Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль мембранного скелета эритроцитов млекопитающих в функционировании транспортных АТФаз

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль мембранного скелета эритроцитов млекопитающих в функционировании транспортных АТФаз"

г ~ од

. ^ ШР Ш7 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Институт эволюционной физиологии и биохимии ии. И.М. Сеченова

На правах рукописи

ШАЛАБОДОВ Александр Дмитриевич

РОЛЬ МЕМБРАННОГО СКЕЛЕТА ЭРИТРОЦИТОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ТРАНСПОРТНЫХ АТФаз

СПЕЦИАЛЬНОСТЬ: 03.00.04 - БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1997

->

Работа выполнена в лаборатории сравнительной биохимии ф Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сечен и Тюменском государственном университете.

Научный консультант-ведущий научный сотрудник Института эволюционной физиологи химии им. И.М.Сеченова РАН, доктор биологических наук Казени

Официальные оппонентны: доктор биологических наук, профессор А.А.Болдырев доктор биологических наук, профессор С.Н.Лызлова доктор медицинских наук, профессор С.С.Михайлов

Ведущее учреждее - Институт цитологии РАН

Защита состоится " 3 " сыг^иия. ] 997 Года в и/0и чш седании специализированного совета Д 002.89.01 по защите диссерт соискание ученой степени доктора биологических наук при Инстит люционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

Адрес института: 194223, Санкт-Петербург, пр.М.Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им.И.М.Сеченова РАН.

Автореферат разослан " % " ¡997.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Транспортные АТФазы относятся к основным системам, осуществляющим первично - активный транспорт ионов, формируя на мембране электрохимические градиенты, энергия которых используется для процессов возбуждения нервной и мышечной ткани, транспорта аминокислот, Сахаров и других метаболитов через плазматическую мембрану клетки. Кроме того, поддерживая внутриклеточный и внеклеточный гомеостаз одно- и двухвалентных катионов, эти системы обеспечивают необходимые условия для нормального протекания жизненноважных процессов на уровне клетки и целого организма (Болдырев, Мельгунов, 1985). Несомненно, что чрезвычайно важная роль систем активного транспорта ионов в клеточном метаболизме должна коррелировать с многообразием способов контроля за их активностью как со стороны клетки, так и целого организма.

В отношении транспортных АТФаз, как и для других ферментов существуют два основных способа регуляции их активности: изменение количества молекул фермента в процессе биосинтеза и модуляция активности уже существующей популяции молекул. Биосинтез молекул фермента de novo можно рассматривать как путь долгосрочной или " отсроченной" регуляции; модуляция активности уже имеющихся молекул фермента отражает срочные потребности клетки и получила название краткосрочной регуляции (Bertorello, Katz, 1993).

Безъядерные эритроциты млекопитающих являются высокоспециализированными клетками, которые могут выполнять функцию переноса кислорода к тканям и органам при сохранении внутриклеточного гомеостаза, в том числе, одно- и двухвалентных катионов. Отсутствие ядра лишает эти клетки возможности решать долгосрочные задачи за счет синтеза молекул de novo, что выдвигает на первый план путь краткосрочной регуляции метаболизма клетки в процессе ее функционирования. С этой точки зрения эритроцит является уникальным объектом исследования внутриклеточной регуляции активности ферментов, в том числе, и транспортных АТФаз. Кроме того, отсутствие внутриклеточных мембранных структур позволяет исследователям получать однородные препараты мембран, что значительно упрощает интерпретацию полученных результатов. При исследовании активности и свойств транспортных АТФаз в препаратах мембран эритроцитов и целых клетках возникает одна проблема - изначально низкая активность ферментов в клетках. Однако, несмотря на это обстоятельство, в последнее десятилетие проведен ряд исследований, связанных с поиском в этих клетках внутриклеточных регуляторов транспортных АТФаз. На сегодняшний день в эритроцитах обнаружены как ингибиторы (Yingst, 1988, 1992), так и активаторы (Петруняка и соавт., 1990, 1994) Na,К-АТФазы, а также модуляторы активности Са-АТФазы (Болдырев, Мельгунов, 1985; Орлов,1987; Maudlin, Roufogalis, 1980; Nassi et al., 1990,1991; Liguri et al., 1994; Fifschi et al.,1995). Имеются литературные данные о тесной связи

Na,K-ATí>a3bi с белковыми компонентами мембранного скелета, в частности, с белком полосы 3 (Fossel, Solomon, 1983; Janoshazi, Solomon,1989), якорным белком анкирином (Nelson et al.,1987,1991; Morrow et al.,1989; Bennett, 1992), а через мембранный скелет- с гликолитическими ферментами (Proverbio,Hoffman, 1977; Mercer, Dunhum,1981; Low et al.,1993). Кроме того, было показано влияние белков мембранного скелета на активность Ыа,К-АТФазы (Казенное, 1991; Bertorello et al., 1992; Bertorello, Katz, 1993), а также Са-АТФазы (Казеннов,1991; Baskin,Langdon, 1981).

Анализ литературных данных показал, что в указанных работах решались конкретные задачи, однако, совокупность полученных результатов позволяла предположить, что белки мембранного скелета могут быть посредниками в реализации внутриклеточных сигналов, направленных на регуляцию активности Ыа,К-АТФазы и Са-АТФазы или непосредственно учавствовать в каталитическом цикле этих ферментов. Для экспериментальной проверки выдвинутого предположения необходимо было выбрать соответствующие методические подходы, а также объекты и методы исследования, которые позволяли бы более адекватно решать соответствующие задачи.

Цель и задачи исследования.

В связи с вышеизложенным, целью данной работы явилось изучение роли белков мембранного скелета эритроцитов млекопитающих в функционировании транспортных АТФаз. Для достижения этой цели мы ставили перед собой следующие задачи :

- модифицировать и стандартизовать методы выявления и определения активности транспортных АТФаз в безъядерных эритроцитах млекопитающих и их мембранных препаратах;

- в сравнительном плане у разных видов млекопитающих провести сопоставление активности транспортных АТФаз и изучить кинетические свойства ферментов в целых эритроцитах, их тенях и мембранных препаратах, лишенных белков мембранного скелета;

- сравнить влияние гемолизата и солюбшшзированных белков мембранного скелега эритроцитов млекопитающих на активность транспортных АТФаз в различных мембранных препаратах, а также модулирующее влияние двухвалентных катионов и АТФ на этот процесс;

- изучить особенности влияния на ферменты белков мембранного скелета, солюбшшзированных из теней эритроцитов, полученных в присутствии и отсутствие двухвалентных катионов и хелаторов в среде гемолиза и промывающих растворах;

- с помощью гель-фильтрации, провести разделение смеси солюбшшзированных белков мембранного скелега на отдельные компоненты, идентифицировать их с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и исследовать влияние отдельных белковых фракций на активность транспортных АТФаз.

Научная новизна.

Показано, что применение твина 20 позволяет выявить активность №,К-АТФазы в эритроцитах млекопитающих без существенного изменения кинетических характеристик фермента. Использование хелатора при получении мембранных препаратов безъядерных эритроцитов на стадии гемолиза позволяет получать стабильную и хорошо воспроизводимую активность Ка,К-АТФазы, которая не зависит от способности препаратов мембран эритроцитов "запечатываться" при помещении их в изотоничную среду инкубации.

В сравнительном плане у нескольких представителей млекопитающих изучена активность транспортных АТФаз в эритроцитах, тенях эритроцитов и препаратах мембран, лишенных белков мембранного скелета. Обнаружены различия в активности транспортных АТФаз в эритроцитах и их мембранных препаратах у исследованных животных, а также снижение активности ферментов после удаления внутриклеточного содержимого в процессе получения теней эритроцитов и после солюбилизации белков мембранного скелета из теней эритроцитов.

Исследование кинетических характеристик АТФазной и фосфатазной стадий ферментативного цикла ИаД-АТФазы показало, что удаление белков мембранного скелета из теней эритроцитов крысы сопровождается изменением чувствительности фермента к модификаторам реакционного цикла (двухвалентные и одновалентные катионы, АТФ, рН среды инкубации). На основании проведенного исследования предложена гипотетическая схема участия белков мембранного скелета в реакционном цикле Ка,К-АТФазы.

Впервые продемонстрировано разнонаправленное, зависимое от концентрации двухвалентных катионов, влияние гемолизата на АТФазную и фосфатазную активности Ыа,К-АТФазы в тенях эритроцитов крысы и в препаратах мембран, лишенных основных белков мембранного скелета.

Впервые проведено сравнительное изучение активности транспортных АТФаз в тенях эритроцитов крысы, полученных с использованием различных сред гемолиза эритроцитов и промывающих растворов. Показано, что смесь солгобилизированных белков мембранного скелета из разных препаратов мембран обладает как ингибирующим, так и активирующим эффектом на активность транспортных АТФаз из различных источников. Выраженность этого эффекта определяется наличием и соотношением двухвалентных катионов магния и кальция в среде определения ферментативной активности.

Проведено разделение с помощью гель-фильтрации солюбилизирован-ных с мембранных препаратов теней эритроцитов крысы белков мембранного скелета. Впервые показано, что отдельные фракции солгобилизированных белков мембранного скелета эритроцитов обладают модулирующим влиянием на активность транспортных АТФаз, зависящим от наличия двухвалентных катионов в среде инкубации, а также интактности цитоскелета препаратов мембран.

Научно-практическая значимость работы.

На основании изучения активирующего действия мембранотропных агентов (твина 20 и ЭДТА) на №,К-АТФазу эритроцитов млекопитающих предложены адекватные и хорошо воспроизводимые методы определения активности транспортных АТФаз в эритроцитах и их мембранных препаратах.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о роли белков мембранного цитоскелета в функционировании транспортных АТФаз, в том числе, в восприятии и трансформации внутриклеточных сигналов, направленных на регуляцию активности ферментов. Результаты исследования расширяют теоретические представления о роли цитоскелета мембран эритроцитов как посредника в регуляции активности мембраносвязанных ферментов, что важно ддя понимания механизмов внутриклеточного контроля как ионного, так и осмотического статуса клетки.

Результаты проведенного исследования используются при чтении общих курсов лекций по биохимии и биофизике и специального курса "Биологические мембраны и транспорт ионов" студентам Тюменского государственного университета.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Использование твина 20 и хелаторов в оптимальных концентрациях позволяет выявлять хородю воспроизводимую активность транспортных АТФаз в эритроцитах и мембранных препаратах эритроцитов млекопитающих, без существенного изменения кинетических характеристик ферментов.

2. Удаление внутриклеточного содержимого эритроцитов в процессе получения теней эритроцитов приводит к снижению активности транспортных АТФаз в препаратах мембран по сравнению с целыми клетками человека, крысы, мыши, морской свинки, но не хомячка и кролика, что свидельствует о наличии в эритроцитах млекопитающих внутриклеточных модуляторов ферментов. На это указывают и результаты экспериментов по предварительной инкубации теней эритроцитов млекопитающих с гемоли-затом, в которых показано активирующего влияние внутриклеточного содержимого эритроцитов на транспортные АТФазы из различных источников.

3. Удаление белков мембранного скелета из теней эритроцитов сопровождается изменением активности и чувствительности Иа,К-АТФазы к модификаторам реакционного цикла фермента, в частности, к АТФ, рН среды инкубации, одно- и двухвалентным катионам.

4. Прединкубация препаратов мембран из различных источников со смесью солюбилюированных белков мембранного скелета вызывает повышение активности транспортных АТФаз; при этом, эффект активации зависит от наличия в среде определения ферментативной активности двух-

валентных катионов магния и кальция, а также ог интактности структуры цитоскелета препаратов мембран.

5. Разделение смеси солюбилизированных белков мембранного скелета с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-75 показало наличие в получаемых белковых фракциях Са2+- и Mg2t -зависимых факторов, обладающих разнонаправлеными модулирующими эффектами в отношении транспортных АТФаз из различных источников.

6. Белки мембранного скелета эритроцитов выполняют функцию адаптера внутриклеточных сигналов, направленных на регуляцию активности транспортных АТФаз, и, кроме того, могут быть непосредственны вовлечены в реакционный цикл исследуемых ферментов.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на : 6-ой конференции биохимиков Прибалтийских республик, Белорусской ССР и Ленинграда (Рига, 1981), Областной межвузовской конференции молодых ученых и специалистов (Тюмень, 1985), Межуниверситетской Всесоюзной конференции по биологии клетки (Тбилиси, 1985), 5-ом Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), 1-ой Всесоюзной конференции "Биохимия -медицине" (Ленинград, 1988), Международном симпозиуме "Транспорт ионов и механизмы его регуляции" (Тбилиси, 1989), Всесоюзном симпозиуме "Ионный транспорт и регуляция функций клетки" (Ленинград, 1991), 4-ом Симпозиуме по биохимии липидов (С-Петербург, 1995), 23-ей конференции федерации Европейских биохимических обществ (Basel, 1995), 1-ом конгрессе федерации Европейских физиологических обществ (Maastricht, the Netherlands, 1995), 1-ом (11) Международном совещании по эволюционной физиологии (С-Петербург, 1996).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов и результатов исследований, обсуждения полученных данных, заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает источников, в том числе 3/3 на иностранных языках. Работа изложена на <Z7i страницах машинописного текста, иллюстрирована S3 рисунками и /£ таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектами исследований явились эритроциты человека, крысы линии Wistar, белой мыши, морской свинки, кролика и золотистого хомячка.

Забор крови у человека проводили из локтевой вены, у кролика - из ушной вены, а у остальных животных - после декапитации. Все исследования проводили в день забора крови. Осажденные при 300 g эритроциты трижды промывали охлажденным 0.145 М NaCI в 10 мМ трис-HCI буфере (рН 7.6 при 25« с).

Мембранные препараты эритроцитов (тени эритроцитов) получали методом гипоосмотического гемолиза по принципу Dodge et al. (1963), используя в качестве гемолизирующей среды 10 мМ трис-HCI буфф (рН 7.6

при 25°С), содержащий и не содержащий ЭДТА, в объемном соотношении к эритроцитам 15:1. В ряде экспериментов в среду гемолиза вводили двухвалентные ионы Mg2+ и Са2к. Гемолизат после центрифугирования при 20000g в течение 20 минут использовался для изучения его влияния на активность ферментов. Промывание препаратов мембран с целью удаления остаточного гемоглобина проводили 3 раза в тех же средах, осаждая мембраны при 20000 g в течение 20 минут.

Мембранные препараты, лишенные периферических белков мембранного скелета, получали по методу Stek & Kant (1974). Тени эритроцитов суспендировали в 10 объемах 1 мМ трис-HCI (рН 7.6 при 25°С) и инкубировали в течение 30 минут в термостате при 37°С при постоянном перемешивании, после чего мембраны осаждали и промывали дважды 10 мМ трис-HCI буфером. В ряде экспериментов состав среды солюбилизации белков мембранного скелета, а также промывающие среды содержали ЭДТА или двухвалентные ионы, что дополнительно указано в тексте. Супер-натант после первого осаждения мембран представлял собой смесь солю-билизированных белков мембранного скелета (СБМС) и использовался для изучения его влияния на активность ферментов. В отдельных сериях экспериментов надосадочнухо жидкость после первого осаждения мембран концентрировали в 3-4 раза путем поглощения воды и низкомолекулярных веществ сухими сефадексами G-15, G-25. Предварительно концентрированную или неконцентрированную смесь белков мембранного скелета фракционировали с помощью гель-фильтрации с использование сефадекса G-75. Смесь белков наносили на колонку, заполненную сефадексом (h = 200 мм; о = 26 мм) и уравновешанную 5 мМ трис-HCI буфером (рН 7.6 при 25°С), содержащем 0.1 мМ ЭДТА. Белок элюировали из колонки тем же буфером со скоростью 4 мл/мин. Содержание белка во фракциях (4 мл) оценивали спек-трофотомегрически при 278 нм.

Электрофоретическое разделение полипептидов теней, бесспектриновых мембран и надосадочной жидкости проводили по Fairbanks et al. (1971) с незначительными изменениями. Толщина геля составляла 1.2-1.4 мм, размер плато - 10x12 см. 10-20 мкл пробы (20-40 мкг белка) наносили в углубление геля, сформированные специальной гребенкой (ширина дорожки 5-6 мм). Электрофорез проводили в течение 2 часов при напряжении тока 125 в (8-9 в/см длины геля) и силе тока 60 мА. После окончания электрофореза пластинку геля извлекали из камеры и помещали в окрашивающие растворы. Молекулярную массу присутствующих на электрофореграммах полос (полипептидов) определяли с помощью калибровочного графика, построенного по скорости миграции маркерных белков с известной молекулярной массой.

Прединкубацию целых эритроцитов, теней эритроцитов и гомогената головного мозга крыс с детергентами проводили при комнатной температуре в течение 30-60 минут в зависимости от вида ткани. Концентрация детергентов и время инкубации подбирались экспериментальным путем при постоянном контроле соотношения белок/детергент в пробе. После предан-

кубации эритроцитов с детергентом, взвесь эритроцитов разводили в 2.5-5 раз 0.25 М сахарозой в 0.02 М трис-HCI буфере (конечное разведение составляло 5-10 раз). Препараты теней эритроцитов доводили до 5-кратного объема 10 мМ трис-HCI буфером (рН 7.6 при 25°С), содержащем, в зависимости от целей эксперимента различные концентрации двухвалентных ионов или хелаторов, что оговорено в тексте. Гомогенат головного мозга разводили в 10 раз тем же раствором сахарозы, что и в случае эритроцитов.

Стандартная инкубационная среда для определения активности АТФаз содержала в (мМ) : NaCI-100 ; KCI-20; MgCI2-3; АТФ-3; ЭДТА-0.5 ; трис-HCI- 50 (рН 7.6 при 25°С). В некоторых сериях экспериментов состав инкубационной среды варьировался, что оговорено в тексте. Определение уаба-ин-чувствительной К-фосфатазной активности проводили как описано Flatman & Lew (1980) в стандартной инкубационной среде, содержащей (в мМ): MgCh-6; KCI-150; ЭДТА-0.5; пара-нитрофенилфосфат (пНФФ)-Ю; трис-НС1-50 (рН 7.4 при 25°С). В ряде экспериментов состав инкубационной среды варьировался. Температура инкубации составляла 37° и 40°. АТФазную и фосфатазную активности определяли по приросту, соответственно, неорганического фосфата (Фн) и пара-нитрофенола(пНФ) в инкубационной среде. N а,К-АТФазную и уабаин-чувствительную К-фосфатазную активность рассчитывали по разнице ферментативных активностей в отсутствие и присутствии 1 мМ уабаина . Активность Са-АТФазы - по приросту АТФазной активности в присутствии ионов Са2+. Активность ферментов выражали в мкмоль Фн (пНФ)/час на мг белка или на мл клеток. Содержание Фн определяли по методу Chen et al.(1957) в нашей модификации, содержание пНФ - как описано у Flatman & Lew (1980). Содержание белка в пробах определяли по методу Lowry et al.(1951). Для построения калибровочной кривой использовали бычий сывороточный альбумин (лиофилизированный).

Результаты экспериментов обработаны статистически с использованием критерия Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Особенности выявления активности транспортных АТФаз в безъядерных эритроцитах и их мембранных препаратах.

Транспортные АТФазы представляют собой интегральные политопические белки, активные центры которых локализованы по обе стороны плазматической мембраны эритроцита, являющейся барьером дня экзогенного АТФ и ионов активаторов. Это создает проблемы в выявлении ферментативной активности in vitro в целых клетках и, поэтому, большинство исследователей предпочитают работать с мембранными препаратами эритроцитов (тенями эритроцитов), полученными методами гипо- или изоосмотиче-ского гемолиза и отмытых от цитозольного содержимого. Однако, при помещении таких мембран в изотоничную инкубационную среду они способ-

ны "запечатываться", образуя непроницаемые для молекул субстрата и кофакторов структуры. С целью преодоления возникающих трудностей в выявлении латентной активности ферментов требуется открытие доступа экзогенному субстрату и кофакторам к активным центрам фермента, локализованным на цитоплазматической стороне мембраны. Для этого используют методы повторного замораживания-оттаивания суспензии эритроцитов, обработку клеток ультразвуком, детергентами, что в, конечном итоге, может привести к изменению кинетических характеристик мембраносвя-занных ферментов. Исходя из вышесказанного, на первом этапе нашего ис-следованния стояла задача разработки надежных, хорошо вопроизводимых методов, позволяющих выявлять активность транспортных АТФаз как в эритроцитах, так и в мембранных препаратах этих клеток, без существенных изменений кинетических свойств ферментов.

Из всех известных приемов, увеличивающих проницаемость мембран, мы остановили свой выбор на использовании детергентов. Предварительные исследования показали, что из трех детергентов (твин 20, тритон Х-100, дезоксихолат натрия), отличающихся по своим амфипатическим свойствам, в большей мере соответствовал нашим требованиям твин 20, так как пре-динкубация эритроцитов с этим поверхностно-активным веществом позволяла выявлять активность МаДС-АТФазы равную активности, выявляемой с помощью тритона Х-100 и дезоксихолата натрия, но, в отличие от последних, он в более широком диапазоне концентраций не подавлял активность фермента. Для эритроцитов млекопитающих это важно, так как активность транспортных АТФаз в них относительно невысокая и, после инкубации клеток с детергентом, последующее разведение клеточной суспензии не должно быть большим. Прединкубация эритроцитов крыс с твином 20 позволила выявить активность и другой транспортной АТФазы - Са-АТФазы; при этом, характер кривых зависимости активности ферментов от концентрации детергента в среде прединкубации был одинаков для обоих ферментов, что, скорее всего, связано с тем, что активация обусловлена увеличением проницаемости мембраны эритроцитов к субстрату и ионам-активаторам. Действительно, последущие эксперименты показали, что прединкубация эритроцитов с твином 20 в оптимальной концентрации (5 мг/мл) не влияет на кинетические характеристики Ка,К-АТФазы, а именно; способность фермента претерпевать конформационные превращения под влиянием таких модификаторов реакционного цикла, как ионы М§2+, АТФ и рН инкубационной среды. Как известно, ионы ускоряют превращение фермента из конформационного состояния Е1 в Е2 (Бкои ,Е$тапп, 1992). В конформации Е1 фермент проявляет АТФазную активность, а в конфор-мации Ег - уабаин-чувствительную К-фосфатазную активность. Учитывая это, в эритроцитах, прединкубированных с твином 20, регистрировали как АТФазную, так и К-фосфатазную активность при различных концентрациях ионов магния в среде инкубации (рис. 1).

Рис.1 Зависимость активности На,К-ЛТФаэы (а) и уабаин-чувствительной К-фосфатазы (б) в эритроцитах крысы от концентрации MgCh в среде инкубации (п = 8 ).

При повышении концентрации MgCb в среде инкубации в интервале от 0,5 до 3 мМ наблюдается значительный прирост активности фермента. Более высокие концентрации MgCh выражение снижают общую АТФазпую активность. Определение уабаин-чувствительной К-фосфатазы в интервале концентраций MgCh в среде инкубации от 3 мМ до 12 мМ показывает существенный прирост этой активности, что, как полагают Flatman, Lew (1980), связано с изменением конформации фермента в сторону Е2, т.е. переход в режим, когда Na.K-АТФаза, функционируя в виде разобщенных протомеров (Болдырев и соавт.,1990), гидролизует неспецифический субстрат п-нитрофенилфосфат.

Введение АТФ в среду инкубации приводит к снижению активности уабаин-чувствительной К-фосфатазы при всех соотношениях концентраций ионов натрия и калия, что свидетельствует о способности фермента претерпевать конформационный переход, в сторону благоприятную для протекания АТФазной реакции, в результате чего уменьшается его способность гидролизоватъ п-нитрофенилфосфат (рис. 2а). Увеличение концентрации ионов натрия в среде инкубации, при одновременном уменьшении ионов калия, приводит к снижению активности уабаин-чувствительной фосфа-тазы. Этот факт свидетельствует о том, что На,К-АТФаза хорошо дискриминирует ионы Na+ и К+. Кроме того, показано (рис. 26), что при изменении рН среды инкубации от 6,8 до 7,8 в присутствии высоких концентраций ионов калия наблюдается выраженное снижение активности К-фосфататазы; в присутствии незначительной концентрации ионов калия выявляется низкая фосфатазная активность и фермент практически не реагирует на изменение рН среды инкубации.

Рис. 2. Зависимость активности уабаин-чувствительной К-фосфатазы в эритроцитах крысы от концентрации АТФ (а) и рН среды инкубации (б).

а) Ряд 1 - NaCl/KCl = 30/150 мМ; Ряд 2 - NaCl/KCl = 95/75 мМ; Ряд 3 -NaCl/KCl = 170/10 мМ; б) Ряд 1 - NaCl/KCl = 30/150 мМ; Ряд 2 - NaCl/KCl = 170/10 мМ. (п = 8 )

Таким образом, полученные результаты исследования показывают, что прединкубация эритроцитов крысы с тайном 20 позволяет выявлять активность фермента, без существенного изменения его кинетических характеристик.

При получении мембранных препаратов эритроцитов (теней эритроцитов) по методу Dodge et al. (1963), было показано, во-первых, что все мембранные препараты имеют правильную ориентацию мембраны (о чем свидетельствует отсутствие активации АХЭ - маркера внешней стороны плазматической мембраны, после прединкубации теней эритроцитов с тритоном Х-100 ) и, во-вторых, что примерно 80 % теней эритроцитов, полученных в результате гемолиза в среде, не содержащей хелатора двухвалентных катионов (10 мМ трис-HCI, рН 7,4 при 25° С), "запечатываются" при помещении их в изотоничную инкубационную среду, переводя фермент в латентную форму. Прединкубация таких препаратов мембран с твином 20 позволяет повысить выявляемую активность Ка,К-АТФазы почти в 4 раза (рис. 3 а), если в среде определения ферментативной активности присутствовал ЭДТА. При внесении 0.5 мМ ЭДТА в среду гемолиза эритроцитов, процент выявляемой активности фермента составлял 70-80% ( рис. 3 б), так как прединкубация таких препаратов мембран эритроцитов с твином 20 повышала активность Ыа,К-А'ГФазы на 20-30 %.

Рис. 3. Активность ЫаД-АТФазы в тенях эритроцитов крысы, полученных в отсутствие (а) и присутствии (б) 0,5 мМ ЭДТА (1, 4), I мМ ЭДТА (26), 2 мМ ЭДТА (36) в среде инкубации. 1а, 16, 26, 36 - нативные тени эритроцитов; 2а, 46 - тени эритроцитов, прединкубированные с твином 20.

На основании полученных результатов был предложен метод выявления активности транспортных АТФаз в тенях эритроцитов млекопитающих, предусматривающий введение в гемолизирующую среду хелатора двухвалентных катионов с целью предотвращения "запечатывания" теней в изотоничной среде определения ферментативной активности.

2. Сравнительное исследование активности транспортных АТФаз в эритроцитах и мембранных препаратах эритроцитов млекопитающих.

Результаты исследований, представленные в табл.1, показывают, что активность транспортных АТФаз в эритроцитах и тенях эритроцитов изученных представителей млекопитающих существенно различается.

Таблица 1

Активность транспортных АТФаз в (мкмоль Фн/мл клеток/час) в эритроцитах и тенях эритроцитов млекопитающих._ ._

Ка,К-АТФаза Са-АТФаза

Крыса (п = 8) эритроциты 21,2 + 1,8 36,2 ± 1,7

тени эритроцитов 7,10 ±0,44 8,60 + 0,61

Мышь ( п = 40) эритроциты 16,8 ±0,67 23,5 ± 1,7

тени эритроцитов 7,50 ±0,39 8,20 ±0,44

Морская свинка (п = 8) эритроциты 6,90 ±0,32 23,8 + 1,0

тени эритроцитов 4,40 ±0,13 2,49 ±0,45

Хомячок (п = 8> эритроциты 5,50 ± 0,43 7,40 ±0,60

тени эритроцитов 4,67 ±0,27 4,58 + 0,46

Кролик (п = 6) эритроциты 2,10 ±0,25 15,7+1,4

тени эритроцитов 1,97 ±0,12 4,54 ±0,40

Активность Ка,К-АТФазы, выявляемая в эритроцитах крысы и мыши, была в 3-4 раза выше, чем в эритроцитах хомячка и морской свинки и 8-10 раз выше, чем в эритроцитах кролика. Активность Са-АТФазы колебалась в меньших пределах, однако, также существенно различалась. В тенях эритроцитов исследованных животных эти различия были менее выражены как для ИаД-АТФазы, так к для Са-АТФазы. Обращает на себя внимание более низкий уровень активности транспортных АТФаз в тенях эритроцитов по сравнению с целыми клетками. Так, для №,К-АТФазы препаратов клеток крысы, мыши и морской свинки различия в активности фермента составили 1,5-3 раза и практически отсутствовали в случае хомячка и кролика. Са-АТФаза в тенях эритроцитов всех исследованных животных была ниже, чем в целых эритроцитах в 2-10 раз. Результаты проведенного исследования позволяют высказать предположение, что в эритроцитах млекопитающих присутствуют модуляторы (активаторы) активности транспортных АТФаз, которые удаляются в ходе получения мембранных препаратов эритроцитов. Отсутствие различий активности Ыа,К-АТФазы в эритроцитах и тенях эритроцитов кролика и хомячка указывает на то, что, скорее всего, модулятор (ы) активности этого фермента связаны с мемраной или, что менее вероятно, вообще отсутствуют в клетках этих животных.

С целью выяснения этого вопроса была проведена серия экспериментов, в которой мембранные препараты эритроцитов прединкубировались с внутриклеточным содержимым эритроцитов млекопитающих. Как показали результаты исследования, прединкубация мембранных препаратов эритроцитов крысы с гомогемолизатом приводила к повышению активности Ка,К-АТФазы и Са-АТФазы на 40% и 80%, соответственно. Гомогемолизат морской свинки активировал Ыа,К-АТФазу теней эритроцитов этого животного на 35%, а Са-АТФазу на 94%. В мембранных препаратах эритроцитов кролика гомогемолизат не активировал На,К-АТФазу, но активировал Са-АТФазу на 46%. Обработка мембранных препаратов эритроцитов кролика гетерогемолизатом (гемолизатом эритроцитов крысы) вызывала повышение активности Ыа,К-АТФазы на 69 %. Полученные результаты исследования указывают на отсутствие видоспецифичности модуляторов активности ферментов, а также на то, что активация транспортных АТФаз обусловлена различными по природе модуляторами. Об этом свидетельствует отсутствие активации гомогемолизатом ИаД-АТФазы теней эритроцитов кролика, в то время как Са-АТФаза выраженно активировалась тем же гемолизатом. На следующем этапе наших исследований мы сравнивали активность транспортных АТФаз в тенях эритроцитов этих млекопитающих и в препаратах мембран, лишенных основных белков мембранного скелета.

3. Сравнительное исследование активности транспортных АТФаз в тенях эритроцитов и мембранных препаратах, лишенных белков мембранного скелета.

Из таблицы 2 видно, что активность Ыа,К-АТФазьг, рассчитанная на мг белка в мембранных препаратах, лишенных белков мембранного скелета (бесспектриновые мембраны), крысы, морской свинки и хомячка была равна активности фермента в тенях эритроцитов, в то время как активность Са-АТФазы в бесспектриновых мембранах была в 1,5-3 раза ниже по сравнению с активностью фермента в тенях эритроцитов у всех представителей млекопитающих, за исключением кролика. При расчете на мл клеток удельная активность На,К-АТФазы и Са-АТФазы была в 1.5-4 раза ниже в бесспектриновых мембранах по сравнению с тенями эритроцитов. Таким образом, показано, что удаление белков мембранного скелета сопровождается снижением активности транспортных АТФаз, при этом, более выраженным в случае Са-АТФазы.

4. Сравнительное исследование свойств уабаин-чувстительной фосфа-тазы в тенях и бесспектриновых мембранах эритроцитов крысы.

На рис. 4 представлены данные по влиянию возрастающих концентраций МцСЬ на активность Ка,К-АТФазы и уабаин-чувствительной К- фос-фатазы в исследуемых препаратах мембран эритроцитов крысы. Видно, что в тенях эритроцитов при концентрации МлСЬ в среде инкубации выше АТФ (3 мМ) активность Ыа,К-АТФазы снижалась, а уабаин-чувствительной фосфатазы, напротив, возрастала. В бесспектриновых мембранах имела место несколько иная картина: так, если в случае фосфатазы, также наблюдалось повышение ферментативной активности, то для Ма,К-АТФазы модулирующего влияния ионов Мя2+ на ее активность выявлено не было и, в том числе, отсутствовало выраженное повышение ак-

Рис. 4. Зависимость активности Иа.К-АТФазы (а) и уабаин-чувствительной К-фосфатазы (б) в тенях эритроцитов крысы и бесспектриновых мембранах от концентрации МцСЬ в среде инкубации. Ряд 1 - тени эритроцитов; Ряд 2 - бесспектриновые мембраны. ( п = 9)

Таблица 2

Активность транспотных АТФаз в тенях эритроцитов и бесспектриновых мембранах.

Вид животного Транспортные АТФазы Тени эритроцитов Бесспектриновые мембраны, полученные в различных средах удаления белков мембранного скелета эритроцитов.

1 мМ трис-НС1 +0,1 мМ ЭДТА, рН 7,6 10 мМтрис-НС1 +1 мМ ЭДТА, рН 6,91 10 мМ трис-НС1, рН 7,6 ЮмМ трис-НС1 + 1 мМ ЭДТА, рН 7,6 10 мМ трис-НС1 + 1 мМ ЭДТА. рН 8,01

Крыса (п = 8) Иа.К-АТФаза 1,90+0,13 8,77 ± 0,63 1,81 +0,12 3,60 ± 0,24 2,57 + 0,19 7,81 ±0,58 1,54 + 0,11 3,26 ± 0,23 1,56 + 0,08 3,78 + 0,19 2,34 + 0,17 6,52 ± 0,47

Са-АТФаза 2,04 + 0,16 9,42 ±0,74 1,45 + 0,11 2,90 ±0,21 3,41 + 0,25 10,3 ±0,75 1,18 + 0,09 2,51 ±0,19 1,45 + 0,13 3,55 ± 0,32 2,01 +0,11 5,60 ±0,31

Морская свинка (п = 7) Ыа,К-АТФаза 0,92 + 0,07 3,96 ± 0,32 1,14 + 0,09 1,91 ±0,15 1,45 + 0,12 5,13 + 0,43 0,65 + 0,04 1,79 ±0,11 1,12 + 0,13 3,52 ±0,14

Са-АТФаза 0,95 + 0,06 4,09 ± 0,26 0,38 + 0,03 0,64 ± 0,05 1,26 + 0,08 4,46 ± 0,28 0,40 + 0,03 1,10 ± 0,08 0,69 + 0,04 2,17 ± 0,13

Кролик (п = 7) ШД-АТФаза 0,47 + 0,03 1,97 + 0,13 0,39 + 0,04 0,66 ±0,07 0,51 + 0,04 1,70 + 0,13 0,32 + 0,03 1,10 ± 0,12 0,17 + 0,02 0,54 ±0,03 0,35 + 0,04 1,09 ±0,12

Са-АТФаза 1,29 + 0,13 5,41 ±0,55 1,87 + 0,15 3,15 ±0,25 1,03 + 0,09 3,43 + 0,30 0,35 + 0,03 1,19 + 0,10 0,36 + 0,04 1,11+0,13 0,87 + 0,06 2,71+0,13

Хомячок (п = 8) ШД-АТФаза 0,95 + 0,10 4,42 ±0,46 1,12 + 0,09 1,83 ±0,15 0,91 + 0,08 1,81 ±0,20

Са-АТФаза 0,85 + 0,10 3,96 ± 0,46 0,58 + 0,04 0,95 + 0,07 0,48 + 0,03 0,97 + 0,08

Примечание: верхние строчки - активность фермента выражена в мкмоль Фн/мг белка/час; нижние строчки - активность фермента выражена в мкмоль Фн/мл клеток/час. Состав среды определения ферментативной активности - стандартный (см. Материалы и методы исследований).

Таким образом, показано, что удаление спектрин-актиновой сети приводит к исчезновению модулирующего влияния ионов на общую АТ-Фазную активность. В бесспектриновых мембранах обе ферментативные активности (расчитагагые на 1 мл клеток) при всех концентрациях МцСЬ были значительно ниже, чем в исходных тенях эритроцитов. Так как №,К-АТФаза является интегральным белком, который не может быть солюби-лизирован в условиях получения бесспектриновых мембран, можно заключить, что обнаруженное снижение связано, скорее всего, либо с потерей активаторов фермента, связанных с мембраной, либо с изменением каталитических свойств фермента. Для решения данного вопроса было исследовано влияние увеличивающихся концентраций АТФ и подщелачивания инкубационной среды на активность уабаин-чувствительной фосфатазы в препаратах мембран клеток, т.е. факторов, способствующих трансформации белковой глобулы фермента из конформации Ег в конформацию Еь При этом, исследование было проведено при разных соотношениях концентраций Ыа+ и К+ в инкубационной среде, т.е. при разном соотношении калиевой и натриевой форм фермента. В отсутствие АТФ и в присутствии 0,25 мМ АТФ в среде инкубации активность уабаин-чувствительной фосфатазы в обоих мембранных препаратах, определяемая при высоком содержании ионов К+, была приблизительно в 2 раза выше, чем в средах с преобладанием ионов Увеличение концентрации АТФ в инкубационной среде сопровождалось повышением активности уабаин-чувствительной фосфатазы как в тенях, так и бесспектриновых везикулах. Следует отметить, что наибольшая активность уабаин-чувствительной фосфатазы в бесспектриновых мембранах выявлялась при меньших концентрациях АТФ (0,5 мМ), чем в тенях эритроцитов. Принципиальное отличие свойств фермента в тенях и бесспектриновых мембранах заключается в выраженной активации К-фосфатазы в тенях при 1 мМ АТФ в высококалиевой среде (рис. 5а, кривая I). В этих условиях абсолютная активность фермента в тенях более чем в 2 раза превышала активность при иных соотношениях одновалентных катионов. В бесспектриновых мембранах этот феномен отсутствовал.

Рис. 5. Зависимость активности уабаин-чувствительной К-фосфатазы в тенях эритроцитов крысы (а) и бесспектриновых мембранах (б) от концент-

рации АТФ в среде инкубации. Ряд 1 - КаС1/КС1 = 30/150 мМ; Ряд 2 -КаС1/Ка = 95/75 мМ; Ряд 3 - ЖСЖа =170/10 мМ. ( п = 9 )

При увеличении рН инкубационной среды от 6.8 до 7.8 активность уа-баин-чувствительной фосфатазы снижалась в обоих препаратах мембран, но данная тенденция наблюдалась только в случае относительно высокой концентрации калия в среде инкубации (рис.6).

Рис.6. Зависимость активности уабаин-чувствительной К-фосфатазы в тенях эритроцитов крысы (а) и бесспектриновых мембранах (б) от рН среды инкубации. Ряд 1 - КаС17КС1 = 30/150 мМ; Ряд 2 - ЫаСЖСЛ = 95/75 мМ; Ряд 3 - ИаСЖС! = 170/10 мМ. (п = 9 )

Эти результаты исследований находятся в соответствии с представлениями о том, что процесс превращения К-конформации фермента в натриевую сопровождается депротонированием активного центра фермента, которое облегчается при защелачивании среды инкубации (Федосова и со-авт.,1993; 5кои,1982).

Результаты исследования показывают, что удаление основных белков мембранного скелета (спектрина и актина) сопровождается снижением как АТФазной, так и фосфатазной активности фермента, приводит к исчезновению модулирующего влияния ионов М£2+ на общую ИаД-С-АТФазную активность и изменению модулирующего влияния АТФ на уабаин-чувствительную К- фосфатазу в высококалиевой среде. Это свидетельствует о влиянии белков мембранного скелета на функционирование транспортной АТФазы. Можно предположить, что удаление основных белков мембранного скелета - спектрина и актина, являющихся стабилизаторами фос-фолипидного бислоя (СаЬег е1 а1.,1988), сопровождается нарушением упорядоченности упаковки фосфолипидов, а также изменениями в их трансмембраной ассиметрии (Tong е1 а1.,1994). С другой стороны, следует учитывать и литературные данные о непосредственной связи а-субъединицы Ыа,К-АТФазы с белками мембранного скелета, через белок анкирин (Devarajan а1.,1994). Поэтому, удаление основных белков мембранного скелета может привести к изменению внутримолекулярной организации интегрированного в бислой фермента, т.е. к состоянию, при кото-

ром изменяется способность фермента претерпевать конформационные изменения в ходе реакционного цикла, в результате чего изменяется каталитическая активность фермента. Однако, учитывая цитоплазматическую локализацию активного центра ИаД-АТФазы, и его стерическухо близость к спектрин-актиновой сети, можно предположить, что белки мембранного скелета могут быть непосредственно вовлечены в одну из реакций каталитического цикла фермента. Поскольку выявлены существенные изменения активности и кинетических свойств К-фосфатазы в препаратах мембран эритроцитов после удаления белков мембранного скелета, не исключено, что такой реакцией может быть дефосфорилирование фермента. По-видимому, в нативных мембранных препаратах (тенях эритроцитов) дефосфорилирование фермента сопровождается не только высвобождением неорганического фосфата в водную фазу, но и переносом остатка фосфорной кислоты на белки мембранного скелета (скорее всего, спектрин). Предполагаемая гипотеза позволяет объяснить выявленные различия в активности и кинетических свойствах фермента в тенях эритроцитов и бесспек-триновых мембранах.

6. Влияние гемолизата эритроцитов на активность транспортных АТФаз из различных источников.

В литературе имеются сведения о наличии в эритроцитах млекопитающих ингибитора Ш,К-АТФазы (Уп^^ШЯ; й а1.,1992), а также предполагается присутствие активатора фермента (Петруняка и соавт.,1991; Петруняка, Панюшкина, 1994). Последними авторами было высказано предположение о том, что модуляторы активности N а, К-АТФаз ы могут обладать как так и Са2+-зависимыми свойствами. Учитывая это, в

данном разделе работы изучалось влияние двухвалентных катионов М§2+, Са2+ и АТФ на процесс активации гемолизатом Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга, теней эритроцитов и бесспектриновых мембран. Пара-лельно определялась активность Са-АТФазы. Головной мозг был выбран в качестве объекта исследований в связи с высокой активностью и функциональной важностью К'а,К-АТФазы в этой ткани. Сравнительное исследование процесса активации гемолизатом транспортных АТФаз в тенях эритроцитов и в препаратах мембран, лишенных белков мембранного скелета, позволяет определить роль этих белков в передаче модулирующего влияния внутриклеточных факторов на активность исследуемых ферментов.

Как показали результаты исследования, гемолизат эритроцитов активировал Иа.К-АТФазу гомогената головного мозга крыс в среднем на 40% при всех концентрациях М^СЬ в среде инкубации. Прединкубация теней эритроцитов с гемолизатом (рис.7 а) приводила также к повышению активности Ма,К-АТФазы; при этом, при увеличении концентрации МдСЬ в среде инкубации, процент активации возрастал, достигая при 12 мМ МдСЬ 50 %. В бесспектриновых мембранах обнаружена обратная зависимость:

14

и

я 12 £ 10

5

"5

е

л с о г

&

б)

ПРядУ ИРдгЙ

Рис. 7. Активность №,К-АТФазы в тенях эритроцитов крысы (а) и бесспектриновых мембранах (б) до (ряд 1) и после (ряд 2) прединкубации с гемолизатом.

1 - 3 мМ МдСЬ в среде инкубации; 2-6 мМ МдС!г в среде инкубации; 3-12 мМ МдС1г в среде инкубации. (п = 9)

в

2

Рис. 8. Активность уабаин-чувствительной К-фосфатазы в тенях эритроцитов крысы (а ) и бесспектриновых мембранах (б), прединкубированных с гемолизатом в отсутствие (1, 2) и присутствии (3, 4) 0,5 мМ АТФ в среде инкубации. (п = 9)

1, 3 - нативные тени эритроцитов; 2, 4 - тени эритроцитов, прединкуби-рованные с гемолизатом.

если при 3 мМ М§СЬ процент активации составил 45 %, то при 12 мМ \-lgCl2 активация практически отсутствовала( рис. 7 б).

Исследование влияния гемодизата на частную реакцию Ыа,К-АТФазы -К-фосфатазную, показало практически полное ингибирование активности уабаин-чувствительной фосфатазы в тенях эритроцитов и снижение активности фермента в бесспектриновых мембранах до 28 % от исходного уровня. Внесение 0.5 мМ АТФ в среду инкубации уменьшало ингибирование гемолизатом активности уабаин-чувствительной фосфатазы, однако, восстановления активности фермента до исходного уровня в тенях эритроцитов не происходило, в отличие от фермента бесспектриновых мембран (рис.8). Внесение ионов Са2+ в среду инкубации не влияло на процент активации гемолизатом Ка,К-АТФазы гомогеиата головного мозга крысы. В то же время, в тенях эритроцитов активация фермента гемолизатом увеличивалась до 46 % в присутствии 0.5 мМ СаСЬ в среде инкубации (против 24% в контроле). В бесспектриновых мембранах, напротив, активация после внесения 0.5 мМ СаСЬ исчезала. Са-АТФаза гомогената головного мозга, а также обоих препаратов мембран эритроцитов активировалась гемолизатом примерно в 2 раза.

Таким образом, полученные результаты показывают, что в гемолизате эритроцитов присутствуют модуляторы активное™ транспортных АТФаз, эффект которых зависит от ионного состава инкубационной среды и вида мембранного препарата. Факторы, присутствующие в гемолизате, активируют общую АТФазную реакцию и, в то же время, значительно подавляют К-фосфатазную как в тенях эритроцитов, так и в бесспектриновых мембранах, при этом, несколько менее выражение в присутствии АТФ. По-видимому, эти факторы способствуют конформационному переходу фермента Ег * Е> и ускорению скорости оборота полного ферментативного цикла. Для данного эффекта необходимо присутствие двухвалентных катионов и интактность мембранного скелета. В случае бесспектриновых мембран, Мц2+ и Са2+, напротив, подавляют проявление активирующего, в отношении общей АТФазной активности, действия гемолизата.

7. Влияние смеси солюбилизированных белков мембранного скелета па активность транспортных АТФаз из различных источников.

Прежде всего исследовали влияние солюбилизированных белков мембранного скелета (СБМС), выделенных из препаратов мембран, полученных при использовании ЭДТА в средах гемолиза и промывающих растворах. Прединкубация гомогената головного мозга крыс и теней эритроцитов с СБМС приводила к достоверному повышению активности Ка,К-АТФазы. При увеличении концентрации МдСЬ от 3 до 12 мМ MgCÍ2 в среде инкубации процент активации фермента в гомогенате головного мозга крыс возрастал с 19% до 76%. В тенях эритроцитов активация фермента гемолизатом также увеличивалась при повышении концентрации ионов магния в среде инкубации и достигала 37 % при 12 мМ МдСЬ. В бесспектриновых мембранах обнаружена иная закономерность: если при 3 мМ МдСЬ в среде

Рис. 9. Активность Ма,К-АТФазы в тенях эритроцитов крысы (а) и бесспек-триновых мембранах (б) до ( Ц } и после ( ) прединкубации с СБМС. 1 - 3 мМ МдС1г в среде инкубации; 2 - 6 мМ МдСЬ в среде инкубации; 3- 12 мМ МдСЬ в среде инкубации. (п = 9)

Рис. 10. Активность уабаин-чувствителъной К-фосфатазы в тенях эритроцитов крысы (а) и бесспектриновых мембранах (б), прединкубированных с СБМС в отсутствие (1, 2) и присутствии (3, 4) 0,5 мМ АТФ в среде инкубации. 1, 3 - нативные тени эритроцитов; 2, 4 - тени эритроцитов, предин-кубированные с СБМС. (п = 9)

инкубации процент активации составлял 69%, то при 12 мМ MgCh активация практически исчезала (рис.9). Таким образом, характер активации Na.K-АТФазы препаратов мембран клеток под действием СБМС был схож с таковым в случае обработки мембран гемолизатом. Это позволяло предположить, что активация Ыа,К-АТФазы СБМС обусловлена влиянием тех же факторов. Между тем, в отличие от гемолизата, СБМС лишь на 30% ин-гибировали уабаин-чувствительную фосфатазную активность в тенях эритроцитов, а внесение 0.5 мМ АТФ в среду инкубации полностью снимало их ингибирующий эффект. В бесспектриновых мембранах СБМС, в отличие от гемолизата, активировали уабаин-чувствительную фосфатазу как в отсутствие, так и в присутствии 0.5 мМ АТФ в среде инкубации (рис.10). Внесение в среду инкубации 0.5 мМ CaCh не изменяло процента активации Na.K-АТФазы солюбюшзированными белками мембранного скелета как в тенях эритроцитов, так и в бесспектриновых мембранах, а также не влияло на процесс активации фермента гомогената головного мозга крыс под действием СБМС.

Таким образом, при одинаковом влиянии гемолизата и СБМС на общую Ыа,К-АТФазу из разных мембранных источников, обнаружены принципиальные отличия в их действии на К-фосфатазную реакцию. Можно сделать вывод о разных механизмах модулирующего влияния гемолизата и СБМС. По-видимому, в СБМС содержаться дополнительные факторы, вовлеченные в регуляцию активности фермента. Основываясь на данных предыдущего раздела, таковыми можно рассматривать основные высокомолекулярные белки мембранного скелета (спектрин и актин), структурная организация которых зависит от ионного состава среды и присутствия минорных белков-регуляторов.

В литературе имеются сведения о том, что внесение ЭДТА на стадиях гемолиза эритроцитов и отмывания препаратов мембран от внутриклеточного содержимого способствует удалению из препаратов мембран кальмо-дулина (Орлов и соавт.,1985), кальнактина (Yingst,1988) и тропомиозина (Bennett, 1989), белка способного контролировать длину актиновых фила-ментов и регулировать сродство спектрина к актину (Salzer et al.,1993); при этом, ионы Са2+ и Mg2+ регулируют протекание этого процесса (Bennett,1990). Отмечено, что короткие фгагаменты актина стимулируют активность Na.K-АТФазы (Bertorello,Katz,1993). Исходя из этих данных, было проведено исследование на мембранных препаратах эритроцитов, полученных с использованием разных сред гемолиза и отмывающих растворов. Было показано, что в случае отсутствия ЭДТА в гемолизирую-щем и промывающих растворах при получении теней эритроцитов, СБМС, выделенные из таких мембранных препаратов, активируют Na,K-АТФазу гомогената головного мозга крыс; при этом, ионы Са2+ уменьшают активацию, что свидетельствует о том, что в данной смеси белков мембранного скелета содержится не только активатор, но и Са-зависимый фактор, обладающий противоположным эффектом. Внесение ионов Mg2+ в среду гемолиза эритроцитов, а также в промывающие препараты мембран

растворы (что предотвращает диссоциацию тропомиозина из эритроци-тарной мембраны), показало следующие результаты (табл.3).

Таблица 3

Активность транспортных АТФаз в микросомально-митохондриальной фракции коры больших полушарий головного мозга крыс до и после предин-кубации с солюбилизироваиными белками мембранного скелета эритроцитов. _______

Активность ферментов в мкмоль Фи/мг белка/час

АТФаза Контроль СБМС "А" Контроль СБМС "В" Контроль СБМС "С"

Ш,К-АТФаза 8,7 + 0,5 11,0+0,6* 8,9 + 0,6 10,3+1,1 9,1 + 0,7 8,0 ±0,3

7,9 ±0,3 9,5 ±0,5* 7,8 ± 0,4 9,1 ±0,8 8,0 + 0,4 6,1 ±0,5*

Са-АТФаза 0,70+0,09 1,6+0,2** 0,80+0,07 1,7+0,2** 2,0 + Ь,3 2,3 + 0,2

Примечание: Гемолиз эритроцитов и промывание мембранных препаратов проводили в 10 мМ трис-НС1 буфере (рН 7,6 при 25°С), содержащем 1 мМ ЭДТА, а также 0,2 мМ М8СЬ (СБМС "А"), 0,5 мМ М§СЬ (СБМС "В") или 2 мМ МёСЬ (СБМС "С"). Солюби-лизацию белков мембранного скелета проводили путем инкубации полученных теней эритроцитов при 37°С в течение 30 минут в 1 мМ трис-НС1 буфере (рН 7,6 при 25°С) + 0,1 мМ ЭДТА, содержащем 0,02 мМ М£СЬ (СБМС "А"), 0,05 мМ К^СЬ (СБМС "В") или 0,2 мМ (СБМС "С"). Контролем служил гомогенат головного мозга крыс, предин-кубированный в соответствующей среде удаления белков мембранного скелета. Результаты являются средним значением из 8 экспериментов. *р< 0,05; **р< 0,01. В графе ,гЫа,К-АТФаза": верхние строчки - активность фермента в отсутствие СаСЬ в среде инкубации; нижние строчки - активность фермента в присутствии 1 мМ СаСЬ в среде инкубации.

Прединкубация гомогената головного мозга крыс с СБМС "А" приводила к активации №,К-АТФазы как в присутствии, так и в отсутствие СаСЬ в среде определения ферментативной активности. Са-АТФаза активировалась СБМС в 2 раза. Однако, прединкубация гомогената головного мозга крыс с СБМС "С" не приводила к активации ЫаД-АТФазы в отсутствие СаСЬ в среде инкубации; внесение 1 мМ СаСЬ позволило, напротив, выявить ингибирующий эффект СБМС на 1Ча,К-АТФазу гомогената головного мозга крыс. Са-АТФаза не изменяла свою активность после пре-динкубации гомогената головного мозга с СБМС "С". В тенях эритроцитов ингибирующий эффект на Ка,К-АТФазу в присутствии ионов Са2+ в среде инкубации был выявлен после прединкубадии теней эритроцитов с СБМС "В" (табл. 4). Таблица 4

Активность транспортных АТФаз тенен эритроцитов крысы до и после пре-динкубации с солюбилизироваиными белками мембранного скелета._

АТФаза Активность ферментов в мкмоль Фн/мл клеток/час

"А"-тени эритроцитов "В"-тени эритроцитов "С"-тени эритроцитов

Контроль СБМС "А" Контроль СБМС "В" Контроль СБМС "С"

№,К-АТФаза 7,9 ±0,3 9,8 + 0,4* 10,5 ±0,9 9,8 + 0,8 7,8 + 0,6 7,8 ± 1,2

6,5 ±0,2 7,6 + 0,4* 8,3 ±0,6 6,6±0,5* 5,7 ± 0,4 6,3 ± 0,6

Са-АТФаза 9,1 ±0,4 11,5+0,6* 10,1 ±0,8 13,2±1,2* 14,0 + 0,7 15,5 ±0,8

Примечание: Гемолиз эритроцитов и промывание теней эритроцитов проводили в 10 мМ трис-НС1 буфере (рН 7,6 при 25°С), содержащем 1 мМ ЭДТА и 0,2 мМ М§СЪ ("А" -

тени эритроцитов), 0,5 мМ MgCh ("В" - тени эритроцитов), 2 мМ MgCh ("С" - тени эритроцитов). Удаление белков мембранного скелета проводили путём инкубации полученных теней эритроцитов при 37°С в течение 30 минут в 1 мМ трис-HCl буфере (рН 7,6 при 25°С) содержащем 0,1 мМ ЭДТА и 0,02 мМ MgCh (СБМС - "А"), 0,05 мМ MgCh (СБМС - "В") и 0,2 мМ (СБМС - "С"). Контролем служили мембранные препараты, прединкубированные в соответствующей среде удаления белков мембранного скелета. Результаты являются средним значением из 7 экспериментов. *р< 0,05; В графе "Na,K-АТФаза":верхние строчки- активность фермента в отсутствие СаСЬв среде инкубации; нижние строчки - активность фермента в присутствии 1 мМ СаСЬ в среде инкубации.

Результаты экспериментов показывают, что при получении теней эритроцитов в стандартных условиях происходит удаление модуляторов активности ферментов, которые можно сохранить, исключая из сред получения препаратов мембран ЭДТА, либо, напротив, вводя в эти среды двухвалентные катионы. Действительно, нами было показано, что введение ионов Са2+ в гемолизирующую и промывающие среды позволяет получить тени эритроцитов, СБМС которых активируют Ыа,К-А'ГФазу гомогената головного мозга крыс; внесение ионов Са2+ в среду инкубации уменьшает в 1.5 раза активирующий эффект белков. Таким образом, внесение ионов Са2+ в среды получения мембранных препаратов (как и исключение ЭДТА) позволяет сохранить Са-зависимое модулирующее влияние СБМС на активность К'а,К-АТФазы. Таким же эффектом обладают и двухвалентные ионы Mg2+. Совокупность полученных результатов позволяет нам сделать вывод, что в смеси солюбилизированных белков мембранного скелета содержатся как М§2+-зависимый фактор, усиливающий процесс активации Ыа,К-АТФазы белками мембранного скелета , так и Са2+-зависимый фактор, устраняющий эффект активации, либо угнетающий активность фермента. Эффекты СБМС на Na.K-АТФазу могут быть объяснены с учетом литературных данных (Bertorello & Cantiello, 1992) об активирующем влиянии коротких филаментов актина на фермент. Исходя из классических представлений об участии АТФ, Са2+ и Mg2+ в процессе полимеризации G-актина, а также о влиянии тропомиозина на этот процесс, активирующий эффект или его отсутствие определяется концентрацией коротких филаментов актина в среде определения ферментативной активности, которые способствуют переходу фермента из конформации Ei в Ег (Bertorello & Cantiello, 1992). При получении теней в среде с низкой ионной силой F-актин диссоциирует на молекулы G-актина. Введение СБМС в среду определения ферментативной активности Ка,К-АТФазы сопровождается полимеризацией актина, степень которой (а следовательно и степень активации Ыа,К-АТФазы) зависит от соотношения АТФ, Са2+, Mg2+. Са2+ препятствует, a Mg2+ способствует полимеризации актина и их соотношение определяет концентрацию тех форм актина, которые и обладают активирующим действием (короткие филаменты актина). В случае получения теней с сохраненным тропомиозином (в присутствии Mg2+), диссоциации F-актина, очевидно, не происходит, т.к. этот катион, кроме того, способствует ассоциации тропомиозина с длинными филаментами актина (критическая концентрация Mg2+ - 0,5 - 2 мМ) (Fowler, Bennett, 1984). Следовательно, СБМС

из таких теней не должны обладать сколь либо существенным активирующим эффектом, а введение Са:' должно снижать активность фермента, что и обнаружено в нашем исследовании. Повышение же активности К-фосфатазы под влиянием СБМС, не содержащих тропомиозина, по-видимому, связано с увеличением количества молекул фермента в конфор-мации Ег под влиянием коротких филаментов актина. Для окончательного выяснения этого вопроса в следующей серии экспериментов было проведено разделение СБМС на отдельные фракции с помощью гель-фильтрации на сефадексах и изучено влияние белков этих фракций на активность транспортных АТФаз из разных источников.

8. Влияние отдельных фракций солюбилизированных белков мембранного скелета на активность транспортных АТФаз из разных источников.

На рис. 11. приведены кривые элюции белка после нанесения исходного и концентрированных с помощью сефадексов С-15 и С-25 супернатантов, содержащих солюбилизированные белки мембранного скелета, подученные в результате инкубирования теней эритроцитов в среде с низкой ионной силой без Мд2+. Некоицентрированный супернатант элюировался из колонки в виде одного белкового пика во фракциях N 6-12. При разделении концентрированных на сефадексах С-15 и С-25 супернатантов выявлялось 2 пика; первый пик в тех же фракциях , а второй - во фракциях 21-26. При предварительном концентрировании СБМС на сефадексе в-15 второй пик был более выраженным. ______

Рис. 11. Профиль элюции белков из колонки, заполненной сефадексом С-75. Ряд 1 - без предварительной концентрации СБМС; Ряд 2 - предварительная концентрация СБМС на сефадексе С-25; Ряд 3 - предварительная концентрация СБМС на сефадексе С-15.

На рис. 12 представлены схемы типичных электрофореграмм полипептидов исходных теней, мембранных препаратов, лишенных периферических белков, СБМС и белковых фракций обоих пиков. Видно, что тени содержа-

ли полный набор белков, характерных для мембран безъядерных эритроцитов. После инкубации их в среде с низкой ионной силой, из мембран удалялись основные белки мембранного скелета - спектрин (полосы 1 и 2) и актин (полоса 5), причем, эти белки выявлялись в супернатанте ( смеси солю-билизированных белков мембранного скелета). Пик 1 содержал в основном спектрин (обе его субъединицы 260 и 235 кДа) и небольшое количество актина (43 кДа). Во фракциях пика 2, несмотря на относительное большое содержание белка, не удалось выявить ни одной белковой полосы.

1 2 3 Ч 5 6 7 В

5-

Рис.12. Полипептидный состав мембранных препаратов эритроцитов крысы и СБМС. 1-исходные тени эритроцитов; 2-бесспектриновые мембраны; 3- супернатант, содержащий СБМС; 4- белки пика 1 после элюции неконцентрированной смеси СБМС; 5,6-беяки пика 1 после элюции концентрированной на сефадексах С-15 и в-25 смеси СБМС, соответственно; 7,8- белки пика 2 после элюции концентрированной на сефадексах в-15 и С-25 смеси СБМС, соответственно.

Данные по влиянию отдельных белковых фракций, полученных после разделения смеси неконцентрированных белков мембранного скелета, на активность транспортных АТФаз гомогената головного мозга крыс представлены в табл. 5.

Таблица 5

Прирост активности транспортных АТФаз ( в % ) в микросомально-митохондриальной фракции коры больших полушарий головного мозга крысы после прединкубации с белками фракций пика I, полученных после элюции на колонке неконцентрированной смеси СБМС.

Мембранные препараты АТФаза Номера белковых фракций пика!

8 9 10 И 12

Гомогенат головного мозга Na.K-АТФаза 16 + 3 10 + 2 25 + 3* 8 + 2 21+4* 12 + 3 22 + 3* 15 + 2 11 + 2 8 + 2

Са-АТФаза 40+4* 250+ 25" 250+ 32** 225+ 20** 60 + 7*

Результаты являются средним значением из 8 экспериментов. * р< 0.05 В графе " N а, К-АТФ аз а": верхняя строчка- активность фермента в отсутствие СаСЬ в среде инкубации; нижняя строчка - активность фермента в присутствии 1 мМ СаСЬ в среде инкубации.

Видно, что практически все фракции пика 1 активируют ИаД-АТФазу в отсутствие ионов Са2+ в среде инкубации. Внесение 1 мМ СаС12, снижало

активирующий эффект на фермент белков фракций пика в 1.5-3 раза. Са-АТФаза активировалась белками этого пика более выраженно. Прединку-бация белков фракции Nile гомогенатом головного мозга крыс показала, что зависимость активации Ка,К-АТФазы белками фракции от концентрации ионов Mg2+ в среде инкубации отсутствовала. Следовательно можно сделать вывод, что после гель-фильтрации СБМС на сефадексе G-75 происходит потеря фактора, определяющего Mg-зависимость процесса активации Ка,К-АТФазы.

Прединкубация теней эритроцитов и бесспектриновых мембран с белковыми фракциями пика 1, полученного после элюции на колонке неконцентрированной смеси СБМС, показала следующие результаты (табл. 6).

Наиболее выраженно белковыми фракциями пика 1 активировалась Na.K-АТФаза бесспектриновых мембран; внесение ионов Са3+ в среду инкубации снимало активирующий эффект белков. Са-АТФаза теней эритроцитов не активировалась белками фракций пика 1, но активировалась этими белками в бесспектриновых мембранах.

Таблица 6

Прирост активности транспортных АТФаз ( в %) в тенях эритроцитов и бесспектриновых мембранах после прединкубации с белками фракций пика I, полученных после элюции на колонке неконцентрированной смеси СБМС.

Мембранные препараты АТФаза Номера белковых фракций пика!

8 9 10 11 12

Теии эритроцитов Na,K-AT«&a3a 14 + 2 17 + 2* 5 + 2 9 + 3 6 + 2 11+2 16 + 2* 17 + 1* 12+1 11 +1

Са-АТФаза 6 + 2 12 + 3 11+3 4 + 2 6+2

Бесспект-риновые мембраны Na,K-AT<t>a3a 14+2 0 + 4 18 + 4* 7 + 1 21 +3* -3 + 1 25 + 3* -7 + 2 18 + 3* 3+1

Са-АТФаза 15 + 3 30 + 3* 30 + 4* 30 + 4* 0 + 5

Результаты являются средним значением из 8 экспериментов. * р < 0.05 В графах "Ыа,К-АТФаза": верхняя строчка - активность фермента в отсутствие СаСЬ в среде инкубации; нижняя строчка - активность фермента в присутствии 1 мМ СаСЬ в среде инкубации.

Белки пика 1, полученные после элюции на колонке предварительно концентрированной смеси СБМС на сефадексе в-15, достоверно не активировали Ка,К-АТФазу теней эритроцитов, однако, в отсутствие СаСЬ в среде инкубации выраженно активировали фермент бесспектриновых мембран (29%); при этом внесение ионов Са2' в среду инкубации снимало активирующий эффект СБМС на фермент бесспектриновых мембран (рис. 13) .

Рис. 13. Прирост активности Ка,К-АТФазы (в % к контролю) в тенях эритроцитов крысы (а) и бесспектриновых мембранах (б) после прединку-бации с белками пика 1 (1) и 2 (2). О - в отсутствие СаСЬ в среде инкубации; ¡Ц - в присутствии 1 мМ СаСЬ в среде инкубации. (п = 9 )

Белки пика 2 не активировали Иа.К-АТФазу теней эритроцитов, но активировали в отсутствие ионов Са2+ фермент бесспектриновых мембран (26 %). После концентрирования смеси СБМС на сефадексе С-25, белки пика 1 не активировали фермент теней эритроцитов, но активировали Иа,К-АТФазу бесспектриновых мембран в присутствии ионов Са2+ в среде инкубации (26%).

Результаты данной серии экспериментов показывают, что в смеси СБМС присутствует фактор, активирующий ИаД-АТФазу, действие которого подавляется ионами Са2+ (рис.13 б). Этот фактор удаляется из смеси СБМС сефадексом О-25, но не С-15 и, поэтому, его молекулярный вес должен быть в пределах 1,5-5 кДа. Вместе с тем, начинает проявляться Са-зависимая активирующая способность СБМС. Исходя из высказанных предположений о том, что активирующим компонентом СБМС являются короткие филаменты актина, полученные результаты можно трактовать следующим образом. Среди белков мембранного скелета есть низкомолекулярный Са2+-ингибируемый фактор, регулирующий образование коротких филаментов актина (ограничивающий рост филаментов актина). Удаление его (при поглощении сефадексом в-25) приводит к неограниченному росту актиновых филаментов, который можно подавить ионами Са2+.

ВЫВОДЫ

1. Предогакубация эритроцитов млекопитающих с детергентом твином 20 позволяет выявить активность Ка,К-А'ГФазы без существенного изменения кинетических характеристик фермента. Внесение в среду гемолиза эритроцитов хелатора двухвалентных катионов предотвращает процесс "запечатывания" получаемых мембранных препаратов после помещения их в изотоничную инкубационную среду, что позволяет в 3-4 раза уменьшить содержание латентной формы фермента и получать стабильные и хорошо вопроизводимые значения удельной активности транспортных АТ-Фаз.

2. Удаление внутриклеточного содержимого из эритроцитов млекопитающих (но не кролика и хомячка) сопровождается снижением активности ИаД-АТФазы. Активность Са-АТФаза у всех представителей млекопитающих в тенях эритроцитов была ниже, чем в эритроцитах . Прединкуба-ция теней эритроцитов крысы и морской свинки с гомогемолизатом приводила к выраженной активации Ма,К-АТФазы и Са-АТФазы. Са-АТФаза теней эритроцитов кролика активировалась гомогемолизатом, в то время как Ка,К-АТФаза теней эритроцитов кролика активировалась только ге-терогемолизатом из эритроцитов крысы, но не гомогемолизатом. Эти данные свидетельствуют о том, что модуляция активности транспортных АТ-Фаз осуществляется различными по природе факторами.

3. Удаление белков мембранного скелета из теней эритроцитов млекопитающих приводит к снижению активности транспортных АТФаз. В экспериментах на мембраных препаратах эритроцитов крысы показано, что удаление основных белков мембранного скелета (спектрина и актина) приводит к изменению чувствительности фермента к модулирующему влиянию модификаторов реакционного цикла Ыа,К-АТФазы ( одно- и двухвалентные катионы, АТФ, рН инкубационной среды). На основании совокупности полученных данных высказано предположение, что белки мембранного скелета вовлечены в реакционный цикл транспортных АТФаз на стадии дефосфорилирования фермента.

4. Гемолизат эритроцитов и белки мембранного скелета, сотобилизи-рованные из теней эритроцитов крысы, активируют общую Ка,К-АТФазную активность как в тенях эритроцитов, так и в бесспектриновых мембранах. При этом, в зависимости от вида мембранного препарата, двухвалентные ионы и Са2+ оказывали на процесс активации фермента разнонаправленный эффект. Обнаружено принципиальное отличие в действии гемолизата и солюбилизированных белков мембранного скелета на уабаин-чувствительную К-фосфатазу, активность которой в бесспектриновых мембранах выраженно угнеталась гемолизатом, но активировалась белками мембранного скелета. Полученные данные свидетельствуют, что факторы, присутствующие в гемолизате, способствуют конформационному переходу фермента в состояние Е1 (Ма-форма), а солюбилизированные бел-

ки мембранного скелета сдвигают равновесие фермента в сторону конфор-мации Е2 (К-форма).

5. Солюбилизированные белки мембранного скелета из теней эритроцитов крысы, полученных с использованием различных сред гемолиза эритроцитов, а также промывающих растворов, обладают как активирующим, так и ингибирующим эффектом на активность ТЧа,К-АТФазы из различных источников. Выраженность этого эффекта определяется наличием и соотношением двухвалентных ионов Mg2+ и Са2+ в среде определения ферментативной активности.

6. Полученные с помощью гелоь-фильтрации на сефадексе G-75 высокомолекулярная фракция белков (пик 1) и низкомолекулярная фракция (пик 2) содержат Мц1У-зап1тсимый фактор, увеличивающий активацию Na,K-АТФазы белками мембранного скелета, и Са2+ -зависимый фактор (1,5-5 кДа), снижающий этот эффект.

7. Совокупность полученных результатов позволяет заключить, что в эритроцитах млекопитающих содержатся зависимые от двухвалентных катионов мембраносвязанные модуляторы ( Mg2+ -активирующий и Са2+-ингибирующий) активности ИаД-АТФазы, эффекты которых зависят от интактности мембранного скелета эритроцитов, что свидетельствует о непосредственной роли цитоскелетных белков в восприятии и трансформации внутриклеточных сигналов, направленных на регуляцию активности транспортных АТФаз. Кроме того, не исключено, что белки мембранного скелета могут быть вовлечены в одау из стадий реакционного цикла транспортных АТФаз, а именно, стадию дефосфоргогарования ферментов, акцептируя на себя неорганический фосфат.

Список основных работ по теме диссертации

1. Казенное A.M., Масяова М.Н., Шалабодов А.Д. Влияние отравления крыс фосфорорганическим ингибитором ацетилхолинэстеразы на активность ЫаД-АТФазы головного мозга II Нейрохимия. - 1983. - Т.2, N3. -С.146-152.

2. Казеннов A.M., Маслова М.Н., Шалабодов А.Д. Исследование активности Ка,К-АТФазы в эритроцитах млекопитающих // Биохимия. - 1984. -Т.49, вып.7. - С.1089-1095.

3. Изотова И.А., Шалабодов А.Д. Механизм активирующего действия мембранотропных агентов на Кта,К-АТФазу эритроцитов млекопитающих II Тез. докл. Областной межвузовской конференции молодых ученых и специалистов. - Тюмень, 1985. - С.143.

4. Шалабодов А.Д. Особенности активирующего действия мембранотропных агентов на Na.K-АТФазу эритроцитов млекопитающих // Тез. докл. Межуниверситетской Всесоюзной конференции по биологии клетки.-. Тбилиси, 1985.-С.163.

5. Казеннов A.M., Маслова М.Н., Шалабодов А.Д. Свойства Na,K-АТФазы эритроцитов млекопитающих в норме и при первичной артери-

альной гипертензии // Тез. докл. У Всесоюзного биохимического съезда. -Киев, 1986.-Т.2.-С.319.

6. Казенной A.M., Маслова М.Н., Шалабодов А.Д. Механизм активирующего действия детергентов и хелаторов на Кга,К-А'ГФазу теней безъядерных эритроцитов // Биохимия. - 1986. - Т.51, вып.2. - С.224-229.

7. Kazennov A.M., Maslova M.N., Gurevich V.S., Bagrov J.Yu., Shalabodov A.D. Some properties of erythrocyte Na+-K+-ATPase in essential hypertension II Clin. Exp .Hypertension. - 1987. - Vol.A- 9, N 7. - P.1221-1232

8. Соловьев B.C., Соловьев C.C., Шалабодов А.Д. О роли транспортных АТФаз в формировании повышенного периферического сопротивления при первичной артериальной гипертензии // Тез. докл. I Всесоюзной конференции "Биохимия-медицине". - Ленинград, 1988. - С.254.

9. Казенное A.M., Маслова М.Н., Шалабодов А.Д. Участие белков ци-тоскелета безъядерных эритроцитов в функционировании транспортных АТФаз // Тез. докл. Международного симпозиума "Транспорт ионов и механизмы его регуляции". - Тбилиси, 1989. - С.212.

10. Казеннов A.M., Маслова М.Н., Шалабодов А.Д. Роль мембранного скелета безъядерных эритроцитов в функционировании мембранных ферментов // ДАН СССР. - 1990. - Т.312, N1. - С.223-226.

11. Соловьев B.C., Фролова О.В., Шалабодов А.Д. Ыа.К-АТФаза как маркер интегративной целостности биологических мембран // В сб. научн. трудов "Комплексное исследование медико-биологических проблем здоровья Тюменской области". - Тюмень, 1993. - С.85-87.

12. Мацкевич Ю.А., Казеннов A.M., Шалабодов А.Д. Сравнительное исследование внутриклеточной регуляции активности транспортных АТФаз в безъядерных эритроцитах // Журн. эволюц. биохим. и физиол. - 1994.

- Т.30, N5. - С.690-697.

13. Казеннов A.M., Маслова М.Н., Рустамов Ф.А., Шалабодов А.Д. Активность На,К-АТФазы эритроцитов как диагностический и прогностический показатель артериальной гипертензии // Тез. докл. конференции "Артериальная гипертензия" Ркспериментальные и клинические аспекты).

- 1995, РАН. - С.30-31.

14. Казеннов A.M., Маслова М.Н., Мацкевич Ю.А., Шалабодов А.Д. Роль линидов и цитоскелетгных белков мембран эритроцитов грызунов в регуляции активности транспортных АТФаз // Труды 1У Симпозиума по биохимии липидов. - Москва, 1995. - С.38.

15. Matskevich J.A., Shalabodov A.D., Kazennov A.M. Effect of hemolisate and calcium ions on Na,K-ATPase activity in membrane preparations of mammalian erythrocytes // 23rd Meeting of the Federation of European Biochem.Societies, Basel, August 13-18. - 1995. - Abstracts - P.195.

16. Kazennov A.M., Maslova M.N., Matskevich J.A., Frolova O.V., Shalabodov A.D. Role of the membrane skeleton proteins of rat erythrocytes in functioning of transport ATPase II 1 Congress of Federation of European Physiol. Science, The Netherlands, Sept.-1995.- Abstracts - P. R28.

17. Казеннов А.М., Фролова О.В., Шалабодов А.Д. Влияние гемолиза-та эритроцитов и смеси солюбилизированных белков мембранного скелета на активность транспортных АТФаз мембранных препаратов эритроцитов крысы II Научный вестник Тюменского государственного университета (биологические науки). - Тюмень. - 1996. - Т.1, N1. - С.34-39.

18. Фролова О.В., Шалабодов А.Д. Влияние твина 20 на функционирование Кта,К-АТФазы эритроцитов крысы II Научный вестник Тюменского государственного университета (биологические науки). - Тюмень. - 1996. -Т.1, N1. - С.40-45.

19. Казеннов А.М., Рустамов Ф.А., Фролова О.В., Шалабодов А.Д. Сравнительное изучение свойств уабаин-чувствительной фосфатазы в тенях и бесспектриновых мембранах эритроцитов крысы// Журн. эвол. биохим. физиол.-1996,- Т.32, N 4.- С. 393-400.

20. Казеннов А.М., Катюхин JÏ.H., Маслова М.Н., Мацкевич Ю.А., Рустамов Ф.А., Шалабодов А.Д. Сравнительное исследование реологических свойств эритроцитов и активности транспортных АТФаз клеток у разных млекопитающих II Тез.докл. 1(11) Международного совещания по эволюционной физиологии. - С-Пегербург. - 1996. - С.89-90.

21. Шалабодов А.Д. Механизмы регуляции активности транспортных АТФаз эритроцитов млекопитающих// Научный вестник Тюменского государственного университета (биологические науки). - Тюмень. - 1997. - Т.2, N 1,- С.15-25.

22. Казеннов А.М., Рустамов Ф.А.,Фролова О.В., Шалабодов А.Д. Влияние отдельных фракций солюбилизированных белков мембранного цитоскелета на активность транспортных АТФаз эритроцитов крысы // Научный вестник Тюменского государственного университета (биологические науки). - Тюмень. - 1997.- Т.2, N 1.- С.26-31.

23. Kazennov А.М., Maslova M.N., Matskevich Yu.A., Rustamov F.A., Shalabodov A.D. Species variability in activity of erythrocyte transport ATPases in mammals// Comp.Biochem.Physiol.,1997, (in press).