Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительные исследования внутриклеточной регуляции активности транспортных АТФаз в безъядерных эритроцитах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительные исследования внутриклеточной регуляции активности транспортных АТФаз в безъядерных эритроцитах"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ им.И.М.СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

УДК 612:577.152.Зь577.153.4

МАЦКЕВИЧ Юлия Андреевна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ТРАНСПОРТНЫХ АТСаз В БЕЗЪЯДЕРНЫХ ЭРИТРОЦИТАХ

Специальность: 03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

г

Работа выполнена в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. Сеченова РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук А.М.Казеннов

Официальные оппоненты: кандидат биологических наук, заведующий кафедрой биохимии Санкт-Петербургского Государственного Университета Е.Г.Скворцевич; доктор биологических наук И.И.Марахова.

Ведущее учреждение: Институт физиологии им. И.П. Павлова, г. Санкт-Петербург.

Защита состоится г. в /3 часов на заседании

Специализированного ученого совета К 002.89.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Институте эволюционной физиологии и биохимии им.И.М. Сеченова РАН (194223, Санкт-Петербург, пр.Мориса Тореза, 44).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан "// "

Ученый секретарь Специализированного Ученого совета, К.002.89.01

кандидат биологических наук Л.В. Зуева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Основные представления с принципах функционирования Na-Hacoca в плазматических мембранах сложились в основном в результате изучения характеристик активного транспорта натрия в безъядерных эритроцитах человека. Эритроциты млекопитающих до сих пор являются одним из главных объектов исследования механизмов функционирования и регуляции h'a-насоса, молекулярным субстратом которого является Мг.К-АТЯаза.

Давно известно, что активность и свойства транспортних АТФ-аз плазматических мембран в*(8начительной степени определяются свойствами ее липидного матрикса, в который погружены молекулы ферментов (Болдырез, Мельгунов, 1985). Исследования последних лет показали, что работа Na-Hacoca тесно связана и с анион-транспортирующей системой (Fossel, Solomon, 1985; Janoshazl, Solomon, 1989), а также с белковыми компонентами мембраны, принимающими участие в образовании мембранного скелета (Казен-нов, Маслова, 1990; Bennett, 1990). Кроме того, интенсивно развиваются представления о регуляции работы Иа,К-АТФазы эндогенными модуляторами , как внеклеточными (Goto et al., 1992), так и внутриклеточными (Yingst, 1988).

В последнее время показаны количественные и качественные отличия в системах активного транспорта одно- и двухвалентных катионов в эритроцитах разных видов млекопитающих (Willis et al., 1992; Mllanlck, 1992).Однако причины этих различий и их связь с особенностями функционирования эритроцитов как высо-коспеци&чизированных клеток остаются не вполне понятными.

Е связи с вышесказанным представляет несомненный интерес изучение активности и свойств транспортных АТФав, а также механизмов регуляции их активности в сравнительном плане в эритроцитах разных представителей млекопитающих, отличающихся по активности транспортных АТФаз и внутриклеточному соотношению одновалентных катионов.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось изучение особенностей регуляции активности транспортных АТФаз эритроцитов ряда млекопитающих. Для достижения этой цели были пос-

тавлены следующие задачи:

- изучить фосфолипидный, жирнокислотный и полипептидный состав мембран эритроцитов некоторых видов млекопитающих;

- определить активность транспортных АТФаз в целых эритроцитах этих видов животных и сопоставить полученные данные с данными по активности этих ферментов в мембранных препаратах (тенях) эритроцитов этих животных;

- провести сравнительное определение активности транспортных АТФаз;в мембранных препаратах эритроцитов этих видов млекопитающих с различным полипептидным составом;

- исследовать влияние внутриклеточных модуляторов на активность транспортных АТФаз различных мембранных препаратов эритроцитов ряда млекопитающих в отсутствие и присутствии Са++.

Научная новизна. Впервые в сравнительном плане у нескольких видов грызунов и кролика проведено одновременное изучение активности ИаД-АТФазы и Са-АТФазы, а также фосфолипидного, жир-нокислотного и полипептидного состава мембран эритроцитов.

Обнаружены существенные различия в активности транспортных АТФаз в целых эритроцитах исследованных животных и разная степень ее снижения после удаления внутриклеточного содержимого при получении теней эритроцитов.

Выявленные различия связаны, очевидно, не с особенностями фосфолипидного, жирнокислотного и полипептидного состава эрит-роцитарнкх мембран,' который мало отличался у исследованных животных, а с наличием внутризритроцитарной системы внутриклеточных модуляторов активности транспортных АТФаз (Са++-зависимые и Са++-независимые активаторы и ингибиторы), обладающей видоспецифическими особенностями.

Показана необходимость интактности мембранного скелета эритроцитов для оптимального функционирования транспортных АТФаз и передачи модулирующего действия внутриклеточного Са++ на Иа.К-АТФазу; действие внутриклеточных активаторов На,К-АТФазы проявлялось как на фермент теней эритроцитов, так и на фермент мембранных препаратов, лишенных белков мембранного скелета.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные свидетельствуют о том, что уровень активности транспортных АТФаз

у разных видов млекопитающих определяется системой внутриклеточных модуляторов ферментов, имеющей характерные для каждого вида свойства.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют также о важной роли белков; мембранного скелета эритроцитов в функционировании интегральных мембранных ферментов.

Полученные данные расширяют современные представления о путях регуляции активности транспортных АТФаз млекопитающих в целом, а также поддержания активности этих ферментов в эритроцитах на.уровне, характерном для данного вида, что важно в плане понимания механизмов контроля ионного гомеостаза как в ■ отдельных клетках, так и на^уровне целого организма.

Основные положения, выносимые на защиту:

1.Показано, что удельная активность Иа.К-АТФазы и Са-АТФ-азы в тенях эритроцитов по сравнению с целыми клетками в несколько раз ниже у мыши, морской свинки и кролика и не отличается у хомячка, что свидетельствует о присутствии в эритроцитах изученных животных (кроме хомячка) активаторов фермента, вымывающихся в процессе получения теней.

2. Наличие внутриэритроцитарного активатора Иа.К-АТФазы у мьпяи и морской свинки подтверждено в прямых опытах, где продемонстрировано Са++-не зависимое активирование фермента под действием гемолизата в мембранных препаратах.

3.Показано, что последовательное удаление белков мембранного скелета из теней эритроцитов приводит к прогрессивному падению удельной активности (в расчете на мл клеток) транспортных АТФаз у всех исследованных животных.

4. Продемонстрировано зависимое от концентрации ингибиро-вание ИаД-АТФазы конами кальция в целых эритроцитах морской свинки и его отсутствие в мембранных препаратах, свидетельствующее о наличии Са++-зависимого внутриклеточного ингибитора фермента.

Апробация диссертации. Результаты работы докладывались на: заседании Ленинградского отделения Всесоюзного биохимического общества (Ленинград, 1886), II Всесоюзном совещании по эволюционной физиологии (Ленинград, 1987), I Всероссийском съезде общества физиологов (Пущино, 1993), конференции "Современные

проблемы энергетики организма" (Ст.-Петербург, 1993).

Публикации. Результаты исследований опубликованы в 2 статьях и 1 тезисах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, об-8ора литературы, описания методов и результатов исследований, обсуждения полученных данных, заключения и выводов. Библиография включает \ наименований, в том числе на иностранных языках. Работа изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками и таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований были эритроциты мышей линии СВА, крыс популяции Wistar, морских свинок, хомячков и кроликов.

Для получения суспензии эритроцитов кровь, полученную путем декапитации животных или из ушной вены (у кроликов), отмывали от лейкоцитов и плазмы согласно ранее описанной процедуре (Казеннов и соавт., 1984).

Для выявления активности АКаз в цельных эритроцитах их прединкубировали с неионнкм детергентом теином 20 (Казеннов и соавт., 19Я4). Отмытые эритроциты смешивали с равным объемом детергента, приготовленного на 0,213 М сахарозе в 0,02 М трис-HCl буфере (рН 7,4 при 25'С). Конечная концентрация твина 20 в пробе составляла от 2,5 до 15 мг/мл. Смесь инкубировали при комнатной температуре ь течение . 30 минут. Затем взвесь эритроцитов мыши разводили в 5 раз, а остальных животных - в 2,5 раза (конечное разведение составило соответственно 10 и 5 раз) раствором 0,25 М сахарозы в 0,02 М трис-HCl буфере (рН 7,4 при 25"С) и определяли активность АТФаз.

Тени эритроцитов получали методом гипоосмотического гемолиза эритроцитов по методу Dodge et al. (1963), используя в качестве гемолиэирухмцей среды 10 мМ трис-HCl буфер (рН 7,6 при 25*С), содержащий 1 мМ ЭДТА.

Для получения гемолизата, использовавшегося в экспериментах по определению его влияния на активность транспортных АТ'Х-аз, один объем отмытых эритроцитов перемешивали с 5 объемами

охлажденной до 4*С гемолизирующей среды, выдерживали при этой температуре в течение 5 минут и центрифугировали в центрифуге К-24 (ГДР) при 20 ООО g в течение 20 Минут. Осадок теней отбрасывали, а полученный супернатант использовали в экспериментах. 1 объем конечного осадка неразведенных теней эритроцитов смешивали с 5 объемами полученного супернатанта и полученную суспензию мембран эритроцитов использовали для определения активности АТФаз. В качестве контроля использовали тени, разведенные 5 объемами гемолизирующей среды.

Бесспектриновые везикулы (везикулы 1) получали по методу Steck, Kant (1980) путем инкубации 1 мл свежеприготовленных теней в 10 мл 1 мМ трис-НСДбуфера (рН 7,4) при 37"С в течение 30 минут.

Везикулы II (мембранные препараты, лишенные полос 2.1 и 4.1, а также большей части спектрина и актина) получали по методу Hargreaves et al.(1980) путем инкубации свежеприготовленных везикул I в 10 объемах 10 мМ трис-HCl буфера (рН 7,4), содержащего 1 М КС1, при 37°С в течение 30 минут.

Активность АТФаз определяли как описано Казеиновым с соавт., (1984). При определении активности Са-АТФазы, а также ингибирующего влияния кальция на Иа.К-АТФазу в среду добавляли 0,25, 0,5 и 1 мМ СаС12 . В последнем случае концентрация свободного Са++ в среде инкубации, рассчитанная согласно Додсону (1990) с учетом констант связывания всех хелатирующих агентов, присутствующих в среде инкубации, составила соответственно 0,1, 0,3 и 1,0 мкМ свободного кальция. Активность Иа.К-АТФазы рассчитывали по разнице в приросте неорганического фосфата в отсутствие и присутствии 1мЦ уабаина, а активность Са-АТФазы - в присутствии и отсутствие Са++.

Содержание неорганического фосфора определяли модифицированным методом Чэна (Chen et al., 1957; Казеннов и др., 1980).

Содержание белка в пробах определяли по методу Лоури с соавторами (Lowry et al., 1951). Для построения калибровочной кривой использовали бычий сывороточный альбумин (лиофилизиро-ванный).

Полипептидный состав мембранных препаратов определяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по методу Fairbanks et al., (1971).

Извлечение общих липидов проводили по методу Фолча с со-

авторами (Folch et al., 1957). Разделение фосфолипидов разных классов проводили с помощью тонкослойной хроматографии на си-ликогеле КСК б микроварианте согласно Васьковскому с соавторами (1975).

Изучение жирнокислотного состава фосфолипидов мембран проводили на газо-жидкостном хроматографе (PYE-104. Аиглия) с пламенно-ионизационным детектором.

Использовались стандартные методы статистической обработки результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сравнительное исследование активности транспортных АТФаз в целых эритроцитах и тенях млекопитающих

Результаты исследований, представленные в табл. 1. показали, что наибольшая активность Иа.К-АТФазы и Са-АТФазы. выявляемая в целых эритроцитах с помощью твина 20, значительно отличается в клетках разных животных. В то же время активность этих ферментов в тенях эритроцитов (в расчете на мл клеток), достоверно не отличалась у всех трех исследованных видов гры-вунов и была примерно в Б раз ниже в эритроцитах кролика. Ак-. тивность Са-АТФазы также в меньшей степени варьировала в тенях, чем в целых клетках. Снижение активности транспортных АТФаз в тенях по сравнению с целыми эритроцитами также различалось у разных видов. Если в , эритроцитах хомячка активности ИаД-АТФазы и Са-АТФазы достоверно не изменялись, то в эритроцитах других животных активность этих ферментов уменьшалась в 2-10 раз.

Полученные данные позволили высказать предположение о наличии в эритроцитах изученных видов (кроме хомячка) эндогенных модуляторов (активаторов) ферментов, которые удаляются при получении теней эритроцитов, то есть в ходе гемолиза эритроцитов и последующего отмывания мембранных препаратов.

Таблица 1. Активность АТФаз (мкмоль Рн на мл клеток в час) в целых эритроцитах и в тенях мши, хомячка, морской свинки и кролика.

Мг-АТФаза Иа.К-АТФаза Са-АТФава

эритроциты 63,31±3,55 23,16±4,92 60,6514,92

мышь --------------------------—--------------------

(п-5) тени 6,21±0,18 6,53±0,44 13,62±0,51

эритроциты 14,5610,16 6,66±1,11 7,98±1,65

хомячок --------------------------------------------------

(п-5) тени 9,09+0,32 6,19+0,14 10,22Ю,68

морская эритроциты 5,8111,35 13,8813,36 45,12±5,31

свинка --------------------------------------------------

(п-5) Тени 5,2910.65 6Д810.51. 4,48+0,62

эритроциты 9,2311,03 2,5010,90 24,1615,48

кролик --------------------------------;--------------------

(п-5) тени 7,4410,24 1,15Ю,28 9,12Ю,42

Примечание: активность АТФаз в цельных эритроцитах оп-' ределялась после обработки клеток твином 20 в концентрации 5 мг/мл (морская свинка и хомячок) или 7,5 мг/мл (мышь и кролик); активность Са-АТФазы определялась при концентрации свободного кальция 0,3 мкМ.

2. Исследование фосфолипидного, жирнокислотного и полипептидного состава мембран эритроцитов разных видов

Исходя из предполжения, что разные уровни активности транспортных АТФаз могут определяться особенностями Селко-во-липвдного окружения этих ферментов, были проведены исследования фосфолипидного, жирнокислотного и полипептидного состава мембран эритроцитов этих видов.

Полученные данные не выявили принципиальных различий между видами в содержании основных классов фосфолипицов в мембранах эритроцитов разных видоб. Можно отметить только относительно низкое содержание фосфатидилхолина у хомячка. Содержание отдельных жирных кислот также незначительно отличалось у животных разных видов, в то же время для мембран эритроцитов хомячка и морской свинки было характерно более высокое содержание полиеновых и ненасыщенных жирных кислот по сравнению с другими двумя видами животных (табл.2).

Таким образом, полученные данные не дают основания связать разный уровень активности транспортных АТФаз с особенностями •жирнокислотного и фосфолипидного состава мембран.

Результаты исследования полипептидного состава с помощью электрофореза в ПААГ также не выявили принципиальных качественных отличий между мембранами эритроцитов исследованных видов. Некоторые небольшие отличия касались относительного содержания и электрофоретической подвижности белков полос 2.1,

3. 4.2 и 4.5 мембран эритроцитов разных видов.

3. Исследование влияния удаления белкоь мембранного скелета из теней эритроцитов на активность транспортных АТФаз

Для изучения возможной роли белков мембранного скелета в функционировании транспортных АТФаз было проведено сравнительное определение активности ферментов в тенях эритроцитов, везикулах I и везикулах II.

Из данных, представленных на рис.1а, видно, что удаление спектрина и актина из теней эритроцитов не приводило к изменению активности Ыа.К-АТФазы в расчете на мг белка, однако в расчете на мл клеток имело место снижение активности фермента у всех исследованных видов животных примерно на 50Х. Б везикулах И, т.е. мембранах, лишенных кроме спектрина и актина так-

Таблица 2. Фосфолипидный состав (в 7. от общего содержания фос-фолипидов) и хирнокислотный состав (в X от общего содержания жирных кислот) суммарной фракции мембран эритроцитов исследованных животных

мышь • (п-5) хомячок (п-5) морская свинка (п-5) кролик (п-5)

фосфатидилхолин 43,9+2,6 37,0+2,3* 50,1+3,5 47,012,4

фосфатидил-этан оламин 19,4±1,6 21,4±2,3 16,211,7 15,811,3

фосфатидклсерин 10,810,9 12,2+1,8 8.7+0,9 12,9+1,0

фосфатидилинозит 3,6+0,6 2,410.3 2,5Ю.1 2,8+0,4

сфингомиелин 19.1+1,6 23,812,2 19,112,1 18,911,7

лизофосфатидил-холин 3,2+0,5 3,2+0,1 3.410,6 2,610,6

% насыщенных жирных кислот 49,7 42,4 45,4 49.5

7. ненасыщенных жирных кислот 50,3 57,6 54,6 50.5

X моноеновых жирных кислот 17,7 17,9 17,3 19,3

7. полиеновых жирных кислот 32,6 39,7 37,3 31,2

индекс ненасыщенности 134,7 150,8 149,8 134.5

Примечание: * - достоверность отличий от других животных (р< 0,01); сл. - следы, менее 0.5Х.

S)

I Б Ё 'i

Рис.1. Активность Ма,К-АТФазы (а) и Са-АТФазы (0) в тенях, везикулах I и везикулах II эритроцитов. 1 - тени, Z - везикулы 1,3- везикулы II; I - мышь, II морская свинка, III - кролик, 1У - хомячок. По оси ординат: активность ь мкмоль Рн на мг белка в час.

же белков полос 2.1 и 4.1, активность фермента составила 20-257. от уровня исходной активности в тенях.

Удельная активность Са-АТФазы в везикулах I и в везикулах II оказалась сниженной как в расчете на мл клеток, так и на мг белка (рис.16), причем степень падения активности отличалась у разных видов.

Полученные данные позволяют сделать вывод, что удаление белков мембранного скелета из эритроцитарной мембраны приводит к снижению активности транспортных АТФаз у всех исследованных видов, причем Са-АТФаза более чувствительна к дезинтеграции цитоскелетных структур.

4. Изучение влияния гемолизата на активность транспортных АТФ-аэ в тенях эритроцитов

Как следует из предыдущих разделов, нам не удалось выявить существенных межвидовых отличий ни в фосфолипидном, жирнокис- . лотном и полипептидном составе, ни в характере изменения активности транспортных АТФаз мембран эритроцитов исследованных видов млекопитающих при последовательном удалении периферических белков. Исходя из высказанного ранее предположения, что межвидоЕые различия в уровне активности транспортных АТФаз связаны с присутствием в этих клетках модуляторов ферментов, удаляемых при получении теней эритроцитов, было изучено влияние гемолизата на ферментативные активности. Для этого тени эритроцитов прединкубировали с гемолизатом эритроцитов того же вида животного (гомогемолизат) или крысы (гетерогемолизат) и затем определяли активность ферментов в исходных тенях и инкубированных с гемолизатом.

Полученные данные показали (рис.2), что инкубация теней эритроцитов мыши и морской свинки с гомогемолизатом приводила к достоверному повышению активности Иа.К-АТФазы, в то время как в аналогичных экспериментах с тенями кролика и хомячка не выявлено достоверного изменения активности фермента. Инкубация же с гетерогемолизатом приводила к достоверному повышению активности №,К-АТФазк в тенях эритроцитов всех исследованных животных.

Таким образом, результаты экспериментов показали, что в гемолизате эритроцитов морской свинки, мыши и крысы содержится

Рис.2. Активность Ыа,К-АТФазы в тенях эритроцитов при инкубации с 10 мМ трис-НС1 (1). гемолизирухшм раствором (2), гомогемолизатом (3) и гетерогемолизатом (4); I - мышь, II - морская свинка, III - кролик, 1У - хомячок. По оси ординат: активность в мкмоль Рн на мг белка в час.

п <

Ш 2

Рис.3. Зависимость активности Иа.К-АТФазы от концентрации

свободного Са++ в среде инкубации в целых эритроцитах (I) морской свинки (концентрация твина 20 7,5 мг/мл в среде предин^бации), а также тенях (II), везикулах I (III) и везикулах II (IY) в присутствии гемолизата. 1 - в отсутствие Са++, 2 - 0,1 мкМ, 3 - 0,3 мкМ, 4 -1 мкм Са++ в среде инкубации.

По оси ординат: активность в мкмоль Рн на мл клеток в час.

активатор Na.K-АТФазы. причем гемолизат крысы акгисируег фермент у всех животных. Ввиду того, что предварительное кипячение снимало активирующий эффект гемолизата, этот фактор, очевидно, является веществом белковой природы. Факт активирования Na,K-AT'I'asu теней эритроцитов разных видов гетерогемолизатом свидетельствует, по-видимому, об отсутствии видоспецифичности у этого модулятора, по крайней мере, в пределах изученных видоь.

5. Изучение влияния гемолизата и Са++ на активность транспортных АТФаз в целых эритроцитах и различных мембранных препаратах эритроцитов морской свинки

В доступной нам литературе мы не обнаружили сведений о наличии активатора Na.K-АТФазы в безъядерных эритроцитах млекопитающих. В работах Ингста с соавторами (Yintjst et а]., 1985; Ylngst et al., 1987; Ylngst. 1988) было показано, что эритроциты человека содержат Са++-зависимый белок, получивший название калънактика, который снижает активность Ма,К-АТФазы путем увеличения ее чувствительности к ингибированию ионами Са++. Исходя из этих данных, а также учитывая центральную роль этого иона в регуляции физико-химических свойств эритроцитар-ной мембраны (Bennett, 1990; Зварич, 1990), в следующей серии экспериментов было изучено влияние ионов С-а++ на активность транспортных АТФаз в цельных эритроцитах, а также тенях, везикулах I и везикулах 11 эритроцитов морской свинки в отсутствие и присутствии гомогемолизата.

Полученные данные показали (рис.3), что повышение концентрации свободного Са++ в среде инкубации приводило к постепенному снижению активности Na,ii-AT'Ja3U в целых эритроцитах. Между тем в тенях, везикулах I и везикулах II в отсутствие Са++ и при внесении 0,1 и 0,3 мкМ свободного Са++ в среду инкубации не происходило достоверного изменения активности фермента (рис.4). При концентрации Са++ 1 мкМ активность фермента достоверно снижалась в тенях и везикулах I, но не в везикулах II.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что в целых эритроцитах морской свинки присутствует Са++-зависимый ингибитор Na.K-АТФазы (возможно, кальнактин) с высоким сродством к ионам кальция, так как его действие на фермент проявлялось

О

4.0

ао 10 а

40

зл го 1.0

*) 1

4.0 3.0 2Л 1.0 О

- 16-

0 1

Рис.4. Зависимость активности ЫаД-АТФагы в тенях (а),- везикулах I (б) и везикулах II (в) эритроцитов морской свинки от концентрации свободного Са++ в среде инкубации. I - в отсутствие Са++, II - 0,1. Ш - 0,3, 1У - 1 мкм Са++. 1 - в отсутствие гемолизата, 2 - в присутствии гемолизата. По оси ординат: активность в мкмоль Рн на мг белка в час.

уже при низких (0,1 и 0,3 мкМ) концентрациях Са++. Очевидно, при получении теней этот модулятор удаляется, скорее Есего, на этапе отмывания теней, т.к. в тенях ингибирование фермента имело место только при относительно высокой концентрации Са++, а гемолизат не восстанавливал Еысокоаффинное Са++-зависимое ингибирование Ка.К-АТФаы в тенях. Креме того, удаление из мембран эритроцитов белков полос 2.1 и 4.1 сопровождалось потерей чувствительности Иа,К-АТФазы и к высокой (1 мкМ) концентрации Са++. По-видимому, ингибируюшпй эффект Са++ е этой концентрации на Иа.К-АТФазу является следствием непосредственного влияния катиона на фермент или через белки п.п. 2.1 и 4.1 и не опосредовано специфическими модуляторами.

Интересен тот факт, что при внесении гемолнзата в среду инкубации активация Ка,К-АТФазы имела место как ъ Сескальте-вой среде, так и в присутствии 0,1 и 0,3 мкМ Са++ во гсех трех видах мембранных препаратов (рис.3), причем активность фермента повышалась до уровня активности в целых эритроцитах. Зтс можно рассматривать как прямое доказательство присутствия в гемолизате активатора фермента, действие которого, по-р.идимо-му, не модулируется Са++ (по крайней мере, в этом диапазоне его концентраций) и не зависит от интактности мембранного скелета. Активация №,К-АТФаэы гемолизатом при относительно высокой концентрации Са++ (1 мкМ) в тенях и ее отсутствие в мембранных препаратах, лишенных периферических белков, может свидетельствовать об участии белков мембранного скелета в передаче модулирующего действия активатора в этих условиях.

Инкубация с гемолизатом приводила также к активации Са-АТФазы ео всех трех .видах мембранных препаратов (рис.5). Ка основании литературных данных можно почти однозначно утверждать, что этот эффект связан с присутствием в гемолизате каль-модулина; который удаляется из эритроцитов на этапе гемолиза. Интересно, что в случае теней инкубация с гемолизатом приводила к смещению оптимальной концентрации Са++ (при которой выявляется максимальная активность фермента) в сторону более низких величин (рис.5а), что, скорее всего, связано с опосредованным кальмодулином увеличением сродства фермента к Са++. В везикулах I этого явления не -наблюдалось, что может свидетельствовать о том, что белки мембранного скелета, на которых имеются центры связывания кальмодулина (Тапако еЬ а!.. 1991), об-

г 18 г

■<.3 lü 3.5 ¿0 2.5 :

а.о

15 10 D.5 0

¿0 з.з

3.0 2.5 2.0 13 1.0 0.5 0

¿о

3.5 ЗЛ 2.3 2.0 L5 1.0 05 0

м

s I

Рис.5. Зависимость активности Са-АТФазы в тенях (а), везикулах I (о) и везикулах II (в) эритроцитов морской свинки от концентрации свободного Са++ в среде инкубации. I - 0.1, И - 0,3, III - 1 мкм Са++. 1 - в отсутствие гемолизата, 2 - в присутствии гемолизата. По оси ординат: активность в мкмоль Рн на мг белка в час.

легчают взаимодействие кальмодулина с Са-АТФазой, возможно, путем фиксации регуллторного белка вблизи фермента.

Таким образом, результаты наших исследований позволяют полагать, что различия в уровне активности транспортных АТФг.я в эритроцитах разных видов млекопитаювдх могут быть связаны с межвидовыми различиями в регуляции этих Зермэнтоз внутриклеточными модуляторауи, действие которых молет опосредоваться белками мембранного скелета.

В Ы;В О д ы

1. При сравнительном исследовании транспортных АТФаз в целых эритроцитах грызунов (мышь, хомячок, морская свинка) и кролика выявлены выраженные различия в ферментативной активности: активность Иа.К-АТФазы колебалась от 2,5 у кролика до 23,2 мкмоль Рн в час у мыши, а Са-АТФазы - от 8,0 у хомячка до 60,6 мкмоль Рн в час на мл у мыши.

2. По сравнению с целыми эритроцитами удельная активность №,К-АТФазы в тенях эритроцитов исследованных животных (кроме хомячка) была ниже в 2 - 4 раза, а Са-АТФазы - в 2,э - 10 раз. У хомячка удаление внутриэритроцитарного еодерлжого при поучении теней не сопровождалось изменением фермг чтативных &\--1<ъ-ностей.

3. Полученные данные свидетельствуют сб удалении г ходе получения теней внутриклеточного активатора Ма,К-АТФаЕУ. Это предположение подтверждено в прямых опытах, в которых показано, что гемолизат эритроцитов мыши и морской свинки способен почти полностью восстанавливать активность фермента в мембранных препаратах эритроцитов тех же животных, а гетероггмолизат (гемолизат эритроцитов крысы) активировал фермент 1-сех исследованных животных.

4. Продемонстрировано . качественное сходство фосфолипидно-го, жирнокислотного и полипептидного состава мембран эритроцитов изученных животных при незначительных отличиях в содержа-

нии отдельных классов фофсфолипидов, жирных кислот, а также в относительном содержании и электрофоретической подвижности ряда мембранных белков.

5. Показано, что последовательное удаление белков мембранного скелета из теней эритроцитов ( сначала спектрина и актина, а затем белков полос 2.1 и 4.1 ) приводит к прогрессивному падению удельной активности транспортных АТФаз, Солее -выраженному в случае Са-АТФаеы, у всех исследованных животных.

6. Обнаружено зависимое от концентрации высокоаффинное ингибирование Иа,К-АТФазы ионами кальция в целых эритроцитах морской свинки и отсутствие такового в мембранных препаратах эритроцитов, что свидетельствует о присутствии Са++-завискмого ингибитора Иа,К-АТФазы (типа кальнактина) в целых клетках.

7.. Выявленные различия в активности транспортных АТФаз в эритроцитах разных видов млекопитающих в значительной степени связаны с наличием внутриэритроцитарной системы модуляторов (активаторов и ингибиторов) ферментативных активностей, обладающей видоспецифическими особенностями.

СПИНОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ю.А.Мацкевич, А.М.Казеннов. Na.K-АТФаза и полипептидньй состав мембран эритроцитов некоторых видов млекопитающих //В сб. "Проблемы репродукции, ди<йеренцировки и функционирования клетки". - Изд-во ЛГУ, 1987. - С.67-78.

2. Казеннов A.M., Мацкевич Ю.А. Na.K-АТФаза и полипептидный состав плазматической мембраны безъядерных эритроцитов // Тезисы сообщений IX Всесоюзного совещания по эволюционной физиологии. - Ленинград, "Наука", 1986. - С.110.

3. Мацкевич Ю.А., Казеннов A.M., Маслова М.Н. Активность транспортных АТФаз и некоторые характеристики белково-ли-пидного состава мембран безъядерных эритроцитов ряда млекопитающих // Журн.эвол.биохим. физиол. - 1993, т. 30, N8 (в печати).

ЮМли. ¿Г