Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование роли холинергической системы в развитии иммобилизационного стресса у крыс

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дубровский, Виталий Николаевич, Тюмень

ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ДУБРОВСКИЙ Виталий Николаевич

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ХОЛИИЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ В РАЗВИТИИ ИММОБИЛИЗАЦИОННОГО СТРЕССА У КРЫС

03. 00. 13 - ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.б.н. Казеннов А. М. д.б.н. Шалабодов А. Д.

ТЮМЕНЬ 1999

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.......................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ...............................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................10

1.1. Основные положения теории стресса..................................................10

1. 1. 1. Развитие концепции стресса.......................................................................10

1. 1.2. Общий адаптационный синдром................................................................12

1.2. Отравление фосфоорганическими ингибиторами...............................18

1.2. 1. Открытие и химическая структура.............................................................18

1. 2. 2. Механизм отравления ФОИ: АХЭ возбудимых клеток - основная

мишень действия ингибиторов..............................................................................21

1. 2. 3. Патофизиология и клинические проявления интоксикации ФОИ...........24

1.3. Система красной крови......................................................29

1.3. 1. Структурная организация эритроцитарной мембраны.............................29

1. 3. 2. Структурная организация Иа,К-АТФазы..................................................34

1 .3.3. Влияние модификаторов на конформационное состояние различных

фосфоформ ИаД-АТФазы......................................................................................37

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................41

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ...............46

3.1. Выявление активности ЫаД-АТФазы в эритроцитах крыс, мембранных препаратах эритроцитов и грубой микросомально-митохондриальной

фракции коры больших полушарий головного мозга крыс..................................46

3.1. 1. Выявление активности Ыа,К-АТФазы в целых эритроцитах крыс...........47

3. 1. 2. Выявление активности ЫаД-АТФазы в мембранных препаратах эритроцитов крыс...............................................................................................................49

3. 1. 3. Выявление активности ИаД-АТФазы в грубой микросомально-митохондриальной фракции коры больших полушарий головного мозга

крыс.........................................................................................................................52

3. 1. 4. Исследование магнийзависимых свойств ИаДС-АТФазы эритроцитов крыс, мембранных препаратов эритроцитов и гомогената головного мозга при

использовании мембранотропных веществ...........................................................54

3. 1. 5. Обсуждение результатов исследования.....................................................57

3.2 Показатели крови и активность №,К-АТФазы целых эритроцитов и мембранных препаратов эритроцитов крыс, подвергнутых иммобилизационно-му стрессу................................................................................................................63

3.2.1 Показатели крови крыс, подвергнутых иммобилизационному стрессу..............................................................................................................................65

3.2.2 Активность АХЭ и транспортных АТФаз в целых эритроцитах, мембранных препаратах эритроцитов (тенях) и грубой микросомально-митохондриальной фракции коры больших полушарий головного мозга крыс, подвергнутых иммобилизационному стрессу.......................................................67

3.2.3 Обсуждение результатов исследования........................................................75

3.3. Показатели крови, активность АХЭ и транспортных АТФаз в эритроцитах и гомогенате головного мозга крыс, отравленных армином в различных

дозах........................................................................................................................80

3.3.1 Активность АХЭ в эритроцитах и гомогенате головного мозга крыс, отравленных армином в различных дозах.................................................................81

3. 3. 2 Показатели крови крыс, отравленных армином в различных дозах............................................................................................................................83

3. 3. 3 Активность транспортных АТФаз в целых эритроцитах, мембранных препаратах эритроцитов и грубой микросомально-митохондриальной фракции

коры больших полушарий головного мозга крыс, отравленных армином в различных дозах..................................................:........................................................86

3. 3. 4. Влияние армина в различных концентрациях на активность АХЭ и транспортных АТФаз эритроцитов крыс в опытах in vitro..................................92

3.3.5 Обсуждение результатов исследования......................................................94

ВЫВОДЫ..............................................................................................................101

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................103

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АТФ - аденозинтрифосфорная кислота АХЭ - ацетилхолинэстераза ДОХ - дезоксихолат натрия Фн - неорганический фосфат ЭДТА - этилендиаминтетраацетат ЭДИ - эндогенный дигоксинподобный ингибитор ЬБбо- доза с летальным исходом 50%

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Способность адаптации к стрессорным воздействиям является необходимым условием для выживания всех организмов, обитающих в среде с непостоянными физико-химическими параметрами. Высшие животные, включая человека, обладают разнообразйыми механизмами толерантности к множеству воздействий, мишенью которых могут являться как отдельные клетки или системы органов, так и организм в целом. Пребывание организма в стрессовых условиях сопровождается выраженным напряжением адаптивных механизмов, направленных на предотвращение угрожающих жизни изменений гомеостаза, что клинически проявляется в виде "общего адаптационного синдрома" (ОАС). Несмотря на то, что проблеме стресса было посвящено огромное количество исследований, триггерный механизм этой реакции организма остается не вполне ясным. Некоторые авторы предполагают мультиме-диаторный механизм (Хайдарлиу, 1984). Вместе с тем, имеются данные, показывающие, что роль холинергической системы в организме не ограничивается только медиаторными функциями. Например, показано участие холинергиче-ских систем, как центральных так и периферических, в высвобождении АКТГ из гипофиза человека (Rich et al., 1981), стимулирующее влияние ацетилхолина на высвобождение кортиколиберина (Nicholson et al., 1986) и вазопрессина (Armstrong, 1985) в гипоталамусе. Учитывая вышесказанное, весьма вероятным является участие в стресс-реакции ацетилхолинэстеразы (АХЭ), ключевого фермента холинергических структур, осуществляющего гидролиз нейромедиа-тора ацетидхолина. Наряду с этим, важную роль в указанном процессе может играть и Na,K-AT<Da3a, обеспечивающая ионный гомеостаз в отдельных клетках и на уровне целого организма, активность которой также регулируется хо-линергическими механизмами (Елаев и соавт. 1983). Изучение особенностей контроля активности АХЭ и Ш,К-АТФазы в организме при стрессе - важное направление в плане выяснения механизмов ОАС на молекулярном уровне.

Эритроциты периферической крови являются удобным объектом для подобного рода исследований, так как легко доступны для экспериментатора, а изменение активности ферментов в этих клетках могут в определенной степени отражать изменения в клетках других органов. Кроме того, биохимические и механические свойства самих эритроцитов могут определенным образом изменяться в соответствии с энергетическими потребностями организма при стрессе.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в сравнительном изучении стандартных показателей красной крови, а также активности и свойств мембранных ферментов эритроцитов крыс при иммобилизационном стрессе и при активации холинергических структур путем ингибирования АХЭ in vivo с помощью фосфорорганического ингибитора (ФОИ). Предполагалось, что это позволит прояснить значимость холинергической системы в запуске и развитии стресс-реакции.

В работе были поставлены следующие задачи:

- исследовать стандартные показатели красной крови, а также активность и свойства АХЭ и ЫаД-АТФазы в целых эритроцитах и мембранных препаратах эритроцитов при иммобилизационном стрессе у крыс;

- изучить те же показатели после введения крысам in vivo фосфорорганического ингибитора АХЭ в дозах, вызывающих и не вызывающих клинических проявлений отравления;

- изучить влияние армина in vitro на свойства ЫаД-АТФазы в целых эритроцитах и мембранных препаратах эритроцитов крысы.

Положения выносимые на защиту.

- воздействие на крыс острого иммобилизационного стресса и отравление животных армином в дозе ЛД50, сопровождающееся острой картиной интоксикации, вызывают сходные изменения гематологических показателей.

- отравление крыс армином в дозе, не сопровождающейся клиническими проявлениями интоксикации, вызывает снижение активности Ыа,К-АТФазы в целых эритроцитах, сходное с таковым при иммобилизационном стрессе.

- при остром иммобилизационном стрессе и при отравлении крыс армином в дозе 1/2 ЦОзо в организме происходит активация сходных адаптационных механизмов, что позволяет предположить важную роль холинергических структур в процессе адаптации животных.

Научная новизна. Впервые показано, что при чрезмерном возбуждении холинергических структур (отравление крыс армином в дозе, ингибирующей периферическую АХЭ на 100% и АХЭ мозга на 80% и вызывающей судороги и бронхоспазм), имеет место изменение гематологических показателей, сходное с таковым при иммобилизационном стрессе. В то же время изменения активности и свойств ИаД-АТФазы, обнаруженные при стрессе, и свидетельствующие о появлении в крови животных эндогенного дигоксинподобного ингибитора (ЭДПИ) фермента, выявлены лишь в случае отравления крыс армином в дозе, не вызывающей клинических проявлений интоксикации, но ингибирующей периферическую АХЭ на 78%. Полученные данные позволяют предположить, что стимуляция образования ЭДПИ при иммобилизационном стрессе происходит в результате активации холинергических структур периферических органов (возможно коры надпочечников). В условиях же выраженной гипоксии (при судорогах и бронхоспазме в случае отравления крыс высокой дозой армина) эндогенный ингибитор, по-видимому, не способен синтезироваться вследствие дефицита кислорода.

Научно-практическая значимость работы. Проведенные исследования активности и свойств Ка,К-АТФазы в целых эритроцитах крысы и их мембранных препаратах при остром иммобилизационном стрессе и отравлении животных фосфорорганическим ингибитором АХЭ в различных дозах, позволяют сделать предположение о том, что повышение в крови стрессированных животных кон-

центрации эндогенного ингибитора фермента связано со стимуляцией холинер-гических структур периферических органов, возможно связанных с корой надпочечников.

Полученные данные предположительно показывают возможность регуляции активности и свойств Ш,К-АТФазной системы холинергическими механизмами и расширяют представления об участии последних в изменениях, происходящих в организме в ходе развития стресс-реакции.

Результаты исследования используются при проведении спецпрактикума для студентов, специализирующихся по кафедре анатомии и физиологии человека и животных Тюменского государственного университета, и при чтении курсов на кафедре медицинской и биологической физики в Тюменской государственной медицинской академии.

Апробация диссертации. Материалы диссертации доложены на международной научно-практической конференции "Безопасность жизнедеятельности в Сибири и на Крайнем Севере" (Тюмень, 1995); 2-й международной научно-практической конференции "Безопасность жизнедеятельности в Сибири и на Крайнем Севере" (Тюмень, 1997); на семинаре "Социально-гигиенический мониторинг в Тюменской области " (Тюмень, 1997); ХУЛ съезде физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998).

Публикации. Результаты исследований опубликованы в 4-х статьях и 1-х тезисах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов и результатов исследований, обсуждения полученных данных, заключения и выводов. Список литературы включает 192 источников, в том числе 116 на иностранных языках. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, иллюстрирована 16 рисунками и 9 таблицами.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 1.1. Основные положения теории стресса.

1.1.1. Развитие концепции стресса.

Проблема единства организма и окружающей среды давно интересует ученых биологов в различных аспектах. Со времени Ламарка и Дарвина она стала узловой, главным образом, в плане глубокого изучения факторов, которые обуславливают эволюцию органического мира. Почти в то же время физиология вплотную столкнулась с другим аспектом этой проблемы: механизмами нарушения и восстановления единства организма и среды.

Великий французский физиолог Клод Бернар во второй половине XIX века, задолго до того как появилось понятие о стрессе, впервые четко указал, что внутренняя среда (milieu intérieur) живого организма должна сохранять постоянство при любых колебаниях внешней среды. Он осознал, что "именно постоянство внутренней среды служит условием свободной и независимой жизни".

Если сопоставить относительное постоянство внутренней среды организма с фактом прерывистого снабжения организма необходимыми для жизни веществами, то неизбежно встает вопрос о резервах организма, о наличии депо, откуда внутренняя среда организма может получать необходимые пополнения для поддержания своего постоянства. Таким образом, концепция о постоянстве внутренней среды выдвинула ряд важных вопросов, которые и до сих пор являются предметом исследований.

В период развития этих представлений Клода Бернара физиология обогатилась фундаментальным открытием. Речь идет о центральном торможении, установленном И. М. Сеченовым (Сеченов, 1863). Это был первый достоверный факт о тормозящем влиянии ретикулярной формации на спинальные центры.

Легко установить преемственную связь между этим открытием и всем последующим развитием рефлекторной теории И. М. Сеченова, И. П. Павлова и Н. Е. Введенского, вскрывшей основные механизмы саморегуляции, координации и интеграции функций. Именно эта теория определила общие закономерности приспособления высших животных к условиям их существования.

Для физиологии существенно то, чрезвычайные раздражители или необычный размер ежедневных условий существования организма, которые по И. П. Павлову (1900), выступают в качестве патогенных факторов, нарушают механизмы саморегуляции функции, резко суживают диапазон уравновешивания организма со средой и, тем самым, ограничивают коренную способность живых существ поддерживать постоянство своей внутренней среды.

Классические работы JL А. Орбели (1935) об адаптационно-трофической функции симпатической нервной системы вскрыли новые стороны механизмов, обеспечивающих уравновешиваемость организма, постоянство его внутренней среды. Оказалось, что эта часть нервной системы играет важную роль в изменении функциональных свойств различных органов и систем, в том числе центральной нервной системы в соответствии с потребностью адаптации их к текущим задачам функционирования организма.

В 1929-32 г. известный американский физиолог Вальтер Кеннон сформулировал принцип "гомеостазиса" (Cannon, 1932). Он показал, что единство и постоянство внутренней среды организма поддерживается цепью сложных и многообразных процессов, где важная, почти универсальная и во многом инициальная роль принадлежит функции симпато-адреналовой системы.

Отмеченные выше исследования показали, что объединяющим началом целостности организма и соотношения его внешней и внутренней среды является рефлекторный принцип. В исследованиях же взаимоотношений организма и среды на системном и органном уровне и на уровне химических превращений огромный вклад внес канадский ученый Ганс Селье, выдвинувший концепцию

"стресса " или "общего адаптационного синдрома". В 1936 г. Г. Селье впервые показал, основываясь на экспериментах проведенных им на крысах, что если организм подвергается действию сильных агентов таких как холод, хирургические повреждения, интесивные мышечные упражнения или интоксикация сублетальными дозами ядов, то возникает типичный синдром, симптомы которого не зависят от природы повреждающего агента (8е1уе, 1936). Он выделил три стадиив развитии синдрома:

1. стадия тревоги (6 - 48 часов после начала повреждения);

2. стадия резистентности, (спустя 48 часов после начала повреждения);

3. стадия истощения.

Факторы, вызывающие эти стереотипные реакции, Селье назвал "стрессорами", а состояние организма, вызываемое их действием, " стресс-реакцией."

В одной из своих последних работ Селье определяет стресс, как состояние, проявляющееся специфическим синдромом, который включает в себя все неспецифически вызванные изменения в биологической системе (8е1уе, 1959).

Совокупность приведенных выше стереотипных общих ответных реакций организма на действие раздражителей самой различной природы и реакций, имеющих прежде всего защитное значение, была обозначена Селье �