Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологические особенности функционирования аденилциклазной системы растений при действии низких температур

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Физиологические особенности функционирования аденилциклазной системы растений при действии низких температур"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР

институт физиологии растений и генетики

На правах рукописи

ДРАГОВОЗ Игорь Владимирович

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ АДЕНИЛЦИКЛАЗНОЙ СИСТЕМЫ РАСТЕНИИ ПРИ ДЕЙСТВИИ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР

03.00.12 - физиология растений

Автореферат

дассертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1991

Работа выполнена в отделе физиологии роста и развития растений Института физиологии растений и генетики АН УССР

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

КАЖМН Ф.Л.

Официальные оппонента: доктор биологическик наук, профессор

ЫУСИЕНКО Н.Н.

кандидат биологических наук КОСАКОВСКАЯ И.В.

Ведущая организация - Институт ботаники им.Н.Г.Холодного

АН УССР

Защита состоится "у р1 года в чпеов

на заседании специализированного товета . Д 016.67.01 пи защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте физиологии растений и генетики АН УССР по адресу: 252022, Ниев~?2, ул.Васильковская, 31/1?.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений и генетики АН УСС1

• Автореферат разослан __

1991 года

Учений секретарь' спвднедозированного совета кандидат биологических наук

В.А.Труханов

У

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАГОШ

Актуальность проблемы. Адаптация, то есть приспособление организма к условиям среда, является интегрированным пробелом, включающим биохимические, физиологические и генз'пмескио иехалиаки, функционирующие на различных уровнях: молекулярном, клеточном, ор-ганизменном. Первичные реакции организма на влиянмо стреесошх факторов среды направлены на предотвращение повреадои!« wiï,:;:h и, очевидно, являются универсальными (Кузнецов и др., IÎ3?). Однако, изучении механизмов ответа клетки на действие вне®их эффекторов (первичных мессенджеров), в частности, ничкго: температур, уделяется недостаточно внимания. Влияние таких факторов реализуется без проникновения внутрь клетки, а путем активации мембрздних рецепторов, следствием чего является изменение уровня внутриклеточных посредников (вторичных мессенджеров), согласованное действие которых и определяет штегративнцй ответ клетки на внешний стимул. В настоящее время известно несколько сигнал-проводящих путей для эукариот, являющихся универсальными механизмами восприятия, трансформации и реализации внешней информации в клеи-се. Наийолае наученные среди них аденилциклазная и и^гозитол-липвдпая сигнальные системы ( Berridge, 1985). Физиологический эффект вторичных кс-ссекдЕе-ров в обеих системах заключается в регуляции активности протекним-наз, изменяющих уровень и характер клеточного метаболизма (Гякели-на, 1985; Berridge, 1987). В последнее время получена данный, свидетельствующие о функционировании сигнал-проводящих систем и в клетках растений (ïïewton et al,, 1987; povaieh et al,, 198"?J Banjeva et al., 1987). С другой стороны, показана регуляция ак-, тивности фосфодиэстераз растительных и животных клеток с помощью цитокийинов ( Chiatan et al., J988; Hecht et al., ig?4). Индукция цитокининовой активности в растительных клетках (Тальянский и др., 1987), также как и увеличение уровня внутриклеточного цАМ5 (Иткес и др., 1985) вызывались действием интерферона и 2',5'-опк-гоаденилатов, наличие которых показано s настоящее время и для растительных клеток (Бабоша и др., 1990). Особый интерес представляет однонаправленность действия цАЧ£ и Фитогормона цитокинина как в физиологических тестах ( Keaaler, 1973; Сарпвцкая и др., 1979), так я в реакциях, связанных с формированием устойчивости к неблагоприятным факторам среды (Попова, Тотсрев, 1988; Яворская

и др., 1975). Показано участие цАМ5, как вторичного посредника, в формировании ответной реакции клетки на вирусную инфекцию ( АЪа<1 а1., 1986), при синтезе фитоалексинов ( Кигозака е1 а1.,1987). Поскольку аденилциклазная система является одним из общих для эу-кариот механизмов восприятия, передачи и реализации внешних сигналов на биохимическом уровне, мы предположили участие ее в формировании устойчивости растений к экстремальным воздействиям низких температур.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работа является исследование физиологических особенностей функционирования аденил-циклазной системы (АЦ-системы) клеток растений в условиях низких положительных температур, способствующих формированию адаптивных реакций растительного организма. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Усовершенствовать способ идентификации и количественного определения цАМФ в растительных тканях на основе применения эффективных сорбентов для ТСХ и ВЗЕХ и более прогрессивных детектирующих систем.

2. Выделить и идентифицировать фракции белков, обладающих диэстераэной активностью; исследовать их свойства с целью поиска форм ФДЭ, участвующих в метаболизме 3' ,5'-цАМЗ>.

3. Выяснить характер воздействия низкотемпературной закалки

И цАМФ на функциональное состояние хроматина сортов ржи различного географического происхождения.

4. Изучить влияние низкотемпературного стресса на функционирование компонентов аденилциклазной системы (цАШг, ЭДЭ цАШб),

а также состав и содержание цигокининов; исследовать возможные пути регуляции метаболизма" цАШ веществами, повышающими его внутриклеточный уровень, и цитокининами.

5. Разработать способы направленного повышения устойчивости зерновых культур к повреждающему действию низких температур на основе модуляции активности ферментов обмена-цАМФ.

Научная новизна работы. Идентифицирована и частично очищена цитозольная форма фосфодиэстеразы ц/ШФ, по ряду свойств похожая на ФДЗ цАМ'1 животных клеток с низким сродством к субстрату,гОна проявляла чувствительность к ионам дивалентных металлов, Са^+-кальнодулину, метилксгштинам, имела оптимум активности в щелочном диапазоне рН. При действии на проростки низкотемпературного стрес-

са обнаружено снижение активности данной формы '1ДЭ и изменение основных кинетических параметров. В этих же условиях чувствительность фермента к природным эффекторам и синтетическим аналогам ме~ тилксантинов не изменялась. Впервые установлено повышение транскрибирующей активности кариоплазматического фермента РП-П, особенно в области низких положительных температур, при действии на проростки низкотемпературной закалки в течение 24-48 часов. В этих же условиях обнаружено модифицирупщее действие цАМФ и индуктора его синтеза (активатора аденилциклазы, проявляющееся в повышении РНК-синтезирующей активности в широком диапазоне температур, особенно в области низких положительных. Показано, что низкотемпературный стресс вызывал изменение состава и содержания цитокининов проростков ржи. Впервые обнаружено, что в системе 1л vitro зеатин в физиологических (10~^-10"®М) концентрациях ингибировал щелочную форму 5ДЭ цАМ2?, чувствительную к Са^+-кальмодулину, метилксанти-нам, ионам дивалентных металлов. На основании эффектов веществ-модуляторов активности ферментов обмена цАМВ в системах in vivo и in vitro , разработан способ направленного повышения устойчивости зерновых культур к повреждающему действию низких температур

■v

На защиту выносятся следующие положения:

1. Идентифицированная в цитозоле клеток проростков ржи щелочная форма -1ДЭ по ряду свойств (чувствительность к Са^-кальмодули-

ну, метилксантинам, ионам дивалентных металлов: К., = 2,9 мМ) ана-

м

логична Ферменту тканей животных с низким сродством к субстрату. Снижение активности фермента (при действии метилксантинов, зеати-на и низких положительных температур) свидетельствует о вовлечении данной формы ЩДЭ в метаболизм 3',5'-цАМФ растительных клеток (в' норме и при действии неблагоприятных факторов среда).

2. Однонаправленность действия низких положительных температур, цАЧФ и веществ, повышающих его уровень в клетках, на активность кариоплазматического фермента РП-П in vivo и in vitro свидетельствует об участии аденилциклазной системы в мобилизации адаптивных реакций растительного организма к неблагоприятным условиям среды на клеточном и молекулярном уровнях.

3. Направленное влияние на процесс низкотемпературной адаптации растений путем модуляции активности ферментов метаболизма цАМ5 является основой для скрининга веществ, повышагакх устойчивость растений к экстремальному воздействии низких температур.

Практическая значимость работы. Усовершенствованный способ анализа цАМФ методом ВЭЖХ внедрен в практику Института физиологии растений и генетики и Института ботаники им.Н.Г.Холодного АН УССР. Метод анализа природных цитокининов широко используется в ИЯТ АН УССР, а также внедряется в практику во ВНИИ сахарной свеклы ВАСХН11Л. Установлены эффекты веществ-модуляторов активности ферментов обмена цАМЗ?, позволяющие использовать их для решения конкретной задачи растениеводства: для повышения устойчивости зерновых культур к повревдающему действию низких температур.

Реакция компонентов вденилциклазной системы на действие синтетических и природных физиологически активных соединений в системах in vivo и ia vitro , может быть использована для скрининга препаратов-криопротекторов. Изменение функциональной активности кариоплазматического фермента РП-П растений с различной, генетически детерминированной, устойчивостью к низким температурам в процессе закаливания можно рекомендовать в качестве тест-системы для оценки на холодо- и морозостойкость.

Апробация работы. Материал диссертации представлялся на У1 Всесоюзном симпозиуме "Циклические нуклеотиды" (Петрозаводск, 1988); на 1У Межрегиональной конференции молодых исследователей "Актуальные проблемы физиологии растений и генетики" (Киев, 1988); на II Всесоюзной конференции по регуляторам роста и развития растений (Киев, 1988); на 1У Всесоюзном совещании "Клеточный цикл растений" (Ужгород, 1989); на ыездународном симпозиуме "?.1олекуляр-ная организация биологических структур" (Москва, 1989); на 1У Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Минск, 1990).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, 2 находится в печати.

Структура и обьем диссертации. Диссертационная работа изложена на 167 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа включает 7 таблиц и иллюстрирована 29 рисунками. Библиография содержит 251 наименование, из них 168 иностранных.

-5-

СОЛЕРЕАНИЕ РАБОТЫ

I. Компоненты аденилпиклазной системы (цАМФ, Щд) растительных клеток при действии низкотемпературного стресса и исследование возможности направленного изменения ее активности

цА1.13>. Одним из эффективных методов разделения и анализа сложных смесей химических веществ, в том числе и природных соединений, является высокоэффективная жидкостная хроматография (В35Ш (Стыскин и др., 1986). В литературе (Яворская и др., 1989) приведен способ определения цАМФ в растительном материале, основанный на использовании ЗЭНХ после очистки экстрактов различными хроматографическими приемами. Однако, он достаточно трудоемкий, обладает рядом недостатков в связи а длительностью подготовки образца к анализу и относительно низкой эффективностью хрснатографического процесса. В связи с этим, нами была проведена работа по усовершенствованию способа анализа цАМФ в тканях растений на основе применения, эффективных сорбентов для ТСХ и ВЗНОС (пластинки "Merck" IJ5554,' колонка "tlltraaphera С 18 IP 4,6x250 ми, 5 мкм, "Altex-Beekman", США) и более прогрессивной инструментальной базы при разделении циклофосфатов о помощью ВЭЕХ (жидкостный хроматограф System Gold™ Method Development System, Be clan fin, США). В результате удалось исключить одну стадию очистки на тонком слое и поднять полноту определения примерно на 25?-. Применение ион-парного ыарианта ВЭЖХ на обраиеннс-фазном сорбенте позволило в несколько раз повысить эффективности' хроматографического процесса (более S2COO теоретических тарелок на I метр) и разделить цАМЗ? и сопутствующие компоненты (рис. I). Этот метод был использован чпми при изучении влияния холодового стресса и модуляторов активности аденилциклазной системы на .содержание uAMi у растений.

А259

ЩЭ. Методами дробного фракционирования сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе выделена и идентифицирована ФДЭ цАМ'1, проявлявшая активность в щелочном (7,2) диапазоне рН. Установлены кинетические характеристики данной Форш фермента и исследована чувствительность к различным факторам. Эта форма ФДЭ активировалась комплексом Са^+-кальмодулин, проявляла чувствительность к ионам дивалентных металлов (рис. 2) и тео-филлшу (рис. 3). По совокупности изучаемых свойств (Км, рй-опти-мум активности, чувствительность к Са^+-кальмодулину, метияксанти-нам, М62+ ) данная форма фермента аналогична -1ДЭ животных тканей с низким сродством к субстрату, участвующей в метаболизге 3',5'-цАЧЬ (Этингоф, Думлер, 1981; Иткес и др., 1985).

s 25

%

1 20 15

10

tí

A*

U-,

12 3 4

Рис.2. Влияние ионов и кальмодулина на активность щелочной формы

1 + ЭГГА (I мU),

2 +• Э1ТА (I мМ) + кальмодулин (6 ыкГЛ) -

3 + Са£+ (10 мкМ) +• кальмодулин (6 мк'З).

4 + Ca¿+ (100 мк!Л) + кальмодулин (б мкМ).

Рис.3. Влияние метилксантина теофиллина на активность щелочной формы ФДЭ.

1 - контроль,

2 - - - +■ 8 мМ теофиллина,

3 - -"- + 8 мМ теофиллина + I мМ ЭГГА.

5

Действие низких температур и веществ-модуляторов на компо-г ненты аденилциклазной систем. При изучении влияния низкотемпературного стресса на компоненты АЦ-системы показано увеличение уровня внутриклеточного цАМ$ (табл. I), с одной стороны, и резкое снижение активности ФДЭ цАМФ, с другой (рис, 4).

• Таблица I

Концентрация иАШ в тканях двухсуточных проростков ржи после кратковременной обработки холодом (+2°С, 1-3 ч), результаты представлены в расчете на I г сырой массы ткани

Продолжительность :_Концентрация uAI.'.Ü_

обработки, ч : нг : 'л по отношение _к контролю_

120,85+5,48 ICO

I 170,36+4,87 124,5

3 264,00+7,25 192»9

Рис.4. Изменение активности щелочной формы ФДЭ после воздействия на проростки низких положительных температур +2 С, 3 ч).

1 - контиоль,

2 - +2°С, 3 часа.

мМ цАМФ

Низкие температуры вызывали уменьшение сродства фермента к субстрату и снижение максимальной скорости реакции, но не оказывали влияния на его чувствительность к эффекторам (Са^+-кальмодулину, метилксантинам, Mg2"9. Полученные результаты указывают на возможность повышенной оперативности в регуляции фосфодиэстеразой уровня цАМФ при действии неблагоприятных факторов среда. Обработка проростков веществами-модуляторами активности АЦ-системы вызывала быстрое (через 2 часа) повышение уровня внутриклеточного цАМФ (рис. 5), что предполагает действие препаратов на определенные участки клеточного метаболизма - ферменту обмена цД!.й. В системе in vitro синтетический аналог теофиллина ИОС 3914 (8-бром-7-/2-ацетоксиэтоксиметил/теофиллин) существенно ингибировал активность ФДЭ как в норме (рис. б), так и при действии низких температур на растение. По видимому, физиологический эффект препарата реализуется через фосфодиэстеразу цАМФ, которая может рассматриваться как "молекулярная мишень" этого соединения. 100г . л

П/ 0|

t. к с

80

60

40

Рис.5. Влияние экзогенной обработки двухсуточных проростков рки сорта Вятка 2 веществами-модуляторами аде-нилциклазной система на уровень внутриклеточного цА1,1£.

1 - контроль, л

2 - + ИОС 3914, 10 М,

3 - + ЕР-2, 5-10-4М.

ы 1 25

а

а 20

й

к

ч ш 15

>о и

1 10

ЮГ

§1 5

3

Рис.6. Влияние теоЛиллинб и его синтетического аналога (ИС-С 3914) на актип-ность щелочной формы ФД8.

1 - контроль,

2 _ + 8 мМ теофилл-лна,

3 _ -»- + 0,01 мИ ИОС 3914,

4 _ + о,02 кЧ ¡ЮС 3914.

гщ&

I 2 £ 4

2. Функциональное состояние хроматина проростков ржи в условиях низких положительных температур и его изменение пои действии цАМ'{

Реакция растительных'клеток па воздействие внешней среды, в частности, на низкие температуры, связана с глубокими изменениями Функциональной активности генетического аппарата, направленными на мобилизацию приспособительных реакций (Титов и др., 1981; МоЬара1;га et а1., 1987). Предполагается, что адаптация растений к экстремальным температурам представляет собой конститутивный признак, детерминированный генетически (Аветисова, 1988). В связи с этим дальнейшие исследования проводились на проростках ржи сорта Вятка 2, сформированного в условиях Севера, и сорта местной селекции Харьковская 60. Действие низких положительных температур на проростки с различной устойчивостью к температурному фактору вызывало, с одной стороны, общее повышение РНК-сдатезирующеЙ активности кариоплазматического фермента РП-П, а с другой - появление второго максимума активности в области "закаливающих" (+5°С) температур (рис. 7). По-видимому, существуют формы фермента с различными температурными оптимумами активности, которые активируются в зависимости от внешних условий. У сорта ржи Вятка 2 наблюдалась более четкая реакция на действие закаливающих температур, чем у Харьковской 60. Поскольку при низких температурах синтез мРНК и соответствующих им белков, характерЕшх для нормального состояния, подавлен (Кузнецов и др., 1987), повыие-ние активности■кяпиогяазматического фермента (особенно в области

86412

Рис.7. РНК-полимеразная активность (РП-П) изолированных ядер проростков ржи сорта Вятка 2 при действии низких положительных температур: I - контроль, 2 - обработка температурой +2°С 24 часа, 3 - обработка температурой +2°С 48 часов.

10 20 30 40 V с

низких закаливающих температур) может быть связано с индукцией адаптивных реакций на уровне генома. При изучении характера воздействия цАМФ на функциональное состояние хроматина обнаружили, что влияние низкотемпературной закалки на проростки, также как цА?№ и индуктора его синтеза ЕР-2Д мембраноактивного поликатиона, активирующего аденилциклазу (Каган'и др., 19®), является однонаправленным: в опытах 1п -1г1-Ьго на изолированных ядрах наблюдали пошшение транскрибирующей активности РП-П (особенно в области низких положительных температур) под действием препарата цАМ$ и ЕР-2 (рис. 8). Такое цАШ~зависимое повышение активности карио-плаэматического фермента РНК-полимеразы П в этих условиях свидетельствует о вовлечении цАМФ в индукцию адаптивных реакций на уровне генома. О правомерности такого заключения говорит и значительное (более, чем в 2 раза) увеличение активности РП-П в присутствии комплекса цАМФ-рецепторный белок, в частности, при

20

15 10

Рис.8. РНН-полимеразная активность (РП-П) изолированных ядер проростков ржи сорта Дымка при действии низких положительных температуо и повышении концентрации внутриклеточного цА.МФ:

I - контроль; 2 - +2 С,24 часа;

3 - +Ю-4:,ГцАмФ, +2°С, 24 часа;

4 - +5>10-4!,1 ЕР-2, +2°С, 24 часа.

40 4, С

- II -

ниикой положительной температуре (Yaworsltaya et al., 1989). Следовательно, обнаруженные в системах in rivo и in vitro геномные эффекты низких положительных температур и цАИ, позволяют предполагать регуляторную роль аденилциклазной системы в изменении направленности физиологических реакций растительных клеток с целью повышения их адаптивного потенциала к факте рам среды.

3. Взаимодействие цитокининов и аденилциклазной системы клеток проростков рта в условиях низкотемпературного стресса

Основываясь на концепции однонаправленности действия пДМФ и цитокининов в физиологических тестах (Бочарова и др., 1989; Титов и др., 1986; Яворская и др., 1975), исследовали влияние низкотемпературного стресса на состав и содержание цитокининов, а также возможный путь регуляции метаболизма цАМФ с помощью цитокининов. С этой целью № разработали способ анализа цитокининов, основанный,на экспресс-очистке грубых растительных экстрактов с помощью ТСХ с последующей идентификацией и количественной оценке' методом ВЗЖХ. Кратковременное воздействие холода (+2°С, 1-3 ч) на проростки вызывало значительное (в 1,5 раза) увеличение концентрации зеатина и резкое падение (в 2 раза) эндогенного уровн/ зеатин-рибозида (рис. 9). Рибозиды цитокининов рассматриваются в качестве транспортных форм фитогормонов ( Staden, Davej-, 1979), поэтому повышение содержания зеатина может осушествлятьс(

Рис.9. Влияние кратковременной обработки низкими положительными температурами (+2°С, 1-3 ч) на эндогенный уровень цитокининов: зеатина ( 2) и зеатин-рибозида ( гя ).

I - контроль, 2-1 час, 3-3 часа.

за счет истощения пула зеатин-рибозцца, претерпевающего химические превращения. В то же время, свободные основания (в частности, зеатин) являются наиболее активными формами цитокшинов, регулирующими саше разнообразные физиологические процессы ( Pa-bii, Latham, 1963). В этих же условиях зеатин, в широком диапазоне концентраций (Ю'^-Ю'^М) эффективно иягибировал активность £ДЭ цАМФ, чувствительной к Са^+-кальмодулшу, метилксантинаы и ме2+ (табл. 2).

Таблица 2

Ингибирование активности ФДЭ цАМФ различными концентрациями зеатина в системе in vitro

Добавки в среду инкубации фермента

Активность ЙДЭ цАМ$ нМ цШ на I мг белка в мин

% активности фермента к контролю

Контроль Зеатин, 10"5М Зеатин, 10"6М Зеатин, '.Й-Ю^М Зеатин, Ю"7М

3,14 1,09 0,69 ■0,87 1,02

100 34,71 21,65 27,71 32,48

В связи с этим мокно предположить, что одним из возможных путей регуляции метаболизма цАМ$ в растительных клетках может быть влияние цитокининов т фосфодиэстеразу, в частности, в условиях низких температур. В пользу етого свидетельствует одинаковый характер действия и количественных изменений цАМФ и зеатина при неблагоприятных условиях среда ( \'1гагота, 1987; Очеретяна и др., 1990), что дает основание предполагать взаимосвязь между системой цАМФ и ввтокшинами в регуляции клеточного метаболизма.

4. Направленное повышение устойчивости зерновых культур на основе модуляции активности ферментов метаболизма пАМФ

На основании реакции аденилкиназной системы на действие низких температур и физиологических эффектов препаратов (HOC 3914 и EF-2), повышавших уровень цАНФ, исследовали влияние ¡этих соединений на устойчивость тлодых растений рки к повреждающему действию отрицательных температур. Синтетические модуляторы активности

- 13 - .

ферментов аденилцикяазной системы, подобно цАМ5, а 1,5-2 раза повышали устойчивость растений к экстремальному воздействию отрицательных температур (рис. 10).

« 80 к

1б0

е] 40

и к 5 20

-18 I гЬ Н, Г1! гЬ 1

-20 1 +| -ь -ь ■ь

1

I

Рис .10. Влитие цАМФ и веществ-модз лятаров аденил-циклазной с юте® на выживаемость молодых растений ржи сорта Харьковская 60. I - контроль;

обработка растворами исследуемых препаратов, М: гГ- И0С 3914, Ю-4М;

3 - И0С 3914. Ю-5Ц;

4 - ЕР-2» 10-4; .

5 - ЕР-2, 5-10-45

6 - цАШ, 10-4.

Сорта различного географического происхождения (Вятка 2, Харьковская 60), имеющие различный адаптивный потенциал к низким температурам, показали однотипную реакцию на обработку исследуемыми веществами: проявлялось защитное действие цАМФ, И0С 3914 и ЕР-2, выражавшееся в увеличении количества выживших растений после действия на них отрицательных температур. Защитный эффект препаратов реализовался в период, предшествующий экстремальным воздействиям температуры, что, по-видимому, связано с мобилизацией адаптивного потенциала растительного организма путем направленного воздействия на аденилциклазную систему клетки. На этом, вероятно, основано и повышение устойчивости растений к другим факторам среды ( у -радиации, фитопатогенам), что открывает возможность скрининга веществ, обладающих антистрессовой активностью.

ВЫВОДЫ

1. На основе применения эффективных сорбентов для ТСХ и ВЭЖХ, а такке прогрессивной детектирующей системы, усовершенствован способ анализа цАМФ в растительных тканях, позволяющий существенно повысить полноту определения циклофосфата и эффективность Хроматографического процесса.

2. В штозоле клеток проростков ржи обнаружена фосфодиэсте-раза по ряду свойств (рН-оптимум активности, чувствительность

к Са2+ -кальмодулину, метилксантинам, ионам дивалентных металлов) подобная ФДЭ животных клеток с низким сродством к субстрату, участвующей в метаболизме 3', 5'-цАМ1.

3. Кратковременное воздействие низких положительных температур на проростки ржи вызывало резкое снижение активности ФДЭ цАМ§, следствием чего являлось повышение эндогенного уровня циклонуклеотидов.

4. Показано однонаправленное стимулирующее действие низких положительных температур и цАМФ на активность кариоплазматичес-кого фермента РП-П (особенно в области низких "закаливающих" температур), свидетельствующие о вовлечении аденилциклазной системы в мобилизацию адаптивных реакций на клеточном и молекулярном уровне.

5. В опытах in vivo показано, что синтетические вещества-модуляторы, увеличивающие уровень внутриклеточного цАМФ, повышали .устойчивость молодых растений гржи к повреждающему действию низких температур. Эти ре эультать!1,' наряду с опытами in vi-tro, свидетельствуют, что исследуемые соединения действуют на конкретные звенья внутриклеточного метаболизма - ферменты обмена цАМФ.

6. Одним из возможных путей регуляции метаболизма цАМФ цито-кининами может быть ингибирование ЩЦЭ зеатином, уровень которого изменяется при действии экстремальных факторов среды.

7. Реакция аденилциклазной системы на действие синтетических и природных физиологически активных соединений является основой Для скрининга веществ, повышающих устойчивость растений

к низким температурам.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

I. Яворская В.К., Калинин а.Л., Драговоз И.В. и др. Физиологическая роль цАМФ-связывающих белков в клетках проростков ржи // Физиология раителий,- 198Г7,- 34, !?5.- С.963-971.

2. Драговоз И.В., Яворская В.К., Калинин Ф.Л. и др. Влияние цАМ5 на устойчивость проростков пгаенииэ и ржи к низким температурам и процессы температурной адаптации растений // У1 Всесоюэн. симпозиум "Роль циклических нуклеотидов и вторичные посредников в регуляции ферментативных реакций". Тезисы доил.- Петрозаводск.- 1988.- С.82

3. Yavorskaya V.K., Drngovoz I.V., Harkova V.E.,-Fedenko K.P. The effect of cAIiP on plant cell chromatin during the development of otresa tolerancs // Internat. Symposium "Molec. organization of biol. structures",- M.- 1939.- Abstract Euck, II.-P.293.

4. Яворская B.K., Драговоз И.В., СавинскиЯ C.B. и др. Определение циклического 3' ,5 '- А!,1Ф (цА'Ш в растительных тканях методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Физиология и биохимия культ, растений.- 1989.- 20, !?б.- С.607-614.

5. Влияние цА.М® на устойчивость проростков ржи к холодовому стрессу и процессы температурной адаптации растений // 1У Все союэн. конференция молодых ученых по физиология растительной клетки.- Тезисы докл.- M.- 1990.- С.152.

6. Савинский C.B., Драговоз И.В., Педченко В.К. Определение зеатина, индолил-3-уксусной и абсцизовой кислот из одной растительной пробы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Физиология и биохимия культ, растений.- 1991,- 23, №6.- С.

7. Kofinan I.Sh«, Dragovoz I.V., Yavorskaya V.K. Separation of Cyclic Э',5'-АШР and related sutatances by ion-pairing НРЬС // Chromatograjn.- 1990,- 11, 112,- P. 2-3.

8. Яворская B.K., Драговоз И.В., Маркова В.Е., Феденко Е.П. Взаимодействие цитокининов с системой циклического АМ$ (3',5'-АМФ) в процессах низкотемпературной адаптации растительных клеток // Докл. АН СССР (в печати).

9. lavorakajra V,K,, Dragovoz I.V,, Savinaky S.V. et al. Determination of cyclic 3* ,5'-Adenosine monophosphate in plant . t.isaues by high performance liquid chromatography // Phyto-cheiaical Analysis (in preaa),