Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические изменения эритроцитов при остром отравлении метафосом и их коррекция перфтораном

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические изменения эритроцитов при остром отравлении метафосом и их коррекция перфтораном"

На правах рукописи

ВОЛЖИН АЛЕКСАНДР ОЛЕГОВИЧ

БИОХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ III'И ОСТРОМ ОТРАВЛЕНИИ МЕТАФОСОМ И ИХ КОРРЕКЦИЯ ПЕРФТОРАНОМ

03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону 1998

Работа выполнена в Дагестанской государственной медицинской ака демии.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Волжина Н.Г.

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

, Голубев A.M.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Защита состоится '.................1998 г. на заседании диссертационно

го совета Д 084.53.01 при Ростовском государственном медицинском универ ситете (344022 г. Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер., 29.)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского госу дарственного медицинского университета.

Сторожук П.Г.,

доктор медицинских наук, ст. научный сотрудник Трапезонцева P.A.

Ведущая организация: Ростовский государственный университет

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент

Н.Я. Корганов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Фосфорорганические соединения (ФОС) широко применяются в сельском хозяйстве в качестве инсектицидов, акарицидов, фунгицидов, гербицидов, дефолиантов, десикантов, ротентицидов. Кроме того, к ФОС относятся и боевые отравляющие вещества из группы "нервных ядов", имеющиеся на вооружении армий многих стран мира. В последние годы в Российской Федерации больные с острыми отравлениями ФОС составляют 5-10 % от общего числа больных, поступающих в специализированные токсикологические центры (Лужников, 1994). В связи с этим, исследования молекулярных механизмов повреждающего действия ФОС, с одной стороны, а с другой — молекулярных механизмов, компенсирующих повреждающее действие фосфор органических пестицидов, являются актуальными.

В детоксикации различных ксенобиотиков, в том числе и пестицидов, важнейшая роль принадлежит монооксигеназной системе, являющейся 1-й фазой биотрансформации (Тиунов, 1987, 1991). В детальных исследованиях Ю.С. Кагана и сотрудников (Каган и др., 1980, 1988; Каган, 1986) выявлена индукция цитохрома Р450 при отравлении ФОС. На основании вышесказанного авторы использовали индукцию цитохрома Р450 как один из новых принципов терапии отравления ФОС. Авторы исследовали индекс терапевтической эффективности фенобарбитала, классическою индуктора моно-оксигеназ, при интоксикации крыс различными фосфорорганическими пестицидами в дозе ЛД50 (валотон, этафос, хлорофос и др.) и показали существенное снижение токсичности всех исследованных ФОС.

С другой стороны, было показано (Образцов и др., 1993, 1994; Михайлов и др., 1993), что различные фторуглероды, растворяясь в гидрофобной области микросомальных мембран, образуют комплекс с ключевым ферментом монооксигеназной системы — цитохромом Р450 . Авторы предполагают, что именно факт образования комплекса цитохрома Р450 с перфторорганиче-скими соединениями (ПФОС) может быть молекулярной основой разнообразных изменений, происходящих в организме после введения перфториро-ванных углеродов. В печени начинается усиленный синтез цитохрома Р450 ,

общее содержание которого увеличивается в 3-4 раза. Один из представит лей ПФОС — перфторан — аналогично другим индукторам фенобарбитал вого типа — способен индуцировать не только ферменты монооксигеназн< системы печени, но и П-й фазы биотрансформации ксенобиотиков: микрос мальных УДФ-глюкуронилтрансферазы и глутатион-8-трансфера: (Михайлов и др., 1993).

В комплексной терапии отравлений фосфорорганическими соедш пнями применяют переливание донорской крови или частичное кровезам щение (Лудевич, Лос, 1983; Лужников, 1994).

Все вышеописанное позволило использовать перфторан в терапии oí poro отравления одним из представителей фосфорорганических пестицид — метафосом.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Выяснить возможность применения перфторана для коррекции биох мических изменений в эритроцитах при остром отравлении метафосом.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Исследование интенсивности внутрисосудистого гемолиза, кислс ной резистентности эритроцитов и активности глюкозо-6-Ф-дсгидрогеназь плазме крови при остром отравлении метафосом как интегральных пока: телей стойкости эритроцитов.

2. Определение молекул средней массы — высокоактивных соединен! накапливающихся в условиях интоксикации, при пероральном введении а тафоса.

3. Выявление особенностей активности Na, К-ЛТФазы эритроцитов их мембран при остром отравлении метафосом.

4. Исследование содержания АТФ и 2,3-дифосфоглицерата — peryj торов газотранспортной функции гемоглобина — при отравлении мета^ сом.

5. Обосновать возможность применения перфторана для коррекции í таболитических изменений, происходящих в эритроцитах при остром отр; лении метафосом.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

1. Настоящая работа является исследованием, направленным на сравнительное изучение стабильности мембран эритроцитов при остром отравлении метафосом.

2. Установлено, что при остром отравлении мстафосом в дозе ЛД50 снижается кислотная резистентность эритроцитов, повышается уровень вне-эритроцитарного гемоглобина и активность глюкозо-б-Ф-ДГ в плазме крови, что свидетельствует о дестабилизации мембран эритроцитов и мембрано-токсическом эффекте метафоса.

3. Впервые установлено накопление в плазме крови отравленных метафосом собак молекул средней .массы, коррелирующее с тяжестью состояния животных.

4. Впервые показано, что при остром отравлении метафосом снижение активности N8, К-АТФазы в мембранах эритроцитов выражено в меньшей степени, чем в цельных эритроцитах.

5. Впервые установлено, что введение перфторана снижает тяжесть мембранотоксического эффекта метафоса и повышает выживаемость животных. Корригирующий эффект перфторана на эритроциты проявляется в модификации обменных процессов, наблюдается нормализация уровня АТФ и 2,3-ДФГ, увеличивается активность N3, К-АТФазы и гшокозо-б- Ф-дегидро-геназы, что свидетельствует о восстановлении биохимических процессов, обеспечивающих газотранспортную функцию эритроцитов.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Метафос, введенный пероралыю в дозе ЛД50 , обладает мембрано-токсическим эффектом, что проявляется в снижении уровня кислотной резистентности эритроцитов, повышении свободного гемоглобина и активности глюкозо-6-Ф-дегидрогеназы в плазме крови.

2. При остром отравлении метафосом в плазме крови имели место количественные и качественные изменения молекул средней массы.

3. В эритроцитах при остром отравлении метафосом происходит накопление АТФ и 2,3-ДФГ, что свидетельствует о нарушении их газотранспортной функции.

4. Псрфторан, введенный животным после острого отравления, снижает тяжесть мембранотоксического эффекта метафоса, усиливает устойчивость эритроцитарной мембраны к повреждающему действию метафоса и оказывает корригирующий эффект на метаболизм эритроцитов.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ:

Подученные данные дают новую информацию о структурно-функциональных изменениях эритроцитов при действии метафоса, расширяя наши представления о биохимических механизмах и патогенезе острых отравлений фосфорорганическими пестицидами.

Эти данные могут служить теоретической предпосылкой для прикладных исследований по направленной фармакологической коррекции эритро-цитарного метаболизма при острых отравлениях ФОС.

Исследование интегральных показателей стойкости эритроцитарной мембраны (резистентность эритроцитов, уровень свободного гемоглобина, активность глюкозо-6-Ф-дегидрогеназы) могут быть использованы как тсст для оценки глубины повреждений при острых отравлениях фосфорорганическими пестицидами.

Определение уровня молекул средней массы в плазме крови может служить ценным показателем, характеризующим тяжесть повреждения при остром отравлении метафосом; в пользу этого говорит простота и достаточная информативность существующих экспресс-методов определения МСМ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Результаты работы докладывались и обсуждались на научно-практической конференции по охране природы Дагестана (Махачкала, 1995); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 75-летию проф. Р.П. Аскерханова (Махачкала, 1995); научной конференции "Морфогенез, курортные и физические факторы" (Махачкала, 1996); 4-ой региональной научной конференции "Химики Северного Кавказа — производству" (Махачкала, 1996); 54-ой научной конференции студентов и молодых ученых Дагестанской государственной медицинской академии (Махачкала, 1997); Всеармейской научной конференции "Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в военной медицине"

(Санкт-Петербург, 1997); Всероссийской конференции но физико-химическому анализу многокомпонентных систем (Махачкала, 1997), совместном заседании кафедры биологической химии и ЦТ1ИЛ ДГМА (ноябрь 1997).

Публикация материалов исследования: но основным положениям диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 156 источников на русском языке и 42 на иностранных языках. Работа содержит 20 таблиц и иллюстрирована 9 рисунками.

Материал и методы исследования

Опыты проведены на 24 собаках и 110 белых беспородных крысах массой 170-190 г.

Острое отравление метафосом вызывали путем перорального введения пестицида предварительно наркотизированным животным. У собак применяли для наркоза гиопентал, для крыс использовали калипсол.

Мстафос вводили в желудок через зонд в дозе ЛД50, которая для собак составляет 47 мг/кг, а для крыс — 25 мг/кг (Мельников, 1987).

Через 30 мин после введения мстафоса животным вводили эмульсию перфторана. Собакам эмульсию перфторана вводили из расчета 10-15 мл/кг в бедренную вену, крысам — в хвостовую вену в количестве 1 мл/100 г.

Исследования проводили в различные сроки после введения метафоса и перфторана: через 30, 90 и 180 мин. В контрольной группе животным после отравления метафосом вводили эквивалентное количество физиологического раствора.

В некоторых сериях исследовали биохимические показатели плазмы крови и эритроцитов при плеторическом введении перфторана крысам в дозе 1-1,5 мл/100 г.

Крыс забивали декапитацией. Свободно вытекающую кровь собирали в пробирку с антикоагулянтом (гепарин). У собак кровь для исследования получали из бедренной вены.

Определение кислотной резистентности эритроцитов проводили гю методу Терскова и Гительзона (Леонова. 1987) с использованием 0.004 и соляной кислоты в качестве гемолитика. Концентрацию свободного гемоглобина в плазме крови определяли по реакции с бензидином (Кассирский, 1970).

Содержание молекул средней массы (МСМ) в плазме крови определяли скрингашговым методом (Габриелян, Липатова, 1984) в модификации Нико-лайчика и со ант. (1991). Поглощение образцов исследовали в ультрафиолете при длинах волн 254 и 280 нм, рассчитывали коэффициент К — соотношение wcT4HKH4M tjm}уi\y_ v.oJni ?'л0 и 25" нм.

Количество АТФ и 2,3-дифссфоглицсрата (2,3-ДФГ) в эритроцитах определяли по метод}' Виноградовой и соавт. (1980).

Активность глюхозо-6-Ф-дегидрогеназы (глюкозо-6-Ф-ДГ) определяли в эритроцитах и плазме крови (Алексеев; Ермаков, i 983) спектрофотимегри-чески по скорости восстановления 11АДФ при 340 нм.

Определение Na, К-АТФазы эритроцитов и их мембран проводили по методу A.M. Казеннова и др. (1980, 1984). Мембраны эритроцитов получали методом гипоосмотического гемолиза (Казеннов и др., 1984). Активность Na, К-АТФазы рассчитывали как разность между общей и Mg-зависимой АТФа-зой. Об активности фермента судили по приросту неорганического фосфора (НФ) (Рожанец и др., 1978) в среде инкубации и выражали в мкмолях НФ на мг белка/час или мл эритроцитов/час. Концентрацию белка определяли по методу Лоури (Lowry et al, 1951).

Полученные экспериментальные данные подвергали статистической обработке по методу малой выборки (Кокунип, 1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате экспериментов установлено, что метафос в дозе ЛД50 обладает мембранотоксическим эффектом. Об этом свидетельствуют данные, полученные при изучении интегральных показателей стабильности эритро-

цитарных мембран ■— кислотной резистентности, содержания свободного гемоглобина и активности гтокозо-6-Ф-ДГ в плазме крови.

Через 30 и 90 мин после перорального введения метафоса в дозе ЛД50 снижается кислотная резистентность эритроцитов. При этом уменьшается время выхода основного пика и падает длительность гемолиза. Изменяется качественный и количественный состав эритроцитов у отравленных метафо-сом собак. Количество повышенностойких эритроцитов (гемолиз от 4-х и более мин) падает на 46 %, количество среднестойких эритроцитов остается без изменения.

Снижение кислотной резистентности эритроцитов при остром отравлении метафосом, по-видимому, связано с физико-химическими изменениями в мембране эритроцитов, особенно ее липидных компонентов (Федоров и др., 1986; Колбасин и др., 1991; Волжина и др., 1996), которые, в основном, и обеспечивают резистентность эритроцитов (Леонова, 1987). Нельзя сбрасывать со счетов и еще одну причину уменьшения устойчивости эритроцитов к кислотному гемолитику. Введение метафоса в дозе ЛД50 для животных является стрессом, а при различных стресс-воздействиях наблюдается стресс-полицитемия, при которой из кровяных депо в кровяное русло выбрасываются эритроциты (Капохин, Маслова, 1984; Маслова, Резник, 1984). Специальные исследования вышеуказанных авторов показали, что стресс-полицитемия характеризуется увеличением в крови популяции старых эритроцитов, обладающих низкой стойкостью к кислотному гемолитику.

Снижение стойкости эритроцитов к кислоте, которое наблюдалось в наших экспериментах, еще не означает, что в сосудистом русле происходит гемолиз. Одним из критериев интенсивности гемолиза является уровень свободного гемоглобина в плазме крови (табл. 1).

Через 30 мин. после введения метафоса уровень свободного гемоглобина в плазме крови вырос в 2,2 раза, а через 90 мин. — в 3,4 раза.

Таким образом, при остром отравлении метафосом снижаегся кислотная резистентность эритроцитов, при этом в плазме крови нарастает содержание свободного гемоглобина. Возможно, между этими процессами и нет прямой связи, т.е. падение кислотной резистентности эритроцитов еще не яв-

ляется причиной и условием их последующего гемолиза. Повышение внутри-сосудистого гемолиза эритроцитов, по-видимому, связано с различными параллельно идущими процессами, среди которых: изменения метаболизма самой клетки, нарушения структуры и появление дефектов в мембране эритроцитов, а также изменения химического состава плазмы крови.

Таблица 1

Содержание свободного гемоглобина при остром отравлении метафосом и введении перфторапа

Этапы исследовании Концентрация Нв в мг% в%

контроль 10,8 ±0,87 100

мстафос:

30 мин 23,7 ± К/"* 219,4

90 мин 36,7 ±0,65+ 339,8

Метафос-t-перфторап

30 мин 22,4 х 1,92* 207.4

90 мин 16,8 ±0,74* 155,6

Примечание: во всех таблицах звездочкой отмечены статистически достоверные различия но отношению к контролю.

Усиленный гемолиз эритроцитов имеет отрицательные последствия по двум направлениям. Во-первых, при этом снижается количество циркулирующих в крови эритроцитов, а, следовательно, ухудшается снабжение организма кислородом. Во-вторых, в ряде работ (Valensuela et al, 1986; Gutteridge. 1987; Clemens et al, 1989) показано, что гемоглобин способен индуцировать процессы пероксидации. Следовательно, повышение уровня свободного гемоглобина в плазме крови приводит к усилению ПОЛ, а в итоге — к лизису клеток. Возникает порочный крут.

Еще одним интегральным показателем стабильности эритроцитарных мембран является активность глюкозо-6-Ф-ДГ в плазме крови (табл. 2).

Через 30 мин после отравления метафосом активность глюкозо-6-Ф-ДГ в плазме крови увеличивается на 37,5 %, еще выше активность фермента через 90 мин, когда возрастание активности глюкозо-6-Ф-ДГ составило 64 %.

Таблица 2

Активность глюкозо-6-Ф-ДГ при остром отравлении метафосом и введении перфторана

Этапы исследования Плазма крови эритроциты

тюль НАДФН +Н+/мл/мш1

контроль 5,28± 0,17 943± 32,7

метафос:

30 мин 7,26 ±0,25* 765,9 3±4,1 *

90 мин 8,66 ±0,34* 640,7 ±26,3*

метафос + перфторан

30 мин 7,06±0,25* 852 ±30,8

90 мин 6,61 ±0,27* 880,0 ±30,4

Повышение активности глюкозо-б-Ф-ДГ в плазме крови собак с острым отравлением происходит на фоне уменьшения ее активности в эритроцитах. Через 30 мин после введения метафоса падение активности составило 19 % , а через 90 мин — 37 %. Снижение активности глюкозо-6-Ф-ДГ в эритроцитах может оказать значительное влияние на весь эритроцитарный метаболизм. В результате реакции, катшшзируемой глюкозо-6-Ф-ДГ, образуется НАДФН+Н+ , необходимый для поддержания глютатиона в восстановленном состоянии. Сохранение глютатиона в восстановленном состоянии необходимо для предохранения ряда ферментов от инактивирования, осаждения мембраны клетки от действия перекисей и окислительной денатурации гемоглобина.

Подводя итоги исследований по изучению интегральных показателей стабильности эритроцитарных мембран — кислотной резистентности эритроцитов, содержания внеэритроцитарного гемоглобина и активности глюкозо-б-Ф-ДГ в плазме крови, можно констатировать, что метафос в дозе ЛД50 оказывает повреждающее влияние на мембраны эритроцитов и изменяет их проницаемость.

Этот мембрапотоксический эффект метафоса может оказать существенное влияние и на структурно-функциональное состояние мембран различных клеточных органелл, и, в первую очередь, лизосом. В результате активации лизосом и изменения проницаемости их мембран может наблюдаться выход протеолитических ферментов и, как следствие, увеличение протео-лиза и накопление продуктов деструкции белков, и в первую очередь — молекул средней массы (МСМ).

В плазме крови отравленных метафосом собак увеличивается концентрация МСМ (табл. 3).

Таблица 3

Молекулы средней массы в плазме собак при остром отравлении мета-

фосом и введении перфторана (М ± га)

Этапы исследования Ен4 Ещ> Отношение Б®» / Емо

Контроль 0,154 0+.009 0,215± 0,01 1,42± 0,077

Метафос:

30 мин 0,192 ±0,01* 0,306+0,012* 1,59+ 0,066

90 мин 0,20410,008* 0,302 0,013* 1,48 ±0,036

Метафос+ перфторан:

30 мин 0,188 ±0,008* 0,295± 0,006* 1,59 ±0,067

90 мин 0,161 ±0,01 0,262± 0,008* 1,65 ±0,096

Через 30 мин после отравления метафосом показатель Екч вырос по сравнению с нормой на 24 %, а показатель Емо— на 42,3 %. Еще выше содержание МСМ в плазме крови собак через 90 мин после отравления: показатель Еи4 выше на 30,5 %, а показатель Егво остался на уровне предыдущего этапа отравления.

Показатель Еао характеризует поглощение пептидной фракции МСМ и зависит от содержания ароматических аминокислот, поэтому можно говорить, что в плазме крови отравленных метафосом животных накапливаются среднемолекулярные пептиды.

Увеличение в плазме крови МСМ может усилить отрицательный эффект метафоса и способствовать про1рессированию патологических процессов. Здесь уместно привести данные В.Е. Рябинина (1990), в которых показано, что среднемолекулярные пептиды уменьшают активность монооксиге-назных систем и скорость окисления НАДФН+Н+ . Это может снижать де-токсикационную функцию организма и способствовать ухудшению состояния экспериментальных животных. Увеличение количества МСМ в плазме крови собак после введения метафоса может быть и причиной увеличения свободного гемоглобина и снижения кислотной резистентности эритроцитов, т.к. некоторые авторы сообщают о способности МСМ снижать резистентность эритроцитов и ускорять гемолиз (Туликова, 1983; Волчегорский и др., 1994. 1996).

Индикатором структурно-функционального состояния эритроцитов является мембраносвязанный фермент Na, К-АТФаза, который является интегральным белком мембраны. Кроме того, ионные градиенты, создаваемые Na, К-АТФазой, по гипотезе В.П. Скулачева (1986), выполняют роль энергетического буфера.

Активность Na, К-АТФазы при остром отравлении метафосом исследовали как в цельных эритроцитах, так и в их мембранах (табл. 4).

Через 30 мин после введения метафоса в цельных эритроцитах происходит падение активности Na, К-АТФазы на 26 %, в то время как в мембранах активность фермента остается без изменения (небольшое уменьшение оказалось статистически недостоверным).

Через 90 мин после отравления наблюдается дальнейшее уменьшение активности Na, К-АТФазы, выраженное в большей степени в цельных эритроцитах, чем в мембранах. Снижение активности фермента в цельных эритроцитах составило 38 %. а в мембранах — всего 9 %.

На функционирование Na, К-АТФазы может оказывать влияние целый комплекс факторов, так как активность фермента находится в прямой связи со своим мгасроокружеггаем. Контролируется работа Na, К-АТФазы многими регуляторными механизмами, включая местные факторы, а также циркулирующие в крови гормоны (Мацкевич и др., 1994; Goto et al, 1992).

Таблица 4

Биохимические показатели эритроцитов при остром отравлении метафосом и введении перфторана

№ серии Условия опыта АТФ М±ю мкмольЛмл 2,3-ДФГ М±т мкмольЛмл л\а, К-А'ГФаза

эритроциты мкмоль НФ/ 1 мл/час мембраны мкмоль НФ/мг/час

1. Контроль 1,21± 0,06 5,19 ±0,46 15,33 ±0,46 1,88 ±0,05

2. Метафос 30 мин 1,78 ±0,11 Р^с 0,001 6,66 ±0,25 Р|.2< 0,001 11,41 ±0, 53 Р1-2<0,00 1 1,79± 0,04 Р1-2 > 0,5

3. 90 мин 2,03± 0,09 Риз <0,001 Р2-3 >0,5 7,40± 0,34 Рьз< 0,001 Р2-з >0,5 9,5 ±0,55 Р,.з< 0,001 1,72 ±0,05 Р1-3 0,05

4. метафос+ перфторан 90 мин 1.30± 0,07 Рм >0,5 Рз-4 0<,001 5,74 ± 0,17 Р1.4 > 0,5 Рз-4< 0,001 14,38± 0,54 Рь4>0,5 Рз-4 <0,001 1,84± 0,07 Рм > 0,5 Рз-4 > 0,5

Угнетение активности Na, К-АТФазы может явиться одним из проявлений повышения концентрации дигиксиноподобного ингибитора в плазме крови, появление которого при различных видах стресса постулировано в ряде работ (Багров и др., 1991; Kelly et al, 1985; Lichtenstein et al, 1987 и др.). Разница в активности ферментов в цельных эритроцитах и их мембранах позволяет предположить, что многократное отмывание сначала эритроцитов, а затем их мембран в гшюосмотической среде для получения теней приводит к удалению ингибитора с рецепторной поверхности Na, К-АТФазы.

Еще одной причиной снижения активности Na, К-АТФазы может быть прямое воздействие метафоса на эритроциты. Липофильность и высокая реакционная способность метафоса предполагают возможность; его непосредственного действия на мембрану эритроцитов, а следовательно, и на мембра-носвязанные ферменты. Здесь уместно вспомнить, что различные фосфорор-ганические пестициды, представителем которых является метафос, интерка-лируют в область углеводородных цепей фосфолипидов, либо могут взаимодействовать путем распределения на поверхности гидрофобных участков мембраны эритроцитов (Панасенко и др., 1984). В итоге — уменьшение активности АТФазы. Активирование процессов ПОЛ в эритроцитах при остром отравлении метафосом (Волжина и др., 1996) может также быть причиной снижения активности фермента. Липидные перекиси обладают мощным мембранолитическим эффектом и могут тггибировать мембраносвязашше ферменты. Высокая полярность кислородсодержащих группировок, появляющихся в результате индукции ПОЛ в полиеновых ацилах фосфолипидов мембраны, нарушает гидрофобные липидо-белковые взаимодействия в мембране эритроцитов. Для Na, К-АТФазы существенное значение имеют взаимодействия неполярных аминокислотных остатков с гидрофобными углеводородными цепями мембраны. Снижение жидкостности мембраны приводит к устранению кооперативных взаимодействий между АТФ-связывающими центрами фермента и предотвращает сшивание больших субъединиц, что обусловливает отрицательную кооперативность по субстрату, приводя к падению активности Na, К-АТФазы (Болдырев, 1992).

Следствием торможения активности Ка, К-АТФазы в эритроцитах при остром отравлении метафосом может быть смещение ионного равновесия в крови, что может привести к избыточному накоплению катионов внутри эритроцитов, накоплению ионов К+ в плазме и гемолизу эритроцитов.

Активность Иа, К-ЛТФазы в эригроцитарной мембране находится в зависимости от содержания в клетках красной крови АТФ, основная масса которой расходуется для работы ионных насосов.

При остром отравлении метафосом происходит накопление АТФ в эритроцитах (табл. 4). Через 30 мин количество АТФ увеличивается на 47,1 %, еще выше ее содержание через 90 мин после введения пестицида, когда уровень АТФ вырос на 67, 7 %. Сопоставление активности АТФазы и содержания АТФ в эритроцигах отравленных животных показало, что одной из причин накопления АТФ является падение активности Ыа, К-АТФазы. Возможен еще один путь накопления АТФ у экспериментальных животных — снижение расхода АТФ на фосфорилирование спсктрина и других белков ци-тоскслета эритроцитов. Это может оказать влияние на форму эритроцитов, изменить вязкоэластические свойства мембран и способность эритроцитов к деформации. У отравленных метафосом белых крыс происходит значительное снижение деформируемости эритроцитов (Магомедов, Газимагомедова, 1997), что приводит к повышению вязкости и нарушению периферического кровотока (Голубев и др., 1997).

Другим макроэргическим соединением эритроцитов является 2,3-дифосфоглицерат (2,3-ДФГ), который выполняет регуляторную роль и является модулятором газотранспортной функции гемоглобина.

Количество 2,3-ДФГ в эритроцитах отравленных животных возрастает (табл. 4). Через 30 мин. его концентрация в эритроците увеличивается на 28,3 %, а через 90 мин. содержание 2,3-ДФГ на 42,6 % больше, чем в контроле.

Повышение 2,3-ДФГ у отравленных ФОС животных указывает на увеличение потребности в кислороде. И действительно, при действии ФОС в организме развивается гипоксия смешанного тина (Лошадкин, Абнизов, 1995).

В динамике АТФ и 2,3-ДФГ существенное значение имеет концентрация неорганического фосфора (НФ), количество которого в эритроцитах

отравленных метафосом крыс снижается, составляя через 30 мии после отравления 47,7 %, а через 90 мин — 24,8 % исходного уровня.

Подводя итоги исследования метаболизма эритроцитов и их мембран при действии мстафоса в дозе ЛД50 можно констатировать, что метафос вызывает структурно-функциональные изменения эритроцитов, приводящие к нарушению их газотранспортной функции.

Знание механизмов развития повреждения эритроцитов при остром отравлении ФОС может быть использовано для разработки рациональных методов лечения и коррекции нарушенного метаболизма.

Для коррекции патологических процессов, возникающих при остром отравлении одним из представителей ФОС — метафосом, применен перфто-ран — синтетический кровезаменитель, переносчик кислорода.

Перфторап является представителем перфторуглеродных соединений, который разрешен к применению в клинической практике. Этот кровезаменитель применяется для лечения кровопотери (Иванов, 1984, 1992; Ярочкин и др., 1986; Голубев и др., 1993; 81етЬеиЬпег, 1988), травмы мозга

(Усенко, Петренко, 1994), хирургической патологии головного мозга (Зозуля и др., 1987), алкогольного психоза (Вайчюлис и др., 1995), гипоксии (Мороз. 1995) и другой патологии.

Сначала была проведена серия экспериментов по плеторическому введению перфторана и его влиянию на структурно-фуцкциональнос состояние эритроцитов и некоторые биохимические показатели плазмы крови (табл. 5).

Исследования показали, что плеторическое внутривенное введение перфгорана не оказывает заметного влияния на кислотную резистентность эритроцитов. Время выхода основного пика, время окончания гемолиза, а также распределение эритроцитов по группам стойкости к кислотному гемо-литику после введения перфторана не отличались от контрольных животных.

При плеторическом введении перфторана структурно-функциональное состояние эритроцитов не изменяется. Интегральные показатели состояния мембран эритроцитов (содержание свободного гемоглобина и активность глюкозо-6-Ф-ДГ в плазме крови) через 1 и 3 часа после инъекции перфторана остаются такими же, как и у контрольных животных. Не наблюдается досто-

Таблица 5

Биохимические показатели плазмы крови и эритроцитов при плеторическом ведении перфторана

Условия Свободный Глюкоза МСМ плазмы Глижозо- АТФ 2,3-ДФГ Na, К-

опыта Нв мг% плазмы Е254 Егво К 6-Ф-ДГ эрнгроц. эршроц. АТФаза

ммоль/л плазмы мкмоль/мл эритрцитов

Контроль 9,62± 4,54 ± 0,126± 0,168± 1,34± 4,99 ± 1,21 ± 5,19± 15,33 ±

0,59 0,29 0,003 0,004 0,029 0,28 0,016 0,23 0,46

Перфторан 9,63± 6,26*± 0,124+ 0,154*± 1,24*± 5,58± 1,14± 5,20+ 14,97±

60 мин 0,61 0,46 0,003 0,004 0,026 0,21 0,071 0,22 0,57

Перфторан 10,76± 4,49± 0,124± 0,173± 1,4± 4,88 1,10± 5,07± 16,24±

180 мин 0,54 0,72 0,003 0,002 0,03 0,14 0,073 0,10 0,64

верных различий в содержании в эритроцитах и модуляторов их газотранспортной функции — АТФ и 2,3-ДФГ. Остается без изменения и активность N3, К-АТФазы в эритроцитах.

Из всех исследованных показателей через 60 мин после введения перфторана в плазме крови изменяется только концентрация глюкозы, которая увеличилась на 38 °/о, и уменьшается количество чзеднемолекулярных пептидов. Увеличение глюкозы в плазме крови, по-видимому, связано со стресс-реакцией на введение нерфторана. Через 3 часа эти показатели возвращаются к исходному уровню и не отличаются от контроля.

В основной серии экспериментов перфгоран вводили через 30 мин после затравки животных м ста ф о сом в дозе ЛД50 ■

! ¡гследовзния кисло той резистентности эритроцитов отравленных ме-тафосом животных показали, что инъекции перфшрана не оказали существенного влияния ни но время выхода основного пика, ни на время окончания гемолиза. Эти показатели остаются такими же. как и у отравленных, животных, которым был введен физиологический раствор, и остаются пониженными но сравнению с контрольной группой. Аналогичные результаты получены и при изучении распределения эритроцитов по группам стойкости.

Таким образом, не обнаружено нормализации эритрограмм у отравленных собак после введения нерфторана.

Иная картина наблюдается при исследовании содержания свободного гемоглобина в плазме крови (табл. 1). У отравленных животных через 30 мин поете введения перфторана снижается уровень свободного гемоглобина по сравнению с животными, которым был введен физиологический раствор. Однако и через 90 мгаг. после введения перфторана уровень свободного гемоглобина остается выше, чем в контроле.

Введение эмульсии перфторана отравленным животным изменяет' уровень МСМ в плазме крови (табл. 3). Через 30 мин после инъекции перфторана показатель £254 повышен па 22 %. а показатель Е220— на 37.2 % по сравнению с контролем. Через 90 мин после введения перфторана показатель Е;54 снизился до уровня контрольных цифр. Показатель Егво , хотя и уменьшился по сравнению с предыдущим этапом, но еще остался на 22 % выше, чем в

контроле. Б тоже время он существенно снизился по сравнению с соответствующим показателем у нелеченных животных (22 % против 40,5 %).

Одной из причин снижения МСМ и свободного гемоглобина у отравленных животных, которым был введен перфторан, может быть то, что перфторуглероды являются хорошими жидкими адсорбентами с развитой активной гидрофобной поверхностью, на которую сорбируются различные вещества. Эмульсии ПФОС легко сорбируют белки и фосфолипиды.

1 мл 10 % эмульсии ПФОС связывает 3,7 мг белка и 0,5 мг фосфолипи-дов (Иваницкий, Белоярцев, 1983). Аналогичные результаты приведены и в других работах (Терешина, Доронина, 1986; Терешина и др., 1986). Нельзя исключить и возможность взаимодействия с введенными перфторуглеродами и метафоса, который является гидрофобным соединением.

Значительное снижение свободного гемоглобина и МСМ в плазме крови отравленных собак, которым вводили перфторан, может снизить действие ФОС и способствовать улучшению состояния животных и нормализации некоторых показателей крови.

Лечение перфтораном, проведенное в ранний период после отравления, приводит к изменению биохимических показателей эритроцитов (табл. 2 и 4).

В эритроцитах леченных перфтораном собак увеличивается активность глюкозо-6-Ф-ДГ по сравнению с животными, которым был введен физиологический раствор. Уже через 30 мин после инъекции перфторана активность глюкозо-6-Ф-ДГ в эритроцитах увеличивается, достигая почти исходного уровня через 90 мин.

Введение перфторана отравленным метафосом животным снижает степень ингибировапия активности N3, К-АТФазы, и ее активность практически возвращается к норме. Это касается активности фермента как в цельных эритроцитах, так и в их мембранах.

Увеличение активности N3, К-АТФазы у отравленных животных после лечения перфтораном приводит к уменьшению количества АТФ в эритроцитах. Содержание АТФ леченных животных достигает контрольных величин, небольшое отклонение оказалось статистически недостоверным. Снижается уровень и другого макроэргического соединения — 2,3-ДФГ, связывающего,

как и АТФ, обменные процессы в эритроцитах с их кислородтранспортной фушсцией. Уменьшение уровня АТФ и 2,3-ДФГ в эритроцитах леченных животных, по-видимому, отражает уменьшение кислородной задолженности в тканях, что свидетельствует о восстановлении биохимических процессов обеспечения газотранспортной функции эритроцитов.

Подводя итоги исследований влияния перфторана на. эритроцит!,I отравленных метафосом животных, можно констатировать, что перфторан оказывает нормализующее влияние на структурно-функциональное состояние эритроцитарной мембраны. Корригирующий эффект перфторана реализуется за счет изменения биохимических процессов обеспечения газотранспортной функции эритроцитов и сохранения гемоглобина в функционально активном состоянии. Перфторан снижает тяжесть течения раннего периода после отравления метафосом, способствуя нормализации обменных процессов в эритроцитах.

Таким образом, наши данные позволяют предположить, что перфторан может оказать достаточно эффективное воздействие в общем комплексе профилактических и лечебных мероприятий в клинике острых отравлений ФОС

Мы надеемся, что проведенные исследования изучения структурно-функциональных изменений эритроцитов и их мембран при остром отравлении метафосом будут способствовать более полному представлению о некоторых сторонах метаболизма эритроцитов при действии токсических веществ. а также поиску путей и методов эффективного лечения.

В Ы В О Д Ы:

1. Метафос в дозе ДЦя) обладает мембранотоксичееким действием, о чем свидетельствует изменение интегральных показателей стабильности эри-троцитарных мембран. У отравленных метафосом собак снижается кислотная резистентность эритроцитов, в плазме крови возрастает уровень свободного гемоглобина и увеличивается активность глюкозо-6-Ф-дегидрогеназы.

2. В плазме крови собак с острым отравлением метафосом наблюдается накопление МСМ. Содержание пептидных компонентов МСМ плазмы возросло в большей степени (через 30 мин на 42,3 %, через 90 мин — на 40,5 %), чем нспептидных (на 24,7 % и 30 % соответственно).

3. Активность глюкозо-6-Ф-ДГ в эритроцитах при остром отравлении метафосом снижается: через 30 мин после отравления наблюдается падение активности на 19 %, а через 90 мил — на 33 %.

4. При остром отравлении метафосом в эритроцитах падает активность Ыа, К-АТФазы, причем в мембранах эритроцитов уменьшение активности фермента выражено в меньшей сгепепи, чем в цельных эритроцитах.

5. При пероральном введении метафоса в дозе ЛД50 в эритроцитах увеличивается концентрация регуляторов газотранспортной функции гемоглобина — АТФ и 2,3-ДФГ, причем через 90 мин после отравления количество метаболитов выше, чем через 30 мин. У отравленных метафосом животных в эритроцитах появляется большое количество неорганического фосфора, свидетельствующего о том, что накопление АТФ и 2,3-ДФГ идет не только в результате превращения внутри системы АТФ-2,3-ДФГ-НФ.

6. Плеторическое введение перфторана в дозе 10 мл/кг не оказывает существенного влияния на структурно-функциональное состояние эритроцитов и их мембран.

7. Перфторан, введенный животным через 30 мин после острого отравления, снижает тяжесть мембранотоксического эффекта метафоса, повышает устойчивость эритроцитарпой мембраны к повреждающему действию метафоса и оказывает корригирующий эффект на метаболизм эритроцитов.

Мембранотропное действие перфторана проявляется в увеличении кислотной резистентности эритроцитов, уменьшении внеэритроцитарного гемоглобина и активности гшокозо-6-Ф-ДГ в плазме крови, а также молекул средней массы в плазме крови.

8. Корригирующий эффект перфторана на метаболизм эритроцитов после пероралыюго введения метафоса заключается в нормализации уровня АТФ, 2,3-ДФГ,НФ, а также в увеличении активности N3, К-АТФазы и глю-козо-6-Ф-ДГ в эритроцитах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВAIП1ЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Влияние метафоса на физико-химические свойства эритроцитов (Волжина Н.Г., Магомедов М.А., Магомедова З.М.).-//Матер. XIII научно-практ. конф. по охране природы Дагестана.-Махачкала, 1995. -С. 125-127.

2. Биохимическая характеристика эритроцитов при острой кровопоте-ре и введении перфторана (Волжина Н.Г., Магом едой а З.М., Билалов Ф.И.).-//Всероссийская научно-практич. конф., посвященная 75-летию проф. Р.П. Аскерханова. Тез. докл.-Махачкала, 1995.-С. 210 -212.

3. Интегральные показатели структурно-функционального состояния мембран эритроцитов при остром отравлении метафосом//Матер. научной конф. "Морфогенез, курортные и физические факторы.-Махачкала, 1996.-С. 42-44.

4. Структурно-функциональное состояние эритроцитов при остром отравлении метафосом (Волжина Н.Г., Магомедова З.М., Билалов Ф.И.).-//Матср. научи, конф. "Морфогенез, курортные и физические факторы".-Махачкала, 1996.-С.39-42.

5. Влияние метафоса на кислотную резистентность эритроци-тов//Химшси Северного Кавказа — производству. Тез. докл. 40-ой региональной конф. - Махачкала, 1996.-С. 140-141.

6. Молекулы средней массы в плазме крови при остром отравлении метафосом (Волжина Н.Г.).-//Химики Северного Кавказа — производству. Тез. докл. 4-ой региональной конф.-Махачкала, 1996.- С. 137-138.

7. Влияние перфторана на физико-химические свойства эритроцитов (Магомедова З.М.).-//54 научи, конф. студентов и молодых ученых ДГМА. Тез. докл.-Махачкала, 1997.-С. 22.

8. Активность Na, К-АТФазы в эритроцитах и их мембранах при остром отравлении метафосом и введении перфторана/ЛДентр научно-технической информации РД.- Махачкала, 1997.- 11 с.

9. Среднемолекулярные пептиды в крови при кровопотере и введении перфторана (Эфендиева И.В.).-//54 научи, конф. студентов и молодых ученых ДГМА. Тез. докл.- Махачкала, 1997.- С. 12-13.

10. Особенности изменения химического состава крови при остром отравлении метафосом//Труды Всерос. конф. по физико-химическому анализу многокомпонентных систем.- Махачкала, 1997. С. 45-46.

11. Молекулы средней массы в плазме крови при острой кровопотере и введение перфторана (Эфендиева).-/ЛГез. докл. юбилейной межвуз. конф., посвящен. 65-летию ДГУ,- Махачкала, 1997.- С. 149-150.

12. Влияние метафоса на активность Na, К-АТФазы в эритроци-тов//Матер. междунар. конф. "Прикладные и фундаментальные вопросы анатомии, лимфологии и сердечно-сосудистой системы".-Махачкала, 1997.- С. 12-14.

13. Биохимические изменения в крови при плеторическом введении перфторана (Волжина Н.Г., Газимагомедова М.М., Курбанов К.З.).-//Всеармейская научн. конф.-"Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в военной медицине".-Тез. докл.- Санкт-Петербург, 1997.-С. 17-19.

14. Корригирующий эффект перфторана на структурно-функциональные изменения эритроцитов при остром отравлении метафосом (Волжина Н.Г., Газимагомедова М.М.).-//Всеармейская научн. конф.-"Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в военной медицине".- Тез. докл.- Санкт-Петербург, 1997.- С. 19-20.