Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамика и механизм изменения активности Na, K-АТФазы эритроцитов крыс в условиях стресса

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Динамика и механизм изменения активности Na, K-АТФазы эритроцитов крыс в условиях стресса"

Министерство науки, высшей школы и технической политики О Г Я 0 Д Российской Федерации РОСТОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

- о дец ш • университет

Специализированный совет К 063.52.09 по биологическим наукам

На правах рукописи

МЕДВЕДЕВА Инна Александровна

ДИНАМИКА И МЕХАНИЗМ ИЗМЕНЕНИЯ АКТИВНОСТИ №а,К-АТФазы ЭРИТРОЦИТОВ КРЫС В УСЛОВИЯХ СТРЕССА.

(03.00.04 - Биологическая химия)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону 1993

Работа выполнена в Институте эволюционной физиологии и бис ыии им. И.М.Сеченова (г. Санкт-Петербург) и на кафедре биохик и микробиологии Ростовского государственного университета.

Официальные оппоненты:

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор М.Н.Маслова (г. Санкт-Петербург)

кандидат биологических наук, доцент А.А.Синичкин (г. Ростов-на-Дону)

доктор медицинских наук, о.н.с. P.A. Трапезонцева (г. Ростов-на-Дону, ЦНИИ РОДНМИ)

доктор биологических наук, проф. Т.Х. Шартанова (г. Нальчик)

Ca нкт-Петербургский государственный университет, кафедра биохимии

Защита соотоится " " 199fr. в /Я^час

на заседании специализированного совета К 063.52.09 по биолог чеоким наукам в Ростовском государственном университете (34401 г. Ростов-на-Дону, ул.Б.Садовая.105, клуб РП/,2 этаж)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Р1У

Автореферат разослан "_" _1993г.

Ведущвя организация:

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

(Кирой В.Н.)

Актуальность проблемы:В настоящее время как человек, так и животные всё чаще сталкиваются с различного родз стрессорными ситуациями, механизмы и последствия которых на организм изучены ещё недостаточно. Развитие стресса лежит в основе многих патологических процессов, поэтому изучение влияния экстремальных факторов Л организм необходимо для более глубокого понимания причин возникновения и профилактики заболеваний. Как известно, главной мишенью адаптации организма являются биологические мембраны (Крепе,1981). В связи с этим, исследование механизмов действия стресс-факторов на организм должно быть направлено прежде всего на выявление изменений в структуре, свойствах клеточных мембран, а также их маркёров - мембрановстроенных ферментов.

Наиболее удобным и доступным объектом исследования являются эритроциты (Черницкий, Воробей,1981; Леонова,1986), состояние плз-'зматической мембраны которых адекватно отражает структурно-функциональное состояние мембран тканей всего организма (Рожковский, Кре-сюн,1991).

Одним из индикаторов структурно-функционального состояния плазматических мембран является уабаинчувствительная №а,К-АТФаза. Градиенты, создаваемые №а,К-насосом вовлечены в регуляцию объема клетки, поддержание соответствующей среды для синтеза белка, контроль за дыханием и гликолизом, регуляцию внутриклеточного значения рН и трансмембранного переноса Сахаров,'аминокислот, нейротрансмитте-ров; градиент ионов №э+ необходим для формирования потенциала действия, для контроля за внутриклеточным содержанием Са (Аскари , 1990). В связи С этим, механизмы контролирующие активность №а,К -АТФазы в норме и при экстремальных воздействиях привлекают прис -тальное внимание.

Одной из стратегий биохимической адаптации, наряду с приспособлением на уровне макроколекулярных компонентов и микросреды, яв-

лнется приспособление на функциональном уровне (Хочачка, Сомеуо , 19Ш), включая выработку ингибиторов и активаторов ферментов.

13 течение последних десятилетий ведутся- поиски эндогенных регуляторов Ка.К-АТФвзы. В связи с открытием эндогенных дигоке;'н-подоб-ных ингибиторов №а-насоса в организме высших животных, содержание которых увеличивается при ряде патологических и физиологических состояний, стало высоказываться мнение о том, что ]1»а,п-АТ^аза может выполнять рецедторную функцию в плазматической мембране и, таким образом, может осуществляться гуморальная регуляция работы №а-насо-са (Аппег ДЗЗ^).

Эндогенный дигоксин-подобный фактор (ЭД£) - это до настоящего времени в чистом виде не выделенное соединение (или группа соединений), обладающее сходной с гликозидами наперстянки иммунореактивно-стью и биологическими свойствами (С1о1х ,1Уи7). Специфическим рецептором для ЗДФ является альфа-субъециница №а,К-дТ4азы (ЗсНетахЧа ,

9

1583). Ряд вк^уреыальных и патологических состояний вызывает наруше ние активного транспорта одновалентных катионов (Ка-насос) в эритроцитах, миокарде,'гладких мышцах сосудов (Маслова, Громов,1^71; ;.1еерсон й др. ,ГЭ8^;ъес1г1 ,1984; ЗЬаПосй , )^еиига Низкая

активность фермента в этих условиях может служить косвенным овиде -^гельством наличия ингибитора(ов) Юа,К-АТаазы. Установлено, что та -кис патологические состояния как почечная и печеночная недостаточность, гипертония различной этиологии, ишемия миокарда сопровождаются появлением в плазме крови веществ. 1или веществ), обладающих дигоксин-^одобной'иммунореактивностью (Багров и др.ДУСУ; ОгиЬег в* а1., 1960р!аш1уп вt аХ .,198^). По-видимому, они и являются эндогенными'физиологическими модуляторами активности ))а,К-АТ4азы.

. В литературе отсутствуют данные о механизмах регуляции активности данного фермента при экстремальных воздействиях. Поэтому, учитывая важность роли Юа,К-АТ£аэы в поддержании нормального функции

онирования организма, исследование состояния активного транспорта одновалентных катионов при экстремальных воздействиях имеет важное значение для выявления механизмов стрессорного поражения и его предупреждения путем подбора эффективных антистрессорных препаратов.

Цель и задачи исследования:Цель данной работы заключалась в изучении активности и свойств №а,К-АТФазы эритроцитов крыс при экстремальных воздействиях на организм, исследование возможного механизма изменения активности фермента, поиск подходящих маркеров и протекторов стресса.

Конкретные задачи исследования заключались в следующем: '

1. Исследование активности №а,К-АТФазы эритроцитов и их мембранных препаратов (теней) у крыс при различных экстремальных воздействиях: иммобилизации в пеналах, гипотермии, гипероксии, фн-ческой нагрузке и физической нагрузке на фоне голодания.

2. Исследование активности №а,К-АТФазы эритроцитов и теней у крыс с различной устойчивостью к стрессу.

3. Определения ингибирующего действия плазмы крови стрессиро-ванных животных на активность №а,К-АТФазы эритроцитов контрольных крыс/

4. Изучение адаптогенного действия повторного стрессирования на активность №а,К-АТфазы эритроцитов крыс.

5. Изучение влияния'дельта-сон индуцирувщего пептида и сывороточного альбумина человека в качестве предполагаемых протекторов при стрессе на активность №а,К-АТ$азы эритроцитов, крыс.

Положения, выносимые на защиту;

1. Активность №а,К-АТФазы эритроцитов и устойчивость животных по отношению к стрессу коррелируют с двигательной активностью крыс в тесте "открытое поле".

2. Угнетение активности Ш,К-АТФазы эритроцитов является неспецифической реакцией организма на действие стресс-факторов (на примере пяти видов стресса).

3. Одним из механизмов снижения активности №а,К-АТФазы эритроцитов при стрессе является повышение в крови стрессированных животных концентрации эндогенного ингибитора(ов), который, взаимодействуя с рецепторным участком на №а,К-АТФазе, угнетает ее активность.

4. Предварительное введение дельта-сон индуцирующего пептида и сывороточного альбумина человека повышает устойчивость животных по отношению к стрессу, оказывает протекторное действие на М,К-АТФазу эритроцитов стрессировавных животных.

Научная новизна.В работе впервые проведены систематические исследования активности !йа,К-АТ<5взы эритроцитов при различных экстремальных состояниях, описано повышение концентрации эндоген-нзго(ых) ингибитора(ов) (предположительно ЭДФ) №а,К-АТФазы при остром стрессорном воздействии. При этом наблюдали значительное угнетение активности ,К-АТФазц в эритроцитах при иммобилизации, гипотермии, гипероксии, физической нагрузке и физической нагрузке на фоне голодания. Все эти состояния сопровождались выраженной стресс-реакцией. Обнаруженная отрицательная линейная корреляция между активностью №а,К-АТФазы эритроцитов в норме и при стрессе и степенью угнетения активности фермента в эритроцитах контрольных особей плазмой от стрессированных кивотных позволило предположить, что снижение активности №э,К-чАТФазы при стрессе происходит в связи с повышением концентрации эндогенного ингибитора в

плазме стреосированных животных. Кроме того, удаление ингибитора с рецепторного участка №л,К-АТ$ааы при получении мембранных препаратов (теней) эритроцитов в гитюсмотической среде приводило к исчезновению различий в активности фермента при стрессе и в контроле.

Было показано: дельта-сон индуцирующий пептид, сывороточный альбумин человека оказывают антистрессорное действие на организм. Предварительное введение данных соединений снижает уровень эндогенного ингибитора(оз) в плазме крови стрессированных крыс и предупреждает понижение активности №а,К-АТФазы эритроцитов.

На.учно-практическая ценность работы.

Полученные в результате исследований данные представляют ин-| терео с точки зрения поиска механизмов воздействия на клеточные мембраны и их маркеры различных стресс-факторов, способствует расширению наших знаний о регуляторных механизмах в условиях стресса. Данные об ингибировании №а,К-АТФазы эритроцитов при пяти различных экстремальных воздействиях дают возможность определить роль Яа,К-насоса и эндогенных ингибиторов в функциональных сдвигах ионного равновесия при стрессе.

Исследование активности )£а,К-АТФазы эритроцитарных мембран используется в эксперименте как тесЯ-система для скриннинга и определения эффективности антистрессорных препаратов.

У стрессированных животных предварительное введение дельта-сон индуцирующего пептида и сывороточного альбумина человека предотвращало снижение активности №а,К-АТФазы эритроцитов. Таким образом, применение данных соединений может расширить возможности профилактики стрессорных состояний и защиты организма в экстремальных условиях.

_ в -

Апробация работы: результаты исследований были доложены на Всесоюзной конференции "Молекулярные и клеточные основы кислотно-основного и температурного гоыеостаэа", Сыктывкар, 4-8 июня 1991 года; на совместном заседании кафедры биохимии и НИИ Биолог', и РГУ (Ростов-на-Дону, 3 февраля 1992 года); на объединенной научной сессии сотрудников и студентов УБЦ биолого-почвенного факультета РГУ (Ростов-на-Дону, 14 апреля 1952 года); на заседании Ростовского отделения -Всероссийского биохимического общества (Ростов-на-Дону, 3 июня 1993 годы); на совместном заседании отдела физико-химической биологии НИШ РГУ и кафедры биохимии и микробиологии РТУ (Ростов-на-Дону, II октября ¿993 года).

Структура и»объем диссертации. Диссертация изложена на .... страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов исследования, результатов исследования^ обсуждения результатов, выводов и списка испльзован-ног,-литературы, который содержит .... отечественных и .... зарубежных работ. Работа содержит .... рисунка и .... таблицы.

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы, в печати - одна.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛВДМШ1Л.

.Объектами исследований являлись цельная кровь, эритроциты, тени- эритроцитов и плазма крови самцов крыс линии Вистар и беспородных крыс, возраст 3-4 месяца, масса 150-250 г.

Постановка эксперимента. Проведены следующие серии экспериментов:' • ■

т. Разделение животных в тесте "открытое поле" на "активны*" й "неактивных" по двигательной активности.

2. Помещение крыс в .условия острого стресса, путём воздействия иммобилизации в пеналах (I час), гипотермии в холодовой камере (3 часа), гипероксии в барокамере при давлений кислорода 0,375 МПа (30 мин.), Физической нагрузки (плавание I час), Физической нагрузки на фоне голодания (3 суток).

3. Действие повторного иммобилизвционногЬ стресса (через двое суток 4 раза).

4. Выявление протекторного действия САЧ и ДСИП в условиях им-мобилиззционного стресса в опытах in vivo и in vitro.

Определение двигательной активности крыс методом "открытого поля". Животных помещали в центр круглого манежа, дно которого было разделено на 8 секторов. Тестирование проводили ежедневно в течение недели до стресса и сразу после экстремального воздействия по 5 минут. Основными показателями теста били: число пересеченных секторальных линий, число вставаний на задние конечности' с упором и без упора на стенку, грумминг и дефекация.

Кровь для анализа получали после декапитации. В качестзе внти-коагулянта использовали гепарин (125 ед/мл).

Гематокрит определяли на центрифуге TH-I2 при 5000 3 в течение 7 минут. .

Кислотную резистентность эритроцитов определяли по методу Ги -тельзонэ И.И. и Терскова И.А. (1959).

Подсчёт количества эритроцитов производили в камере Горяева по методу Николаева И,Н. (1954).

Плотность крови определяли путем сопоставления с известно!; кло-тностью раствора Си

Определение активности Р'а.К-АТФазн в цельных эритроцитах и тенях эритроцитов. Для определения активности №а,К-АТФвзн в эритроцитах их отыывзли от плазмн 0,145 М BaCI в 0,G2 М трис-HGI-буфере

(рН 7,6 при 25°С). Тени эритроцитов получали методом гипоосмоти-ческого гемолиза клеток (Dodge et al.,1963) используя в качестве гемолизирующей среди ЮмМ трис-НС1-буфер (рН 7,6 при 2Ь°С), содержащий 1мМ ЭДГА.

Цельные эритроциты преинкубировали при комнатной температуре с твином-20 в течение 40 минут. Далее эритроциты и тени эритроту тов инкубировали в среде следующего состава (в конечном разведении) в мМ: KaCI - 100; KCI - 10; трис-HCI - 50; АТФ-2№а - 2; . MgCL, - 3; ЭДТА - 0,5.

Инкубацию проводили при 37°С в течение 30 минут на водном термостата в присутствие и отсутствии 2мМ уабаина.

Общую АТФазную активность определяли по степени увеличения н< органического йосфата в пробах (Фн), а активность Га,К-АТФазы -по разности между общей АТФазной активностью в присутствие и отсутствии уабаина.

Активность АТйззы выражали в мк моль Фн/ час/ 1мл упакованные эритроцитов в случае цельных клеток. Для теней эритроцитов активность №а,К~АТФазы выражали в мк моль §н/час/мг белка. Концент-,рацию белка определяли по методу Лоури (lowry et ai.,I95I). .

Содержание неорганического фосфзта определяли модифицированным методом Чена (Chen et al .,1954).

Метод "функциональные нагрузки" на фермент (Маслова и др., 1991) заключается в том, что помимо инкубации эритроцитов в стандартных условиях также проводили"инкубацию клеток при 6мМ и 12 мМ MeCL>, не изменяя состава остальных компонентов.

Получение безбелковкх с.упернатантов плазмы крови и оценка их способности угнетать №а,К-АТФэзу цельных эритроцитов контрольных особей проводили по методу Уме/*1 и соавт. (umeda et al*> I9G7). Эритроциты перед обработкой твином-£0 преинкубировали с безбелковым супернатантом в течение 10 минут в соотношении 1:1.

Получение окисленных препаратов сывороточного альбумина человека проводили путей окисления альбумина нвдмуравьиновой кислотой (БэйлиД965; Дэвени и др. ,1976).

Концентрацию ионов №а и К"*" в плазме крови и в эритроцитах экспериментальных животных определяли по стандартным методам (пламен ная фотометрия и атомная абсорбционная спектрометрия) и выражали в мМ/литр.

Данные обрабатывали статистически с применением критерия Стъю-дента (Владимирский,1983). Резко выделяющиеся показатели отбрасывали с помощью критерия Шовене (Конунин,1975).

В работе использовали следующие реактивы: АТФ-2№а фирмы " Rea-naí' (Венгрия), ЭДТА-4№а и сахароза фирмы " CaiMochem" (США),триц уабаин фирмы "Serva" (ФРГ), твин-20 фирмы "Регао " (ФРГ). Осталь -нке реактивы отечественного производства марки х.ч. и ч.д.а.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Двигательная активность как прогностический критерий устойчиво-'

сти к стрессорном.у воздействию.

Существенным вопросом для теории стресса, и для практической медицины является вявление исходной вариабельности функциональной реактивности на протекание стрессорннх реакций и устойчивости к ним. Показано, что ответ на стрессор существенно зависит от состояния организма, пола, питания, истории развития и т.д. (Судаков,1992) Этим обусловлена индивидуальная чувствительность организма к стрез-су..

Тест "открытое поле" ( Нац1934) позволяет выявить индивидуальные отличия в двигательной активности крыс и разделить их на две группы - "активных" (А) и"неактивных" ÍHÁ). К А-крысам■были отнесе-

ны животные, у которых число пересечённых секторальных линий превышало 60, крыс со значениями ниже 40 отнесли к особям с пассивным типом поведения - НА. Высокий уровень горизонтальной двигатели активности соответствовал высокому уровню остальных показа*олей теста.

На рисунке И дане динамика изменения активности №а,К-АТФазы . эритроцитов при иммобилизационном стрессе (ШС). У А-крыс в норме активность фермента достоверно выше на I% (р<0,05)* чем у НА. Снижение активности )<»8,К-АТФаэы после стресса происходило у обеих групп животных, причем, у А-крыс - на 35%, а у НА - на 43%.

£ а

о га ¡У

101

О

а

12

—р<0,05--р<0,001-| гЬ1

-рШ,001п

-ь

НА НА

п - контроль 223 - стресс А - активные крысы НА - неактивные крысы

Рис. №1. Динамика изменения активности №а,К~АТФазы эритроцитов при ШС у крыс с различной двигательной активностью в "открытом поле".

Стрес -реакция сопровождается незначительным снижением чувст-витальности №э,К-АТшвзы к повышению концентрации ионов % в инкубационной среде. Процент снижения активности фермента с увеличе-*

нием Ме до 12мМ уменьшается у А-крыс на '1%, а у НА-животных - на ,16$ (рисунок №2).

Полученные нами данные дают возможность группировать животных до эксперимента и выявлять особенности протекания стрессов у крыс

ё!12

а ■

6

« О :

в ;

А-крысы

НА-крысы

О

и :

' й ! 12

та

I

мМ

ж

л «

о

я «

а

6-.

01

ч-

I 3 б 12 . 3 е ___12_

концентрация ионов магния концентрация ионов магния

Рио. №2. Зависимость активности №а,К-АТФазы эритроцитов крыс с различной двигательной активностью от концентрации ионов в среде инкубации при стрессе.о-контроль;«- стресс.

исходно различающихся по двигательной активности в "открытом поле". Необходимо отметить о существовании корреляции между типологически ми особенностями поведения животных в тесте и их устойчивостью к стрессу, которая проявляется в повышенной устойчивости системы активного транспорта (№а-насос) у А-к{5ыс в условиях стресса, чем у. НА. Активность №а,К-АТФазы зависит от уровня двигательной активности животных и в опыт необходимо брать првдворительно отобранных в тесте "открытое поле" крыс, чтобы сократить разброс экспериментальных данных. Этим правилом мы руководствовали с,ь в дальнейших наших исследованиях и выбирали только А-крыс.

2. Активность Квд ,К-АТФазы эритроцитов при стрессах различной природы и механизм нарушения функционирования системы активного транспорта ионов и К+ при экстремальных воздействиях.

Состояние острого стресса вызывали помещением животных в различные экстремальные условия, в выборе которых руководствовалась данными литературы (Панин,1983; Маслова,Резник,1984; Кэтюхин,Ызслова, 1984; А1с>1агЫ еъ а].,1989), а также собственными исследованиями.

- 1.4. Для оценки степени выраженности неспецифической стрессорной реакции у животных при действии различных стрессоров (иммобилизации в пеналах, гипотермии, гипероксии, физической нагрузке, физической нагрузке на фоне голодания) определяли следующие показатели: гема-токрит, максимум кислотного распада эритроцитов, плотность крови и число эритроцитов. По нвшему мнению это наиболее доступные маркеры, изменение которых при экстремальных воздействиях коррелирует с из -менением классических показателей стресса - концентрацией гортико -стероидов в плазме крови, и аскорбиновой кислоты в надпочечниках (Катюхин, Маслова,1984).

При пяти экстремальных воздействиях, которые сопровождались вы -раженной стресс-реакцией, происходило снижение активности йа,К-АТФ-взы в эритроцитах на 30 - 4356 (р(0,05; р<0,001) (рисунок №3). Эти изменения обусловлены, вероятно, верпецифичеоким (отрессорным) эф -фектом применяемых воздействий.

Рис. №3. Динамика изменения активности ¡¿а,К-АТФазы эритроцитов при 5-ти видах стресса, э» - р(0,001; * - р(0,05.

Одним из путей проверки данного предположения является изучо -ние нормализации исследуемого показателя после прекращения воздействия экстремальных факторов через разные промежутки времени (Ма-слова, Резник,1984).

По нашим данным, уже через 12 часов после применения стрессор-ных факторов (ИМС и гипотермии) активность №а,К-АТФазы эритроцитов не отличалась от уровня контроля (рисунок №4).

Рис. №4. Динамика изменения активности №а,К-АТФвзы эритроцитов

сразу после стресса ( Б53 ) и через 6 (ИЗ ) и 12 (Е1) часов после иммобилизации и гипотермии. (СЗ - контроль)

Снижение активности №а,К-АТ$азы 'приводит к-смещению ионного равновесия в крови. Нами показано снижение концентрации ионов 15а в плазме крови при гипёрокоий (нв р<0,01) и иммобилизации (9,3$

р<0,01). Часовая иммобилизация сопровождается увеличением концентрации №а+ на 2356 (р<0,01). Содержание К* в плазме крови достоверно увеличивается, по нашим данным, при гипероксии (на 20^,р(0,0&); при гипотермии наблюдается уменьшение этого показателя в эритроцитах по сравнению о контролем Сна 13$,р<0,01).

Контролируют работу »в-насоса многие регуляторные механизмы (Со -

dfraind»Pagoo ,I986;R0ssier et al .,1987), включая местные факторы, а также циркулирующие гормоны (Goto et al .,1992).

Угнетение активности №а,К-АТФазы может являться одним из проявлений повышения концентрации эндогенного дигоксинподобного Фвк-тора(ов) (ЭДФ) (Багров и др.,1991;1)е Yiardener et al .,1985), который, по мнению Doucet (1988), относится к факторам, регулирующим активность фермента в короткие сроки.

Известно, что концентрация ЭДФ в плазме крови может значительно повышаться при некоторых физиологических состояниях и ряде заболеваний, в основе которых лежит изменение свойств клеточных мембран, нарушение структурных свойств клеточных белков. Эти про -цессы во многих случаях связаны с действием факторов внешней среды (Dahl ,1972; Судаков,1976). Многие исследователи считают, что ЭДФ является физиологическим регулятором активности Кв.К-АТМвзы (Clolx ,I9£f7;Haddy ,1990).

Понижение активности }?а,К-АТФазы при стрессе в цельных эритроцитах и отсутствие каких-либо изменений в мембранных препаратах клеток (тенях) позволило предположить, что многократное отмывание эритроцитов в гипоосмотической среде при получении теней способствовало удалению ингибитора с рецепторной поверхности йа,К-АТФазы. Это наблюдение свидетельствует о том, что угнетение активности №з-насосэ происходило вследствие действия специфического ингибитора, а не в результате изменений структуры бамого фермента или его мембранного окружения. Принимая во внимание литературные данные об обратимости связывания ЭДФ с узнающим участком альфа-оубъецини-цы №э,К-АТФазы (Senn- et al .,1988)", восстановление активности фермента через 12 часов после стресса ыы связываем с уменьшением концентрации предполагаемого ингибитора п.лле прекращения действия стресс-фактора.

Ранее была выявлена коррелятивная связь между активностью Ка,

Кг-АТФззы в цельных эритроцитах и способностью плазмы крови к угнетению №а-насоса в эритроцитах контрольных животных (Багров и др., 1991). Мы в своих исследованиях обнаружили, что плазма крови, полученная от крыс, подвергнутых стрессу, ингибирозалэ активность №а,К-АТФазы в контрольных эритроцитах, то есть присутствующий в плазме фактор индуцировал картину сходную с проявлением стресса (рисунок №5).

£ р<0,00Ь 1 1 р<0,05

ч <12 о -Ь -Г

ш в- . \ X Si fi

л Р ч о 3 к я 0 VS 1 1 1

иммобилизация гипотермия

Рис. М5. Влияние безбелковых супернатантов плазмы крози (ББСП) на

активность №а,К-АТФазы эритроцитов контрольных крыс. □ - контрольные эритроциты + ББСП контрольных крыс; EZ2 - контрольные эритроциты + ББСП стрессированных крыс; КЗ - контрольные эритроциты + ББСП стрессированных крыс через.6

часов после стресса; 153 - контрольные эритроциты + ББСП стрессированных крыо через 1В часов после стресса.

Нами выпилена отрицательная корреляционная связь между активностью !яа-насоса в цельных эритроцитах и способностью плазмы крови стрессированных животных к угнетению lía,К-АТФазы контрольных крыс ( при иммобилизации - г= -0,79 ,р<0,01 ,п=8 ; при гипотермии -г=-0,88,р<0,001,п=7 ).

' - 16 -

Восстановление активности фермента при использовании плазмы стрессированных особей, полученной от них через 6 и 12 часов посла стресса (рисунок №5), отражает постепенное уменьшение количестве ингибитора при прекращении действия стресс-фактора.

3. Изучение влияния повторного стресса на активность №а,К-АТФазы эритроцитов.

Известно, чтр при повторном воздействии одних и тех же стрессоров организм может пр|. .¡пособиться к экстремальным условиям: стрес-сорные реакции постепенно ослабевают (Тигрэнян,1988). При многократном действии стрессорного фактора развивается долговременная адаптация, которая по мнению Меерсона Ф.З. (1986), реализуется на. основе многократного повторения стадии срочной адаптации (Айрапе -тянц, Гуляева,1988),

В наших исследованиях мы воздействовали на крыс повторной иммобилизацией. Нр^ однократном экстремальном воздействии происходит снижение активности №а,К-АТФазы эритроцитов на 46% (р<0,001), повторный №АС снижал активность йа-насоса на 42% (р(0,001). При третьем стрессировании снижение составляло 26$ от контроля (р<0,05). Четырёхкратное воздействие часовой иммобилизации уже не сопровождалось снижением активности №а,К-АТ®аэы, что может свидетельствовать о развитии адаптации системы активного транспорта №а+ и К+ к данному стресс-фактору (рисунок № 6),

4. Изучен- з антистрессорного действия ДСЩ на активность №а,К-АТФ-ззы эритроцитов при ИМС.

Как известно, введение дельта-сон индуцирующего пептида до стресса .сопровождается повышением устойчивости организма к стресс-фав -гору (Коплик и др.,1982; Судаков,1992). В условиях нашего эксперимента предворительное введение ДСИП сопровождалось знтистрессорным эффектом' на систему'"активного"транспорта (На-на со с) в эритроцитах.

Рис. !í6. Влияние повторного стресса на активность №а,К-АТФа'чы эритроцитов.

I - контроль; 2 - 1-й стресс; 3 - 2-ой стресс; 4 - З-п стресс; 5 - 4-й стресс; к» - р<0,001; к - р(0,05.

Введение пептида в модельную систему определения активности №э ,К-АТ-$ээн in vivo и in vitro сопровождалось нормализацией активности фермента на контрольном уровне у крыс, подвергнутых ШС {рисунок №7). * '

Полученные данные свидетельствуют о том, чПо ДСШ обладает протекторным действием на эритроцитарную мембрану и мембрановетро-еннуга йа,К-АТ5?а.зу; По-видимому, пептид оказывает своё защитное действие, стабилизируя структурно-функциональное состояние ме"0 -ран эритроцитов и инактивируя предполагаемый эндогенный ингибитор, вероятно, на уровне-ВДС. •...-,■

Мы получили также снижение ингибирующего эффекта гглазми кров;: крыс, которым ввели ДСШ и затем подвергли часовой. 1ЫС на эритроциты контрольных животных. Как в опытах in vivo,, так я in vi irо активность Фермента при инкубации контрольных эритроцптог с bí'"¡ стрессированных крыс не отличалась от нормы и составляла ъ о"\т. ■ in vitro 1,4 (п=6) и in vivo - 14,9+ 0,6 í-n=6) мкЧюяь .v./

/час/мл эритроцитов.

£

16-

ас <&

л

<=?

о 2

М S

-р <0,001

р<0,001—] Í

1 ^

-p(0,ü0I-f

без ДСИП ДСШ in vlíro ДСШ1 in vivo

I I - KOHTPOJ

ES3 - стресс

Рис. Ш. Влияние ДСШ на активность )?а ,К-АТФазы эритроцитов крыс в норме и при стрессе.

5 . Изучение антистрессорного действия САЧ на активности №э,К-АТФэзы в эритроцитах крыс при ШС.

Основываясь на литературных и собственных данных (Маслова, мов,1971 {Lechl et al .,1984; Mott et al.,1985; Kazennov et al , 1986) можно сделвть вывод, что снижение активности №а,К-АТФэзы •эритроцитах, в также в миокарде и гладких мышцах сосудов являем Показателем для различных форм стрессовых состояний. Поэтому o¡ тема определения активности йа,К-АТФазы может быть использованг для идентификации стресс-реакции и поиска антистрессорннх arem Протекторный эффект САЧ продемонстрирован нами.на модели ию билизэционного стресса. По нашим данным, САЧ оказывает нормали: ющее действие на показатели крови, выбранные нами в качестве мг

керов стресса. Введение альбумина in vivo и in vitro сопровождЕ

/

лось восстановлением активности )га ,К-АТФазы эритроцитов стресс! ванных животных до контрольного уровня (рисунок №8).

Протекторное действие САЧ на Ка-насос может быть обусловлен!

антиокислительными свойствами белка, которые связаны с его структурными особенностями (Halliwell .Gutterige ,1990). Предполагают, что антиокислительное действие альбумина обусловлено наличием OH-, SH-, №Hg- групировок . аминокислот (Дубинине,I99'¿; Holt et al., 1984).

Окисление вышеназванных групп надмуравьиновой кизлотой и введение САЧ окисленного (САЧок) в модельную систему определения ак. -тивности №а,К-АТФазы в эритроцитах в опытах in vitro сопровождалось снижением активности фермента как в норме - на 32% (р<0,05), так и при стрессе - на 40$ (р<0,001). Таким образом, окисленный препарат в данных условиях не оказывает протекторный эффект на &а-насос стрессированных животных, более того,сам САЧок дестабилизирует мембрану и №а,К-АТФазу эритроцитов.

В опытах in vivo действие окисленного альбумина было аналогично действию натявного САЧ.

Рис.Ь 8. Влияние САЧ на активность №а,К-АТФазы эритроцитов крыс в норме и при стрессе.

Q- контроль стресс

<ч а х

0

аз <

х

01

из ч

о «

я

¿1.

16

В..

-р(0,05 -]

p(0,0UI-+

í-i

без САЧ

САЧ in vitro (JA4 In vivo

- 22 -

Благодаря наличию в молекуле альбумина большого числа диссоциирующих полярных групп, чрезвычайной конформационной лабильности (Дашевский,1987), сывороточный альбумин способен связывать и транспортировать в крови практически все низко- и високоыоле • кулярные агенты (Сергеев и др.,1962). Известно, что альбумин cbí зывает препараты дигиталиса, в частности дигитоксин (Pike , Kie ■ ruff ,1982). Это позволило нам предположить, что САЧ может связь ввть и инактивировать предполагаемый ЭДФ.

Действительно, нами получено снижение ингибиру.ющего эффекта плазмы крови крыс, которым ввели САЧ и затем подвергли часовой иммобилизации на эритроциты контрольных животных. Как в оштах in vivo, так и in vitro активность фермента при инкубации контро; них эритроцитов с ББС11 стрессированных крыс не отличалась от нормы и составляла в опытах in vivo 13,7+1,0 (п=19) и in vitro -12,8+ 1,6 (п=Ю) мк моль Фн/час/мл эритроцитов.

Таким-^образом, на основании полученных результатов можно предположить, что СА1} оказывает свое антистрессорное действие на ct

ф +

стему активного транспорта ионов и К путем стабилизации ст^ ктурно-функционального состояния мембраны и, по-вицимоыу, путем "разобщения" структурных взаимоотношений фермента с ингибитором.

Список использованных сокращений.

ЭДф - эндогенный дигоксин-подобнь:4 фактор(ы) ИМС - иммобилизационный стресс САЧ - сывороточный альбумин человека ДСШ - дельта-сон индуцирующий пептид ББСП - бепбелковые супернатанты плазмы крови АТф - вденозинтрифосфорнвя кислота

-23 -

ВЫВОДЫ

1. По результатам тестирования крыс в "открытом поле" выявлены чёткие различия в активности №а,К-АТФаэы эритроцитов между животными с различной двигательной активностью ("активные" и "неактивные"). Установлено, что активность №а,К-АТФазы у "активных" крнс на 19% выше, чем у"неактивных!

2. При иммобилизационном стрессе показано снижение активности йа, К-АТФазы в эритроцитах у "активных" особей на 35$, у "неактив -них" - на 43$.

3. Установлено, что снижение активности ,К-АТФаэы в эритроцитах является проявлением неспеци^ической реакции организма на действие экстремальных факторов, вызывающих стресс-реакцию- (иммобилизация в пеналах (1час), гипотермия (+4°С, 3 часа), гиперок-сия (0,375 Шв, 30 минут), физическая нагрузка (I час), физическая нагрузка на фоне голодания (3 суток)).

4. Полное восстановление активности №а,К-АТЗазы в эритроцитах после применения указанных видов стресса выявлено через 12 часов.

5. В плазме животных, подвергнутых.стрессу, обнаружено появление эндогенного(ых) ингибитора(ов) ДОв.К-АТФвзы, предположительно дн-гоксин-подобной природы.

6. В мембранных препаратах эритроцитов (тенях) активность №а,К-АТФазы при. стрессе не изменялась, что, вероятно, связано с удалением ингибитора №а,К-АТФвзы с рецепторн'ой поверхности йермен-ía в процессе получения теней.

7. При многократном иммобилиззционном стрессе происходит постепенная адаптация к данному воздействию и при четвёртом стрвссировз-нии животных изменения зктивности )!<>а,К-АТФазы эритроцитов не обнаружено.

8. Предварительное введение крысам дельта-сон индуцирующего пепти'-да и сывороточного альбумина человека в опытах in vivo и in vie -

го сопровождалось протекторным эффектом данных соединений на активность №а,К-АТФазы эритроцитов. Характерных для стресса изменений в крови в условиях имыобилизационного стресса при этом не выявлено. 9. Активность №а,К-АТФазы эритроцитов может служить маркёром стресс -реакции и моделью для поиска антистрессорных агентов.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Медведева И.А., Мэ-слова М.Н. Изменение активности №а,К-АТФ-азы эритроцитов крыс при холодовом стрессе// Молекулярные и клеточные основы кислотно-основного и температурного гомеостэза: Тез. докл.всес.конф./ Сыктывкарский гос. ун-т. Сыктывкар, 1991. С.71.

2. Медведева И.А., Маслова М.Н., Панов А.А. Влияние гипотерми-ческого стресса на активность !йа,К-АТФазы эритроцитов крыс// Физиологический журнал им. И.М.Сеченова. 1992. т.78. ВН. С.119-124.

3. Медведева И.А., Маслова М.Н. Активность №а,К-АТФазы эритроцитов при иммобилизационном стрессе у крыс с различной двигательной активностью// Физиологический журнал им. И.М.Сеченова. 1993.т.79. №10. С.17-22,

4. Медведева И.А., Маслова М.Н. ДинамикаТГмеханизм изменения активности !ёа,К-АТ5азы эритроцитов крыс при действии стрессоров различной этиологии// Физиологический журнал им. И.М.Сеченовя. 1993. т.79. №12. С.28-34.