Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы внутриклеточной регуляции активности Na+,K+-АТФазы эритроцитов крысы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизмы внутриклеточной регуляции активности Na+,K+-АТФазы эритроцитов крысы"

РГ6 од

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова

на правах рукописи

ФРОЛОВА

Ольга Валерьевна

МЕХАНИЗМЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ №МС-АТФазы ЭРИТРОЦИТОВ КРЫСЫ.

Специальность: 03.00.04. - Биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1996

Работа выполнена в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН и Тюменском государственном университете

Научные руководители:. доктор биологических наук А.М.Казеннов доктор медицинских наук, профессор

B.О.Соловьев

Официальные оппонетны: доктор биологических наук, профессор

С.К.Лызлова доктор медицинских наук, профессор

C.С.Михайлов

т

Ведущее учревдение: Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН, г. Санкт-Петербург

Защита состоится илйНА Х996 г. в часов на

заседании диссертационного Совета К 002.89.01 по присуждениюученой степени кандидата биологических наук при Институте эволюционной физиологии и биохимии им И.М.Сеченова РАН (194223, Санкт-Петербург, пр. Мориса Тореза, 44).

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке ИЭФиБ им. И.М.Сеченова РАН

Автореферат разослан " № " МХьк- 199е г_

Ученый секретарь диссертационного Совета К 002.89.01, кандидат биологических наук

Л.В.Зуева

ХАРЛКТЕРИСТИКЛ РАБОТЫ

¿^¡¿алъность_пдобле^ы. Иа.К-АТФаза плазматических мембран клеток организма, открытая почти 40 лет тому назад й.Скоу (Skou, 1957), представляет собой молекулярный субстрат Na-Hacoca и играет ключевую'роль как в поддержании ионного гомеостаза в отдельных клетках (Болдырев, 1992; Skou, 1988, Skou & Esmann, 1993 ), так и в регуляции водно-солевого обмена на уровне целого организма (L1-ngrel et al., 1991, 1994; Katz, 1986), за что, прежде всего, от-вественен фермент, локализванный в почечных канальцах. Несомненно то, что такая жизненно важная функция организма должна быть под строгим контролем тонких механизмов, осуществляющих регуляцию активности данного фермента.

В литературе рассматриваются разные способы регуляции активности На,К-АТФазы в организме (Rosaler et al., 1987): механизм долгосрочной регуляции за счет изменения количества мембранного фермента путем модуляции биосинтеза молекул фермента (Bertorello & Katz, 1993) и механизм краткосрочной регуляции, реализующийся, в основном, на уровне клетки с участием вторичных мессенжероз и эндогенных модуляторов (Ewart & Klip, 1995). Пожалуй, особое мес-.то среди регуляторов активности Ыа.К-АТФазы занимают эндогенные дигиталис-подобные ингибиторы фермента (основным из которых является эндогенный уабаин), действие которых развивается относительно быстро (в течение десятков минут) за счет изменения их концентрации в крови и может сохраняться в течение долгого времени (Blauateln, 1992,1993). Специфичность действия эндогенного уабаи-на на клетки разных органов и тканей определяется, в частности, соотношением разных исоформ а-субъеданицы фермента (Akera & Ng, 1991; Sweadner, 1991; Jewell et al., 1992), имеющих неодинаковую чувствительность к уабаину.

Проблема внутриклеточной регуляции активности Na.K-АТФззы представляется на сегодняшний день наиболее актуальной, поскольку з этой области много неясных вопросов и противоречивых данных. Исследования последнего десятилетия продемонстрировали тесную связь Иа-насоса с белковыми компонентами мембранного скелета, в

частности, с анионтранспортирущей системой, т.е. с Солком п.З (Possel & Solomon, 1983; Janoahazl & Solomon, 1989), с якорным белком ащшрином (Nelson et al., 1987,1991; tíorrow et al., 1989; Bennett, 1992), а через мембранный скелет - с мембранрсвязанными ; ферментами, например, гликолитическими (Proverbio, Hoírman, 1977;-Мегсег, Dunhum, 1981; Low et al., 1993). Показано существование внутриклеточных модуляторов Na.K-АТФазы (активаторов л ингибиторов) (Ylngst, 1988, 1992; Петруняка и соевт., 1990,1991; Мацкевич и соавт., 1994, Мацкевич, Казеннов, 1994). Установлено также влияние белков мембранного скелета на активность и кинетические свойства Na.K-АТФазы (Казеннов, 1991; Bertorello et al., 1992; Bert-orello Sl Katz, 1993).

Цель и задачи исследования. В настоящей работе нами предпринята попытка на примере безъядерных эритроцитов крысы изучить влияние гемолизата и смеси солюбилизированных периферических белков мембранного скелета эритроцитов (ВМС) на активность Na.K-АТФазы-в мембранных црепаратах клеток с разным полипептидным составом с целью выяснения взаимоотношений мевду внутриклеточными модуляторами активности фермента, мембранным скелетом и самим ферментом.

В работе были поставлены следующие задачи:

- провести сравнительное изучение активности и некоторых' .кинетических характеристик Na.K-АТФазы и уабаин-чувствительной К-фосфатазы (частная реакция АТФазного цикла) в целых эритроцитах крысы, тенях эритроцитов и мембранных препаратах, лишенных основных белков мембранного скелета спектрина и актина ("бесспектрино-вые" мембраны);

- исследовать влияние факторов, способствующих конформацион-ным переходам фермента, на функционирование Na.K-АТФазы в целых эритроцитах и мембранных препаратах эритроцитов;

- изучить влияние гемолизата эритроцитов 1фысы и солюбилизн-рованых ВМС на активность Na.K-АТФазы и уабаин-чувствительной фо-сфатазы в тенях и бесспектриновых мембранах в отсутствие и в присутствии Са2+ и АТФ;

- с помощью гель-фильтрации попытаться разделить отдельные компоненты смеси солюбилизированных ВМС эритроцитов и идентифицировать их с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

- изучить влияние отдельных фракций солюбилизированных ВМС, полученных в результате гель-фильтрации, на активность Na.K-АТФазы и Са-АТФазы мембранных препаратов из разных источников.

ШШШЗ-Швизнд. Установлено, что последовательное удаление знутриклеточного содержимого и периферических белков мембраны эритроцитов крысы - спектрина и актина, сопровождается прогрессивным падением активности Иа.К-АТФазы и снижением скорости уабаин-чувствительной К-фосфатазной реакции, а также изменением чувствительности фермента к эндогенным низкомолекулярным модуляторам (двухвалентным катионам и АТФ).

Впервые продемонстрировано неодинаковое, зависящее от концентрации двухвалентных катионов, влияние гемолизата и белков мембранного скелета на активность Иа.К-АТФазы в мембранных препаратах эритроцитов крысы с разным полипептидным составом.

Впервые выявлено модулирующее влияние разных фракции солюб. • лизироЕанных БМС, полученных при гель-фильтрации, на активность ,'!э,К-АТФазы и Са-АТФазк мембранных препаратов эритроцитов и гомо-гената головного мозга крысы. Показано активирующее влияние фракции, содержащей основные белки мембранного скелета эритроцитов -спектрина и актина,-на активность транспортных АТФаз, наиболее выраженное для фермента головного мозга.

Ядуч^-г1рдщхпесг^_э^и*ость_рдбош. Показано, что как в гемолизате эритроцитов, так и в растворе смеси солюбизированных .балков мембранного скелета присутствуют факторы, активирующие Иа,К-АТФазу эритроцитаряой мембраны и головного мозга крысы, причем степень эффекта зависит от вида мембран и проявляется более выракенно в случав мембранных препаратов, лишенных периферических белков, а также в отношении фермента головного мозга. Сделан вывод, что активирующим эффектом обладают основные белки мембранного скелета - спектрин или актин, или их комплекс-

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о важной роли белков мембранного скелета эритроцитов в функционировании транспортных АТФаз, являющихся трансмембранными ферментами и имеющими активный центр на цитоплазматичвекой поверхности мембраны в непосредственной стерической близости от белков мембранного скелета, которые, очевидно, вовлечены в ферментативный цикл этих Ферментов.

Полученные данные расширяют современные представления о путях регуляции активности транспортных АТФаз, что важно в плана понимания" механизмов контроля ионного гомеостаза как в отдельных клетках, так и на уровне органов и целого организма.

¿пробаццЯ-йийс§ШШУи. Результаты работа докладывались на:

рабочих заседаниях по проблеме "Комплексное изучение медико-биологических проблем здоровья населения Тюменской области", посвященных 30-летию Тюменского государственного медицинского института (Тюмень, 1993); The First FEPS Congress (September 9-12, 1995, Maastricht, The Netherland); конференции по проблеме "Клинико-физиологические аспекты здоровья" (Тюмень, 1Э95).

Публикации. Результаты исследований опубликованы в 4 статьях и 4 тезисах.

Стуинтцуа ц объем работ. Диссертация состоит из введения, , обзора литературы, описания методов и результатов исследований, обсуждения полученных данных, заключения и выводов, (¡шсок цитируемой литературы включает 246 источников, в том числе 200 на иностранных языках. Работа изложена на 165 страницах машинописного текста, иллюстрировна 32 рисунками и 2 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования являлись эритроциты крыс-самцов линии Wlatar в возрасте' 13-14 недель с массой тела 220-240 г. Смешанную венозно-артериальную кровь получали после декапитации животных. В качестве антикоагулянта использовали гепарин (150-200 ед/мл). Все .исследования проводились в день забора крови.

Эритроциты осаждали путем центрифугирования при 300 g в течение 5 мин, после чего удаляли плазму крови и лейкоцитарную пленку. Эритроциты трижды промывали охлажденным изотоническим расвором (0,145 М NaOl в 0,02 М трис-HCl буфере pH 7.6 при 25°С.

Мембранные препараты эритроцитов (теш) получали путем гапс-осмотического гемолиза по методу Dodge et ai. (1963). В качестве гемолизиругацей среды использовали 10 мМ трис-HCl буфер (pH 7.6), содержащий I мМ ЭДТА (Казеннов и соавт., 1984). Объемное соотношение эритроцитов и гемолизируюцей среды составляло 1:15. Теш осавдали центрифугированием при 20000 g в течение 20 мш. и трижды промывали 10 мМ трис-HCl буфером, каждый раз осавдая мембраны при тех не условиях центрифугирования. Гемолизат, предназначенный для изучения его свойств, получали при соотношении эритроцитов и гемолизирупцей среды 1:5,

Мембранные препараты, лишенные периферических белков мембранного скелета получали по методу Steck & Kant (1974) следующим образом. Свежеприготовленные тени эритроцитов суспендировали в 10

объемах I мМ трис-НС1 буфера (рН 7.6) и инкубировали в термостате при 37°С в течение 30 мин при постоянном осторожном перемешивании. Мембраны осаждали при 20000 g в течение 15 мин. и двавды промывали 10 глМ трис-НС1 буфером. Сунеряатант после первого осаждения мембран представлял собой смесь периферических мембранных белков и использовался для изучения его влияния на активность ферментов.

Для фракционирования смеси ВМС использовали метод гель-фильтрации на сефэдексе й-75. Неконцентрированный или концентрированный с помощью сефадексов 0-15 или 0-25 супернатант наносили на колонку, заполненную сефадексом (1г = 200 мм; о = 26 мм), уравновешенным 5 мМ трис-НС1 буфером (рН 7.6) с 0,1 мМ ЭДТА. Белок о.тсировали из колонки тем же буфером со скоростью 4 мл/мин. Соде-;1ани9 белка во фракциях объемом 4 мл оценивали спектрофотометри-■;ески при 278 нм.

Электрофоретэтеское разделение белков проводили в камере для вертикального электрофореза по методу Ра1гЬапХз е1; а1. (1971) в 5,6 % полиакриламидном геле в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия. Толщина геля составляла 1,2-1,4 мм, размер плато - 10x12 см. Пробы в объеме 10-20 мкл (20-40 мкг белка) наносили в углубления геля, сформированные специальной гребенкой (ширина дорожки 5-6 мм). Электрофорез проводили в течение 1,5-2,0 часов при напряжении тока 125 в (8-9 в/см длины геля) и силе тока 60 мА. После окончания электрофореза пластины геля помещали в фиксирующий и окрашивающий раствор. Окрашенные пластины геля высушивали между двумя листами целлофана.'

Стандартная инкубационная среда для определения активности АТФаз содержала (в мМ): НаС1-100; КС1-20; м&С1г-3; АТФ-3; ЭДТА-50; трис-НС1 -50 (рН 7.4 при 25°С). Для определения активности Иа.К-АТФазы в среду вводили I мМ уабаина, для определения Са-АТФазы - СаС12 в разных концентрациях. Опреление уабаин-чув-ствительной фосфат азной активности проводили как описано Пагтап & Ьегс (1980) в стандартной инкубационной среде, содержащей (в мМ): МеС13-6; КС1-150; ЭДТА-0,5; пара-нитрофенилфосфат (пНФФ) -10; трис-НС1 -50 (рН 7.4). Состав инкубационной среды варьировали в зависимости от целей эксперимента.

Для выявления АТФазной и фосфатазной активностей в целых эритроцитах, клетки предварительно инкубировали с твином 20, приготовленном на 0,25 М сахарозе в 0,02 М трис-НС1-буфере (рН 7,6) в

соотношении 1:1 в течеыш 45-60 мин. (¡и&озюь . "оо;,т., IL>64). Затем взвесь эритроцитов доьздили тем гм раотвэр"!; сахарозы до 5 объемов первоначально взятых эритроцитов. 0,1 м/. суспензии эритроцитов (или мембранных препаратов) вводили в 0,5 мл инкубационной среда и ферментативную реакцию проводили при 37°С в течение 40-60 мин. Реакцию останавливали введением 0,2 мл 15% трихлорук- , сусной кислоты.

АТФазную и фосфатазную активности определяли по приросту, соответственно, неогранического фосфтата (Фн) и пара-нитрофенола (пНФ) в инкубационной среде. Ыа,К-АТФазную и уабаин-чувствительную К-фосфатазную активность рассчитывали по разнице ферментативных активностей в отсутствие и в присутствии I мМ уабаина и выражали в мкмоль Фн (пНФ)/час либо на мл клеток, либо на мг белка (в случае мембранных препаратов). Содержание Фн определяли методом Chen et al (1957) в модификации Казеннова и соавт. (1984). Содержание пНФ определяли как описано у Flatman & Lew (1980).

Содержание белка в пробах определяли по методу Lowry et al.(1951). Концентрацию свободного кальция в среде инкубации рассчитывали согласно Додсону (1990) с учетом констант связывания всех хелатирующих агентов, присутствующих в среде.

Экспериментальные данные обработаны статистически с использованием критерия Стьюдента. В таблицах и на рисунках представлены средние арифметические исследованных параметров (М) и их стандартные ошибки (т).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Активность и свойства Ма,К-АТФазы и уаба"ч-чувствительной К-фосфатазы в целых эритроцитах, тенях и бе зпектриновых мембранах

В работах Казеннова и соавт. (1990, 19:1), Мацкевич и соавт. (1994 а,б) было показано снижение активиста транспортных АТФаз при удалении внутриклеточного содержи?- то из безъядерных эритроцитов некоторых млекопитающих и дальнейшее падение активности этих ферментов при удалении из эритроцитарных мембран основ-шх периферических белков мембранного скелета спектрина и актина. Авторами было высказано предположение, что в цитоплазме клеток гекоторых млекопитающих присутствуют активатор(ы) Иа.К-АТФазы,

действие которого реализуется через белки мембранного скелета, а сами ВМС, кроме того, связаны с функционированием Па,К-АТФазы.

В нашей работе исследовались целые эритроциты, отмытые от плазмы крови, а также два вида мембранных препаратов эритроцитов - тени и "бесспектриновые" мембраны. Электрофоретический полипептидный профиль изученных мембранных препаратов, а также суперна-танта; полученного после солшбилизации периферических белков эри-троцитарной мембраны, представлены на рис 1. Видно, что тени эритроцитов крысы содержат полный набор мембранных периферических и интегральных белков, характерных для человека и других млекопитающих, а в мембранах, подвергшихся процедуре солюбилизации периферических бэлков, практически отсутствуют основные белки мембранного скелета - спектрин (его обе субъединицы) и актин. Эти белки содержатся в супернатанте. Супернатант, представляющий, таким образом, смесь белков мембранного скелета, использовали в последую-

Рис.Г. Полипептидшй состав мембранных препаратов эритроцитов крысы и солюбилизирован-ных БМС. а - исходные тени эритроцитов; б - бесспектриновые везикулы; в - супернатант, содержащий солюбилизиронанные белки мембранного скелета. 1,2 - а и р-субъединицы спектрина; 3 - белок полосы 3; 5 - актин (обозначения по номенклатуре Fairbanks et al, 1971).

Активность На,К-АТФазы и уабаин-чувствительной К-фосфатазы в изученных клеточных объектах суммированы в табл.1. Из таблицы видно, что как общая Иа.К-АТФазная активность, так и уабаин-чувствительная К-фосфатазная активность снижаются в

щих сериях экспериментов.

1— а— э — ¡=Е

3- ч«г ^амм -

5- — —

323 —

а б в

2 раза посла удаления внутриклеточного содержимого в процессе получения теней. Кроме того, удаление периферических селков мембранного скелета сопровождается дополнительным приблизительным трехкратным падением обеих ферментативных активностей 'ц эритроци-тарной мембране.

Далее мы попытались выяснить, как влияют факторы, способствующие переходу фермента из одного конфирмационного состояния в другое, на активность Na.K-АТФззы в целых эритроцитах крысы и их мембранных препаратах. Активность фермента исследовали при увеличении концентрации АТФ и повышении рН, т.е. использовали воздействия, способствующие преходу Е2->Е1, а также в условиях повышающихся концентраций Mg2"1", что способствует, по мнению Flatman & "Lew (1980) , обратному конформационному переходу (Е^Е,).

1.1. Влияние на активность Ш,К-АТФази в целых эритроцитах и мелбранкых препаратах с различная полипептЮным составом

На рис.2 представлены данные по влиянию возрастающих концентраций MgCI2 на активность Na,К-АТФазы и К-фосфатазы в целых эритроцитах и мембранных препаратах. В целых клетках и тенях эритроцитов крысы обнаружена та же зависимость, что и в тенях эритроцитов человека (Flatman & Lew, '1.980): при концентрациях Mg2"1" в среде определения ферментативной активности, превышающих концентрацию АТФ, активность общей Ма.К-АТФазы прогрессивно снижается, в то время как активность фосфатазы, напротив, постепенно повышается. Эта зависимость .для фосфатазы имела вид гиперболы, что свидетельствует о насыщаемости.данного процесса.

В "бесспектриновых" везикулах наблюдалась несколько иная картина. Во-первых, не выявлено модулирующего влияния Mg2* на общую Ыа,К-АТФазную активность. Кроме того, в случае К-фосфатазы, хотя и наблюдалось постепенное повышение ферментативной активности при увеличении концентрации MgCl2, эта зависимость имела прямолинейный характер. Таким образом, удаление спектрин-актиновой сети из мембран эритроцитов приводит к исчезновению модулирующего влияния Mg2* на общую АТФазную активность. В тенях эритроцитов обе ферментативные активности (в расчете на I мл клеток) были в 2 раза ме • нъше, чем в целых эритроцитах при 1,5 и 3 мМ HgClg. В бесспектриновых мембранах обе ферментативные активности (также рассчитанные на I мл клеток) при всех концентрациях MgCIg были значительно ни-

Таблица 1. Активность Ыа*,К*-АТФазы н уабаин-чувствительнойК'-фосфатазы в целых эритроцитах (мкмольФн(пНФ)/час/мл клеток) и мембранных препаратов (мкмольФн(пНФ)/час/мл клеток; мкмольФн(чНФ)/час/мг белка) (п=15. М*т).

МЕМБРАННЫЕ ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ

Na'.K'-АТФаэа К'-фосфатаза

на мг балка на мл клеток на мг белка на мл клеток

эритроциты 19.75t1.57 4.05Ю.38

Тени 2.181.0.18 9.8010.90** 0.4310.07 1.9510.20**

"бесспектриновые" везикулы 1 27Ю.2 1 2 8710.40* 0.2 8 ±0.03 0 65±0 05

* - р < 0.05; ** - р < 0.01 (достоверность различий между мембранными препаратами)

12 18 [MgCtJ, мМ

А 12 r ..I — I

хо-1 г"ч!* А' * I

8 II

б

4

2

12 18 [MgCIJ, мМ '

12 18 [MgCIJ, мМ

-З--«

Рисунок J. Зависимость активности Na*,K*-АТФазы (3,4) (мкмольФн/час/мл клеток) и уабаин-чувствителыюй К*-фосфатазы Ш) (мкмольпНФ/час/мл клеток) (1,2) эритроцитов (1), теней (II). "бесспектриновых" везикул (III) от концентрации MgCh в среде инкубации в присутствии (2,4) и отсутствие (1,3) обработки детергентом твин-20: п»15.

жэ, чем в исходных тенях эритроцитов, причем наибольшие различия в активности общей Na.K-АТФазы выявлены при 3 MíM MgC.'L?, а К-фосфатазы - при 6 мМ MgGIg. Так как Na.K-АТФаза является интеграль- ; ным мембранным белком, этот фермент не может быть солюбилизирован в условиях получения "бессгоктриновых" мембран, и обнаруженное снижение активности фермента не обусловлено уменьшением количества единиц фермента. Снижение ферментативной активности при удалении внутриклеточного содержимого, вероятно, связано с потерей какого-то активатора фермента, в то время как аналогичной эффект прй удалении периферических белков может быть обусловлен изменением каталитических свойств фермента из-за нарушения структурной организации мембраны.

Таким образом, исчезновение чувствительности общей АТФазной активности к высоким концентрациям Mg2+ после удаления из мембран спектрина и актина позволяет предположить, что эти белки, или, возмойю, иные минорные компоненты, ответственны за этот эффект; хотя не исключено, что происходит нарушение упаковки фосфолицидов липидного матрикса, который стабилизируется белками мембранного .скелета (Calver et al., 1988). Для решения данного вопроса было исследовано влияние факторов,способствующих быстрой трансформации фермента из конформации Е2 в конформацию Е^.

1.2. Влияние АТФ и ptí среды на активность уаОаин-чувствителъной К-фосфатазы в целых эритроцитах и жеябранкых препаратах

Ускорение перехода Е2->Е1 под влиянием АТФ было экспериментально показано Скоу (Skou, 1974). По его же данным (Skou, 1982) процесс превращения К-конформации Иа.К-АТФа'зы в натриевую сопровождается освобождением протона из активного центра фермента.

Исследование было проведено при разных соотношениях концентрации Na+ и К+ в инкубационной среде, т.е. при разном соотношении калиевой и натриевой форм фермента. Полученные данные представлены на рис.3 и 4.

В отсутствие АТФ активность К-фосфатазы в обоих мембранных препаратах в среде с высоким содержанием калия была приблизительно в 2 раза выше, чем в средах с преобладанием натрия. Абсолютная ферментативная активность в бесспектриновых везикулах была ниже (в 1,5-4 раза) по сравнению с тенями эритроцитов при любом составе инкубационной ;реды как в отсутствие, так и в присутствии АТФ.

в. о 6 4 3 2 1 О

1 2

3 4 5 0 [АТФ], мМ

12 3 4

[АТФ], мМ

Рисунок 2. Зависимость активности К*-фосфатазы (мкмольпНФ/час/мл клеток) теней (а) и "бесспектриновых" везикул (б) от концентрации АТФ в среде инкубации, в присутствии различных соотношений концентраций NaCl и KCl (в мМ): п=9. 1 - [NaCl] / [KCl] - 30/150; 2 - [NaCl] / [KCl] - 95/75; 3 - [NaCl] / [KCl] - 170/10.

7.8 pH

7.8 pH |

Рисунок 3. Зависимость активности К*-фосфатазы (мкмольпНФ/час/мл клето*) теней (а) и "бесспектриновых" везикул (б) от рН среды инкубации, в присутствии различных соотношений концентраций №С1 и КС1 (в мМ): п-9. I - [ЫаС1] / [КС1] - 30/150; 2- [№С1] / [КС1] = 95/75; 3 - [ЫаС1] / [КС1] » 170/10.

0

Увеличение концентрации AT* а инкубационной средо сопровождалось повышением активности уббаин-чувствительной К-фосфатасы как в тенях, так и в бесспектриновых везикулах. Следует отметить, что, по сравнению с тенями, наибольшая активность К-фосфатазн;в бесспектриновых везикулах выявлялась при меньших концентрациях АТФ (0,5 -мМ): это имело место при всех исследовашщх соотношениях натрия и калия в среде. Принципиальное отличие свойств фермента в тенях и | везикулах заключалось в выраженной активации К-фосфатлзы в тенях под влиянием АТФ в интервале концентраций субстрата 0-1 мМ в вы- , сок'окалиевой среде ([Na+]:tK+l = 30мМ:150 мМ) (рис.2 а, кривая I). При этом, абсолютная активность фермента в тенях в присутствии I мМ АТФ более чем в 2 раза превышала активность при иных соотноше-■ ниях одновалентных катионов. В везикулах в присутствии I мМ АТФ активность фермента при всех исследованных соотношениях натрия и, калия была практически одинаковой.

1фи увеличении рН инкубационной среда от 6.8 до 7.8 актив-' • ность К-фосфатазы снижалась как в тенях, так и в бесспектриновых везикулах, но только в случае относительно высокой концентрации калия в среде и не изменялась при соотношении [Na+1:(K+] = 150 мМ:10 мМ (рис.4). Эти результаты находятся в соответствии с представлениями о том, что процесс превращения К-конформации фермента ,в натриевую сопровождается депротонированием активного центра фермента, которое облегчается АТФ (Skou, 1982; Федосова и соавт., 1993), особенно при низких концентрациях Na+. Полученные данные свидетельствуют, что для этого процесса не имеет значения интакт-ность белков мембранного скелета.

Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод, что удаление белков мембранного скелета из эритроцитарной мембраны сопровождается выраженным снижением как активности общей На,К-АТФазы так и скорости частной ее реакции - К-фосфатазной. При этом исчезают модулирующее влияние инов магния на общую Na,K-АТРазную активность и АТФ на увбаин-чувствительную фосфатазу в высококалиевой среде; в то же время изменение рН инкубационной среды сопровождается одинаковыми измененями ферментативной активности в обоих мембранных препаратах.

Таким образом, воздействия, рассматривающиеся как факторы, вызывающие конформационные перехода фермента могут, по нашим данным, не только непосредственно влиять на фермент, но осуществлять, очевидно, свое модулирующее действие через белки мембранно-

■Эх

го скелета. Хорошо известно (Bennett, 1989), что Mg~ и / S являются также регуляторами взаимодействия мембранных белков спектри-на, актина и белка п.4.1, образующими основное функциональное соединение мембранного скелета. Поэтому не исключено, что изменения з структурной организации мембранного скелета мэгут отражаться на Функционировании транспортных АТФаз. Кроме того, в прямых опытах ■■¡оказано (Bertorello & Katz, 1993), что короткие филаменты актина способны непосредственно активировать На,К-АТФазу.

Все эти факты свидетельствует о влиянии БМС на работу транспортной АТФазы, механизм которого не вполне ясен. Можно, однако, предположить, что удаление спектрина, являющегося стабилизатором фосфслипкдного бислоя (Calver et al., 1988), сопровождается пару шением упорядоченностч- упаковки фосфолипидов и, таким образом, приводит к нежелательным конформационным изменениям молекулы этого интегрального фермента или к состоянию, при котором способность фермента к конформационным переходам в процессе его функционирования уменьшается.

Вместе с тем, учитывая цитоплазматическую локализацию активного центра фермента в мембране и, следовательно, тесную стериче-скую близость последнего к спектрин-актиновой сети, можно предположить, что спектрин, актин и (или) иные белки мембранного скелета непосредственно вовлечены в одну из реакций каталитического цикла фермента. Поскольку выявлены существенные изменения активности и кинетических свойств К-фосфатазы при удалении БМС, есть основания полагать, что такой реакцией может быть процесс дефос-форилирования фермента, который может осуществляться не только путем гидролиза фосфофермента с переходом неорганического фосфата в водную фазу, но также в результате прямого переноса фосфатного остатка на один из белков мембранного скелета.

Для проверки вышеуказанных предположен^* били проведены эксперименты по изучению влияния гемолизата и солюбилизированных БМС на активность Na.K-АТФазы и увбаин-чувствителъной фосфатазы в тенях и бесспектриновых мембранах.

2. Влияние гемолизата и смеси солюбилизированных БМС на активность Na,K-AT$83n в мембранных препаратах эритроцитов крысы п отсутствие и в присутствии Mg2'1' и Са2+

в работах Ингста и соавт. (Yin-'st et а1.,'19Я8, 199?), '< та-

кжв Петруняки и соавт. (1981,199 ) в эритроцитах выявлено присутствие внутриклеточных ингибиторов и активаторов Иа.К-АТФазы. О непосредственном влиянии белков мембранного скелета на функционирование N8,К-ЛТФазы свидетельстуют данные Казеннова и соавт. (1990, 1991) и ВегЧогеПо ег а1. (1992, 1993). В данном разделе работы представлены данные полученные при исследовании влияния гемолизата и смеси солюбилизированных белков мембранного скелета на активность ка,К-АТФазы и уабаин-чувствительной ССосфатазы в зависимости от концентрации двухвалентных катионов и АТФ в инкубационной среде.

На рис.4 представлены данные о влиянии гемолизата и смеси солпЗилизированных периферических белков (СБМС) эритроцитарной мембраны на активность Ка.К-АТФазы в тенях и бесспектриновых мембран эритроцитов. Как установлено в предыдущем разделе, увеличение концентрации в инкубационной среде от 3 до 12 мМ сопровождав тс ч 40-50^ падением активности фермента в тенях эритроцитов, однако в бесспектриновых мембранах достоверного изменения активности фермента не происходит. Прединкубация теней эритроцитов как с гемолизатом, так и с СБМС приводила к существенному повышению активности общей ма.К-АТФазы, причем при увеличении концентрации МбС12 в инкубационной среде степень активации при обоих воздействиях возрастала, достигая при 12 мм МеС12 соответственно 50% и 45%. В бесспектриновых мембранах обнаружена обратная зависимость: если при 3 мм активация фермента гемолизатом и со-любилизированными БМС (СБМСДоставляла 45% и 64%, соответственно, то при 12 мм М§С12 она вообще отсутствовала.

Что касается частной реакции иа.К-АТФазы - К-фосфатазной, то здесь получены неожиданные результаты. Предварительная инкубация мембранных препаратов с гемолизатом приводила практически к полному ингибированию уабаин-чувствительной фосфатазы в тенях и снижению активности в бессспектриновых мембранах до 28% от исходного уровня. Этот эффект несколько уменьшался в присутствии 0.5 мы АТФ. Разнонаправленные изменения общей Иа.К-АТФазной и фосфатаз-ной активностей можно связать с разным соотношением калия и натрия в среде инкубации В то же время СБМС лишь на 30% ингибировали фосфатазную активность в тенях эритроцитов, а АТФ полностью предупреждал этот эффект. В бесспектриновых мембранах указанная предобработка мембран СБМС приводила к активации фосфатвзы как в отсутствие (44?б), так и в присутствии (41%) АТФ. Полученные резуль-

□-1 Ш-2 Н-ЗИ-4

Рисунок 4. Зависимость Ыа4,К.*-АТФазы (мкмольФн/час/мд клеток) теней (а) и "бесспекгрнновых" везикул (б) от концентрации \fgCl2 в срейе инкубации; п~9. I - 3; 'Л - б; Ш - 12 мМ МдСЬ

1 - в отсутствие обработки; 2 - обработка гемолнзатом; 3 - обработка СБМС; 4 -обработка в присутствии свободного Са!* (0,3 мкМ).

* - р < 0.05; ** -р < 0.01 (достоверность отличий по сравнению с контролем)

татч свидетельствуют, что при кажущемся сходстве влияния гемоли-зата и СБМС на общую ма,К-АТФазу в обоих мембранных препаратах эри/роцитов крысы, механизм их активирующего действия, по-видимому, отличается. Об этом свидетельствуют и результаты по влиянию ионов кальция на характер активации №,К-АТФазы.

Основываясь на данных Ингста (Yi.ngst.i988) о том, что активирующее влияние малых концентраций Са2+ на Ыа.К-АТФазу опосредуется через кальнактин, представляющий по мнению, высказанному автором позже, ег а1.,1992) часть молекулы кальмодулина, и данных ^аггеП & РепгШоп, 1977) о присутствии в эритроцитах значительного количества кальмодулина, мы исследовали влияние микромолярных концентраций Са2+ в инкубационной среде на активацию ыа,К-ЛТФэзы гемолизатом и СБМС. Параллельно определялась также активность Са-АТФлзы, т.е. фермента, для которого кальмодулин является естественным модулятором активности.

Прездэ всего следует отметить,- что предварительная инкубация как теней, так и бесспектриновых мембран эритроцитов с гемолизатом вызывала почти двухкратное повышение активности Са-АТФаза. Вместе с тем, СБМС достоверно не изменяли активности Са-АТФазы в обоих мембранных препратах эритроцитов. Таким образом можно сделать вывод, что в смеси солюбилизированных периферических белков мембраны эритроцитов крысы кальмодулин отсутствует, что согласуется с литературными данными (Вазк1п & Ьапзйоп, 1981). Присутствие Са2+ в инкубационной среде по-разному влияло на активность ма,К-АТФазы в тенях и бесспектриновых мембранах (рис.4). В тенях Сал+ достоверно снижал активность фермента, в бесспектриновых мембранах - не изменял ее. В случае предобработки мембран СБМС добавление в среду этого двухвалентного катиона не изменяло процент активации фермента как в тенях, так и в бесспектриновых мембранах. При использовании гемолизата в присутствии Са<,+ наблюдалось изменение степени активации фермонта, однако если в тенях имело место отчетливое усиление активации ферментативной активности, то в бесспектриновых везикулах, напротив, активация практически исчезала.

Все вышесказанное позволяет заключить, что эффекты гемолизата, по-видимому, связаны с присутствием в нем низкомолекулярных активатора и ингибитора, или фактора, направленность эффекта кс-торого зависит от вида мембран и ионного состава инкубационной средн. Эффекты же СБМС на АТФазы обусловлены влиянием белков мемб-ранчпго скелета эритроцитов (спектрином, актином или их компле-

;ссом). Для уточнения механизма активирующего влияния СБМС била :1роведена серия опытов по разделению этой смеси белков с помощью гель-фильтрации.

3. Влияние отдельных конпонентов СБМС на активность ма,К-АТФазы

Для выяснения механизма активирующего действия СБМС на ГЯа.К-АТФазу теней и Оесспектринових мембран эритроцитов криси были проведены 2 серии опытов по разделению смеси СБМС с помощью гельфильтрации на сефадексе о-75.

На рис.5 приведены типичные кривые элюции бежа после нанесения исходного и кощентрированного с помощью сефадекса с-25 или 0-15 супернатанта, содержащего солюбилизированные белки мембранного скелета (СБМС) и полученного в результате инкубирования теней в среде с низкой ионной силой (т.е. в процессе получения бес-спектриновых мембран). Видно, что неконцентрированный супернзтант элюировался из колонки в виде одного белкового пика в интервале меззду 6 и 12 фракциями В случае разделения концентрировгнного супернатанта отчетливо выявлялись 2 пика - перьцй пик в том же интервале, а второй широкий пик между 21 и 27 фракциями, причем при концентрировании сефадексом 0-15 второй пик был в 3 раза больше, чем в случае концентрирования сефадексом 0-25. Из рисунка видно, что пик I содержит главным образом спектрин, обе его субъедшпщы (260 и 235 кДа), а также небольшое количество актина (43 кДа). Во фракциях пика 2, несмотря на относительно большое содержание белка, не удалось выявить ни одной белковой полосы. По-видимому это обусловлено тем, что определяемый при 278 нм белок представлен в пике 2 низкомолекулярными пептидами, не фиксирующимися на элект-рофореграммах. Далее исследовали влияние полученных фракций на активность на,К-АТФазы и Са-АТФазы в тенях и бесспектриновых мембранах эритроцитов крысы, а также вгомогенате серого вещества коры головного мозга крысы после удаления ядерной фракции.

Отдельные белковые фракции СБМС полученные после предварительного концентрирования суфадексом С-25, по-разному влияли на активность №,К-АТФазы и Са-АТФазы из разных источников (рис.6).Так, пик I активировал Ка,К-АТФазу головного мозга (в среднем на 32$ как в отсутствие, так и в присутстЕ$щ I мМ СаС12). На фермент теней фракция I оказывала лишь небольшой активирующий эффект (менее 10.95), причем не влиял на степень активации. Фермент бесспек-

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 N9 пробы

Рисунок 5. Профиль элюции белка из колонки (0-75). 1 - бет предварительной концентрации СБМС; 2 - концентрация (3—25; 3 - концентрация 0-15.

%

30 20 10 0

-1П

?о

%

16 14 12 10 8 6 4 2 0

-1 3

б)

I

-/5 3,5 II

П-1П-2Е-3

Рисунок б. Зависимость активности Ып\К*-АТФачы (в % к контролю) гомогената головного мозга (а), теней эритроцитов (б), "бесспектриновых" везикул (в) при обработке фракциями СБМС; п=7.

1 - 0-75, предварительная концентрация

0-25; 2 - 0-75, предварительная концентрация О—15; 3 - в присутствии СаС12 (I мМ).

1-пик I; II - пик 2 *-р< 0.05; **-р <0.01 (достоверность различий по сравнению с контролем)

-2.1-

Таблица 2. Изменение активности Ыа+,К+-АТФази и Са!'- ЛТФали '

Мембранные препараты № пробы [СаС12], мМ Процент активации ферментативной активное!к транспортных А'ГФаз

Ыа'К'-АТФаза Са2*-АТФаза

Гомогенат головного 8 0 15.5 ± 2.5*

мозга 1 9.5 ±2» 40 ±4 •

9 0 25 ±3.1**

1 8± 1.4 250 ±25**

10 0 21 ±4"

1 12 ±2.4* 250 ±32**

11 0 22 ± 3*

1 15 ± 1.5* 225 ±20**

12 0 11 ±2*

1 7.5 ± 1.5 60 ±7*

Тени эритроцитов 8 0 1 14 ±2.3* 17 ± 1.8* 6 ± 2

0 5 ± 2

9 1 9 ± 2.3* 12 ± 3*

10 0 1 6± 1.2 11 ±2* II ±2.5

11 0 16± 1.2*

1 17 ± 1* 4 ± 1.5

12 0 12 ± 1*

1 11 ± 1* 6± 1.7

"бесспектриновые" везик^^лы 8 0 1 14 ± 2* 0 ± 4 15 ± 3

9 0 18 ±3.5*

.,, 1 7 ± 1 30 ±3*

10 0 ч 21 ±3*

1 1 -3± 1 30 ±4*

11 < '■ 0 25 ±2.7**

1 -7± 1.1 30 ±4*

12 0 , 18 ± 3*

1 3 ± 0.9 0 ± 5

* - р < 0.05; ** - р < 0.01 (до. .оверность отличий по сравнению с контролем)

- 2,4-

тринових мембран ингибировался на 15% в отсутствие коков кальция и активировался на 32;» при добавлении в инкубационную среду Са2+.

Белки пика 2 достоверно повышали активность на.К-АТФазы лишь в гомогенате головного мозга, однако в меньшей степени, чем белки пика I. Внесение конов кальция снижало уровень активации в 2 раза.

Следует отметить, что в случае предварительного концентрирования супернатанта с помощью сефадекса 6-15 активирующее влияние пика 2 в отношении Ка,К-АТФази головного мозга полностью исчезало, но появлялся активирующий эффект в отношении фермента мембранных препаратов эритроцитов, который в бесспектриновых мембранах подавлялся ионами кальция. Для Фермента бесспектриновых мембран в отсутствие Са2+, как и в случае пика I, отмечен небольшой ингиби-рующий эффект.

Для сравнения исследовалось также влияние супернатанта (смесь СБМС), фракций пиков I и 2 на Са-АТФазу в тех же мембранных объектах. Выявлена выраженная активация Са-АТФазы в гомогенате головного мозга под действием смеси СБМС и фракции I (более чем в 2,5 раза). Активность Са-АТФэзы теней практически не изменялась как под влиянием супернатанта, так и фракций обоих пиков. В то же время имела место выраженная активация этого фермента в. везикулах: на 76%, 51% и 32% соответственно под действием супернатанта, фракции I и фракции 2.

В отдельной серии опытов, где разделение СБМС на колонке с сефадексом с-75 проводили без предварительного концентрирования супернатанта, было изучено влияние на активность ферментов отдельных фракций пика I (табл.2). Установлено, что все фракции пика I достоверно активаровали Иа,К-АТФазу как в гомогенате головного мозга, так и в обоих мембранных препаратах эритроцитов. Ввведение в инкубационную среду ионов кальция не изменяло степени активации фермента в тенях эритроцитов, в 1,5-2 раза снижало активацию фермента в гомогенате головного мозга и полностью подавляло ее в бесспектриновых мембранах. Отмечено значительное повышение активности Са-АТФазы при инкубации бесспектриновых мембран и гомогената головного мозга с фракциями 9, 10 и II. В тенях достоверное повышение активности Са-АТФазы (на 10%) обнаружено лишь при действии фракции N 10.

Итак, результаты данного раздела работы показали, что фракции пика I, полученного при разделении неконцентрированного супернатанта на сефадексе 0-75 и содержащего обе субъединицы спектри-

-гъ-

¡1а и актин, достоверно активируют ка,К-АТФазу ео всех ме(.. ранних препаратах, причем добавление Са2ь в инкубационную среду приводило к исчезновению активирующего эффекта в отношении фермента бес спектриновых мембран и некоторому снижению его в гомогенате голо -зного мозга. Выраженная активация Са-АТФазы наблюдалась только е гомогенате голоеного мозга.

В случае концентрирования супернатанта (т.е. смеси СБМС) с аомощью 6-25, белки пиков I и 2 отчетливо активировали ИаД-АТФазу как в отсутствие, так и в присутствии Са2+ лишь в гомогенате головного мозга крысы. При концентрировании с помощью сефадекса (3-15 способность фракций пика 2 активировать фермент головного мозга исчезала, несмотря на то, что количество белка в этом пике увеличивалось втрое, <йжно предположить наличие низкомолекулярного ингибитора на,К-АТФазн, который поглощается сефадексом о-25. Са-АТФаза активировалась в гомогенате мозга (более чем в 2.5 раза) и бесспектриновых мембранах (более чем на 50%) и ее активность практически не изменялась в тенях эритроцитов под влиянием исходной смеси СБМС и фракций пика I. Активирующая способность Фракций пика 2 была несколько ниже и составила Ь2% для гомогената мозга, 32 % для бесспектриновых мембран и 0?5 для теней.

Полученные данные позволяют сделать вывод, что активирующим эффектом на ыа,К-АТФазу обладают как структурные белки (спектрин и актин), так и низкомолекулярный фактор, по-видимому пептидной природа, мол.масса которого должна быть в пределах 1000-1500 Дэ. Не исключено участие в регуляции фермента и других минорных низкомолекулярных белков или пептидов, обладающих ингибирующим эффектом на на,К-АТФазу, которые из-за небольшого содержания или малой мол.массы не могут быть выялены на электрофореграммах. Активирующий эффект фракций пика I (т.е. спектрина и актина) не модулировался ионами кальция, в то время как эффект пика 2 зависел от присутствия этих катионов. Можно предположить, что низкомолекулярные модуляторы №,К-ЛТФазы имеют разнонаправленный эффект в зависимости от присутствия физиологических концентраций СаЛ+.

выводи

I. Удаление внутриклеточного содержимого из эритроцитов крисы, а также периферических белков мембранного скелета из теней эритроцитов сопровождается прогрессивным стткением активности

на.К-АТФазы и Са-АТФэзы.

2. Для фермента мембранных препаратов эритроцитов, лишенных периферических белков мембранного скелета, не обнаружено характерного ингибирувдего влияния повышающихся концентраций ионов магния на актизность ИаД-АТФазы, при этом выявлен измененный характер активации уабаин-чувствительной К-фосфатазы.

3. В присутствии I мМ АТФ и высокой концентрации инов калия (Е2-форма фермента) отмечено резкое повышение активности уабаин-чувствительной К-фосфатазы в тенях эритроцитов, но не в бесспек-триновых мембранах.

4. Защолачиваше высококалиевой инкубационной среды сопровождалось снижением активности уабаин-чувствительной К-фосфзтазы в обоих мембранных препаратах эритроцитов. Это свидетельствует о том, что депротонирование активного центра фермента при трансформации Е2-формы в Е1-форму не требует интактности мембранного скелета.

5. Показано, что гемолизат эритроцитов обладает выраженным активирующим эффектом на транспортные АТФазы обоих мембранных препаратов, при этом двухвалентные катионы (»%2+и Са2+) являются модуляторами активации N8,К-АТФазы с разнонаправленным эффектом в отношении фермента теней эритроцитов и бесспектриновых мембран.

6. Выявлено также активирующее влияние смеси солюбилизиро-ванных белков мембранного скелета (СБИС) эритроцитов крысы на транспортные АТФазы мембранных препаратов эритроцитов и гомогена-та головного мозга крысы.

7. При фракционировании солюбилизированных белков мембранного скелета с помощью гель-фильтрации на сефадексе 0-75 получены две фракции белков, одна из которых (выокомолекулярная) содержала основные белки мембранного скелета спектрин и актин, а вторая -низкомолекулярное вещество(а) (по-видимому, полипептидной природы), не выявляемое при электрофорезе в ПААГ. Показано, что фракция, содержащая спектрин и актин, обладает активирующим эффектом в отношении транспортных АТФаз, наиболее выраженным для ферментов головного мозга.

8. Полученные данные позволяют сделать еывод, что белки мембранного скелета эритроцитов крысы, очевидно, вовлечены в реак ;л-онный цикл Ма,К-АТФазы на стадии дефосфорилирования фермента, и через гая может опосредоваться модулирующее влияние внутриклеточных регуляторов активности Фермента.

СПНСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦЮ!

1. Соловьев B.C., Фролова О.В., Шалабодов А.Д. Na.K-АТФапа !*ак маркер интегративной целостности биологических мембран // 3 сб. научных трудов Тюм.ГМИ "Комплексное изучение медико-биологических пробоем здЬровья населения Тюменской области. -Тюмень. - 1993. - 2 часть. - С.85-86.

•2. Kazennov A.M., Maslova M.N., Matskevlch Y.A., ohalabodov A.D., Frolova O.V. Role of the membrane skeleton proteins of rat erythrocytes in functioning of transport ATPase - Eur.J.Physiol.- 1995.- Suppl. Vol.430, Ni.- P.R28.

3. Фролова O.B., Шалабодов А.Д. Механизмы внутриклеточной регуляции активности Na.K-АТФазы эритроцитов млекопитающих // В сб. научных трудов Тюм.ГУ "Физические нагрузки'в клинике и спорте." - Тюмень. - 1996. - С.14-15.

4. Фролова О.В., Шалабодов А.Д. Исследование ферментативной активности Na.K-АТФазы как показателя интегративной целостности мембран при различных мембранопатиях // В сб. научных трудов Тюм.ГУ "Физические нагрузки в клинике и спорте." -Тюмень. - 1996. - С.25-26.

5. Фролова О.В., Шалабодов А.Д. Влияние твин-20 на функционирование Na.K-АТФазы эритроцитов крысы // "Научный вестник Тюм.ГУ (биологические науки)." - Тюмень. 1996. - С.41-46.

6. Каэеннов A.M., Фролова О.В., Шалабодов А.Д. Влияние ге-молизата эритроцитов и смеси солюбилизированных белков мембранного скелета на активность транспортных АТФаз мембранных препаратов эритроцитов крысы // "Научный вестник Тюм.ГУ (биологические науки)." - Тюмень. - 1996. - С.111-121.

7. Казеннов A.M., Рустамов Ф.А., Фролова О.В., Шалабодов А.Д. Сравнительное ивучение свойств уабаин-чувствительной фос-фатазы в тенях и бесспектриновых мембранах эритроцитов крысы // "Научный вестник Тюм.ГУ (биологические науки)." - Тюмень. -1996. - С.93-107

8. Каэеннов A.M.. Рустамов Ф.А., Фролова 0.В., Шалабодов А.Д. Влияние белков мембранного <скелета на частные реакции Na.K-АТФазы эритроцитов млекопитающих // Журнал эволюционной физиологии и биохимии. - 1996. - T.'"S, N4 (в печати).

тип. СП6МАПО. 3«. '