994. P.23.

25. Mal'tscva E.L. Arachidonic acid and phospholipids oxidation products as the inhibitors of PKC activity //' Book of abstracts of 5lh International Congress on PAF and related lipid mediators. Berlin. Germany. 1995. P.I 13.

26. Mal'tscva E.L. Regulation of PKC activity by lipid peroxidation products. //Book of abstracts of I6'1' International Cancer Congress. New Delhi. India. 1994. P. 121.

27. Mal'tscva E.L. Arachidonic acid and phospholipids as the regulators of protein kinase С activity // lsl European Congress on Pharmacology; Milan, Italy. 1995. P. 52.

28. Mal'tscva E.L. The effect of oxidized phospholipids on the substrate dependence of PKC activity in vitro: kinetic analysis // Book of abstracts of 4lb Intern. Conference on the Essential Fatty Acids. Edinburg, Scotland. 1997. P. 261.

29. Mal'tscva E.L.. Zlatanov 1. Effect of insulin and glucagons on the lipid microviscosity of liver plasma membranes // Book of abstracts of 38lh International Conference on Biochemistry of Lipids. Assisi. Italy. 1997. P.25.

30. Мальцева E..1. Папьмипа И.П. Действие форболового эфира в широком спектре концентрации (10^-10° М) на структуру лппидной компоненты мембран ЭР опухолевых клеток //Сб. тез. докл. 5-ой Междунар.конф.«Биоантиоксндант».Москва.1998. С.149-150.

3 1. Mal'tscva E.L. Kinetic analysis of inhibition oí" PKC activity by LPO // Book of abstracts of International Symposium "'Anno 2000: a lipid milestone". Utrecht. Netherlands. 2000. P.56.

32. Mal'tscva E.L.. Pal'mina N.P., Burlakova E.B. The effect of ultra low doses of antioxidants on the enzyme activity - protein kinase С // Proceedings of G.I.R.I. Meeting. Brussels. Belgium. 2000. P. C.3. 1-14!

33. Мальцева E.JI. Применение метода спинового зонда для изучения действия форболового :)фира в широком диапазоне концентрации на микросомальные мембраны опухолевых клеток // Сборник тезисов докладов 11-ой Междунаодной. Конференции «Магнитный резонанс в химии и биологии», Звенигород. 2001. С. 94-95.

34. Mal'tscva E.L.. Gurcvich K.G.. Pal'mina N.P. Natural (a-tocopherol) and synthetic (phenozan K) antioxidants regulate PKC activity in a wide concentration range // Book of abstracts of 14lh International Symposium on Drug Affecting Lipid Metabolism. New York, USA, 2001. P.76.

35. Белов В.В.. Mishalle Т.. Мальцева EJL, Пальмина Н.Г1. Влияние а-токоферола в широком спектре концентраций на структурные характеристики гидрофобных областей ли-ппдиого бпелоя мембран клеток печени мышей in vitro. // Сборник тезисов докладов б"011 Международной конференции «Бпоантиоксидант». 2002. С. 658.

36. Mal'tscva E.L. The effect of oxidized phospholipids and arachidonic acid on PKC activity in vitro:kinclic analysis//Book of abstracts of 5' ISSFAL Congress. Montreal. Canada.2002.P.165.

37. Mal'tscva E.L.. Pal'mina N.P., Gurevich G. Bimodal type of regulation of PKC activity by antioxidants down to ultra-low doses". // Abstracts of 2" International Conference "Non-linear dosc-rcsponsc relationships in Biology: Toxicology and Medicine; Amherst. USA. 2002. P. 25.

38. Mal'tscva E.L.. Pal'mina N.P.. Burlakova E.B. LPO products inhibit PKC activity: kinetic analysis // Book of abstr. 8lh Intern. Congress on Phospholipids. Vienna. Austria. 2002. P.47.

39. Mal'tscva E.I... Zlatanov I., Spassov V. ESR method applicated to study the effect of hormones and modulators on the lipid microviscosity of plasma membranes in vitro. // Book of abstr. Intern. Symp."Lipids& Bioinembranes: New Technologie". Davos.Switzerland.2002.P.37.

40. Мальцева Е.Л., Пальмина Н.П. Действие форболового эфира в диапазоне концентраций 10° - Ю"""1 М на микросомальные мембраны опухолевых юге ток in vitro. // Тезисы докл. 111 Между|iap. Сими. «Механизмы действия сверхмалых доз». Москва. 2002. С.21.

41. Белов В.В., Мальцева ЕЛ., Пальмина И.П. Влияние а-токоферола в широком спектре концентраций на структурные характеристики липидного бислоя мембран эндоплазмати-ческого ретикулума клеток печени мышей in vitro // Т езисы докладов 111 Междулар. Симпозиум «Механизмы действия сверхмалых доз». Москва. 2002. С. 7.

42. Mal'tseva E.L. Lipid peroxidation microviscosity and adenylate cyclase activity in plasma membranes after injection of antioxidant// Book of abstracts of 44lh Intern. Conference on Biosciences of Lipids. Keble College. Oxford. UK. 2003. P. 17.

43. Mal'tseva E.L. ESR method applicated to study the effect of hormones and modulators on the lipid microviscosity of plasma membranes // Book of abstracts of 8th Intern. Summer School on Biophysics '"Supramolacular Structure and Function". Rovinj. Croatia. 2003. P.67.

44. Mal'tseva E.L.. Pynzar' E.I.. PaFmina N.P. The effect of phorbol ester in a wide range of concentration on the membranes of Ehrich Aseite Carcinoma // Book of abstracts of World Conference on Dosing of Anti-infectives (WCDA) celebrating Paul Ehrlich's 150th Birthday. Nurenberg. Germany. 2004. P. A-78.

45. Белов B.B., Мальцева ЕЛ., Пальмина П.П., Бурлакова Е.Б. Роль полярности растворителя в обеспечении эффекта сперхмапых доз биологически активных веществ. //Тезисы докл. III Биофизического Съезда. Воронежский Гос. Университет. 2004. С 620.

46. Belov V.V., Mal'tseva E.L.. PaFmina N.P. The effect of «-tocopherol in a wide range of concentrations on the structure of microsomal membranes. // Book of abstracts of Is1 Intern. FEBS Workshop on Lipids. Dijon. France. 2005. P. 50.

47. Mal'tseva E.L., PaFmina N.P. Spin probes in study the effect of phorbol ester on tumor membranes /7 Book of Abstr. Intern. Symposium "Lipids, Liposomes, and Biomembrancs 2005: New Technologies'". Vancouver. Canada. 2005. P.34.

48. Белов B.B.. Мальцева ЕЛ., Пальмина Н.П. Природный АО «-ТФ - модификатор структуры ИМ клеток печени. // Тезисы докладовУП Междуиар .Конф. «Биоаптп-оксидапт». Москва. 2006. С. 73-74.

49. PaFmina N.P., Belov V.V.. Mal'tseva F..L. Modification of lipid domains in liver plasmatic membranes by ex-tocopherol in a wide concentration range in vitro // Book of abstracts of 4,h EuroFed Lipid Congress. University of Madrid. Spain. 2006. P. 209.

50. Mal'tseva E.L.. Pynzar Е.1.. PaFmina N.P. The effect of phorbol ester in a wide range of concentration on tumor membrane lipids. Ultra low doses phenomenon. // Book of abstr. 9lh Intern.School Biophysics.''Supramolecularstructure&functions". Rovinj. Croatia. 2006. P.56.

51. Мальцева ЕЛ., Богданова Н.Г., Пальмина H.JI. Универсальный модулятор систем вторичных посредников ТФА как модификатор структуры лппидов биологических мембран в широком диапазоне концентраций». // Тезисы докл. 8'"" Спец. Выставки «Изделия и технологии двойного назначения. Диверсификация 011К». «Биологически активные вещества в СМД. Препараты двойного назначения» Москва. ВВЦ. 2007. С. 12-13.

52. Пальмина Н.П., Белов В.В.. Жерновков В.Е.. Мальцева ЕЛ. О механизмах действия биологически активных веществ в СМД. /Тезисы докл. 8'°" Спец. Выставка «Изделия и технологии двойного назначения. Диверсификация ОПК». «Биологически активные вещества в СМД. Препараты двойного назначения» Москва. ВВЦ. 2007. С.5-7.

53. Мальцева ЕЛ., Богданова H.F., Пальмина Н.П. Форболовый эфир как модификатор структуры и перекисного окисления липпдов клеточных мембран в широком диапазоне концентраций. // Тезисы докладов 7-ю Международного симпозиума «Механизмы действия сверхмалых доз». Москва. 2008. С.67-68.

54. Mal'tseva E.L. Belokoneva O.S. The effect of fatty acids and antioxidants on the lipid membrane microviscosity and binding activity of brain opioid receptors .//Book of abstracts of 6Ul EuroFed Lipid Congress. Athens.Greece. 2008. P. 396 .

55. Мальцева ЕЛ., Богданова Н.Г.. Пальмина Н.П. Действие форбодового эфира (ТФА) в широком диапазоне концентраций на структуру липидов клеточных мембран. Эффекты СМД ТФА .//Сб. тезисов докл. V Междунар. Конгресса «Сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине». Санкт-Петербург. 2009. С.112.

56. E.L. Maltscvaa V.V. Belov. N.P. Pal'mina The effect of a-tocopherol in a wide range of concentrations on lipid microviscosity of HR membranes in vitroJ/Book of abstracts of FFBS Advanced Course "Lipid Signaling and Disease. Oilona. Italy. 2009. P. 27-28.

57. N.P. Palmina, E.L. MaFtseva Natural antioxidant - a-tocopherol in combined chemotherapy oflumor.// Book of abtracls 7thEuroFed Lipid Congress. Graz, Austria. 2009. P.282.

58. E.L. Maltscva, V.V. Belov, N.P. Palmina The changes of membrane lipid microviscosity as affected a-tocopherol in a wide range of concentration. // Book of abstr.7lh 1SSFAL Congress. Maastricht. The Netherlands. 2010.V. 194.

59. F..L. Maltscva. V.V. Belov. N.P. Palmina. The effect of oxazols on lipid microviscosity and rigidity of liver microsomal membranes in vitro.//Abstracts of8lh EuroFedLipid Congress. Munich. Germany. P. 198.

60. Пальмина Н.П., Белов В.В., Часовская Т.Е., Мальцева ЕЛ. Механизмы Действия природных и синтетических АО в СМД на структуру биологических мембран. // Сб. тезисов 8°" Междунар.коиф. «Биоантиоксидант». 2010. С. 354-356.

61. Пальмина Н.П., Гаинцева В.Д., Мальцева ЕЛ . Природный АО -ТФ в химиотерапии опухолей // Сб. тез. 8°" Междунар. Конф.«Биоантиоксидант». 2010. С. 356-357.

Подписано в печать 12.04.11. Формат 60x84/16. Тираж 130 экз. Усл. печ. л. 4,5. Заказ 448

Типография Издательства РУДН 117923, ГСП-1, г. Москва, ул. Орджоникидзе, д.З

10199760

2010199760

Информация о работе

Мальцева, Елена Львовна
доктора биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.02

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Мембраны и ферменты как мишени действия модуляторов систем вторичных посредников ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Мембраны и ферменты как мишени действия модуляторов систем вторичных посредников"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Мембраны и ферменты как мишени действия модуляторов систем вторичных посредников
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика