Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства транспортных АТФаз в различных мембранных препаратах эритроцитов человека и крысы в норме и при первичной артериальной гипертензии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Свойства транспортных АТФаз в различных мембранных препаратах эритроцитов человека и крысы в норме и при первичной артериальной гипертензии"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ _Г г.7 ,л -,"м- И. М. СЕЧЕНОВА_

■ На правах рукописи

УДК 616.12—008.331 1:557.152.3

ОГОРОДНИКОВА

Людмила Евгеньевна

СВОЙСТВА ТРАНСПОРТНЫХ АТФаз В РАЗЛИЧНЫХ

МЕМБРАННЫХ ПРЕПАРАТАХ, ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И КРЫСЫ В НОРМЕ И ПРИ ПЕРВИЧНОЙ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ

Специальность: 03.00.04 — Биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

Работа выполнена в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН.

Научный руководитель — доктор биологических наук А. М. Казенное.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В. П. Нестеров; кандидат биологических наук Н. В. Кулева.

Ведущая организация — Институт кардиологии МЗ России, г. Санкт-Петербург.

на заседании Специализированного ученого совета К.002.89.01 при ИЭФиБ им. И. М. Сеченова РАН (194223, г. Санкт-Петербург, пр. Мориса Тореза, 44).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭФиБ им. И. М. Сеченова РАН.

/•Г /<¿-/¿2 Автореферат разослан « » 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

Защита состоится

1994 г. в

часов

К.002.89.01, кандидат биологических наук

Л. В. Зуева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На,К-АТФаза плазматических мембран клеток животных представляет собой систему активного транспорта На+ и К+. Используя энергию гидролиза АТФ фермент осуществляет трансмекбранннй перенос одновалентных катионов против градиента их электрохимических потенциалов, обеспечивая таким образом по-.стоянство неравновесного распределения этих ионов ие.вду клеткой й средой /Болдырев, 1990/.

Многочисленные исследования природы Наг-насоса привели к достаточно полному представлению о структуре и механизме действия фермента. Фермент является интегральным белком плазматической мембраны клеток и находится в тесной пространственной и функциональной взаимосвязи с другими мембранными .белками. Так, были получены доказательства взаимодействия Йа,К-АТФазы с периферическим белком мембранного скелета анкйрином / Nelson et al.f 1991/, установлена связь с анионным переносчиком - белком полосы 3 / Janoshazi, . 1989/, а также выявлено рёгуляторное влияние на активность фермента спектрин-актинового комплекса /Казеннов', Маслова, 1991/.

В последние годы бшго высказано мнение, что На,К-АТФаза может являться клеточным рецептором и мишеНыо действия эндогенных дигоксин-подобных факторов /ЭДФ/, циркулирующих в плазме крови животных и людей. Повышенное содержание ЭДФ было Найдено при различных патофизиологических состояниях, включая артериальную ги~ пертензию различного происхождения /Мао Gregor, detVardener, 1984/. Было обнаружено, что ЭДФ-являются специфическими, высокоафинными ингибиторами работы На,К-АТФазы и могут регулировать работу фермента разных клеток при этой патологии. Данные о наличии этих ингибиторов в организме животных и Людей в предгипертензивный период / Воsohl et al.,1989/ подразумевают изменение активности фермента уже на начальных этапах формирования этого заболевания.

С другой стороны, рядом исследователей были получены доказательства наличия определенных структурных и функциональных нару-иений в мембранном скелете эритроцитов при первичной АГ. В частности, было показано увеличение содержания белка полосы 3 в мембране эритроцитов у крыс shr /гулак и соа'вт., 1984/ и белков

п.4.5 и 6 в мембране эритроцитов больных гипертонической болезнью /ГБ/ / ьов1поу еЪ а1., 1989/, выявлены изменения в процессах фо сформирования белка п.4.1 в мембране оритроцитов у крыс Л-1 R / РобЪпоу et а1., 1986/. :

- Исходя из вышесказанного, представляется вероятным сущестьо-вание взашосвязи между белками мембранного скелета и На,К-АТФазой, которая, по-видимому, нарушена при АГ, что может приводить к определенным изменениям в работе фермента при этой патологии. Все это вызывает несомненный интерес к изучению активности и свойств Ыа,К~ АТФазы при первичной АГ и определило наши цели и задачи исследования. 1

Пели и задачи исследования. Цель данной работы - исследование регулирующего влияния белков мембранного скелета эритроцитов на функционирование Ша,К-АТФазы. Были поставлены следующие задачи:

1. Поиск оптимальных условий для выявления наибольшей активности На,К-АТФазы в мембранных препаратах эритроцитов с различным полипептидным составом.

2. Исследование регулирующего влияния периферических белков мембранного скелета на активность и свойства На,К-АТФазы.

Помимо изучения особенностей работы На,К-АТ®азы в норме, было предпринято исследование активности и свойств этого фермента при первичной ДГ. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучение активности и свойств На.К-А'х^азы в цельных эритроцитах у лиц с пограничной артериальной гипертензией /ПАГ/

и у людей с наследственной предрасположенностью к гипертонической болезни /ГБ/.

2. Исследование активности и свойств На,К- , Са- и М^-АТФаз в мембранных препаратах эритроцитов с различным полипептидным составом у крыс со спонтанной гипертензией / ШД /, у лиц

с ПАГ и у больных ГБ. Научная новизна. Впервые проведено'изучение активности и свойств На,К-АТФазы в 'мембранных препаратах эритроцитов с различным полипептидным составом: тени эритроцитов, "бесспектриновые" везикулы /мембраны, лишенные спектрина и актина/ и везикулы со "снятши~полосами~спектрша"й актина, белка'п.2.1 и 4.1. Показано, чтЬ"Удаление этих периферических белков из мембраны эритроцитов сопровождается онижением активности На,К-АТФазы и потерей чувстви-

тельности фермента к модуляторам его работы. •

Впервые определены оптимальные условия дда выявления наиболь-' шей активности Яа,К-АТФазы в мембранных препаратах эритроцитов с различным полипептидннм составом. Показано, что для определения наибольшей активности фермента необходимо.одновременное воздействие на эритроцитарнуя мембрану хелаторов и детергентов.

При изучении активности На.К-АТФазы в мембранных препаратах эритроцитов с различным полипептидным составом у спонтанно гипер-т.ензквных крыс и у людей на разных стадиях развития ГВ показано участие белков мембранного скелета эритроцитов в нарушении работы На.К-АТФазы при первичной АГ.

. ■ Впервые получены данные, свидетельствующие о пониженной активности Яа.К-АТФазы в эритроцитах у лиц с ПАГ и с наследственной отягощенностыо по ГБ.-Показано, что снижение активности Жа,К-АТФазы у людей в период развития АГ обусловлено присутствием у них в плазме крови эндогенных дигоксин-подобных факторов, ингиби-рующих активность На,К~АТФаэы в мембрана. ■

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные, свидетельствующие о важной роли белков мембранного скелета эритроцитов в функционировании интегральных мембранных ферментоз, позволяют углубить наши представления о механизмах регуляции транспортных АТФаз и, в частности, двухвалентными катионами, метаболитами и рэгуляторными белками.

Результаты исследований влияния мембранотропннх соединений на активность и свойства транспортных АТФаз в эритроцитах позволили выработать.подходы выявления высокой активности На.К-АТФазы В мембранных препаратах эритроцитов с различным полипептидным составом.

Изучение активности На,К-АТФазы у лиц в различные периоды развития гипертонической болезни позволило выявить определенные отличия в работе На.К-АТФазы у лиц с пограничной артериальной ги-яеруензией и разработать "Способ диагностики предрасположенности к развитию гипертонической болезни". Подана заявка на признание метода изобретением и получен приоритет за № 1833220114, 60471 от 31.09.1990 г.

Основные положения, выносимые на защиту: ■

1. Установлено разное активирующее влияние детергентов и хела-торов на активность На,К-АТФазы в мембранных препаратах эритроцитов с различным полипептидным составом.

2. Показана важная роль мембранного скелета эритроцитов в функционировании систем активного транспорта катионов /На,К-АТФазы

и Са-АТФазы/ в передаче модулирующего действия внутриклеточных регуляторов активности ферментов - Mç2+, Са2+ и АТФ.

3. Продемонстрировано, что у людей с наследственной отягощен-ностью по ГБ и с пограничной артериальной гипертензией /ПАТ/ имеет место пониженная активность На,К-АТФаэы в целых эритроцитах по сравнению с нормотензивными лицами .без Генетической предрасположенности к атому заболеванию.

4. Установлена высокая ингибирующая На.К'-АТФазную активность способность плазмы крови лиц о ПАГ по сравнению-с плазмой контроля, что обусловлено присутствием у лиц с ПАГ повышенного содержания эндогенных ингибиторов фермента, очевидно ЭДФ, и свидетельствует о важной патогенетической роли ЭДФ на начальном периоде заболевания.

Апробация диссертации. Результаты работы докладывались на: Рабочих совещаниях по проблеме "Тонус" /1992, 1993 Санкт-Петербург/; ца симпозиуме по проблемам патогенеза артериальной гипертензии и атеросклероза /Новосибирск, 1992/; на рабочем совещании по государственной общеакадемической программе "Обеспечение жизнедеятельности человека в процессе трудовой деятельности на основе вскрытой фундаментальных физиологических закономерностей" /Санкт-Петербург, 1990/; на заседании Санкт-Петербургского кардиологического общества им. Г.Ф.Ланге /Санкт-Петербург, 1991/; на годовых итоговых научно-практических конференциях больницы Мб и клиник Санкт-Петербургского Педиатрического Медицинского Института /Санкт- ' Петербург, 1991/. ''

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы /3 главы/, описания методов исследования, экспериментальной части /3 главы/, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 186 страниц машинописного текста, 3 таблицы и 18 рисунков. Библиография включает 180 литературных источников, в том числе 155 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССВДОВАНИЯ

Работа была выполнена на эритроцитах., полученных от крыс-самцов линий Вистар, Вистар-Киото / №КХ / и Окамото-Аоки /БНЯ /. Ряд экспериментов проводился на эритроцитах здоровых людей, а-также на эритроцитах, полученных от лиц с пограничной артериальной I гипертензией / ПАГ/ и с наследственной предрасположенностью к развитию гипертонической болезни / ГБ /.

Б работе были использованы крысы в возрасте 13-14 недель /3 мес./ линий Вистар и \vicr /с массой тела 220-240 г./ и 5НЯ /с массой тела 280-300 г./. Среднее артериальное давление- в группе крыс №КХ составляло 122±4 мм рт.ст. и в группе ВНН _ 1б5±4 мм рт.ст,

В ходе экспериментов было обследовано 34 человека о ПАГ, 26 нормотензивных людей о генетической предрасположенностью к ГБ и 21 здоровый человек с артериальным давлением не выше 130/85 мм рт.ст. и без наследственной предрасположенности по ГБ. '•'

Бее обследованные были мужчиннми в возрасте от 18 до 30 лет. ' Диагноз ПАГ устанавливали по критериям ВОЗ. Клиническое обследо-" вание бьше проведено на базе кафедры внутренних болезней №2 Санкт-Петербургского Педиатрического Института и студенческой больницы под руководством к.м.н. Ю.С.Титкова. Все лица с ПАГ прошш обследование в условиях стационара на предмет исключения вторичных форм артериальных гипертензий. В день забора крови проводился клинический осмотр исследуемых лиц.

Забор крови у людей проводили из локтевой вены утром натощак. Для получения крови у крыс животных декапитировали. В качестве антикоагулянта использовали гепарин /150-200 ед/мл/. Все исследования проводили в день забора крови. .

Для получения эритроцитов кровь центрифугировали при 300 д в течение 5 мин., плазму и лейкоцитарную пленку удаляли. Эритроциты промывали триады охлажденным изотоническим раствором 0,145 И НаС1 в 0,02 М тряс-НС1-буфере, рН 7,6 при 25°С.

Мембранные препараты эритроцитов /тени/ получали с помощью гипоосмотического гемолиза по принципу Боё^е "еь а1. /1963/. В качестве гемолиЗируотцей среды использовали 10 р^Л трис-НС1-буфер /рН 7,6 при 25°С/, содержащий 1 мМЭДТА, в соотношении к эритро-

цитам 20,1,

"Бесспектриновые" везикулы получали по методу steck 8с Kant /1974/ путем инкубации свежеприготовленных теней в- среде с низкой ионной силой /в 10 объемах 1 мМ трис-НС1-буфера /рН 7,6// в течение 30 мин. при 37°С, после чего, мембраны осаждали и дважды промывали в 10 мМ трис-НС1-буфере /рЙ 7,6/.

Снятие белков п.2.1 и 4.1 с "бесспектриновых" везикул про- . ВОДИЛИ ПО методу Hargrievs et al. / Hargrievs et al., 1980/ в нашей модификации, Полученные "бесспектриновые" везикулы смешивали с навеской сухого К01, так что конечная концентрация этого раствора составляла 1 М раствор. После чего препараты инкубировали с течение 30 мин. в термостате при 37°С и дважды промывали 10 мМ трис-НС1-бу$ером /рН 7,6/, каждый раз предварительно центрифугируя в. течение 1Q мин. при 20000 об/мин.

Электрофорез"белков теней," '"бесспектриновых" везикул проводили по методу. Fairbanks' /1971/ с небольшими изменениями.

Предишсубацшо целых эритроцитов и их мембранных препаратов проводили с детергентом твином-20 при.комнатной температуре в течение 30-60 мин.

Определение активности транспортных АТФаз проводили в среде инкубации, содержащей/ мМ /: HaUl - 100, ,КС1 - 10, трис-HCl - 50, АТФ - 2, MgClg - 3, ЗДТА - 0,5. В.зависимости от целей эксперимента в ряде опытов концентрацию компонентов изменяли. Для выявления Са-АТФазной активности в среду вводили СаС12 в различных концентрациях. Температура инкубации составляла 37° или 44°С. Активность АТФаз рассчитывали по приросту неорганического фосфата / Фн/, содержание Которого определяли модифицированным методом chsn а1 /1957/. Активность На,К-АТФазы рассчитывали по разнице между АТФ азной активностью в отсутствие и в присутствии 1 мМ уабаина, -ак- ' тивность Са-АТФазы - по разнице в активности в присутствии и в отсутствие Са^+ в инкубационной среде. Активность Мд-АТФазы определяли в присутствии уабаина.

Активность АТФаз -выражали в мкмоль Фд/час на мг белка в случае, мембранных препаратов эритроцитов и в мкмоль Фн/час на 1 мл упакованных клеток В случае целых эритроцитов.' Гематокрит определяй после стмдзкк эритроцитов от плазмы в стеклянных капилярах на центрифуге ТН-12 при 12000 об/шн.

Определение активности фосфатаз осуществляли как описано Fiatman & Lew /1980/ с использованием в качестве субстра-

та паранитрофенилфосфата /п-НФФ/. В состав инкубационной среды входили /в «/: На+- 10, К+- 100, трис-НС1 - 50, 6, ЭДТА - '

0,5, пНФФ - 10. В ряде экспериментов в состав инкубационной среды вводили CaClg в различных концентрациях. Активность фосфатаз рассчитывали по приросту п-нитрофенола. Активность- уабаин-чувсг-витвльной К-фосфатазы рассчитывали по разнице мезду активностью фермента в отсутствие и в присутствии 1 Ш уабаина.

Содержание белка в пробах определяли методом lowry et ai. /1951/.

, .. Определение процента ингибирования активности Па,К-АТФазы в цельных эритроцитах здоровых людей плазмой от лиц с ПАТ и больных ГБ было сделано методом Умеда и соавт, / umeda et al,, 1987/ с небольшими изменениями. '

Использовали стандартные метода статистической обработки результатов.

■ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ »

1. Сравнительное исследование свойств На,К-АТФазы в мембранных препаратах эритроцитов крысы с различным полипептид-• шел составом

Изучение механизмов работы и регуляции транспортных АТФаз на уровне отдельных клеток актуально в теоретическом аспекте, а также имеет практическое значение в плане поиска возможных нарушений этих механизмов при некоторых патологических состояниях, связанных с изменением ионного гомеостаза. Учитывая немногочисленные литературные данные последних лет о существований структурных и функциональных взаимосвязей На,К-АТФазы с окружающими этот фермент белками, дальнейшие исследования в этом направлении представляют несомненный интерес, так как позволяют углубить наши представления о путях регуляции активности этих ферментов в норме и при патологии.

Одним из методических подходов для таких исследований является сравнительное изучение свойств транспортных АТФаз в мембра-

нах безъядерных эритроцитов с различным полипептидным составом, полученных путем избирательного удаления из них тех или иных периферических белков /Казеннов и соавт., 1990/, а также влияния на активность фермента внутриклеточных метаболитов и катионов, являющихся модуляторами работы ферментов.

В нашем исследовании были использованы три вида мембран эритроцитов крысы Вистар: тени - мембраны эритроцитов, отмытые . от внутриклеточного содержимого и сохранившие форму клеток и правильную ориентацию мембраны; мембраны, из которых были удалены белки мембранного .скелета епектрин и актин /везикулы-1/ и мембраны, лишенные, кроме того, анкирина /белок п.2.1/ и белка п.4.1 /везикулы-2/. установлено, что содержание общего белка в везику-лах-1 и в везикулах-2 составляло, соответственно, 50% и 30% по сравнению с тенями эритроцитов, причем в препаратах теней практически все мембраны имели правильную ориентацию» тогда как в препаратах везикул обоих видов около половины мембранных структур представляли собой вывернутые везикулы.

Несмотря на значительную потерю неинтегральных /периферических/ белков из мембраны эритроцитов крыс Вистар, удельная активность На,К-АТФазы / в расчете на мг белка/ была практически одинакова во всех трех мембранных препаратах, что свидетельствовало о снижещш активности фермента на единицу поверхности мембраны. Наглядно это видно на рис. 1, где ферментативная активность выражена в расчете на мл первоначально взятых клеток. Выявленное снижение активности На,К-АТФазы, по-видимому, не являлось следствием потери мембранного материала, т.к. при электрофоретическом исследовании не было обнаружено уменьшения содержания белка п.З, который является интегральным,

Дяя выявления латентной АТФазной активности в исследованных мембранных препаратах был использован "мягкий" неионный детергент тзин-20 /Казеннов и соавт. , 1986/. Показано," что достоверный прирост активности имел место лишь в^случае везикул-1, что позволяет сделать вывод о наиболее низкой проницаемости этого вида мембран для низкомолекулярных веществ. По-видимому, в тенях и везикулах--2 имеется относительно'свободный подход субстрата, ингибитора-уаЬсЦ-Нс; к катионов к соответствующим центрам фермента.

Представленные данные дают основание сделать вывод, что последовательное удаление периферических белков из теней эритроци-

до

после обработки 0,05% твином-20

Рис. 1. Активность На,К-АТФазы в тенях эритроцитов /1/, вези-кулах-1 /сняты белки: спектрин, актин/ /2/, везикулах -2 /сняты белки: спектрин, актин, п.2.1, 4.1/ /3/ до и после обработки мембранных препаратов 0,05% твином--20; п=6.

р<:0,05 '

4

8-1 3 ! 2

и 1 2 3 6 . 12 /ЩС12/,

Рис. 2. Зависимость активности На.К-АТФаэы от концентрации МуИд в среде инкубации в тенях эритроцитов /1/, "бесспектриновых" везикулах-1 /2/, и в везикулах-2 /3/; п=18.

тов крысы приводит к прогрессивному падению активности На,К-АТФ азы, что, очевидно, обусловлено снижением скорости гидролиза АТФ отдельными ферментными комплексами, а не уменьшением их количе-' ства. Возникает вопрос, как при этом изменяются свойства фермента!' и, в частности, чувствительность его к внутриклеточным модуляторам.

Было изучено влияние на активность Яа,К-АТФазы увеличиваю- . щихся концентраций М^2"1", что, как считают, изменяет соотношение форм фермента Е^ и Е2. На рис. 2 представлены данные зависимости активности фермента от концентрации NtyGlg Для трех изученных, видов мембранных препаратов, В случае теней эритроцитов обнаружена классическая зависимость / Flatman & Lew, 1980; Kazennov, 1987/ - ингибирование общей АТФазной активности при введении в среду М<^С12 в концентрациях, превышающих оптимальную /3 мМ/. В "бесспектриновых" везикулах имелр место смещение оптимума действия М§2+ в сторону более "низких его концентраций и исчезновение кнгибирующого влияния высоких концентраций катиона на фермент. Интересно, что в везикулах-2 модулирующее влияние на На,К-АТФазу вообще отсутствовало. Эти данные свидетельствуют о нарушении процесса конформадаонного перехода фермента Е^ - Eg под влиянием М§2+ после удаления спектрин-актиновой сети с внутренней поверхности мембраны и о потере чувствительности Иа,К-АТФазы к активирующему влиянию физиологических концентраций после снятия с мембраны анкирина и белка п.4,1.

Далее с использованием в качестве субстрата п-нитрофенилфо-сфата более подробно были изучены активность уабаин-чувствитель-ной К-фосфатазн, отражающей частную реакцию На.К-АТФазного цикла - фосфатазную, а также влияние на нее АТФ и Са2+. Одновременно, определялась уабаин-резистентная фосфатаза..Полученные данные /рис. 3/ подтвердили предположение о снижении количества фермента в конформации Ез после удаления спектрина и актина, т.к. имело место значительное онижение фосфатазной активности /на 65-70$/ более выраженное, чем общей'АТФазной активности /на 40$/. При •' этом, в случае теней, введение в инкубационную среду АТФ повышало активность фосфатазына 20$, а увеличение Са2+ на фоне АТФ Еи^аленпо япгибировало фосфатазную активность,' В "бесспектриновых" везикулах обнаруженные эффекты АТФ и Са2+ на фосфатазу от-

сутствовали.

Следует отметить, что в тенях эритроцитов Са-фосфатаза в отсутствие АТФ вообще не выявлялась; напротив,введение Са2+ в инкубационную среду сопровождалось отчетливым падением активности общей уабаин-резистентной фосфатазы /рис.3/. В присутствии АТФ определялась относительно высокая активность Са-фосфатазы /около 10 мкмоль п-НФ/час на мл клеток/ при концентрации CaClg - 1 ММ /около i мкМ • Са2+/. После удаления спектрин-актиновой сети Са-фэсфатазная активность падала болев чем в, 5 раз, т.е. в значительно большей степени, чем уабаин-чувствительная фосфатаза.

В последние годы рядом исследователей dwm получены докаэа-. тельства, что внутриклеточные фосфаты /АТФ, 2,3-ДФГ/ и двухвалентные катионы /Са2+, М$2+/ определяют физико-химическое состояние мембранного скелета через влияние на белок-белковые взаимо- 1 действия /см. обзоры Казеннов, Маслова, 1987; Bennett, 1989/. Упорядоченность упаковки периферических бёлков, образующих мембранный скелет эритроцита, достигается определенным оптимальным соотношением АТФ и Са2+ внутри клетки, которое является .'достаточно постоянной величиной. По-вйдимому, "оперативное" регулирование физических свойств мембранного скелета в ходе функционального цикла эритроцита осуществляется 2,3-ДФГ и М£2+. В пользу этого свидетельствуют данные о том, что их внутриклеточная концентрация имеет выраженные колебания в зависимости от степени оксигена-ции крови; концентрация М^2+ в 3 раза ниже, а концентрация 2,3-ДФГ. в 10 раз выше в артериальной крови по "сравнению с венозной / Bennett, 1989/. Известно, что самоассоциация мембранных белков определяется концентрацией как 2,3-ДФГ, так и М^АТФ / levin, 1991/, что отражается на процессах флуктуации мембраны и ее механических свойствах. В частности показано,/ Levin, 1991/, что удаление спектрин-актиновой сети из мембраны приводит к исчезновению колебательных процессов мембранной поверхности, индуцируемых М}2+ и АТФ.

Таким образом, прослеживается отчетливая связь между степенью насыщенности гемоглобина кислородом, концентрацией внутриклеточных модуляторов молекулярной организации мембранного скелета и физико-механическими свойствами мембраны в целом. Учитывая тес-

50

40

30 20

10

0

0 0,05 0,5

1,0 мМ,СаС1

2

0 0,05

Рис. 3. Зависимость активности уабаин-резистентной /а/ и уабаин-чувствительной /б/ паранитрофенилфосфатаз в тенях /Т/ и в "бесспектриновых" везикулах /В/ от концентрации СаС12 в среде инкубации /концентрация ЭДТА - 0,5 мМ/ у крыс Вистар в отсутствие / — /ив присутствии АТФ /---/.

60

50

40 •30

20 10

7 6

5

4 3

2

1 • О

О 0,05 0,5

А

IV

п—я-Т

1,0

1,0 гМ, СаС12 0 0,05 0,5

Рис. 4. Зависимость активности уабаин-резистентной /а/ и уабаин-чувствительной /б/ паранитрофенилфосфатаз в тенях /Т/ и в "бесспектриновых" везикулах /В/ от концентрации СаС12 в среде инкубации /концентрация ЭДТА - 0,5 мМ/ у крыс Вистар-Киото /1/ и ¿ИР- /2/ в отсутствие / — /ив присутствии 0,5 мМ АТФ /---/.

кую стерическую близость активных центров транспортных АТФаз и • белков мембранного скелета, а также данные о том, что спектрин в комплексе с актином-и белком п.4.1 обладает АТФазной, активностью / sato et al. , 1986/, можно 'предположить функциональную связь ферментов с белками мембранного скелета. Полученные наш данные свидетельствуют в пользу такого предположения. Однако, возможны разные объяснения результатов' исследования.

Возможно, что периферические белки мембранного скелета, а также анкирин вовлечены в ферментативные циклы транспортных' АТФ аз и через эти белки или специальные белки-регуляторы, связанные со скелетом, осуществляется передача- регулирующего влияния внутриклеточ21ьк фосфатов и двухвалентных катионов на работу' ферментов. Нельзя исключить также возможность того, что удаление белков мембранного скелета и якорного - белка анкирина, связывающего скелет с интегральными белками мембраны, в том числе и с jl- субьединицёй На,К-АТФазы, приводит с одной стороны к дестабилизации липидного•бислоя мембраны, а с Другой - к изменению внутримембранной упаковки ферментов и, как следствие, изменению их каталитических свойств.

Результаты данного раздела работы легли в основу дальнейших исследований по изучению особенностей функционирования транспортных АТФаз в эритроцитах людей и крыс с первичной артериальной гипертензией.

2. Влияние белков мембранного скелета эритроцитов на активность и свойства транспортных АТФаз у крыс с первичной артериальной гипертензией / бнй /.

При сравнительном исследовании активности На,К-АТФазы в мембранных препаратах эритроцитов с различным полипептидным составом /тени и "бесспектриновые" везикулы/.у крыс wky и sHfl было показано, что в тенях эритроцитов крыс shh активность На,К-АТФазы на 20$ выше, чем у крыс irá /соответственно 5,2±р,2 и 4,6д0,15 мкмоль Ф /час на мл/. Следует отметить, что введение в инкубационную среду ЭДТА достоверно повышало активность фермента лишь в случае нормотензивных крыс линии wky ; при этом исчезали различия в активности На,К-АТФаэы в тенях мезду этими линиями

крыо. Удаление спектрина и актина из теней эритроцитов крыс обеих линий сопровождалось падением ферментативной активности и исчезновением различий между крысами wkx и аня.

Изучение активности уабаин-чувствительной и уабаин-резистен-тной К-фосфатаз в тенях эритроцитов крыс WKY и SHH /рис. 4/ не выявило каких-либо существенных отличий в абсолютных активностях ферментов как в отсутствие, так и в присутствии АТФ. Однако, в случае уабаин-чувствительной фосфатазы присутствие в инкубационной среде 0,5 мМ АТФ в значительно большей степени повышало ферментативную активность у крыс WET , Чем у крыс SHM /соответственно на 65$ и 30/2/. В оптимальных условиях /0,5 мМ АТФ и 0,05 мМ СаС12/ прирост активности составлял соответственно 75$ и 47$, а при высокой концентрации кальция /0,5 мМ СаС12/ прирост /+30$/ шел место только у крыс Вистар-Киото.

Необходимо отметить, что по свойствам как уабаин-чувствительной, так и уабаин-резистентной фосфатаз крысы линий. WKÏ и ВНЕ выраженно отличались от нормотензивных крыс Вистар /рис. 3 и 4/. Так, активность уабаин-чувствительной фосфатазы у них в оптимальных условиях была в 1,7-1,8 раза выше, чем у крыс Вистар, а при увеличении концентрации CaClg снижалась в большей степени. После •удаления спектрин-актиновой сети из мембран активность фермента

у v/kï и shr снижалась приблизительно в такой же степени, что,

р..

и у крыс Вистар, а также исчезало ингибирующее действие Ca на ферментативную активность. Однако, если у крыс Вистар исчезало модулирующее /активирующее/ .влияние АТФ на ферментативную активность; то у крыс wky и SHß оно практически не изменялось. Этим уабаин-чувствительная'фосфатаза отличалась от общей уабаин-резистентной фосфатазы, свойства которой в "бесспектриновых" везикулах всех трех линий крыс, не отличались, несмотря на это в тенях они имели выраженные отличия как по абсолютной активности, . .так и по оптимальной концентрации кальция, которая для крыс WKY • и бнн : .была'значительно ниже, чем для крыс Вистар. Так, при концентрации СаС1£ в инкубационной среде 0,25-мМ в присутствии 0,5 мМ АТФ общая уабаан-резистентная фосфатаза была на 50% выше, а Са-фосфатаза в 2-раза выще у крыс 'ЛК1 и sur по сравнению с крысами Вистар.

Приведенные в данном разделе данные еще раз подтверждают

наши представления о том, что регуляция и, по-видимому, работа • транспортных АТФаз тесно связана с состоянием периферических белков мембранного скелета эритроцитов.крыс. Однако несомненно, у разных линий крыс имеются определенные различия, которые не всегда можно однозначно трактовать, Из литературы известно, что основными механизмами, регулирующими структурно-функциональное состояние мембранного скелета являются процессы фосфорилирования-дефос-форилирования мембранных белков'/ Bennett, 1990/, в которых ведущую роль играют АТФ и двухвалентные катионы. Принимая во внимание данные / Postnov et al., 1987/ об изменении процессов фос-форштрования белков мембранного скелета- эритроцитов у крыс^Цй, можно полагать, что имеющиеся нарушения в функциональном состоянии спектрина и связанных с ним других белков мембранного скелета у крыс .s Н R могут приводить к повышению скоростей фосфорилиро-вания этих белков АТФ и дефосфорилирования в результате Оа-зави-симой фосфатазной реакции / Maretzki, 1986/.

По-видимому, у обеих линий крыс / WKi и shh / имеются существенные сходные отличия от крыс Вистар в реактивности транспортных АТФаз по отношению к внутриклеточным модуляторам АТФ и Са2+ в силу особенностей свойств периферических белков и их структурной организации. Возможны также качественные или количественные отличия в содержании белковых модуляторов активности транспортных - Са-зависимых белков кальмодулина и кальнактина / zingst, 1988/, хотя это предположение менее вероятно, т.к. имеются данные о том, что практически весь кальмодулин вымывается при получении теней.

Отсутствие существенных различий в свойствах транспортных АТФаз в эритроцитах и их мембранных препаратах между крысами линий Wкг и SHR можно отнести за счёт биологической гетерогенности нормотензивных крыс wky /' Kurtz, 1987/. С другой стороны, следует отметить, что, хотя крысы WKI и являются классическим нормотензивным контролем для крыс' SHR , АД у них все же растет с возрастом, если сравнить с крысами Вистар. Поэтому возможно, что обнаруженные нами изменения активности и свойств уабаин-чувствительной фосфатазы и Са-фосфатазы отражают лишь компенсаторные механизмы, направленные на предуправдение развития гипертензии, которые у крыс wn более эффективны.

3. Характеристика Ка,К-АТФазы в эритроцитах и их мембранных препаратах у лвдей при формировании первичной артериальной гипертензии

Интерес к изучению транспортных АТФаз при ГБ у людей основан на современных представлениях о патогенезе этого заболевания на мембранноклеточном уровне. Результаты исследований последних 1015 лет и, предце всего, отечественных ученых / Постнов, Орлов, 1987/ дали основание полагать, что первичная артериальная гипер-тензия у человека и крыс развивается в результате наследственного генерализованного дефекта плазматических мембран, выражающегося в нарушениях структуры и катионтранспортных функций мембран. Нарушения структурной организации плазматических мембран, обнаруженные в предгипертензивный период заболевания / Jüevynck, 1982/, могут сопроводцаться изменением активности мембраносвязанных ферментов, в том числе и На,К-АТФазы. Между тем, ряд исследователей считает, что важную роль в патогенезе заболевания играют дигок-син-подобные факторы /ингибиторы/ На,К-АТФазы, циркулирующие в Крови, содержание КОТОрЫХ Возрастает при ГБ /blac Gregor, deWardener, 1987/. Действием этих эндогенных факторов объясняют пониженную активность На,К-АТФазы, которая была обнаружена в клетках разных органов, в том числе и в эритроцитах / itahman, 1986/.

Относительно малое число работ по изучению йа,К-АТФазы в начальном периоде развития ГБ побудило нас провести сравнительное исследование активности и свойств этого фермента в эритроцитах, тенях эритроцитов и в "бесспектриновых" везикулах у лиц с пограничной артериальной гипертензией /ПАТ/ и с наследственной отяго- ■ щенностью по данному заболеванию. Для сравнения были обследованы и больные с,развившейся артериальной гипертензией.

Для выявления наибольшей активности На,К-АТФазы в целых эритроцитах использовали мембранотропные вещества - детергент твин-20 и ¡ЭДТА. В этой серии экспериментов наиболее высокая фермента- ' тивная- активность у лиц всех исследованных: групп определялась после обработки эритроцитов твнном-20 в концентрации - 10 мг/мл, при этом у здоровых людей введение 0,5 мМ ЭДТА в среду дополнительно активировало фермент па 29',?. Активация На,К-АТФязы под действием ЭДТА обнаружена у лиц с ПАТ и больных ГБ при использо-

Табл. 1. Активность На,К-АТФазы в целых эритроцитах /мкмоль Фн/час на мл/, в тенях и "бесспектриновых" везикулах /мкмоль $н/час на мг/ у здоровых людей, у лиц с ПАГ и у больных ГБ.

концентрация твина-20, мг/ш!

здоровые люди

лица с ПАГ

больные ГБ

в отрутстще 0 5 ш ЭДТА в присутствии ыш ДАЛ

эритроциты

5 10

Щ!

Шйе

1.51+0.09 1.28+0.03' Общ® 11 Й^О, 04

** **

*»

3.22+0.42 •

т в н и

0

0,5

0,48*0,04 0,52^,04

0,64^0,07** 0,74^,09*"

• 0,5±0,07 0,48^0,05

везикулы

0,78^0,15 0,96^0,20 0,8^0,20 0,74^0,11 .1^,19 0,86^,26

0 0,5

** р<0,01 /достоверность различий по сравнению с контролем/

вании тьина-20 в более низкой концентрации /5 мг/мл/. Учитывая, литературные данные/Казеннов и соавт., 1986/ о том, что активирующее действие хелаторов реализуется с внутренней стороны мембраны, можно сделать вывод, что эритроцитарная мембрана больных имеет меньшую прочность и легче дезинтегрируется под действием детергента.

Из табл. 1 видно,что активность На,К-АТФазы в'целых эритроцитах была снижена как у больных ГБ, так и у лиц с ПАГ, причем наиболее отчетливо это снижение /соответственно на 30% и 20%/ выявлено при концентрации твина-20 - 10 мг/ш и в присутствии ЭДТА. В отличие от целых эритроцитов в тенях эритроцитов больных ГБ снижения активности Яа.К-АТФазы не было обнаружено; у лиц с ПАГ, напротив, имело место даже повышенная активность фермента ' /более чем на 30$/. В "бесспектриновых" везикулах достоверных различий в активности На,К-АТФазы мевду исследованными группами выявлено не было. Сйедует также подчеркнуть, что при удалении спектрина и актина из теней эритроцитов человека снижение ферментативной активности /расчитанной на мл клеток/ было менее выраженным /25-30$/, чем в случае теней эритроцитов крысы /50-60$; см. раздел 1/. .

Снижение активности На,К-АТФазы в целых эритроцитах у лиц . с ПАГ и больных 1Б и отсутствие таковых изменений в тенях эритроцитов дает основание предположить наличие в плазме крови у этих людей эндогенных ингибиторов активности фермента, отмывающихся с поверхности эритроцитов в процессе получения теней.

Данные о пониженной активности На,К-АТФазы у нормотензивных людей с наследственной предрасположенностью к развитию ГБ /рис. 5/ также служат косвенными доказательствами присутствия у них в плазме крови эндогенных факторов, ингибйрующих активность фермента. Так, активность Па,К-АТФазы в эритроцитах родственников больных ГБ была на 26$ ниже по сравнению с активностью фермента у нормотензивных людей без наследственной отягощенности по ГБ. При разбивке группы с генетической предрасположенностью к развитию ГБ по группам с учетом наследственного фона по ГБ, мы обнаружили достоверно более низкую активность На,К-АТФазы /на 16$/ в эритроцита* людей с наследственной отягощенностью по линии матери, чем по линии отца /рис. 5/. В.то же время в группе лиц с ПАГ не

Рис. 5. Активность Яа.К-АТФазы в Целых эритроцитах у лиц с нормальным АД без наследственной отягощенности'по ГБ /1/, у лиц с ПАР /2/ и с наследственной отягощенно-стью по ГБ /3//по линии отца /За/ и по линии матери /36//

**р<0,01 /достоверность различий по отношению к контролю/

8-1 О

г

Рис. 6,

1

||

ш

1 2 3 Активность На,К-АТФазы в целых эритроцитах, инкубированных с плазмой здоровых людей с нормальным АД /1/, с плазмой лиц с ПАТ /2/ и больных.ГБ /3/.

** р<0,01 / достоверность

отношению к контролю,

различи: нтролю/

;й по

I

было обнаружено влияния генетических факторов на активность На.К-АТФазы.

Тот факт, что при возрастании АД не выявлялась связь актив-, ности На,К-АТФазы с генетическими факторами в мембране эритроцитов, вероятно, свидетельствует о важности присутствия в организ- . ме повышенного количества ЭДФ именно в предгипертензивный период. Это отчасти подтверждается и нашими результатами о более выраженной способности плазмы крови лиц с ПАГ, чем плазмы больных ГБ, угнетать активность фермента в эритроцитах здоровых людей без наследственной о тягощенное™ по ГБ /20$ и 16$, соответственно/ /рис. 6/.

Нам представляется, что повышение содержания ЭДФ в плазме у людей в предгипертензивный период, сопровождающийся снижением 'активности На,К-АТФазы в мембране эритроцитов, является существенным звеном в патогенезе заболевания в период развития высокого •АД. .

вывода

1. Установлено, что последовательное удаление из теней эрит-.роцитов крысы Вистар белков мембранного скелета /спектрина, актина и белков п.2.1 и 4.1 сопровождается прогрессивным снижением активности Яа,К-АТФазы и исчезновением модулирующего влияния Мр2+ на ферментативную активность.

2. Показано,что по сравнению с тенями эритроцитов в мембранных препаратах, лишенных периферических белков спектрина и актина

/в "бесспектриновых" везикулах/ активности уабаин-резистентной ■ и уабаин-чувствительной К-пНФфосфатаз снижены в 2-3 раза, при этом отсутствует модулирующее влияние и АТФ на работу ферментов.

3. У людей с ПАГ и у крыс с первичной артериальной гипертен-зией /крысы 'линии йНН / обнаружена повышенная активность На,К-АТФазы в тенях эритроцитов по сравнению с нормотензивным контролем. У крыс БНН также имеет-место значительно более высокая активность уабаин-чувствительной фосфатазы /на 40?ь/ и Са-фосфата-зы /в 2-3 раза/. Установлено,.что эти различия в активности ферментов выявляются лишь в случае интактных мембранных препаратов /тени эритроцитов/, но не в мембранных препаратах, лишенных периферических белков мембранного скелета.

4. Впервые показано, что.имеются существенные различия в чув--ствительности уабаин-чувствительной и Оа-активируемой фосфатаз

в тенях /но не в "бесспектриновых" везикулах/ к АТФ и Са2+ между гипертензивными крысами ацц и нормотензивнымй крысами Вистар, что может свидетельствовать об отличиях в свойствах белков мембранного скелета или связанных с ним регуляторов ферментативных активностей.

5. Впервые продемонстрировано, что у людей с генетической пред-расположенностьй к развитию ГБ и у лиц с- ПАТ имеет место пониженная активность За,К-АТФазы в целых эритроцитах по сравнению о нормотензивными людьми без наследственной отягощенности по 1Б.

6. Обнаружена способность плазмы крови лиц с НАГ значительно ингибировать На,К-АТФазу в эритроцитах, что вероятно, обусловлено присутствием у лиц с ПАТ повышенного содержания эндогенных ингибиторов На,К-АТФазы, очевидно, ЭДФ; и может свидетельствовать об их важной патогенетической роли в начальном периоде заболевания. ■ ■

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТБМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Маслова М.Н., Огородникова I.E., Титков Ю.С. Активность и свойства Па,К-АТФазы в эритроцитах и ингибитор На-насоса в плазме у лиц с пограничной артериальной гипертензией // Физиол. журнал СССР им. И.М.Сеченова.- 1991.- Т. 77, № 9.- С.232-237.

2. Маслова М.Н;., Титков Ю.С., Огородникова Л.Е, Активность На,К-АТФазы в эритроцитах и состояние гемодинамики малого круга кровообращения при формировании артериальной гипертонии // Кардиология.- 1992.- Т. 32, ' № 3,- С.44-46.

3. Маслова М.Н., Огородникова Д.Е.,-Титков Ю.С. Активность На,К-АТФазы и ее возможная роль в патогенезе эссенциальной гипертонии // В сб.: "Патофизиологический анализ, факторов риска артериальной гипертензии и атеросклероза" /ред. Штеренталь И.Ш./.-Новосибирск, 1992.- С.74-75.

4. Огородникова Л.Е., Маслова М.Н., Титков Ю.С. Функционирование Ка-насоса в эритроцитах у людей о повышенным риском развития эссенциальной гипертензии // В сб.: "Роль наследственности'

и других факторов риска в развитии сердечно-сосудистых заболеваний" /ред. проф. Ковалев Ю.Р./.- Санкт-Петербург, 1992.- С.83-87.

5. Огородникова Л.Е., Казеннов A.M. Активность и свойства К-пНФфосфатаэы в мембранных" Препаратах эритроцитов с различным полипептидным'составом у крыс линий Вистар, Вистар-Киото.и ВНЕ // Физиол. журнал СССР им. И.М.Сеченова.- 19ЭЗ.- Т. 79, № 7.-С.70-74.

{/гО[Л