Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные изменения мембран эритроцитов при остром отравлении метафосом и их коррекция перфтораном

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Газимагомедова, Мадинат Магомедовна, Махачкала

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ДАГЕСТАНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

ГАЗИМАГОМЕДОВА МАДИНАТ МАГОМЕДОВНА

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ОСТРОМ ОТРАВЛЕНИИ МЕТАФОСОМ И ИХ КОРРЕКЦИЯ ПЕРФТОРАНОМ

03.00.04 - «биохимия»

На правах рукописи

Научный руководитель -доктор биологических наук, профессор Волжина Н. Г.

Махачкала 1999 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение

Глава I. Литературный обзор. Биохимические механизмы токсического

действия фосфорорганических соединений_ 8

I. 1.1. Антихолинэстеразный механизм действия фосфорорганических

соединений_ 8

I. 1.2. Влияние ФОС на структурно-функциональное состояние мембран_ 19

I. 2. Биологическое действие перфторорганических соединений и их

взаимодействие с мембранами_ 25

Глава II. Материалы и методы исследования_ 41

II. 1. Экспериментальные модели и состояние экспериментальных

животных_ 41

II. 2. Выделение мембран эритроцитов_ 42

II. 3. Определение активности ацетилхолинестеразы мембран

эритроцитов_ 43

II. 4. Определение окислительной модификации белков сыворотки

крови_ 44

II. 5. Определение суммарной пероксидазной активности_ 45

II 6. Определение концентрации свободного гемоглобина

в плазме крови_ 45

II. 7. Определение деформируемости эритроцитов_ 46

II. 8. Определение компонентов тиол-дисульфидной системы

в плазме крови и мембранах эритроцитов_ 47

И. 9. Статистическая обработка экспериментальных данных_ 48

Глава III. Активность ацетилхолинэстеразы при остром отравлении

метафосом и введении перфторана_ 50

Глава IV. Тиоловые соединения при остром отравлении метафосом

Стр. 4

и введении перфторана_ 55

IV. 1. Состояние тиолдисульфидной системы в белках мембран

эритроцитов при интоксикации метафосом и введении перфторана_ 55

IV. 2. Состояние тиоловой системы плазмы крови при отравлении

метафосом и введении перфторана_ 62

Глава V. Окислительная модификация белков сыворотки крови

при остром отравлении метафосом и введении перфторана_ 69

Глава VI. Суммарная пероксидазная активность и содержание внеэритроцитарного гемоглобина в плазме крови при интоксикации

метафосом и введении перфторана_ 84

Глава VII. Деформируемость эритроцитов при остром отравлении

метафосом и введении перфторана_ 89

Заключение_ 95

Выводы__ 114

Список литературы__116

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АОЗ - антиоксидантная защита

АОС - антиоксидантная система

АТХ - ацетилтиохолин йодид

АФК - активные формы кислорода

АХЭ - ацетилхолинэстераза

ВЭГ - внеэритроцитарный гемоглобин

ДТНБ - динитробензойная кислота

МДА - малоновый диальдегид

МСМ - молекулы средней массы

СПА - суммарная пероксидазная активность

СРО - свободнорадикальное окисление

ТХ - тиохолин

ПОЛ - перекисное окисление липидов ПФОС - перфторорганические соединения ФОС - фосфорорганические соединения

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Общеизвестно, что пестициды занимают одно из первых мест среди различных загрязнителей окружающей среды. Воздействию пестицидами подвергаются практически все организмы: от бактерии до человека. Среди пестицидов широкое распространение получили фосфороргани-ческие соединения (ФОС). К фосфорорганическим веществам относятся и боевые отравляющие вещества из группы «нервных ядов», имеющиеся на вооружении армии многих стран мира.

ФОС способны вызывать острые и хронические отравления, нарушения на всех уровнях регуляции - от молекулярного до организменного, изменять реактивность организма, ФОС обладают бластомогенными, нейротоксическими, тератогенными и мутагенными свойствами (Каган, 1977; 1981; Калоянова - Си-меонова, 1980).

В последние годы установлено, что кроме антихолинэстеразного действия, ФОС обладают мембранотоксическим эффектом (Контуш, 1991; Голубев, Кон-туш, 1991; Прозоровский и др., 1995, Ford et al., 1986; Clark, 1986). Одними из первых контактируют с ФОС после его проникновения в кровь эритроциты, поэтому исследования биохимических изменений в мембранах эритроцитов являются актуальными.

В детальных исследованиях Ю. С. Кагана и сотрудников (Каган и др., 1980; 1988; Каган, 1981, 1988) показана роль монооксигеназной системы в биотрансформации ксенобиотиков, а также выявлена индукция цитохрома Р450 при отравлениях ФОС. В связи с этим перспективным оказалось использование индукторов монооксигеназ для профилактики отравлений ФОС.

Одним из веществ способных влиять на индукцию монооксигеназных систем оказались перфторорганические соединения (ПФОС), плазмозаменители с газотранспортной функцией (Образцов и др., 1993; 1994; Михайлов и др., 1990; 1993). Было показано, что фторуглероды, растворяясь в гидрофобной области

мембран, образуют комплекс с ключевым ферментом монооксигеназной системы - цитохромом Р450. Такое взаимодействие вызывает существенные биохимические изменения в функционировании монооксигеназной системы, хотя факт гидроксилирования фторуглеродной молекулы не имеет места. Предполагается, что именно факт образования комплекса цитохрома Р450 - ПФОС может быть молекулярной основой разнообразных изменений, происходящих в организме животного после введения фторуглеродов. В печени начинается интенсивный синтез цитохрома Р-450, общее содержание которого увеличивается в 34 раза. Активация ферментов П-фазы биотрансформации ксенобиотиков: мик-росомальных УДФ - глюкуронилтрансферазы и глутатион Э-транферазы также имеет место. Вследствие индукции специфических ферментов происходит усиление детоксицирующей функции печени, наблюдаемой по скорости выведения лекарств из кровотока или по увеличению устойчивости животных к действию некоторых ядов (Михайлов, 1990.). Описанные эффекты ПФОС и позволили нам использовать перфторан при экспериментальном отравлении животных одним из представителей ФОС - метафосом.

Цель исследования

Изучить изменения структурно-функционального состояния мембран эритроцитов при остром отравлении метафосом и их коррекции перфтораном - кровезаменителем, обладающим газотранспортной функцией.

Задачи исследования:

1. Исследовать при остром отравлении метафосом в дозе ЛД50 структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов, изучая следующие параметры:

а) активность ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов;

б) компоненты тиолдисульфидного обмена мембран эритроцитов;

в) Суммарная пероксидазная активность и содержание внеэритроцитарно-

го гемоглобина в плазме крови как интегральные показатели стойкости

эритроцитов;

г) определение деформируемости эритроцитов.

2. Определить показатели тиолдисульфидного обмена в плазме крови при интоксикации метафосом.

3. Выяснить особенности окислительной модификации белков сыворотки крови при остром отравлении метафосом.

4. Обосновать возможность применения перфторана для коррекции структурно-функциональных изменений мембран эритроцитов при остром отравлении метафосом.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Мембранотоксический эффект метафоса в дозе ЛД50 проявляется в угнетении активности АХЭ мембран эритроцитов, увеличении в плазме крови ВЭГ и СПА, перестройке белков мембран эритроцитов, уменьшении деформируемости эритроцитов.

2. При остром отравлении метафосом в дозе ЛД50 происходят структурные изменения белков сыворотки крови, о чем свидетельствуют нарушения их окислительной модификации и изменение в них соотношения количества сульфгидрильных групп и дисульфидных связей.

3. Перфторан, введенный животным после острого отравления метафосом в дозе ЛД5о, оказывает корригирующий эффект на структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов.

Научная новизна

1. Впервые выявлено, что через 30 минут после острого отравления метафосом активируются процессы окислительной модификации белков сыворотки крови.

2. Получены новые данные об изменении компонентов тиол-дисульфид-ного обмена в плазме крови при остром отравлении метафосом в дозе

ЛД50.

3. Впервые установлено, что введение перфторана в ранний период после острого отравления метафосом оказывает нормализующее влияние на структурно-функциональные изменения мембран эритроцитов.

4. Впервые показано, что перфторан способствует эффективному восстановлению нарушенного метафосом тиол-дисульфидного обмена в плазме крови, а также уменьшает окислительную модификацию белков плазмы крови.

Научно-практическое значение работы:

В теоретическом плане полученные результаты расширяют существующее представление о молекулярных механизмах мембранотоксического эффекта метафоса. На основании полученных данных могут быть проведены прикладные исследования по использованию мембранопротекторов для коррекции структурно-функциональных изменений мембран эритроцитов при острых отравлениях ФОС.

Исследование интегральных показателей стойкости мембран эритроцитов - внеэритроцитарного гемоглобина и суммарной пероксидазной активности -могут быть информативным критерием для оценки глубины повреждений при острых отравлениях ФОС, а также служить оценкой эффективности проводимой терапии.

Материалы исследования указывают на перспективность применения перфторана в общем комплексе профилактических и лечебных мероприятий в клинике острых отравлений ФОС и с другими мембранотоксическими веществами.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены на: Всероссийской научной конференции, посвященной 75-летию проф. Р. П. Аскерханова (Махачкала, 1995), итоговой научной конференции ДГУ (Махачкала, 1997), Всероссийской конференции по физико-химическому анализу многокомпонентных систем (Махачкала, 1997), Всеармейской научной конференции «Физиологически

активные вещества на основе перфторуглеродов в военной медицине» (Санкт-Петербург, 1997), Международной конференции «Прикладные и фундаментальные вопросы анатомии, лимфологии и сердечно-сосудистой системы» (Махачкала, 1997).

Глава I.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Биохимические механизмы токсического действия фосфорорганических соединений

I 1. Антихолинэстеразный механизм действия фосфорорганических

соединений

Фосфорорганические соединения (ФОС) нашли широкое применение в качестве инсектицидов, акарицидов, пестицидов, фунгицидов, гербицидов, дефолиантов, десикантов. К ФОС относятся и боевые отравляющие вещества из группы нервных ядов, имеющиеся на вооружении армий многих стран мира. Широкое практическое применение получили пестициды, более 80 пестицидов относится к ФОС. В Российской Федерации широкое распространение получили хлорофос, метафос, фозолон, фталофос, ДДВФ, метилнитрофос и другие ФОС.

Все ФОС являются эфирами фосфорной кислоты и делятся на следующие группы:

- эфиры монотиофосфорной кислоты - метафос, метилэтилтиофос, метилнитрофос, трихлорметафос;

- эфиры дитиофосфорной кислоты - октометиламид и др.;

- амиды пирофосфорной кислоты - хлорофос, дихлордивинил.

Общая формула ФОС -

где Я} и Я2 - различные или одинаковые алкилы, алкоксилы, алкиламины, х -остаток органической или неорганической кислоты (галогены, цианогруппы, остаток нитрофенола, у многих ФОС - остаток замещенной фосфорной кислоты.

Фосфорорганические соединения, применяемые в качестве пестицидов, представляют собой либо твердые кристаллические вещества, либо прозрачные или желтовато- коричневые, часто маслянистые жидкости. Многие из них имеют неприятный специфический запах. Большинство ФОС тяжелее воды; их плотность находится в пределах от 1,1 до 1,7. ФОС хорошо растворимы в органических растворителях - ксилоле, толуоле, ацетоне, хлороформе и др. и плохо растворимы в воде. Некоторые препараты (кильвал, демуфос, метилацетофос, октаметил, хлорофос) растворимы также в воде. Высокий коэффициент распределения большинства ФОС между маслом и водой обуславливает их проникновение через различные биологические мембраны, хорошую резорбцию через неповрежденную кожу, проникновение в мозг через гематоэнцефалический барьер (Мельников 1987, Мельников и др., 1995).

ФОС могут поступать в организм через рот, кожу, дыхательные пути. При пероральном поступлении всасывание начинается уже в полости рта, затем в желудке и тонкой кишке. Препараты быстро проникают в кровоток через гематоэнцефалический и гематопаренхиматозный барьеры - во все органы и ткани, где распределяются довольно равномерно. Несколько более высокие концентрации могут определяться в почках, печени, легких, кишечнике (Лужников,

Наиболее широкое применение в сельском хозяйстве нашли производные монотиофосфорной кислоты, к которым и относится метафос.

Метафос (метилпаратион, вофатокс) имеет систематическое название 0,0 - диметил - 4-нитрофенилтиофосфат и следующую формулу

1994).

N0

Метафос - белое кристаллическое вещество температура плавления, которого 36-36,5; t кипения 158 градусов при 2 мм рт. ст., плотность 1,3518, коэффициент преломления 1.5600. Практически нерастворим в воде, плохо растворим в керосине и других нефтепродуктах. Метафос термически и фотохимически не стоек, вследствии чего продолжительность действия его в полевых условиях меньше, чем у других ФОС.

Метафос полностью разрушается в почве в течение 15-20 дней, превращаясь в простейшие соединения С02и Н3РО4 (Мельников, 1993).

На практике наиболее часто встречаются с пероральными отравлениями ФОС, в том числе и с метафосом. При таких отравлениях различают 3 стадии (Лужников, 1994).

1 стадия- возбуждение. Наблюдается при начальных симптомах отравления. Вскоре после воздействия токсичного вещества (как правило, через 15-20 минут) больные отмечают головокружение, снижение остроты зрения, тошноту. Возможно психомоторное возбуждение (чувство страха, агрессивность). Отмечается также умеренный миоз и потливость. Появляется рвота и спастические боли в животе, повышенное артериальное давление и умеренная тахикардия.

2 стадия - гиперкинезы и судороги - характеризуется полностью развившейся картиной отравления. Психомоторное возбуждение при этом сохраняется или постепенно сменяется заторможенностью. Характерен выраженный миоз с отсутствием реакции зрачков на свет. Отличительными симптомами данной стадии отравления является миофибриляции, которые появляются в области век, мимической мускулатуры лица, мышц груди и голеней. Периодически возникают общий гипертонус мышц, тонические судороги, изменяется также частота сердечных сокращений. Повышение артериального давления у людей достигает максимального значения (250/ 160мм рт.ст). Затем наступает снижение сердечно-сосудистой деятельности.

3 стадия - параличи. В подавляющем большинстве случаев больные находятся в коматозном состоянии, протекающем с резким ослаблением всех рефлексов или полной арефлексией. Преобладают центральные формы угнетения дыхания, и развивается экзотоксический шок. Максимально урежается выраженная тахикардия (более 120 в минуту).

Первичным биохимическим эффектом действия связанный с токсичностью, вызванными ФОС, является ингибирование АХЭ. (Ганжара, Новиков, 1979; Каган, 1981; Лужников, 1994; Harlin, Delinger, 1994; Karalliedde, Henry, 1993 и др.). Обычная функция АХЭ заключается в ограничении нейротранс-миссии под действием ацетилхолина (АХ), выделяющегося в окончаниях холи-нэргических нервов в результате реакции на нервные раздражители. Потеря активности АХЭ может привести к различному спектру эффектов вследствии избыточного нервного раздражения, наиболее выраженным из которых является паралич дыхания и смерть.

АХЭ состоит из четырех, идентичных полипептидных цепей с М 80000. Каждая цепь имеет активный центр и один или более периферических, видимо, регуляторных, связывающих участков (Хухо, 1990). Активный центр содержит анионный участок, который связывает положительно заряженную четвертичную аммониевую группу субстрата, и реакционный участок, катализирующий гидролиз сложноэфирной связи ацетилхолина (рис. 1). Функциональной группой, ответственной за гидролиз, здесь ОН-группа остатка серина, нуклеофиль-ные свойства которой усиливаются имидазольным кольцом соседнего остатка гистидина. Нуклеофильная атака сериновой группой ОН приводит к ацетили-рованию фермента. Скорость этой многостадийной реакции определяет стадия деацетилирования белка с образованием свободного фермента (Хухо, 1990; Main, 1979, Абдулвахабов и др., 1989). В непосредственной близости к анионному участку расположены гидрофобные аминокислотные остатки, создающие безводное окружение для трех метальных групп, связанных с атомом азота ацетилхолина.

Ацетилхолинестераза

V

аниочиии уюсЬк дгоеть*

вепон

штшшт

унш/мшт

сиг. - СИггО-С^О

¿43

мшнтт

кепок

Шттпш

Ъшмтт

Фермент - субстратный комплекс

«I»

ШШШШ

(Ши&шыЪ ушеЬм

-хппии

V

-пцетг шшть

моя Г^ ^ 'шштшт о \

шш

Рис. Схема действия ацетилхолинестеразы. В эстсразном участке атом кислорода остатка серии а (-СН.ОН) Находится около нуклеофильной группы (В) остался гистидина.

Гидрофобные взаимодействия между ферментом и этим�