Влияние липидов на индуцированный апоптоз моноцитов в норме и при раке молочной железы

Ромашкина, Марина Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние липидов на индуцированный апоптоз моноцитов в норме и при раке молочной железы
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние липидов на индуцированный апоптоз моноцитов в норме и при раке молочной железы"

На правах рукописи

003467722

Ромашкина Марина Васильевна

ВЛИЯНИЕ ЛИПИДОВ НА ИНДУЦИРОВАННЫЙ АПОПТОЗ МОНОЦИТОВ В НОРМЕ И ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г.-

Саранск - 2009

003467722

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Владимир Александрович ТРОФИМОВ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Виктор Владимирович ВАЛИУЛЛИН

доктор биологических наук, профессор Любовь Федоровна КУРИЛО

Ведущая организация: Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова

// / ^ Защита диссертации состоится « /р » M&U!_ 2009 г. в «.(£_>•> часов на

заседании диссертационного совета Д 212.117.01 при ГОУВПО «Мордовский

государственный университет имени Н.П. Огарёва» (430000, Республика

Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУВПО "Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева"

Автореферат диссертации опубликован на официальном сайте ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» www.rnrsu.ru E-mail: dsovet@mrsu.ru

Автореферат диссертации разослан CWUU& 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук,

профессор

Балашов В.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Несмотря на то, что молекулярно-генетические исследования свидетельствуют о том, что рак является болезнью генома, механизмы его возникновения и связь этих механизмов с конкретными нарушениями функционального аппарата клеток мало изучены (Баранов B.C. и др., 2000). Вместе с тем, ценность таких данных для практической онкологии более чем очевидна. Во всех опухолях выявлены те или иные нарушения в структуре генетического аппарата или в функциональной активности генов, участвующих, прежде всего в контроле клеточной пролиферации. Расшифровка структуры генома человека позволила идентифицировать многие гены, мутации в которых играют ключевую роль в превращении нормальных клеток в опухолевые. Но факторы, вызывающие такие мутации в своем большинстве не изучены.

Заболевание раком молочной железы (РМЖ) представляет собой патогенетически полиморфное заболевание. В 10% случаев генетически связано с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 (Breast Cancer), механизмы которых недостаточно изучены (Семиглазов В.Ф. и др., 1992; Карпухин A.B. и др., 2002; Поспехова Н.И. и др., 2003; Тихомирова О.С. и др., 2005). В различных типах опухолей причинами их образования являются мутации в «горячих точках» гена р53. Мутация или даже небольшое изменение формы гена р53 приводит к утрате супрессивных свойств и стимуляции опухолевого процесса. В целом ряде исследований было показано, что изменения в гене р53 свидетельствуют о плохом прогнозе у больных РМЖ (Коршунов А.Г. и др., 1996; Чумаков П.М., 2000).

Образование и накопление клона злокачественных клеток связано с блокированием программы апоптоза, что является важным фактом, хотя и недостаточно изученным. Постоянная активация промоторов опухолевого роста приводит к фенотипическим изменениям трансформированных клеток, которые приобретают повышенную способность к пролиферации и утрачивают способность к дифференцировке. Благодаря этим свойствам они имеют преимущества перед клетками нормальных тканей при росте и выживании в одинаковых условиях (Райхлин Н.Т., 1996; 1998; Фильченков A.A. и др., 1999).

Актуальным является, что неспособность клеток претерпеть апоптоз может быть одним из факторов, обуславливающих патогенез различных заболеваний человека, включая рак, аутоиммунные заболевания и вирусные инфекции (Currach М.Е. et al., 1997; Владимирская Е. Б., 2000; Заридзе Д.Г., 2000).

Проказова H.B. и др., 1998; Егорова А.Б. и др., 2001; Alan W. et al., 2002). В частности, показано, что липидный состав нормальных и опухолевых клеток существенно различается (Андреева Е.В., 1987; Терентьев A.A., 1989; Хышиктуев B.C. и др., 1993; Проказова Н.В., 1998). Модификации липидов, включая перекисное окисление липидов и действие фосфолипаз, характерные для патологически измененных клеток, могут усугубить расстройство жизненно важных клеточных функций, в том числе генетических процессов л апоптоза (Boesze-Battaglia К. et al., 1994; Стручков В.А., 2000). Поэтому актуальным является изучение роли компонентов липидов в регуляции пролиферации и апоптоза при канцерогенезе, что в дальнейшем может служить основой для поиска новых препаратов, применение которых позволит существенно снизить риск развития рака и улучшить результаты химиотерапии больных данной патологией.

При онкологических заболеваниях, в частности, при раке молочной железы наблюдается моноцитоз - увеличение количества моноцитов. Моноциты или макрофаги отвечают на воздействие разнообразных агонистов, быстро гидролизуя мембранные фосфолипиды, что приводит к генерации большого числа внутриклеточных и экстраклеточных мессенджеров, в результате чего реализуется многофункциональный потенциал этих клеток (Клебанов Г. И. и др., 1999). Однако при подходе к опухоли, моноциты или макрофаги теряют свою подвижность, а также возможность передавать информацию об обнаруженной опухоли другим иммунокомпетентным клеткам (lin F. et al., 1996; Заридзе Д.Г., 2000). В тоже время до настоящего времени ряд вопросов, касающихся поведения моноцитов изучены недостаточно. В частности, показано, что в моноцитах усиливается липидный метаболизм, интенсифицируются процессы пероксидации липидов (Щербаков В.И., 1990; Gordon S. et al., 1995; Зубова С.Г. и др., 2001).

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении влияния липидов на индуцированный перекисью водорода и стауроспорином апоптоз моноцитов в норме и при раке молочной железы.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) выявить генетическую предрасположенность к раку молочной железы по мутациям в генах BRCA1/2 и р53;

2) исследовать особенности реализации программы апоптоза в моноцитах в норме и при раке молочной железы при действии индукторов апоптоза (перекиси водорода и стауроспорина);

3) изучить влияние липидов (фосфатидилхолина, холестерола и сфингозина) на реализацию программы апоптоза в моноцитах.

Научная новизна работы. Впервые определены мутации в ключевых генах у жителей Республики Мордовия, предрасполагающие к раку молочной железы, оценена их частота. Новыми следует признать данные о том, что в выборке больных раком молочной железы наличие мутаций в гене BRCA1 было выявлено в 76 % случаев. Безусловной новизной обладают сведения о том, что среди выявленных мутаций основную долю заняла мутация 4154delA (56 %). Впервые обнаружено, что доля мутации 185delAG составила 31 % и 5382insC -13 %, а мутация 6174delT BRCA2 в исследуемой выборке больных не выявлена.

Изучены особенности фрагментации ДНК в норме и при раке молочной железы. Перекись водорода и стауроспорин индуцируют апоптоз моноцитов у здоровых людей. У больных раком молочной железы ответ моноцитов на действие индукторов проявлялся, прежде всего, через склонность к гибели путем некроза. Впервые изучено влияние липидов сфингозина, фосфатидилхолина, холсстерола на индуцированную перекисью водорода и стауроспорином гибель клеток. Наибольший проапоптотичсский эффект был выявлен при совместном действии индукторов апоптоза и сфингозина. У здоровых людей этот эффект обнаружен при действии сфингозина (0,001 и 0,01 ммоль/л) и стауроспорина. У больных раком молочной железы высокий проапоптотический эффект моноцитов был обнаружен только при действии 0,001 ммоль/л сфингозина совместно с 10 ммоль/л перекиси водорода и/или стауроспорином.

Впервые показано, что в моноцитах холестерол стимулирует экспрессию генов раннего ответа c-fos и р53.

Научно-практическая значимость работы. Данные проведенного комплексного исследования вносят вклад в решение фундаментальной проблемы биологии клетки - проблемы молекулярных механизмов гибели клетки при раке молочной железы, расширяя представления об участии липидов в апоптозе и некрозе.

Эта область исследований имеет не только теоретическую, но и практическую значимость. Оценка фрагментации ДНК может быть использована в качестве одного из основных критериев прогноза способности клеток к апоптозу при РМЖ. Влияние липидов на активность генетически-опосредованные процессы может быть связано с изменением генной экспрессии посредством взаимодействия липидов со специфическими последовательностями ДНК. Полученные данные по выявлению в клетках крови мутаций в ключевых генах (BRCA1/2, р53) могут быть использованы в медицине для уточнения диагноза онкозаболеваний, в частности рака молочной железы.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ключевыми мутациями клеток крови, предрасполагающими к раку молочной железы у жителей Республики Мордовия, являются мутации 4154delA, 185delAG и 5382insC в гене BRCA1, встречающиеся с частотами 56 %, 31 % и 13 % соответственно; мутация Arg72Pro (R72P) в гене р53 с частотой генотипов Arg/Pro, Arg/Arg, Pro/Pro - 38,5 %, 23,1 % и 38,5 % соответственно.

2. Перекись водорода и стауроспорин индуцируют апоптоз моноцитов у доноров, но при раке молочной железы приводят к гибели клеток, несущих мутации в ключевых генах (BRCA1, 2 и р53), преимущественно путем некроза.

3. Сфингозин и липосомы, содержащие фосфатидилхолин и холестерол, изменяют ответ моноцитов на действие индукторов апоптоза по-разному в зависимости от их природы и концентрации. Ответ клеток на действие липидов и индукторов апоптоза имеет существенные различия у здоровых людей и больных раком молочной железы.

Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации, были доложены на международных научных конференциях: «Актуальные проблемы

экологической физиологии, биохимии, генетики животных» (Саранск, 2005), «Диагностика, терапия, профилактика социально значимых заболеваний человека» (Турция, 2007), на ежегодных Огаревских чтениях (научных конференциях Мордовского госуниверситета) (Саранск, 2006, 2007, 2008 г.), междунар. науч. конференции (вторые Ржавитинские чтения) (Саранск, 2008), междунар. науч. конференции, посвящен. 100-летию со дня рождения профессора Е.В. Сапожниковой (Саранск, 2008), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в числе которых 1 статья в издании, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 127 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа включает 29 рисунков и 3 таблицы. Список цитируемой литературы включает 219 источников, в том числе 103 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа проведена на образцах ДНК и клетках (моноцитах), полученных из цельной венозной крови доноров (практически здоровых людей) и больных раком молочной железы. Исследовано 15 образцов крови доноров и 37 -больных онкологического диспансера г. Саранска, с подтвержденным диагнозом и с письменного согласия пациентов. Клетки выделяли в градиенте плотности фиколл/гипак. Рабочая концентрация суспензии клеток составляла 106 кл/мл. Их жизнеспособность определяли по величине проникновения внутрь клеток красителя трипанового синего. В культуральную среду добавляли Н2О2, стауроспорин («Sigma», США), фосфатидилхолин/холестерол («Sigma», США), сфингозин («Sigma», США). Пробы инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 3-х и более часов. Клетки, погибающие апоптозом и некрозом, выявляли методами флуоресцентной (микроскоп «Люмам-ИЗ», длина волны возбуждающего света 320-390 нм, барьерный фильтр 420-450 нм) и световой микроскопии (микроскоп «Биолам Р-11»), используя акридиновый оранжевый (АО), Hoechst 33258 (Sigma), краситель Мая-Грюнвальда и Гимза (Merk).

Малые однослойные липосомы готовили из расчета 15 мкмоль смеси липидов в 1 мл 10 ммоль трис-HCl-буфера, pH 7,5, содержащего 0,15 моль NaCl. Препараты липосом содержали фосфатидилхолин/ холестерол (мольное отношение 7:1,35:5,49:7).

ДНК выделяли стандартным фенол-хлороформным методом с использованием протеиназы К. Мутации в генах (BRCA1, 2 и р53) выявляли методом полимеразно-цепной реакции с последующим проведением оценки частоты их распространения. Наборы для выявления мутаций и полиморфизмов были получены от профессора Карпухина A.B. (ГУ «Медико-генетический центр

РАМН», г. Москва).

Электрофоретический анализ ДНК проводили по стандартной методике (Kaufmann S. H. et. al., 2000).

Взаимодействие липидов с ДНК моделировали методом молекулярной механики в системе ММ+ с помощью программы HepcrChemTM версия 6.1. Проанализировали изменение экспрессии генов раннего ответа c-fos и р53 под влиянием холестерола. Амплификацию фрагментов ДНК генов c-fos и р53 методом ПЦР проводили с использованием наборов реактивов АмплиСенс-200-1 и АмплиСенс-200-2 (ВЮсот). Для амплификации генов c-fos и р53 применяли синтезированные олигонуклеотиды (Syntol, Россия) со следующими последовательностями: р53 Forward: 5/-CTTCCCGCCА-ТАААААААСА-3/; Reverse: 5/-AGCCCTGA AGTC ATA-AG АС AGC-З/; c-fos Forward: 5/-GCGTCAATGTTCATTGTCATG-3/; Reverse: 5/-CCACATGTCGA-

AAGACCTCA-3/.

В качестве положительного контроля использовали: ß-актин: Forward: 51-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3/; Reverse: 5/-TCGTCATACTCCTGCTTGCTGATCC-3/.

Расчет параметров температуры отжига праймеров проводили с помощью компьютерной программы Praimer 1.0.

После окончания реакции (в тот же день) проводили разделение фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле.

■с Для анализа полученных результатов использовали пакет программ Gel Explorer (Copyright 2000, версия 1.0), Gel Analysis, метод вариационной статистики с использование критерия t Стьюдента. Достоверность различия определяли в каждой серии по отношению к исходному значению Р.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучаемые нами моноциты, выделенные из цельной венозной крови здоровых людей и больных раком молочной железы, не содержали первичных признаков апоптоза или некроза. В то же время общее число моноцитов в крови больных повышалось (моноцитоз), тогда как в норме их содержание составляет 1,7-2,0х109 клеток.

Световая микроскопия окрашенных клеток по Паппенгейму-Крюкову (Фрейфельд Е. И.., 1947; Досон Р. и др., 1991) показала, что моноциты, как в норме, так и при раке молочной железы представляли собой округлой формы клетки с бобовидным ядром. В клетках обнаруживается широкая, не резко очерченная цитоплазма, содержащая различные включения (рисунок 1 А). Ядра клеток, флуорохромированных акридиновым оранжевым (АО) (Карнаухов В. Н., 1978; Завгородняя Е. Т. и др., 1993) выглядят ярко-зелеными, с неравномерно окрашенным хроматином. Живые клетки быстро выводят краситель Hoechst 33258 (Карнаухов В. Н., 1978; Завгородняя Е. Т. и др., 1993) и поэтому имеют тускло-зеленую флуоресценцию.

Рисунок 1. Моноциты: норма (А), апоптоз (Б), некроз (В), окрашенные по Паппенгейму-Крюкову. Увеличение х 900

Наследственные мутации гена ВКСА1 обуславливают 56-87% риска развития рака молочной железы в возрасте 70 лет и 33-50% - в возрасте 50 лет (Тихомирова О.С. и др., 2005). Мутации гена В11СА2 отвечают за 65-95% риска развития рака молочной железы (АЬеНоукЬ Б. е1 а1., 1997).

Наиболее встречаемые мутации в гене ВЯСА 1: С6Ю, 5382тэС, 185<Зе1АО, 4154<1е1А; ВЯСА 2: 6174с1е1Т. Отмечено, что опухоли, ассоциированные с мутациями генов ВЫСА 1 и ВЯСА 2, имеют более высокую степень злокачественности (преимущественно III), по сравнению со спорадическим РМЖ (АЬеИоукИ Э. « а!., 1997).

Для молекулярно-генетического исследования генов ВЫСА 1/2 нами были исследованы фрагменты ДНК, полученные из периферической венозной крови больных онкологического диспансера г. Саранска.

В результате проведения электрофореза в 6% ПААГе были обнаружены на фореграммах однонитевые фрагменты ДНК с разной молекулярной массой (рисунок 2):

Мутация 185с1е1АО в гене ВЯСА1: в норме имеется фрагмент ДНК длиной 315 п.н., в случае наличия мутации наблюдаются 2 дополнительные полосы; б) Электрофореграмма ядерной ДНК на выявление мутации в гене ВЯСА1 на участках 4154ёе1А: К - контрольная ДНК, несущая мутации в гене ВШИА1 на участке 4154с1е1А; 1-9 - исследуемые образцы ДНК. Мутация 4154<1е1А в гене ВЛСА 1: в норме имеется фрагмент ДНК длиной 341 п.н., в случае наличия мутации наблюдаются дополнительная полоса

Мутация 5382тзС в гене В11СА1: в норме имеется фрагмент ДНК длиной 232 п.н., в случае наличия мутации наблюдаются ещё 2 близкорасположенные дополнительные полосы. В 20 интроне гена ВКСА1 с популяционной частотой 2-3% встречается полиморфизм 1У8 20+601т 12, в этом случае на электрофорезе наблюдается 3 полосы с большим разделением, чем при мутации.

Мутация 6174<1е1Т в гене ВЯСА2: в норме имеется фрагмент ДНК длиной 535 п.н., в случае наличия мутации наблюдаются 2 дополнительные полосы.

Наиболее распространенной мутацией гена BRCA 1 является мутация 5382insC в 20 экзоне. Частота встречаемости колеблется от 10 до 63%. В работе Goyther и соавторов показано, что в российских семьях, отягощенных РЯ и /или РМЖ, приходится 47% всех мутаций на долю данной. Среди евреев-ашкенази наиболее распространены мутации гена BRCA 1 - 185delAG, 5382insC; гена BRCA 2 - 6174delT, которые отвечают за 60% случаев РЯ и 30% РМЖ (Lakhani S. et al„ 1999; Зинченко (Мамедова) P.A. и др., 2001).

BRCA 1 5382 ins С BRCA I 185 del AG

BRCA I 4154 del A Рисунок 2. Спектр мутаций в генах BRCA 1/2

И Pro/Pro □ Pro/Arg ■ Arg/Arg

Рисунок 3. Спектр мутаций в гене р53

Исследовали в ДНК клеток крови полиморфизм 72 кодона гена р53, вызывающий замену аминокислоты Arg на аминокислоту Pro. Полиморфизм 72 кодона гена р53 зависит в сильной мере от этнического происхождения и варьирует в разных популяциях. Полиморфизм связан с областью р53, богатой по пролину, которая участвует в регуляции пролиферации и апоптоза. Arg/Pro полиморфизм затрагивает сайт 4 экзона, необходимый для передачи сигналов, поступающих от протеинов, которые регулируют инициацию транскрипции (рисунок 3).

На полученных электрофореграммах представлены фрагменты ДНК с молекулярным весом 296 пар нуклеотидов, свидетельствующие о наличии Рго-аллеля, и фрагменты весом в 169 и 127 пар нуклеотидов. Показано, что частоты генотипов Arg/Pro, Arg/Arg, Pro/Pro составляют 38,5%, 23,1% и 38,5% соответственно.

Таким образом, в генах BRCA 1/2 среди обследуемых больных РМЖ и РЯ основная доля мутаций приходится на BRCA 1: 185deIAG и 5382insC, ген р53 с высокой частотой встречается в виде Рго-аллеля.

В наших экспериментах и перекись водорода (0,5, 1, 10 ммоль/л) и стауроспорин (1 мкг/мл) индуцировали морфологические и биохимические изменения в моноцитах максимально после 3-х часов инкубации (рисунок 1). В норме при действии 0,5 мМ Н202 доля апоптотирующих моноцитов составила 23 %. Основной проапоптотический эффект перекись водорода оказывала в концентрации 1 ммоль/л, в этом случае величина апоптотического индекса составила 47 %, некроза практически не наблюдалось. Наблюдалось общее сморщивание клеток, небольшое уменьшение их в размерах, частичная фрагментация ядер, накопление фрагментов нуклеотического расщепления ДНК размером 180-200 п.н. (рисунок 1 Б). Перекись водорода в концентрации 10 ммоль/л приводила к гибели клеток по пути некроза. При этом апоптотический индекс возрастал до 53 %, примерно у 15 % клеток наблюдались раздутие и вакуолизация цитоплазмы, лизис ядра (рисунок 1 В, 4 А). При действии 10ммоль/л Н202 электрофоретический анализ позволил обнаружить фрагменты ДНК порядка 300 п.н. и больше, что является свидетельством некроза.

Другой индуктор апоптоза - стауроспорин при действии на моноциты в концентрации 1 мкг/мл приводил к гибели апоптозом 68 % клеток. Некроза в популяции анализируемых клеток практически не наблюдалось (рисунок 4 А).

Моноциты больных раком молочной железы реагировали на действие индукторов апоптоза с некоторыми особенностями. При действии Н202 доля апоптотических клеток не превышала 10 %, при этом на долю некротических клеток приходилось 54 - 65 % в зависимости от концентрации перекиси водорода. При действии стауроспорина (1 мкг/мл) доля апоптотических клеток составила 18 %, доля некротических клеток - 73 % (рисунок 4 Б).

При анализе ДНК, выделенной из моноцитов больных раком молочной железы, характерной электрофоретической «лесенки» не наблюдалось.

0,5 иЯюль/л

1ммольл 10ммоль/^Змл)

Яапоптоз И некроз

Рисунок 4. Доля моноцитов, гибнущих путем апоптоза или некроза при действии Н202 и стауроспорина а) у доноров; б) у больных раком молочной железы *- Р<0,05

Нами показано, что липиды влияют на реализацию программы апоптоза, индуцированной перекисью водорода и стауроспорином. На фоне липосомальной стимуляции (соотношение ФХ/ХС 7:1) перекись водорода в концентрациях 1 ммоль/л н 10 ммоль/л вызывала апоптоз у 8 % и 12 % моноцитов доноров, у 10 % и 20 % больных раком молочной железы, соответственно (рисунок 5 А, Б).

Липиды модифицировали проапоптотический эффект стауроспорина, способствуя увеличению выхода клеток, гибнущих некрозом. У больных раком молочной железы в этих условиях апоптозом погибало не более 4 % моноцитов (рисунок 5 А, Б).

При действии липосом с разным соотношением липидов (ФХ/ХС 35:5 и 49:7) и перекиси водорода в концентрациях 1 ммоль/л и 10 ммоль/л апоптотический индекс составил 9 - 16 % и 14-2% моноцитов доноров соответственно, и стауроспорина в концентрации 1 мкг/мл - 20 - 11 % моноцитов доноров (рисунок 6 А, Б).

У больных раком молочной железы при действии липосом (ФХ/ХС 35:5 и 49:7) и перекиси водорода в концентрациях 1 ммоль/л и 10 ммоль/л во всех вариантах доля клеток, погибших некрозом составляла от 7 до 45 %, а апоптотический индекс не превышал 10 %. При действии липосом (ФХ/ХС 35:5) и стауроспорина доля клеток, гибнущих некрозом составляла 77 %, а величина апоптотического индекса - 39 %. Однако при действии липосом (ФХ/ХС 49:7) и стауроспорина величина апоптотического индекса была 10 %, а доля клеток, гибнущих некрозом составила 0,5 % (рисунок 7 А, Б).

Сфингозин модифицировал проапоптотический эффект перекиси водорода, способствуя понижению апоптотического индекса до 20 %, увеличивая число клеток, гибнущих некрозом. В то же время сфингозин в концентрациях 0,001 ммоль/л и 0,01 ммоль/л усиливал проапоптотический эффект стауроспорина, в этом случае апоптотический индекс составлял 27% и 20 %, соответственно (рисунок 8 А, Б).

У больных раком молочной железы при действии 0,01 ммоль/л сфингозина и индукторов во всех вариантах отмечалась значительная доля клеток, погибших некрозом (рисунок 9 Б). В то же время сфингозин в концентрации 0,001 ммоль/л способствовал проявлению у стауроспорина и перекиси водорода в концентрации 10 ммоль/л проапоптотического эффекта, в этом случае апоптотический индекс составил 10 % и 15 % соответственно (рисунок 9 А).

Таким образом, различные липиды изменяли ответ клетки на действие индукторов по-разному, в зависимости от их природы и концентрации. При этом ответ моноцитов на действие индукторов гибели клеток имеет существенные различия у здоровых доноров и больных раком молочной железы, что свидетельствует о важной роли липидов в регуляции клеточных реакций при апоптозе и их модификации при РМЖ.

а апоптоз I некроз

0 ■ Г- !■ ЩЩЩИГ { 1 И111111* | II [ , [ци^щдщ | , лщтщи -т_________

ФХ..Х , ммоль/л ^л,0мНольС:^л ^л?™^'

60 40 20 0

¡¡апоптоз Инекроз

ФХ:ХС 1ммоль/лФХ:ХС+10ммоль/<рХ:ХС+ стаур. ФХ:ХС+стаур. ! ммоль/л 10 ммоль/л (1 мкг/мл)

Рисунок 5. Доля моноцитов, гибнущих путем апоптоза или некроза а) у доноров; б) у больных раком молочной железы при действии перекиси водорода (Н2О2) и стауроспорина и ФХ:ХС (7:1) *- Р<0,05

70 % 60 50 40 30 20 10 0

1апоптоз 1 некроз

ФХ:ХС I ммоль/л ФХ.-ХС+ 10 ммоль/л ФХ:ХС+ стаур. ФХ:ХС+стаур.

1 ммоль/л

10 ммоль/л (1 мкг/мл)

II апоптоз II некроз

ФХ:ХС 1 ммоль/л ФХ:ХС+10 ммоль/л ФХ:ХС+ стаур. ФХ:ХС+стаур.

1 ммоль/л 10 ммоль/л (I мкг/мл)

Рисунок 6. Доля моноцитов, гибнущих путем апоптоза или некроза у доноров при действии перекиси водорода (Н2О2) и стауроспорина и ФХ.ХС а) (35:5); б) (49:7) *- Р<0,05

ФХ:ХС 1 ммоль/л ФХ:ХС+ 10 ммоль/л 1 ммоль/л

ФХ:ХС+ стаУР- ФХ:ХС+стаур. 10 ммоль/^' мкг/мл)

Рисунок 7. Доля моноцитов, гибнущих путем апоптоза или некроза у больных раком молочной железы при действии перекиси водорода (Н2О2) и стауроспорина и ФХ:ХС а) (35:5); б) (49:7) *- Р<0,05

Iапоптоз I некроз

сфингозин 1 ммоль/л 0 001 ммоль/л , о ммоль/л0 00, ммольЯГаУР- О'001 ммоль/л 0,001 ммоль/ЛС02 +1ммоль/л Н202 +10 ммоль//1 мкг/мл>+СтауР'

аапоптоз 1некроз

сфингозин ' ммоль/л0,001 ммоль/л10 ммоль'л 0,001 ммоль/л стаур 0,001 ммоль/л 0,001 ммоль/^1202 +1 ммоль/л Н202 +10 ммоль/л (1 мкг/мл)+стаур.

Рисунок 8. Доля моноцитов, гибнущих путем апоптоза или некроза у доноров при действии перекиси водорода (Н2О2) и стауроспорина и сфингозина а) 0,001 ммоль/л; б) 0,01 ммоль/л *- Р<0,05

Вапоптоз Н некроз

ФХ:ХС 1 ммоль/л

1 ммоль/л

Юммольй мкг/мл)

1апоптоз

1 некроз

сфингозин 1 ммоль'л 0,01 ммоль/л10 ммоль/л стаур. 0,01 ммоль/л

0,01 ммоль/л Н202 + 1 ммоль/л Н202 °'01 ММ0Л,Л,(1 мкг/мл>+стаур.

+10 ммоль/л

Рисунок 9. Доля моноцитов, гибнущих путем апоптоза или некроза у больных раком молочной железы при действии перекиси водорода (Н2О2) и стауроспорина и сфингозина: а) 0,001 ммоль/л; б) 0,01 ммоль/л *- Р<0,05

В настоящее время не вызывает сомнения то, что липиды являются неотъемлемым компонентом хроматина и ДНК, они могут влиять как на структуру ДНК, так и на активность генетических процессов (Федоров Б.Б. и др., 1997; Zhdanov R.I., 2004, 2005). Нами для иллюстрации взаимодействия липидов с ДНК проведены расчеты энергии образования комплексов нуклеиновых кислот с некоторыми липидами, которые не приведены в известных нам научных работах, методом молекулярной механики в системе ММ+ с помощью программы HeperChemTM версия 6.1. Исследования с помощью компьютерного моделирования были проведены совместно с к.б.н. Дудко А.А.

Для расчета структурных и энергетических характеристик комплексов ДНК-липид определено энергетически выгодное расположение липида в структуре ДНК, а также энергии образования липид-нуклеиновых комплексов и олигонуклеотидов (Стручков В.А. и др., 2000; Zhdanov R.I. et al., 2003; Жданов Р.И. и др., 2003).

а а по птоз 1 некроз

001 ммоль/л 11202 ммоль/л НЮ2

+10 ммоль/л (1 мк

Согласно проведенным расчетам, ФХ, содержащий в первом

положении пальмитиновую кислоту (16:0), а во втором положении цис-арахидоновую кислоту (20:4) стремится разместиться в малой бороздке (А-Т)ю. В этом случае наблюдается выигрыш энергии, равный 65 ккал\моль"'' что на 21,9 ккал\моль" ' больше аналогичной энергии связи ФХ, связавшегося с большой бороздкой ДНК. При этом. Ebo„j комплекса (G-C)io с ФХ в малой бороздке на 8,5 ккал\моль"' меньше, чем энергия связи комплекса (А-Т)ю, что свидетельствует о стремлении липида к более или менее специфическому связыванию с определенными последовательностями ДНК (таблица 1, рисунок 10 А, Б, В, Г).

При помещении ХС в малую бороздку (G-C)m наблюдается выигрыш энергии, равный 38,5 ккал\моль"''что на 13,5 ккал\моль"' больше энергии связи ХС с большой бороздкой (G-C)io ДНК. Энергия связи ХС с комплексом большой и малой бороздки (А-Т)ю последовательности имеет сходную энергию Ebond равную ~ 30 ккал\моль"'.

Таким образом, полученные с помощью компьютерного моделирования результаты свидетельствуют о возможности непосредственного взаимодействия липидов, в том числе, фосфатидилхолина и холестерола с определенными последовательностями ДНК, что подтверждает данные научной литературы (Стручков В.А. и др., 2000; Zhdanov R.I. et al., 2003; Жданов Р.И. и др., 2003).

Таблица 1.

Полные энергии (E10t) и энергии связи (Eb0„d) комплексов ДНК-(А-Т)ю и ДНК (G-C)io пар с жирными кислотами, нейтральными липидами и фосфолипидами при расположении липидных компонентов в малой и большой бороздках ДНК

(расчеты методом ММ+)

№ Состав комплекса E,w ккал\моль"' Ebond ккал\моль"' Е1о, ккал\моль-1 Ebond ккап\моль"'

Малая бороздка Большая бороздка Малая бороздка Большая бороздка Малая бороздка Большая бороздка Малая бороздка Большая бороздка

ДНК (А-Т)ю-В-форма 2-эндо-ко»формация ДНК (А-Т)ю -В-форма 2-эндо-конформация ДНК (G-C)io-В-форма 2-эндо-конформация ДНК (G-C)io-В-форма 2-эндо-конформация

3 Фосфатидил-холин (16:0; цис-20:4) 667,6 689,5 65 43,1 376,8 371,4 56,5 61,9

7 Холестерол 701,9 702,7 31 30,2 395,1 408,3 38,5 25

Для изучения влияния липидов на экспрессию генов в опытах in vitro были использованы моноциты белых мышей.

Для выяснения молекулярного механизма реализации комитогенного эффекта холестерола нами была исследована динамика изменения экспрессивной активности генов раннего ответа (c-fos и р52) в культивируемых моноцитах под влиянием холестерола.

А) Б) В) Г)

Рисунок 10. Строение комплекса ДНК с фосфатидилхолином (16:0 пальмитиновая кислота; г/гк;-20:4 арахидоновая кислота), расположенным в: А -малой бороздке ДНК (А-Т)ю, Б - большой бороздке ДНК (А-Т)ю, В - в малой бороздке ДНК (С-С)ю, Г - в большой бороздке ДНК (О-С)ю (программа НерегСЬетТМ версия 6.1)

Нами выявлено, что максимальное накопление мРНК гена с-Аэб в моноцитах под влиянием холестерола происходит при инкубации в течение 10 мин, затем происходит последовательное снижение содержания мРНК (рисунок 11 А).

В целом уровень мРНК гена с-Гоб в стимулируемых моноцитах в течение всего периода наблюдения поддерживался на довольно высоком уровне, что в конечном итоге указывает на способность холестерола усиливать пролиферативную активность клеток (Терентьев А.А. и др., 1998).

Анализ активности гена р53 под влиянием холестерола показал, что наименьшая величина экспрессии гена отмечается при инкубации с модификатором в течение 10 мин, затем происходит резкое возрастание экспрессии к 30 мин и 60 мин инкубации (рисунок 11 Б).

По сравнению с контролем транскрипционная активность гена р53 под влиянием холестерола значительно понижается. В этом случае начальное содержание кДНК в пробе ниже, чем у гена с-Азв.

Ген р53 является центральным геном регулятором апоптоза, поэтому его низкая транскрипционная активность указывает на то, что эндогенный холестерол в целом усиливает жизнеспособность и пролиферативную активность клеток.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о модификации апоптотической программы гибели клеток у больных раком молочной железы. Определяющую роль в развитии патологического процесса играют мутации в ключевых генах ВИСА 1/2, р53, спектр которых определяет специфические особенности заболевания, включая функциональную активность моноцитов или макрофагов.

Ответ моноцитов на действие индукторов гибели клеток имеет существенные различия у здоровых доноров и больных раком молочной железы. При этом в злокачественной трансформации клеток и нарушении программы апоптоза участвуют липиды. Липиды изменяют физиологическую реакцию моноцитов на действие индукторов апоптоза по-разному, в зависимости от их природы и концентрации.

7500 6000 -4500 * 3000 -1500 0

10 30 60

—о— кокгроль

■ ХС (5 м моль/л) —А- ХС (8

ммоль/л)

Время, мин

8 К

X и

си а

8 с

7500 6000 4500 3000 1500 0

Время,мин

— контроль -ХС(5

ммоль/л) ,

■ ■ ХС (8

ммоль/л) 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Рис. 11. Динамика изменения в моноцитах экспрессивной активности генов а) с-й«; б) р53 под влиянием холестерола

Время инкубации - 10 мин (ХС (5 ммоль/л), ХС (8 ммоль/л) - (1, 2), контроль (без добавок) (3); 30 мин ХС (5 ммоль/л), ХС (8 ммоль/л) - (4, 5), контроль (без добавок) (6); 60 мин ХС (5 ммоль/л), ХС (8 ммоль/л) - (7, 8), контроль (без добавок) (9)

Липиды способны влиять на генетические процессы и физиологическую активность моноцитов, специфически модифицируя экспрессию генов раннего ответа. По-видимому, одним из молекулярных механизмов влияния липидов на генную экспрессию является их непосредственное взаимодействие с определенными последовательностями ДНК.

ВЫВОДЫ

1. Изучение распространённости мутации в генах ВЯСА 1/2 и р53 среди больных РМЖ и РЯ показало, что основная доля мутаций приходится на ВИСА 1: 185с1е1АО и 5382шзС, тогда как мутация в гене ВЯСА 2: 6174ёе1Т не выявлена, ген р53 с относительно высокой частотой встречается в виде Рго-аллеля.

200 п.н. Обнаружение крупноблочных фрагментов ДНК порядка 300 п.н. и больше наблюдалось при некрозе.

3. У доноров проапоптотический эффект перекиси водорода и стауроспорина на фоне липосомальной стимуляции отмечался во всех вариантах опыта. У больных раком молочной железы проапоптотический эффект был намного ниже, особенно в вариантах опыта 1 ммоль/л с перекисью водорода. Липосомы способствовали увеличению числа клеток, гибнущих путем апоптоза по сравнению с числом некротических клеток под влиянием 10 ммоль/л перекиси водорода и или стауроспорина.

4. При совместном действии индукторов апоптоза и сфингозина (0,001 и 0,01 ммоль/л), наибольший проапоптотический эффект в моноцитах был выявлен у доноров при действии стауроспорина. У больных раком молочной железы высокий проапоптотический эффект в моноцитах был обнаружен только в вариантах с концентрацией сфингозина 0,001 ммоль/л совместно с перекисью водорода (10 ммоль/л) и или стауроспорином.

5. Холестерол стимулирует в моноцитах экспрессию генов раннего ответа c-fos и р53, тем самым влияя на их функциональную активность. С помощью компьютерного моделирования показано, что липиды могут взаимодействовать со специфическими последовательностями ДНК.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для выявления групп риска необходимо выявлять мутации в генах BRCA1/1, р53, предрасполагающих к раку молочной железы.

2. Липиды и их метаболиты (фосфатидилхолин, холестерол и сфингозин) могут применяться в качестве перспективных биохимических модуляторов, влияющих на активность генетических процессов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Трофимов В. А. Особенности функционирования генетического материала в неблагоприятных экологических условиях / Трофимов В.А., Мадонова Ю.Б., Ромашкина М.В. // Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии, генетики животных. Матер, междунар. науч. конференции. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та. 2005. С. 143-145.

2. Ромашкина М.В. Перекисное окисление липидов в ядрах макрофагов в норме и при патологии / Ромашкина М.В., Трофимов В.А., Аксенова О.Н., Дудко А.А // XXXIV Огаревские чтения. Материалы научной конференции. Естественные науки. 4.2. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та. 2005. С. 57-58.

3. Ромашкина М.В. Оценка спектра мутаций генов BRCA 1/2 у больных раком молочной железы / Ромашкина М.В., Трофимов В.А., Макагон И.П. // Современные наукоемкие технологии. № 12.2007. С. 81.

4. Ромашкина М.В. Перекись водорода как индуктор гибели моноцитов/макрофагов в норме и при раке молочной железы / Ромашкина М.В., Трофимов В.А., Никулин A.B. // Биология: теория, практика, эксперимент. Матер, междунар. науч. конференции, посвящен. 100-летию со дня рождения профессора Е.В. Сапожниковой. Саранск. 2008. Кн. 1. С. 241-242.

5. Ромашкина M.B. Особенности фрагментации ДНК у больных раком молочной железы / Ромашкина М.В., Трофимов В.А., Аксенова О.Н., Никулин

A.B., Дукина Д.Б. // XXXVI Огаревские чтения. Естественные науки. 4.2. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та. 2008. С. 39.

6. Ромашкина М.В. Проблема онкологических заболеваний в Республике Мордовия в связи с экологическим статусом территорий / Ромашкина М.В., Трофимов В.А., Макагон И.П., Иванова Е.А., Дукина Д.Б., Гордеева Т.В., Никулин A.B. // Проблемы биоэкологии и пути их решения. Матер, междунар. науч. конференции (вторые Ржавитинские чтения). Саранск: Изд-во Мордов. ун-та. 2008. С. 324-325.

7. Ромашкина М.В. Влияние Н2Ог и стауроспорииа на гибель моноцитов/макрофагов периферической крови больных раком молочной железы / Ромашкина М.В., Трофимов В.А., Макагон И.П., Никулин A.B. // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. -Новосибирск: изд-во «Арта», 2008. С. 443.

8. Трофимов В.А. Значение молекулярно-генетического тестирования для развития профилактической медицины в Республике Мордовия / Трофимов

B.А., Перепелов A.B., Иванова Е.А., Ромашкина М.В., Солдатов О.М., Никулин A.B., Орешин A.B. // Наука и инновации в Республике Мордовия: материалы VII респ. науч.-практ. конференции. - Саранск, 2008. С. 742-745.

9. Ромашкина М.В. Влияние перекиси водорода и стауроспорииа на гибель моноцитов/макрофагов периферической крови доноров и больных раком молочной железы / Ромашкина М.В., Трофимов В.А. // Морфологические ведомости. №3-4.2008. С. 201-204.

Подписано в печать 09.04.09. Объем 1,0 п. л. Тираж 100 зкз. Заказ № 523. Типография Издательства Мордовского университета 430005, г. Саранск, ул. Советская, 24

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ромашкина, Марина Васильевна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Морфологические особенности и молекулярно-генетическая организация моноцитов и макрофагов

1.2. Молекулярно - генетический механизм апоптоза 15 1.2.1 Генетические аспекты программируемой клеточной гибели 16 1.2.2. Молекулярные механизмы передачи информации в ядро клетки

1.3. Влияние липидов на генетические процессы 21 1.3.1 Роль липидов в рецепции и внутриклеточной сигнализации

1.3.2. Эффекторные пути в регуляции апоптоза. Роль липидных доменов в функционировании клеточных рецепторов

1.3.3. Фагоцитоз погибающих клеток

1.3.4. Липиды ядра клеток в норме

1.3.5. Липидный состав ядер раковых клеток

1.4. Рак - болезнь генома. Апоптоз и рак

1.4.1. Ключевые гены, мутации в которых, предрасполагают к раку молочной железы

1.4.2. Апоптоз при онкологических заболеваниях

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Материалы исследования 48 2.1.1. Объект исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Выделение моноцитов из гепаринизированной крови 48 2.2.1.1 .Постановка эксперимента

2.2.2. Определение жизнеспособности клеток

2.2.3. Выделение ДНК ядерных клеток крови 50 2.2.4.Электрофорез ДНК моноцитов в агарозном геле 51 2.2.5. Приготовление агарозного геля

2.2.6. Световая и флуоресцентная микроскопия моноцитов

2.2.7. Окрашивание моноцитов по Паппенгейму-Крюкову

2.2.8. Окрашивание моноцитов акридиновым оранжевым

2.2.9. Окрашивание моноцитов Hoechst

2.2.10. Получение липосом 54 2.3.Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)

2.3.1. Проведение ПЦР для определения мутации 5382insC в 20 экзоне гена BRCA

2.3.2. Проведение ПЦР для определения мутации 185delAG во 2 экзоне гена BRCA

2.3.3. Проведение ПЦР для определения мутации 4154delA в 11 экзоне гена BRCA

2.3.4.Проведение ПЦР для определения мутации 6174delT в 11 экзоне BRCA

2.3.5. Проведение ПЦР для определения мутации Arg72Pro (R72P) р

2.3.6. Методика проведения электрофореза в ПААГе

2.3.7. Окраска геля

2.3.8. Молекулярное моделирование взаимодействия липидов с ДНК

2.3.9. Постановка обратной транскрипции

2.3.10. Статистическая обработка данных

Глава 3. Результаты исследований 61 3.1 Морфологические особенности моноцитов в норме и при раке молочной железы

3.2. Выявление частот мутантных аллелей генов, предрасполагающих к раку молочной железы

3.3. Влияние перекиси водорода и стауроспорина на гибель моноцитов, особенности фрагментации ДНК в норме и при раке молочной железы

3.4. Влияние липидов на индуцированный перекисью водорода и стауроспорином апоптоз моноцитов

3.5. Моделирование методом молекулярной механики взаимодействий липидов с ДНК

3.6. Влияние холестерола на экспрессию генов раннего ответа

Глава 4. Обсуждение

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние липидов на индуцированный апоптоз моноцитов в норме и при раке молочной железы"

Актуальность проблемы. Несмотря на то, что молекулярно-генетические исследования свидетельствуют о том, что рак является болезнью генома, механизмы его возникновения и связь этих механизмов с конкретными нарушениями функционального аппарата клеток мало изучены (Баранов B.C. и др., 2000). Вместе с тем, ценность таких данных для практической онкологии более чем очевидна. Во всех опухолях выявлены те или иные нарушения в структуре генетического аппарата или в функциональной активности генов, участвующих, прежде всего в контроле клеточной пролиферации. Расшифровка структуры генома человека позволила идентифицировать многие гены, мутации в которых играют ключевую роль в превращении нормальных клеток в опухолевые. Но факторы, вызывающие такие мутации в большинстве своем не изучены.

В различных типах опухолей причинами их образования являются мутации в «горячих точках» гена р53. Мутация или даже небольшое изменение формы гена р53 приводит к утрате супрессивных свойств и стимуляции опухолевого процесса. В целом ряде исследований было показано, что изменения в гене р53 свидетельствуют о плохом прогнозе у больных РМЖ и причина этого до конца остается не известной (Коршунов А.Г. и др., 1996; Чумаков П.М., 2000).

Образование и накопление клона злокачественных клеток связано в том числе и с блокировкой программы апоптоза, что является важным фактом, хотя и недостаточно изученным. Постоянная активация промоторов опухолевого роста приводит к фенотипическим изменениям трансформированных клеток, которые приобретают повышенную способность к пролиферации и утрачивают способность к дифференцировке. Благодаря этим свойствам они имеют преимущества перед клетками нормальных тканей при росте и выживании в одинаковых условиях (Райхлин Н.Т., 1996; 1998; Фильченков А.А. и др., 1999).

Важным, но плохо изученным является то, что в злокачественной трансформации клеток и нарушении программы апоптоза могут участвовать липиды. Нарушение сигнальной функции липидов, объединенных в фосфоинозитидный и сфингомиелиновый циклы, может рассматриваться как важнейшее событие, переводящее клетку в разряд злокачественных (Белоконева О.С., 1993; Butthe Т.М. et al., 1994; Marshall C.J., 1995; Gordon S. et al., 1995; Проказова H.B. и др., 1998; Егорова А.Б. и др., 2001; Alan W. et al., 2002). В частности, показано, что липидный состав нормальных и опухолевых клеток существенно различается (Андреева Е.В., 1987; Терентьев А.А., 1989; Хышиктуев B.C. и др., 1993; Проказова Н.В., 1998). Модификации липидов, включая перекисное окисление липидов и действие фосфолипаз, характерные для патологически измененных клеток, могут усугубить расстройство жизненно важных клеточных функций, в том числе генетических процессов и апоптоза (Boesze-Battaglia К. et al., 1994; Стручков В.А., 2000). Поэтому актуальным является изучение роли компонентов липидов в регуляции пролиферации и апоптоза при канцерогенезе, что в дальнейшем может служить основой для поиска новых препаратов, применение которых позволит существенно снизить риск развития рака и улучшить результаты химиотерапии больных данной патологией.

При онкологических заболеваниях, в частности, при раке молочной железы наблюдается моноцитоз - увеличение количества моноцитов. Моноциты или макрофаги отвечают на воздействие разнообразных агонистов, быстро гидролизуя мембранные фосфолипиды, что приводит к генерации большого числа внутриклеточных и экстраклеточных мессенджеров, в результате чего реализуется многофункциональный потенциал этих клеток (Клебанов Г. И. и др., 1999). Однако при подходе к опухоли, моноциты или макрофаги теряют свою подвижность, а также возможность передавать информацию об обнаруженной опухоли другим иммунокомпетентным клеткам (Iin F. et al., 1996; Заридзе Д.Г., 2000). В тоже время до настоящего времени ряд вопросов, касающихся поведения моноцитов изучены недостаточно. В частности, показано, что в моноцитах усиливается липидный метаболизм, интенсифицируются процессы пероксидации липидов (Щербаков В.И., 1990; Gordon S. et al, 1995; Зубова С.Г. и др., 2001).

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении влияния липидов на индуцированный перекисью водорода и стауроспорином'апоптоз моноцитов в норме и при раке молочной железы.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) выявить генетическую предрасположенность к раку молочной железы по мутациям в генах BRCA1/2 и р53; г

2) исследовать особенности реализации программы апоптоза в моноцитах в норме и при раке молочной железы при действии индукторов (перекиси водорода и стауроспорина);

3) изучить влияние липидов (фосфатидилхолина, холестерина и сфингозина) на реализацию программы апоптоза в моноцитах.

Научная новизна работы. Впервые определены мутации в ключевых генах у жителей Республики Мордовия, предрасполагающие к раку молочной железы, оценена их частота. Новыми следует признать данные о том, что в выборке больных раком молочной железы наличие мутаций в гене BRCA1 было выявлено в 76 % случаев. Безусловной новизной обладают сведения о том, что среди выявленных мутаций основную долю заняла мутация 4154delA (56 %). Впервые обнаружено, что доля мутации 185delAG составила 31 % и 5382insC — 13 %, а мутация 6174delT BRCA2 в исследуемой выборке больных не выявлена.

Изучены особенности фрагментации ДНК в норме и при раке молочной железы. Перекись водорода и стауроспорин индуцируют апоптоз моноцитов у здоровых людей. У больных раком молочной железы ответ моноцитов на действие индукторов проявлялся, прежде всего, через склонность к гибели путем некроза. Впервые изучено влияние липидов сфингозина, фосфатидилхолина, холестерола на индуцированную перекисью водорода и стауроспорином гибель клеток. Наибольший проапоптотический эффект был выявлен при совместном действии индукторов апоптоза и сфингозина. У здоровых людей этот эффект обнаружен при действии сфингозина (0,001 и 0,01 ммоль/л) и стауроспорина. У больных раком молочной железы высокий проапоптотический эффект моноцитов был обнаружен только при действии 0,001 ммоль/л сфингозина совместно с 10 ммоль/л перекиси водорода и/или стауроспорином.

Впервые показано, что в моноцитах холестерол стимулирует экспрессию генов раннего ответа c-fos и р53.

Положения, выносимые на защиту:

Теоретическая и практическая значимость работы. Данные проведенного комплексного исследования вносят вклад в решение фундаментальной проблемы биологии клетки - проблемы молекулярных механизмов гибели клетки при раке молочной железы, расширяя представления об участии липидов в апоптозе и некрозе.

Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации, были доложены на международных научных конференциях: «Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии, генетики животных» (Саранск, 2005), «Диагностика, терапия, профилактика социально значимых заболеваний человека» (Турция, 2007), на ежегодных Огаревских чтениях (научных конференциях Мордовского госуниверситета) (Саранск, 2006, 2007, 2008 г.), междунар. науч. конференции (вторые Ржавитинские чтения) (Саранск, 2008), междунар. науч. конференции, посвящен. 100-летию со дня рождения профессора Е.В. Сапожниковой (Саранск, 2008), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Ромашкина, Марина Васильевна

выводы

1. Изучение распространённости мутации в генах BRCA 1/2 и р53 среди больных РМЖ и РЯ показало, что основная доля мутаций приходится на BRCA 1: 185delAG и 5382insC, тогда как мутация в гене BRCA 2: 6174delT не выявлена, ген р53 с относительно высокой частотой встречается в виде Рго-аллеля.

2. У больных раком молочной железы ответ моноцитов на действие индукторов проявлялся, прежде всего, через склонность к гибели путем некроза. Свидетельством апоптоза явилось накопление фрагментов ДНК 180200 п.н. Обнаружение крупноблочных фрагментов ДНК порядка 300 п.н. и больше наблюдалось при некрозе.

3. У доноров проапоптотический эффект перекиси водорода и стауроспорина на фоне липосомальной стимуляции отмечался во всех вариантах опыта. У больных раком молочной железы проапоптотический эффект был намного ниже, особенно в вариантах опыта 1 ммоль/л с перекисью водорода. Липосомы способствовали увеличению числа клеток, гибнущих путем апоптоза по сравнению с числом некротических клеток под влиянием 10. ммоль/л перекиси водорода и или стауроспорина.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для выявления групп риска и необходимо выявлять мутации в генах BRCA1/1, р53, предрасполагающих к раку молочной железы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ромашкина, Марина Васильевна, Саранск

1. Аксель, Е.М. статистика заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований в 2000 г. / Е.М. Аксель, М.И. Давыдов // Злокачественные новообразования в России и странах СНГ в 2000 г. — М.: РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. 2002. - С. 85-106.

2. Аксенова, О.Н. Влияние модификаторов ФИ-цикла на апоптоз перитонеальных макрофагов / О.Н. Аксенова, В.А. Трофимов, Т.Н. Лычкина // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2004. - № 6. - С. 653-656.

3. Алесенко, А.В. Функциональная роль сфингозина в индукции пролиферации и гибели клеток / А.В. Алесенко // Биохимия. 1998. - Т. 63. -С.5-82.

4. Алесенко, А.В. Влияние циклогексемида на липидный состав ядер клеток печени / А.В. Алесенко, В.А. Красильников // Фармакология и токсикология. 1998. - Т. 49, № 1. - С. 38 - 44.

5. Анализ полиморфизма ДНК с использованием метода полимеразно-цепной реакции / Сост. Г.Е. Сулимова, В.В. Зинченко. М.: АО «Диалог-МГУ». - 1999.-43 с.

6. Андреева, Е.В. Локализация липидов в политеных хромосомах / Е.В. Андреева, Г.П. Пинаев // Цитология. 1987. - Т. 3, № 12. - С. 1491-1495.

7. Арчаков, А.И. Модификация белков активным Ог и их распад / А.И. Арчаков, И.М. Мохосоев // Биохимия. 1989. - № 2. - С. 179 - 186.

8. Баранов, B.C. Геном человека и гены «предрасположенности» (введение в предиктивную медицину) / B.C. Баранов, Е.В. Баранова, Т.Э. Иващенко, М.В. Асеев. СПб.: Интермедика, 2000.-271 с.

9. Белоконева, О.С. Роль ядерных мембранных липидов в регуляции функционирования рецепторов нейтромедиаторов / О.С. Белоконева // Биохимия. 1993.-Т. 58. - Вып.11. - С. 1685-1708.

10. Белоусова, А.К. Загадки гена опухолевого супрессора р53 / А.К. Белоусова // Экспер. онкология. 1996. - Т. 18. - С. 197-207.

11. Блохин, Д.Ю. Программированная гибель клеток в механизмах циторедуктивной терапии опухолевых заболеваний / Д.Ю. Блохин // Патогенез. 2004. -№1. - С. 54-60.

12. Бочков, Н.В. Форболовый эфир блокирует сопряжение ГТФ связывающего белка с рецептор-управляемыми Са"+ каналами / Н.В.Бочков, И.А. Феоктистов, П.В.Авдонин, В.А.Ткачук // Биохимия. 1998. - № 9. -С. 1533-1542.

13. Брюне, Б. Апоптотическая гибель клеток и оксид азота: механизмы активации, анатагонистические сигнальные пути / Б. Брюне, К. Сандау, А.Ф. Кнете // Биохимия. 1998. - № 7. - С. 966 - 975.

14. Владимирская, Е.Б. Апоптоз и его роль в развитии опухолевого роста / Е.Б. Владимирская, А.А. Масчан // Молекулярная биология. 2000. - № 11. - С. 532-537.

15. Генкин, А.А. Опухолевые заболевания системы крови: возраст, уровень холестерина и количество эритроцитов / А.А. Генкин // Тер. архив. -1998.-№3.-С. 60-66.

16. Геннис, Р. Биомембраны: молекулярная структура и функции / Р. Геннис. М.: Мир. - 1997. - 635 с.

17. Груздев, В.В. Повреждения хроматина и матрикса печени крыс при асцитной опухоли Эрлиха / В.В. Груздев // Вопросы мед. химии. 1995. - Т. 38, № 3. - С. 300-307.

18. Досон, Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джони.-М.: Мир. 1991.-С. 466 467.

19. Доценко, Э.А. Холестерин и липопротеины низкой плотности как эндогенные иммуномодуляторы / Э.А. Доценко, Г.И. Юпатов, А.А. Чиркин // Клинич. иммунопатология. -2001. -№ 3. С. 6-15.

20. Дранник, Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология / Г.Н. Дранник. М.: ООО « МИА». - 2003. - 604 с.

21. Дубинина, Е.Е. Окислительная модификация белков / Е.Е. Дубинина // Успехи соврем, биологии. 1993. -№ 1. - С. 71 - 81.

22. Дубинина, Е.Е. Некоторые особенности функционирования ферментной антиоксидантной защиты плазмы крови человека / Е.Е. Дубинина // Биохимия. 1993. - Т.58. - Вып. 3. - С. 268-273

23. Дятловицкая, Э.В. Сфингонин в сфингомиелинах опухолей и регенерирующей печени мышей/ Э.В.Дятловицкая, А.Г.Кондыба, А.М.Козлов, О.Г.Сомова // Биохимия. 2001. - Т.66. - Вып.З. - С.624-628.

24. Егорова, А.Б. Повреждение цитоскелета и клеточных мембран при апоптозе / А.Б. Егорова, Ю.А. Успенская, С.В. Михуткина, Е.Ю. Ставицкая // Усп. совр. биол. 2001. -№ 5.-С. 502-509.

25. Еремин, А.Н. Операционная стабильность каталазы и ее коньюгатов с альдегидедекстранами и СОД / А.Н. Еремин // Биохимия. 1996. - № 4. - С. 664-679.

26. Жданов, Р.И. Липидом новый информационный уровень в исследовании генома человека / Р.И. Жданов, А.А. Кубатиев // Патогенез. -2003.-Т. 1. — № 1.-С.2-11.

27. Завгородняя, Е.Т. Модифицированный метод определения функциональной активности лимфоцитов крови с использованием акридинового оранжевого / Е.Т. Завгородняя, М.З. Шахмардоков, М.Н. Исаева // Клин. лаб. диагностика. 1993. - № 2. - С. 75-76.

28. Зенков, Н.К. Активные кислородные метаболиты в биологических системах/ Н.К. Зенков, Г.Б. Меньшикова // Успехи современной биологии. -1993.-№3,-С. 286-290.

29. Зенков, Н.К. Внутриклеточный окислительный стресс и апоптоз / Н.К. Зенков, В.А. Козлов // Успехи современной биологии. 2001. - № 5. - С. 440445.

30. Зинченко, В.П. Активация фосфолипазы связыванием с мембраной, индуцированным ФИ-3 киназой опосредованым доменом ПГ / В.П. Зинченко, А.С. Гуковская, Т.В. Вышинская // Биохимия. 2001. - № 3. - С. 414-422.

31. Зинченко (Мамедова), Р.А. Анализ разнообразия аутосомно-рецессивных заболеваний в Российских популяциях / Р.А. Зинченко (Мамедова), Г.И. Ельчинова, С.Г. Гаврилова, Е.К. Гинтер // Генетика. 2001— Т. 37, № 11.-С. 1559-1570.

32. Зинченко (Мамедова), Р.А. Разнообразие аутосомно-доминтантных заболеваний в Российских популяциях / Р.А. Зинченко (Мамедова), Г.И. Ельчинова, С.Д. Нурбаев, Е.К. Гинтер // Генетика. 2001. - Т. 37, № 3. -С. 373-385.

33. Зубова, С.Г. Роль молекул адгезии в процессе распознавания чужеродных и трансформированных клеток макрофагами млекопитающих / С.Г. Зубова, В.Б. Окулов//Усп. совр. биол. 2001. - Т. 121, № 1. - С. 59-66.

34. Канцерогенез / Под ред. проф. Д.Г. Заридзе. М.: Научный мир. 2000. - 745 с.

35. Карр, Ян. Макрофаги: Обзор ультраструктуры и функций / Ян. Карр // М.: Медицина. 1978. - 189с.

36. Карнаухов, В.Н. Люминесцентный спектральный анализ клетки / В.Н. Карнаухов. М.: Наука. - 1978. - 208 с.

37. Карпухин, А.В. Наследственная предрасположенность к раку молочной железы / А.В. Карпухин, А.Н. Логинова, Е.А. Хомич, Н.И. Поспехова // Медицинская генетика. 2002. - Т. 1, № 6. - С. 254-261.

38. Кетлинский, С.А. Эндогенные иммуномодуляторы / С.А. Кетлинский, А.С. Симбирцев, А.А.Воробьев. СПб: Гиппократ. - 1992. - 256 с.

39. Клебанов, Г.И. Клеточный механизм прайминга и активации фагоцитов / Г.И. Клебанов, Ю.А. Владимиров // Усп. совр. биол. 1999. - № 5. - С. 462-475.

40. Козначеев, К.С. Функция гена р53/ К.С Козначеев, Ф.Г.Румянцев, И.Г Мустафин // Биохимия. 2001. - № 2. - С. 366-370.

41. Кондрашова, М.Н. Отрицательные аэроионы и активные формы кислорода / М.Н. Кондрашова // Биохимия. 1999. - Т.64. - Вып.З. - С. 430432.

42. Коршунов, А.Г. Иммуногистохимическое изучение экспрессии онкобелка р53 в астроцитарных глиомах больших полушарий головного мозга / А.Г. Коршунов, Р.В. Сычёва // Арх. пат. 1996. - Вып.6 - С. 37-42.

43. Коршунов, А.Г. Иммуногистохимическое изучение апоптоза в глистомах больших полушарий головного мозга / А.Г. Коршунов, Р.В. Сычёва, А.В. Голанов // Арх. пат. 1998. - Вып.З - С. 23-27.

44. Красильников, В.А. Состав фосфолипидов ядерного матрикса раковых клеток / В.А. Красильников // Архив патологии. 1999. - Т. 43. - № 1. -С. 12-16.

45. Красильников, В.А. Сигнальные пути регулируемые фосфоинозит-3-киназой и их значение для роста, выживаемости и злокачественной трансформации клеток / В.А. Красильников // Биохимия. 2000. - № 1. — С. 68- 75.

46. Крутецкая, З.И. Структурно-функциональная организация G белков и связанных с ними рецепторов/ З.И. Крутецкая, О.Е. Лебедев // Цитология.-1992.-№11.-С.24-412+

47. Крутецкая, З.И. Механизмы регуляции входа Са в перитонеальные макрофаги крысы / З.И. Крутецкая, О.Е. Лебедев // В матер. Междунар. Конф.: Рецепция и внутриклеточная сигнализация. Пущино-на-Оке. 1998. - С. 30-32.

48. Кузина, A.M. Липиды в над молекулярном комплексе ДНК. тимуса и печени крыс / A.M. Кузина, И.К. Коломейцева, С.Д. Стразина // ДАН СССР. -1985.-Т. 85.-С.1189-1191.

49. Кушлинский, Н.Е. Современные возможности молекулярно-биохимических методов оценки биологического «поведения» рака молочной железы / Н.Е. Кушлинский, Е.С. Герштейн // Вест. РАМН. 2001. - № 9. - С. 65-70.

50. Лобанова, Ю.С. Эстрогензависимый апоптоз в клетках рака молочной железы: роль сигнального пути, регулируемого NF-kB / Ю.С. Лобанова, A.M. Щербаков, В.А. Шатская и др. // Биохимия. 2007. - Т. 72. - Вып. 3. - С. 392-401.

51. Любченко, Л.Н. Клинико-молекулярная патология наследственного рака молочной железы и яичников / Л.Н. Любченко, Н.И., Поспехова, С.М. Портной и др. // Вестник Московского Онкологического Общества. 2005. — №2.-С. 3-4.

52. Мамедова, Р.А. Медико-генетическое описание населения двух районов Краснодарского края / Р.А. Мамедова, М.Ю. Кадошникова, В.А. Галкина и др. // Генетика. 1999. - Т. 35, № 1. - С. 68-73.

53. Манских, В.Н. Пути гибели клетки и их биологическое значение /

54. B.Н. Манских // Цитология. 2007. - Т. 49. - № 11. - С. 909-915.

55. Маянский, А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге / А.Н. Маянский, Д.Н. Маянский // Новосибирск: Наука. 1989. - 344 с.

56. Меньшикова, Е.Б. Активные кислородные метаболиты в биологических системах / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи соврем, биологии. 1993. - № 3. - С. 286-296.

57. Меньшикова, Е.Б. Окислительный стресс при воспалении/ Е.Б. Меньшикова, Н.К.Зенков // Успехи современной биологии. 1999. - № 2. - С. 1056-1063.

58. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / Под ред. С. Херингтона, Дж. Маке. М.: Мир. - 1999. - 358 с.

59. Мурзина, Н.П. Лейкоцитарная формула (лейкоцитограмма, Differential White Blood Cell Count) / Н.П. Мурзина. 2006.

60. Мушкамбаров, Н.Н. Молекулярная биология / Н.Н. Мушкамбаров,

61. C.Л. Кузнецов. М.: МИА. 2003. - 535 с.

62. Новиков, B.C. Физиологические аспекты апоптоза/ В.С.Новиков, В.Н.Цыган // Российский физиологический журнал им.И.М.Сеченова. 1997. -№4.-С. 344-350.

63. Новожилова, А.П. Механизмы клеточной смерти: проблемы и перспективы / А.П. Новожилова, А.Н. Плужников, B.C. Новиков // Программированная клеточная гибель. СПб.: Наука. - 1996. - С. 22-26.

64. Пальцев, М.А. Цитокины и их роль в межклеточных взаимоотношениях / М.А. Пальцев // Арх. пат. 1996. - Вып. 6 - С. 37.

65. Пальцев, М.А. Мелкоклеточный рак и карциноиды легких: морфология апоптоза и экспрессия биомолекулярных маркеров опухолевого роста / М.А. Пальцев, С.А. Демура, Е.А. Коган // Арх. пат. 2000. - Вып. 5. - С. 11-17.

66. Петухов, В.И. Роль Fas-опосредованного апоптоза в реализации противоопухолевого эффекта а-интерферона при хроническом миелолейкозе / В.И. Петухов // Гематол. трансфузиол. 2000. - № 4. - С. 29-33.

67. Пинаев, Г.П. Свободнорадикальные повреждения ядерного генетического аппарата клетки / Г.П. Пинаев, В.А. Стручков, Ю.И. Губский // Укр. биохим. журн. 1994. -Т .66. -№ 4. - С. 18-30.

68. Погорелов, В.М. Морфология апоптоза при нормальном и патологическом апоптозе / В.М. Погорелов, Г.И. Козинец // Гематол. трансфузиол. 1995. -№ 5. - С. 17-24.

69. Попова, Е.Н. Регуляция фосфоинозитид специфичной фосфолипазы С / Е.Н. Попова, О.Ю. Плетюшкина, Л.Ю. Щепкина // Биохимия. - 2002 . - № 2. -С. 265-270.

70. Попов, Л.С. Генетически программированная смерть клеток (апоптоз) / Л.С. Попов, Л.И. Корочкин // Генетика. 2004. - Т. 40. - № 2. - С. 149-166.

71. Проказова, Н.В. Влияние лизофосфатидилхолина на передачу трансмембранного сигнала внутрь клетки / Н.В. Проказова, Н.Д. Звездина, А.А. Коротаева // Биохимия. 1998. - № 1. - С. 38-46.

72. Проскуряков, С .Я. Некроз активная управляемая форма программируемой клеточной гибели / С.Я. Проскуряков, B.JI. Габай, А.Г. Конопляников // Биохимия. - 2002. - Т. 67. - Вып. 4. - С. 467-491.

73. Райхлин, Н.Т. Скорость роста опухолевых клеток, лекарственная устойчивость и апоптоз / Н.Т. Райхлин // Актуальные вопросы патологической анатомии. Челябинск. - 1996. - С. 32-33.

74. Райхлин, Н.Т. Регуляция и проявления апоптоза в физиологических условиях и в опухолях / Н.Т. Райхлин, А.Н. Райхлин // Вопросы онкологии. -2002. Т.48. - № 2. - С. 159-171.

75. Самуилов, В.Д. Программируемая клеточная смерть / В.Д.Самуилов,

76. A.В.Олескин, Е.М. Лагунова // Биохимия. 2000. - Т. 65. - Вып. 8. - С. 10291034.

77. Семиглазов, В.Ф. Минимальный рак молочной железы (профилактика, выявление, лечение) / В.Ф. Семиглазов, А.Г. Веснин, В.М. Моисеенко. СПб.: Гиппократ. - 1992. - 342 с.

78. Серов, В.В. Современная классификация хронических гепатитов /

79. B.В. Серов // Рус. мед. журн. 1996. - Т. 4. - № 3. - С. 180-182.

80. Скулачев, В.П. Снижение внутриклеточной концентрации 02 как особая форма дыхательной системы клетки / В.П. Скулачев // Биохимия. -1994. -№ 2. С. 1910-1912.

81. Слюсарь, Н.Н. Фосфолипидный состав ядерного матрикса саркомы Калоши / Н.Н. Слюсарь // Экспериментальная онкология. 1999. - Т. 14. - С. 135-140.

82. Смирнов, B.C. Иммунодифицитные состояния / B.C. Смирнов, И.С. Фрейдлин // СПб: Фолиант. 2000. - 568 с.

83. Соколовская, А.А. СД95-дефицитные клетки сублинии Jurkat/A4, усойчивые к лекарственно-индуцированному апоптозу / А.А. Соколовская, Т.Н. Заботина, Д.Ю. Блохин // Экспер. онкол. 2001. - Т. 23, №3. - С. 174-180.

84. Сторожаков, Г.И. Роль апоптоза в развитии атеросклероза, ишемии миокарда сердечной недостаточности/ Г.И. Сторожаков, Д.Б. Утешев // Сердечная недостаточность. 2000 г. - № 4. - С. 131-134.

85. Стражевская, Н.Б. Структурная липидомика: ДНК-связанные липиды эухроматина, гетерохроматина и ядерного матрикса тимуса и печени крыс / Н.Б. Стражевская, Р.И. Жданов, А.А. Кубатиев // Патогенез. 2004. - № 1. - С. 4-8.

86. Стручков, В.А. Структурные и функциональные аспекты ядерных липидов нормальных и опухолевых клеток / В.А. Стручков // Биохимия. -2000. Т.65. - № 5. - С. 620-643.

87. Стручков, В.А. ДНК-связанные липиды клеток асцитной гепатомы Зейдела и асцитного рака Эрлиха/ В.А.Стручков, Н.Б Стражевская // Экспериментальная онкология. 1989. - Т.П. -№ 1. - С. 35-39.

88. Стручков В.А., Стражевская Н.Б. ДНК-связанные липиды: состав и возможные функции // Биохимия. 1993. - Т. 58. - № 8. - С. 1154-1175.

89. Стручков, В.А. Структурные и функциональные аспекты ядерных липидов нормальных и опухолевых клеток/ В.А.Стручков, Н.Б Стражевская // Биохимия. 2000. - Т.65. - Вып. 5. - С.620-643.

90. Терентьев, А.А. Жирнокислотный состав хроматина крыс при гепатоцилюлярном раке / А.А. Терентьев, Ю.А. Кузьмин // Архив патологии. -1989. Т.42, № 12. - С. 1229-1234.

91. Терентьев, А.А. Изменения структурной организации нуклеосомной нити в процессе активации протоонкогенов / А.А. Терентьев, Г.В. Костюк, П.Я. Бойков//Биохимия. 1998. - Т. 63. - Вып. 2. - С. 183-189.

92. Тихомирова, О.С. Мутации гена BRCA 1, обнаруженные у больных семейными формами рака молочной железы г. Санкт-Петербурга / О.С. Тихомирова, Н.А. Грудинина, В.И. Голубков, Т.В. Брежнева, В.Б.

93. Васильев, К.П. Хансон, М.Ю. Мандельштам // Медицинская генетика. 2005. - Т. 4, № 6. - 276 с.

94. Ткачук, В.А. Фосфоинозитидный обмен и осцилляция ионов Са2+ / В.А. Ткачук // Биохимия. 1999. - № 1. - С. 47-56.

95. Трофимов, В.А. Влияние перекиси водорода на спектр липидов в перитонеальных макрофагах и их ядрах / В.А. Трофимов, О.Н. Аксенова, А.А. Дудко, А.П. Власов // Современные наукоемкие технологии. 2004. - № 3. — С. 92-93.

96. Трофимов, В.А. Характеристика спектра липидов фракций хроматина клеток печени мышей после частичной гепатэктомии / В.А. Трофимов, А.А. Дудко // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. - Т. 141, №1. - С.85-88,

97. Турпаев, К.Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов / К.Т. Турпаев // Биохимия. 2002. - Т. 67. - вып.З. - С. 339-352.

98. Федоров, Б. Лопухов, Л. /Тезисы докладов II всесоюзного биохимического общества (май 1997). Москва.-1997.-4.ч.II.-С.473-475.

99. Филиппов, П.П. Как внешние сигналы передаются внутрь клетки / П.П. Филиппов // Соров. Образов, журн. 1998. - №3.-С. 28-34.

100. Фильченков, А.А. Апоптоз и рак / А.А. Фильченков, Р.С. Стойка // Киев: Морион. 1999. - 184 с.

101. Фрейфельд, Е.И. Гематология / Е.И. Фрейфельд. М. 1947. - 374 с.

102. Хансон, К.П. Апоптоз: молекулярные механизмы и роль в биологии и медицины / К.П. Хансон // Вопросы медицинской химии. 1997. - № 5. - С. 402-407.

103. Хансон, К.П. Апоптоз: современное состояние проблемы / К.П. Хансон // Известия АН. Серия биологическая. 1998. - № 2. - С. 134-141.

104. Хышиктуев, Б.С. Жирнокислотный состав липидов плазмы крови и эритроцитов у больных раком легкого / Б.С. Хышиктуев, Н.А. Хышиктуева, В.Н. Иванова, С.Д. Даренская, С.В. Новиков // Вопросы медицинской химии. -1994.-№5.-С. 48-50.

105. Цыпленкова, В.Г. Апоптоз/ В .Г Цыпленкова, Н.Н. Бескровнова // Архивы патологии. 1996. -№5. -С. 1015-1020.

106. Чумаков, П.М. Роль гена р 53 в программированной клеточной гибели / П.М. Чумаков // Известия РАН. Серия биологическая. 1998. - С. 151156.

107. Чумаков, П.М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью / П.М. Чумаков // Биохимия. 2000. - Т. 65, №1. - С. 34-47.

108. Шпигель, С. Роль сфингозин-1-фосфата в росте, дифференцировке и смерти клеток / С. Шпигель // Биохимия. 1998. - Т. 63. - С. 83-88.

109. Штам, Т.А. Чувствительность к тамоксифену клеток опухоли молочной железы MCF-7 не зависит от уровня экспрессии гена р53 / Т.А. Штам, Р.А. Пантина, Е.Ю. Варфоломеева, М.В. Филатов // Вопросы онкологии. 2007. - Т. 53, № 2. - С. 194-199.

110. Штиль, А.А. Развитие множественной лекарственной устойчивости как срочный ответ клетки на экзогенные воздействия / А.А. Штиль // Биол. мембраны. 2003. - Т. 20, №3. - С. 236-243.

111. Щербаков, В.И. Макрофаги: новая функция рострегулирующая /

112. B.И. Щербаков // Усп. совр. биол. 1990. - № 1. - С. 106-119.

113. Щербаков, A.M. Фактор роста эндотелия сосудов, его рецепторы и антиапоптотические белки BCL-2 и Akt при раке молочной железы / A.M. Щербаков, Е.С. Герштейн, О.А. Анурова и др. // Маммология. 2006. - №3.1. C. 63-69.

114. Элиот, В. Биохимия и молекулярная биология / В. Элиот, Д. Элиот. М.: НИИБМХ. 1999. - 372 с.

115. Adam-Klages, S. FAN: A tumor necrosis factor (TNF) receptor associated protein involved in intracellular signaling / S. Adam-Klages, D. Adam, K.

116. Wiegmann, S. Struve, W. Kolamus, J. Schneider-Mergener, M. Kronke // Eur. Cytokine Netw. 1996. - V. 7. - P. 197.

117. Alan, W. Signalling shortcuts: cell-surface receptors in the nucleus / W. Alan, M. Ulrich // Nat. Rev. Molecular Cell Biologi. 2002. - Vol. 3. - P. 697-702.

118. Albi, E. Sphingomyelin synthase in rat liver nuclear membrane and chromatin / E. Albi, M.V. Magni // FEBS Letters. 1999. - Vol. 460. - P. 369-372.

119. Albi, E. A possible role of cholesterol-sphingomyelin/phosphatidylcholine in nuclear matrix during rat liver regeneration / E. Albi, S. Cataldi, G. Rossi, M.V. Magni // Journal of Hepatology. 2003. - Vol. 38. - P. 623-628.

120. Amundson, S.A. Roles for p53 in growth arrest and apoptosis: putting on the brakes after genotoxic stress / S.A. Amundson, T.G. Myers, A.J.jr. Fomace // Oncogene. 1998. - V. 17. - P. 3287-3289.

121. Ashkenazi, A. Death receptors. Signaling and modulation / A. Ashkenazi, V.M. Dherin//Science. 1998.-V. 281.-P. 1305-1308.

122. Balint, Zs. Lipids as integral constituents of nuclear and chromatin fractions in Ehrlich ascites tumor cells / Zs. Balint // Bsic Appl. Histochem. 1987. -V. 31, №3,-P. 365-376.

123. Barnard, J. A. The cell biology of transforming growth factor beta / J. A. Barnard, R.M. Lyons, H.L. Mases // Biochem. Biophys. Acta. - 1990. - V. 1032. -P. 79-87.

124. Benjamini, E. Immunology, a short course / E. Benjamini, G. Sunshine, S. Leskowitz. WILEY - LISS, New York. - 1996. - 451 p.

125. Berridge, M.J. Elementary and global aspects of calcium signaling / M.J. Berridge // J. Exper. Biol. 1997 a. - V. 200.-P. 315-319.

126. Berridge, M.J. Calcium a life and death signal / M.J. Berridge, M.D. Bootman, P. Lipp//Nature. - 1998.- V. 395. -№ 6703.-P. 645-648.

127. Berridge, M.J. Inositol trisphosphate and calciuml signaling / M.J. Berridge//Nature. 1993. -V. 361. № 6410. - P. 315-325.

128. BIC date base online, http://www.nhgri.nih.gov/.

129. Beutler, В. Tumor necrosis factor in the pathogenesis of infectious diseases / B. Beutler, G.E. Grau // Crit. Care Med. 1993. - V. 21. - P. 423.

130. Beyaert, R. Molecular mechanisms of tumor necrosis factor-induced cytotoxicity.What we do understand and what we do not / R. Beyaert, W. Fiers // FEBS Letter. 1994. - V. 340. - P. 9.

131. В iron, Ch. Effects of IL-12 on immune responses to microbial infections: a key mediator in regulating disease outcome / Ch. Biron, R. Gazzinelly // Current Opinion in Immunology. 1995. - V. 6. - P. 485-493.

132. Boesze-Battaglia, K. Collagen-induced changes in platelet membrane lipid asymmetry / K. Boesze-Battaglia, R.J. Schimmell // Biophys. J. 1994. — V. 66.-N2.-Pt. 2.-P. 60.

133. Bona, C. Textbook of immunologi, sekond ed / C. Bona, F. Bonilla. -Harwood Acad. Publ., Amsterdam. 1996. - 406 p.

134. Bortner, C.D. The role of DNA fragmentation in apoptosis / C.D. Bortner, N.B.E. Oldenburg, J.A. Cidlowski // Trends in Cell Biol. 1995. - V. 5. - P. 21.

135. Budowle, B.R. Nondetectability of restriction fragments and independence of DNA fragment sizes within and between loci in RFLP typing of DNA / B.R. Budowle, Y. Chakraborty, L. Jin Zhong // Am J Hum Genet. 1994. -V. 55(2).- №8.-P. 391-401.

136. Bursch, W. Cell de ath by apoptosis / W. Bursch // Growth regulation and carcinogenesis. 1992. Vol. 2. P. 327-341.

137. Butthe, T.M. Oxidative stress as a mediator of apoptosis / T.M. Butthe, P.A. Sadstrom // Immunol. Today. 1994. - V. 15. - P. 7-10.

138. Cifone, M.G. Multiplle patways originate at the Fas/Apo-1 (CD95) receptor: sequential involvement of phosphatidylcholine-specific phospholipase С and acidic sphingomyelinase in the propagation of the apoptotic signal / M.G. Cifone,

139. P. Roncaioli, R. De Maria, G. Camarda, A. Santoni, G. Ruberti, R. Testi // EMBO J.- 1995.-V. 14.-P. 5859.

140. Cocco, L. Nuclear localization and signalling activity of inositol lipids./ L.Cocco, N.M.Maraldi, S.Capitani, A.M.Martelli, F.A.Manzoli //J. Anat. Embryol. -2001.-V. 106. Suppl l.-P. 31-43.

141. Cocco, L. New frontiers of inositide-specific phospholipase С in nuclear signalling./ L. Cocco, N.M. Maraldi, F.A.Manzoli //Eur. J. Histochem. 2004. - V. 48.-N l.-P. 83-88.

142. Couch, F. BRCA 2 germline mutations in male breast cancer cases in breast cancer families / F. Couch, L. Farid, M. DeShano // Nat. Gen. 1996. - V. 13. -P. 123-125.

143. Currach, M.E. bax- deficiency promotes drug resistance and oncogenic transformation by attenuating p53-dependent apoptosis / M.E. Currach, T.M.F. Connor, C.M. Knudson // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1997. - V. 94.- P. 23452349.

144. Danoff, S.K. Characterization of a membrane protein from mtdifing the inhibitton of inasitol 1,4,5,-triphosfati / S.K. Danoff, S.H. Snyder // Biochim. -1998. -N3.-P. 5-9.

145. Dinarello, C. The role of interleukin-1 in disease / C. Dinarello, S. Wolff // N. Engl. J. Med. 1993. - V. 328. - P. 106-115.

146. Dobash, Y. Overexpression of p53 as a possible prognostic factor in human thyroid carcinoma / Y. Dobash, A. Sakamoto, H. Sigimura // Amer. J. Surg. Path. 1993.-V. 17.-P. 375-381.

147. Downey, G.P. Intracellular signalling in neutrophil priming and activation. / G.P. Downey, T. Fukushima, L. Fialkow, Т.К. Waddel // Cell Biology. -1995.-V. 6.-P. 345-356.

148. Duffy, M.J. Biochemical markers in breast cancer: Which ones are clinically usefue? / M.J. Duffy // Clin. Biochem. 2001. - Vol. 34. - P. 347-352.

149. Ford, D. Genetic heterogeneity and penetrance analysis of the BRCA 1 and BRCA 2 genes in breast cancer families / D. Ford, D. Easton, M. Stratton // Am J Hum Genet. 1998. - Vol. 62. - P. 676-689.

150. Galazka, K. Apoptosis and proliferative activity in primary gastric lymphoma / K. Galazka, J. Stachura // Virch. Arch. 1999. - V. 435. - P. 244.

151. Gao, X. Recessive oncogenes: current ststus / X. Gao, K. Honn // Path. Oncol. Res. 1995. - V. 1. - P. 7-22.

152. Gayther, S. Frequently occring germ line mutations of BRCA 1 gene / S. Gayther // Am J Hum Genet. 1997. - V. 60. - P. 1013-1020.

153. Gordon, S. Molecular immunobiology of macrophages: recent progress / S. Gordon, S. Clarke, D. Greaves, A. Doile // Current Opinion in Immunology. -1995.-V. 7.-P. 24-33.

154. Hale, A.J. Apoptosis: molecular regulation of cell death / A.J. Hale, C.A. Smith, L.C. Sutherland, V.E. Stoneman, V.L. Longhthorne, A.C. Culhane, G.T. Williams // The European Journal of Biochemistry. 1996. - V. 236. - P. 1-26.

155. Hanahan, D. The hallmarks of cancer / D. Hanahan, R.A. Weinberg // Cell. 2000. - V. 100. - P. 57-70.

156. Hannun, Y.A. The sphingomyelin cycle: a prototypic sphingolipid signaling pathway// Y.A.Hannun, R.M.Bell // Adv. Lipid. Res. 1993. - V. 25. -Nl.-P. 27-41.

157. Hannun, Y.A. The sphingomyelin cycle and the second messenger function of ceramide / Y.A. Hannun // J. Biol Chem. 1994. - N5. - P. 3125-3128.

158. Haslett, C. Why is apoptosis important to clinicians? / C. Haslett, J. Savill //BMJ.-2001.-V. 322.-P. 1499-1509.

159. Heinrich, P. Interleukin-6 and the acute phase response / P. Heinrich, J. Castell, T. Andus // Biochem. J. 1990. - V. 265. - P. 621-629.

160. Jabs, T. Reactive oxygen interneediates as mediators of programneed cell death in plants and animals / T. Jabs // Biochem. Pharmacol. 1999. - № 3. - P.231-245.

161. Janeway, ChA. Immunobiology / Ch.A. Janeway, P. Travers // London: Current Biology Ltd. 1994. - 480 p.

162. Jones, D.R. Linking lipids to chromatin / D.R Jones, N. Divecha // Curr. Opin. Genet. Dev. 2004. - N 2. - P. 196-202.

163. Kehrl, J. Transforming growth factor-is a potent negative regulator of human lymphocytes / J. Kehrl, A. Taylor, S. Kim, A. Fauci // Ann. N. Y. Acad. Sci. -1991.-V. 628.-P. 345-354.

164. Kobayashi, D. Protein kinase с inhibitors augment tumornecrosis factor - induced apoptosis in normal human diploid cells / D. Kobayashi, N. Watanabe, N. Yamauchi // Chemotherapy. - 1997. - V. 43. - P. 415-423.

165. Lever, A.F. Is Cancer releted to hypertension or to its treatment? / A.F. Lever, D.J. Hole, G.T. Mclnnes // Clin. Esper. Hypertens. 1999. - V. 21. - № 5/6. -P. 937-946.

166. Liscovitch, M. Crosstalk among multiple signal-activated phospholipases / M. Liscovitch // Trends in Biochem Sci. 1992. - V. 17. - P. 393.

167. Lowe, S.W. Apoptosis in cancer / S.W. Lowe, A.W. Lin // Carcinogenesis. 2000. - V. 21. - 3. P. 485-495.

168. Luttrell, L.M. G-protein-coupled receptors and their regulation / L.M. Luttrell // Adv. Second Messenger Phosphohrotein Res. 1997. - № 31. - P. 263277.

169. Malkin, D. Germ-line p53 mutations in a familial syndrome of breast cancer, sarcomas and othe neoplasms / D. Malkin, F. Li, L. Strong // Science. 1990. -V. 250.-P. 1233.

170. Maraldi, N.M. Nuclear lipid-dependent signal transduction in human osteosarcoma cells / N.M.Maraldi, S.Marmiroli, L.Cocco, S.Capitani, O. Barnabei, F.A.Manzoli //Adv. Enzyme Regul. 1997. - V. 37. - P. 351-375.

171. Marshall, C.J. Specificity of receptor tyrosine kinase signalindg / C.J. Marshall // Cell. 1995. - № 64. - P. 310-319.

172. Martelli, A.M. The generation of lipid signaling molecules in the nucleus. / A.M.Martelli, S.Capitani, L.M.Neri // Prog Lipid Res. 1999. - V. 38. - N 4. - P. 273-308.

173. Martelli, A.M. Nuclear inositol lipid signaling and its potential involvement in malignant transformation / A.M. Martell, L. Manzoli, I. Faenza, R. Bortul, A. Billi, L. Cocco // Biochim. Biophys. Acta. 2002. - V. 1603. - N 1. - P. 7-11.

174. Martelli, A.M. Nuclear inositides: facts and perspectives / A.M. Martelli, L. Manzoli, L. Cocco // Pharmacology & Therapeutics. 2004. - V. 101. - P. 47-64.

175. Muller, G. PKC zeta is a molecular switch in signal transduction of TNF-a, bifunctionally regulated by ceramide and arachidonic acid / G. Muller, M. Ayoub, P. Storz, J. Rennecke, D. Fabbro, K. Fflzenmaier // EMBO J. 1995. - V. 14. - P. 1961.

176. Nakamura, H. Redox regulation of cellular activation / H. Nakamura, K. Nakamura, J. Yodoi // Annu. Rev. Immunol. 1997. - V. 15. - P. 351-369.

177. Nathanson, K. Breast cancer genetics: what we know and what we need / K. Nathanson, R. Wooster, B. Weber // Nat. Med. 2001. - V. 7. - P. 552-556.

178. Obeid, L.M. Programmed cell death induced by ceramide / L.M. Obeid, C.M. Linardic, L.A. Koralak, Y.A. Hannum // Science. 1993. - V. 259. - P. 1769.

179. O'Connor, L. Apoptosis and cell division / L. O'Connor, D.C. Huang, L.A. O'Reilly // Curr. Opin. Cell. Biol. 2000. - V. 12. - P. 257-263.

180. Ohta, H. A possible role of sphingosine in induction of apoptosis by tumor necrosis factor a in human neutrophilis / H. Ohta, Y. Yatomi, E.A. Sweeney, S. Hakomori, Y. Igarashi // FEBS Lett. 1994. - V. 355. - P. 267.

181. Osborn, B.A. Essential genes that regulate apoptosis / B.A. Osborn, L.M. Schwartz // Trends in Cell Biol. 1994. - V. 4. - P. 245-248.

182. Pandolfi, F. A population of sheep rosetting cells lacking T- and monocytic-specific antigens, as detected by monoclonal antibodies / F. Pandolfi, I. Quinti, G. De Rossi et. al. // Clin. Immunol. Immunopathol. V. 22. - 1982. -P. 331.

183. Pardon, J.F. Lipids of politens and metafase chromasom / J.F. Pardon, M.N.F. Wilkins//NewEngl.J.Med.- 1997.-V. 336.-P. 1276-1282.

184. Parmer, P.M. Nitric oxide induces apoptosis/ P.M Parmer, A.G. Ferrge // Nature. 1993.-P. 524-525.

185. Seely, A,J. Cell membrane expression (connectivity) regulates neutrophil delivery, function and clearance. / A.J. Seely, J.L. Pascual, N.V. Christou // Crit. Care.-2003. -V. 7.-P. 291-307.

186. Shwartz, L.M. Cold throughts of death: the role of ICE proteases in neuronal cells death / L.M. Shwartz, C.E. Milligan // Trends in Neurosci. 1996. -V. 19.-P. 555-562.

187. Smith, M.R. Phospholipase C-gamma 1 can induce DNA synthesis by a mechanism independent of its lipase activity / M.R. Smith, Y.L. Liu, N.T. Matthews, S.G. Rhee, W.K. Sung, H.F. Kung // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994. - V. 91. -N 14.-P. 6554-6558.

188. Struchkov, V.A. DNA-bound lipids of normal and tumor cells: retrospective and outlooks for functional genomics / V.A. Struchkov, N.B. Strazhevskaya, R.I. Zhdanov // Bioelectrochem. 2002. - V. 58. - 1. - P. 23-30.

189. Suffys, P. TNF-mediated cytotoxicity is correlated with phospholipase A activity, but not with arachidonic acid release per se / P. Suffys, R. Beyaert, D. De Valck, B. Vanhaesebroeck, F. Van Roy, W. Fiers // Eur. J. Biochem. 1991. — V. 195.-P. 465.

190. Suliman, A. Intracellular mechanisms of TRAIL: apoptosis through mitochondrial-dependent and -independent pathways / A. Suliman, A. Lam, R. Datta, R.K. Srivastava // Oncogene. 2001. - V. 20. - 17. - P. 2122-2133.

191. Szabo, C. Population genetics of BRCA 1 and BRCA2 / C. Szabo, M.-C. King//Am J. Hum. Genet. 1997. - V. 60.-P. 1013-1020.

192. Tamija-Koizumi, K. Nuclear lipid metabolism and signaling / K. Tamija-Koizumi // J. Biochem. 2002. - V. 132, № i.p. 13-22.

193. Thelen, M. Neutrophil signal transduction and activation of the respiratory burst / M. Thelen, B. Dewald, M. Baggiolini // Physiol. Rev. 1993. - V. 73. - P. 797-821.

194. Theodarakis, P. Unmasking of prolifferation restraining activity of the anti-apoptosis / P. Theodarakis, C. D'sa-Eipper, T. Subramanian // Oncogene. 1996. -V. 12, №8.-P. 1707-1713.

195. Thomson, A.(Ed.) The Cytokine Hand book / A.(Ed.). Thomson // London: Acad. Press. 1992. -418 p.

196. Ulevitch, R.J. Recognitionol of Gram negative bacteria and endotoxin by the innate immune system / R.J. Ulevitch, P.S. Tobias // lurnet opinion in Immunology. - 1999. - V. 11. - P. 19-22.

197. Venkitaraman, A. Breast cancer genes and DNA repair / A. Venkitaraman // Science. 1999. - V. 286. - P. 1100-1102.

198. Wada, R. The possible association between expression of p53 and development in depresses type colorectal carcinoma / R. Wada, H. Miwa, H. Abe // Acta. Histochem. Cytochem. 1993. - V. 26. - P. 21-26.

199. Wang, H.-G. Apoptosis regulation by interaction of Bcl-2 protein and Raf-1 kinase / H.-G. Wang, T. Mijashika, S. Takajama // Oncogene. 1994. - V. 9. -P. 2751-2756.

200. Wang, H.-G. Apoptosis: a functional paradigm for programmed plant cell death induced by a host-selective phytotoxin and invoked during development / H.-G. Wang, R.M. Bostock, D.G. Gilchourist // Plant Cell. 1996. - № 8. - P. 375-391.

201. Wiegmann, K. Functional dichotomy of neutral and acidic sphingomyelinases in tumor necrosis factor signaling / K. Wiegmann, S. Schutze, T. Machleidt, S. Witte, M. Kronke // Cell. 1994. - V. 78. - P. 1005.

202. Yang, E. Bad, a heterodimeric partner for BCL-XL and BCL-2, displaces Bax and promotes cell death / E. Yang, J. Zha, J. Jockel // Cell. 1995. - V. 80. - P. 285-291.

203. Yao, B. Phosphorylation of Raf by ceramide-activated protein kinase / В. Yao, Y. Zhang, S. Dellkat, S. Mathiass, S. Basu, R. Kolesnick // Nature. 1995. - V. 378.-P. 307.

204. Yoshinori, N. Alarm lipids / N. Yoshinori // J. Biochem. 2002. - V. 131. -P. 283-284.

205. Zhang, H. Sphingosine stimulates cellular proliferation via a protein kinase C-independent pathway / H.Zhang, N.E.Buckley, K. Gibson, S.Spiegel // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265.-N l.-P. 76-81.

206. Zhdanov, R.I. Impact of lipid-DNA interaction //Micro- and nanostructures of biological systems. Ed. by Bishoff G. 2004. P. 133-159.

207. Zhou, X. Evidence for a local immune response in atherosclerosis. CD4+ T cells infiltrate lesions of apolipoprotein-E-deficient mice / X. Zhou, S. Stemme, G.K. Hansson // Am. J. Pathol. 1996. - V. 149. - 2. - P. 359-366.

208. Zweier, L. NADPH oxidase activation increases the sensitivity of intracellular Ca stores of inasitol 1,4,5,-triphosfati in human endothelial cell / L. Zweier, R.C. Jieglstin // Bioll.Chem. 2000. - N 21. - P. 1579-1585.

Информация о работе

Ромашкина, Марина Васильевна
кандидата биологических наук
Саранск, 2009
ВАК 03.00.25

Диссертация

Влияние липидов на индуцированный апоптоз моноцитов в норме и при раке молочной железы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы