Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Про- и антиоксидантный статус в динамике экспериментального рака шейки матки при действии лазерного излучения

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Про- и антиоксидантный статус в динамике экспериментального рака шейки матки при действии лазерного излучения"

На правах рукописи

ВОРОНОВА ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА

ПРО- И АНТИОКСИДАНТНЫЙ СТАТУС В ДИНАМИКЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО РАКА ШЕЙКИ МАТКИ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

03.03.01 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

з МАЯ 20/2

Ульяновск-2012

005016583

Работа выполнена на кафедре физиологии и патофизиологии в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Генинг Татьяна Петровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

зав. кафедрой физиологии труда и спорта ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет»

Гондарева Людмила Николаевна

доктор медицинских наук, профессор кафедры теоретической и прикладной психологии ФГБОУ ВПО «Тольятгинский

государственный университет» Якунин Валерий Ефимович

Ведущая организация: Федеральное государственное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный университет», г. Самара

Защита диссертации состоится «17» мая 2012 г. в Ю00 на заседании диссертационного совета Д 212.278.07 при ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» по адресу: г. Ульяновск, ул. Набережная реки Свияги, д. 106, корпус 1, ауд. 703.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ульяновского государственного университета, а с авторефератом - на сайте ВУЗа http://www.uni.ulsu.ru и на сайте высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации http://vak.ed.gov.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 432017, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, д. 42, Ульяновский государственный университет, управление научных исследований

Автореферат разослан 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

С.В. Пантелеев

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Необходимость исследования биомедицинской модели опухолевых заболеваний в настоящее время диктуется высокой распространенностью и смертностью от рака. Проблема злокачественного роста является на сегодня одной из самых актуальных в биологии и медицине [Максимов С.Я., 2012]. Показана роль активных форм кислорода (АФК) и инициируемого ими перекисного окисления липидов (ПОЛ) в механизмах канцерогенеза [Ланкин В.З., 2001; Das U.N., 2002]. АФК являются основным источником свободных радикалов, избыточное образование которых приводит к повреждающему действию на клетки [Фархутдинов P.P., 2011]. Важную роль в защите клеток от повреждающего действия АФК играет система антиоксидантной защиты (АОЗ) [Смирнова Л.П., 2002]. Снижение активности антиоксидантной системы или ее несостоятельность способствует повышению активности ПОЛ, что в конечном итоге приводит к мембранопатологическим процессам [Алексеева Н.В., 2000]. Состояние, при котором происходит активация ПОЛ на фоне депрессии или недостаточности естественных антиоксидантных систем называется окислительным стрессом. Соотношение про- и антиоксидантного статуса организма играет важную роль в возникновении и развитии неоплазмы [Чеснокова Н.П., 2004].

Рак шейки матки (РШМ) - одна из актуальных проблем онкогинекологии. По данным ВОЗ ежегодно в мире выявляется около 500 тысяч новых случаев, более 270 тысяч женщин умирают от РШМ [Waggoner S.E., 2003]. В России в последние десятилетия отмечается высокий показатель запущенности РШМ и увеличение числа больных молодого возраста [Морхов К.Ю., 2009].

Широкому использованию лазеров в онкологической клинике препятствует отсутствие единой точки зрения на возможность стимуляции пролиферации опухолевого узла и процессов метастазирования, невозможность воздействия в точных границах опухоли без повреждения здоровых тканей, а также отсутствие данных об изменении биологического портрета злокачественных опухолей различной тканевой организации при воздействии лазерного излучения (ЛИ) с различными параметрами.

В коррекции рака исходным повреждающим агентом преимущественно считают синглетный кислород, что объяснятся его высокой химической активностью [Захаров С.Д., 1999], который может участвовать в цепных свободно-радикальных реакциях, окислять аминокислоты в белках, гуанин в ДНК, инициировать ПОЛ [Schweitzer С., 2003]. Итогом подобных нарушений при превышении репаративных возможностей клетки становится ее деструкция. Светокислородный эффект (СКЭ) заключается в активировании или повреждении биосистем оптическим излучением (в зависимости от световой дозы) посредством прямого фотовозбуждения растворенного в них молекулярного кислорода в синглетное состояние [Захаров С.Д., 1999]. Л.В. Кореи с соавт. (2009) в работах по воздействию ЛИ на клетки опухоли установили, что облучение на длине волны 1268 нм приводит к образованию синглетного кислорода и индуцируемых им реакций окисления, так как ближний инфракрасный диапазон является спектром поглощения кислорода [Иванов A.B., 2003; Амбарцумян Р.В., 2004].

Показано, что существует определенная предельная мощность антиоксидантной системы клеток и (или) организма - антиоксидантная система успешно справляется только с определенным количеством свободных радикалов,

появляющихся в единицу времени [Кореи Л.В., 2009]. Если этот порог превысить, то можно ожидать появления необратимых повреждений, которые при достаточном количестве могут вызвать гибель клеток. Для увеличения СКЭ, вероятно, требуется увеличение интенсивности ЛИ, что возможно за счет увеличения импульсной мощности при сохранении средней мощности [Не Н„ 2009].

В соответствии с вышеизложенным, целью исследования было изучение про- и антиоксидангного статуса в динамике экспериментального рака шейки матки (РШМ-5) и при действии ЛИ.

Основные задачи исследования:

1. Изучить активность компонентов системы «перекисное окисление липидов -антиоксиданты» (ПОЛ-АО) в эритроцитах, плазме крови и опухолевой ткани мышей на разных стадиях роста экспериментального РШМ-5;

2. Оценить влияние фемтосекундного лазерного излучения (ФСЛИ) на параметры системы ПОЛ-АО в эритроцитах и плазме крови интактных мышей;

3. Оценить влияние излучения лазера вынужденного комбинационного рассеивания (ВКР) на параметры системы ПОЛ-АО в эритроцитах и плазме крови интактных мышей;

4. Исследовать влияние фемтосекундного (ФС) лазера на параметры компонентов системы ПОЛ-АО в эритроцитах, плазме крови и неоплазме мышей с РШМ-5;

5. Определить изменения в системе ПОЛ-АО в эритроцитах, плазме крови и неоплазме мышей с РШМ-5 после облучения ВКР-лазером;

6. Оценить морфометрические показатели опухолевой паренхимы и стромы в динамике роста опухоли и после воздействия лазерного излучения.

Научная новизна. Получены новые данные об изменении уровня ПОЛ и динамики показателей ферментативного звена антиоксидантной системы в эритроцитах, плазме крови и опухолевой ткани у мышей в динамике экспериментального РШМ. Проведена оценка влияния излучения фемтосекундного импульсного волоконного эрбиевого лазера с длиной волны 1550 нм и пиковой мощностью 6 кВт и излучения непрерывного высокоинтенсивного волоконного ВКР-лазера с рабочей мощностью 5,5 Вт и длиной волны 1265 нм, являющегося уникальной совместной разработкой института общей физики РАН и Центра Нанотехнологий УлГУ, на параметры, системы ПОЛ-АО в эритроцитах, плазме крови и неоплазме мышей с экспериментальным РШМ.

Научно-практическая значимость. Полученная в итоге проведенного фундаментального исследования система новых физиологических данных об особенностях процессов ПОЛ в динамике прогрессирования РШМ-5 представляет интерес для теоретических и прикладных разделов физиологии и патофизиологии, а также экспериментальной онкологии. Данные по состоянию системы ПОЛ-АО в процессе роста опухоли можно использовать в эксперименте и клинике, в частности, при проведении антиоксидантной коррекции. Исследования по использованию ЛИ могут быть положены в основу изучения практических аспектов применения этого физического фактора в качестве адъюванта эффективности специфического воздействия на неоплазму.

Положения, выносимые на защиту: 1. При прогрессировании экспериментального рака шейки матки система ПОЛ-АО в неоплазме, а также в плазме крови и эритроцитах организма-опухоленосителя переходит на более высокий уровень функционирования.

2. ФСЛИ с пиковой интенсивностью 1910,8 Вт/см2 и средней интенсивностью 0,398 мВт/см повышает уровень функционирования системы ПОЛ-АО в эритроцитах и плазме крови интактных мышей при дозе облучения 2,4 Дж/см2. Влияние непрерывного излучения ВКР-лазера со средней интенсивностью 0,177 Вт/см на интактных мышей имеет дозозависимый характер, повышает уровень функционирования системы ПОЛ-АО и не стимулирует в организме возникновение оксидативного стресса.

3. Воздействие ФСЛИ на мышей с экспериментальным РШМ на стадии интенсивного роста опухоли в дозах 2,4 и 3,6 Дж/см2 стимулирует в последней возникновение оксидативного стресса. Непрерывное облучение ВКР-лазером в дозе 1062 Дж/см2 мышей с экспериментальным РШМ стимулирует возникновение оксидативного стресса в неоплазме в фазу интенсивного роста опухоли.

4. Воздействие фемтосекундного лазера на неоплазму РШМ-5 дозозависимо повышает удельный объем некрозов при снижении удельного объема паренхимы, митотического и апоптотического индексов. Непрерывное излучение ВКР-лазера в тех же условиях не вызывает значимых морфологических изменений в неоплазме.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на Международной научной конференции "Наука и образование: фундаментальные основы, технологии, инновации" (Оренбург, 2010), Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и наука XXI века» (Ульяновск, 2010), SPIE BiOS Symposium (San Francisco, 2011), Всероссийской молодежной научной конференции Института физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН (Сыктывкар, 2011), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс» (Барнаул, 2011), Российской научно-практической конференции с элементами научной школы для молодежи «Модниковские чтения» (Ульяновск 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 5 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы! Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 рисунками и 11 таблицами. Список используемой литературы содержит 269 источников, из которых 120 иностранных авторов.

II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Объектом исследования послужили белые нелинейные половозрелые мыши, которые были разделены на контрольную и 5 опытных групп. В 1-ую опытную группу входили мыши с РШМ-5 на разных сутках после трансплантации опухоли (20-ые, 30-ые, 40-ые); во 2-ую - мыши подверженные воздействию ФСЛИ в динамике прогрессирования РШМ-5- в 3-ю -мыши с РШМ-5, облученные лазером ВКР на разных сроках роста опухоли (10-ые и 20-ые сутки после трансплантации); 4-ю и 5-ю опытные группы составили

интактные мыши, подверженные облучению ФС и ВКР-лазеров, соответственно, в установленных режимах.

Модель РШМ была воспроизведена на белых инбредных мышах массой не менее 20 г путем перевивки опухолевого штамма (НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН).

В качестве источников излучения использовались: 1) ФС эрбиевый лазер, излучающий в ближнем инфракрасном диапазоне (Х=1550 нм) и работающий в импульсным режиме (тимп=100-10"|5с) с пиковой мощностью — 6 кВт, средней мощностью — 1,25 мВт; 2) уникальный непрерывный высокоинтенсивный ВКР-лазер с рабочей мощностью 5,5 Вт и длиной волны 1265 нм, являющийся совместной разработкой института общей физики РАН и Центра Нанотехнологий Ульяновского государственного университета.

В контрольную группу входили здоровые половозрелые мыши возраста 2-4 месяцев. Животным 1-3 опытных групп перевивалась экспериментальная опухоль рака шейки матки РШМ-5. Животные 2й и Зй групп подвергались ежедневному 10-кратному лазерному облучению на разных сутках роста опухоли.

При облучении фемтосекундным лазером средняя плотность энергии на ткань (энергетическая доза) за одну процедуру составляла 0,24 Дж/см2 за 10 минут и 0,36 Дж/см2 за 15 минут, но при этом облучение проходило в импульсном режиме при огромной пиковой интенсивности, равной 1910,8 Вт/см. При 10-ти процедурах 10-ти минутного лазерного облучения суммарная энергетическая доза ЛИ за курс составила 2,4 Дж/см2. При 10-кратном облучении в режиме 15-ти минут на расстоянии 10 см суммарная плотность энергии на ткань составила 3,6 Дж/см .

Таблица 1

Схема эксперимента

Доза облучения Сроки после перевивки опухоли4^ без облучения О. -sf 1» -<ч ö IS е <т> & "•О ¡3 ГО 3 § »J 0П о. й К д о, Я сч >ч § о U ¿Т Д СО

без опухоли контроль Опыт 4а Опыт 46 Опыт 5а Опыт 56

20 сутки Опыт 1 Опыт 2а Опыт 26 - -

30 сутки Опыт 1 Опыт 2а Опыт 26 Опыт За Опыт 36

При облучении ВКР-лазером в режиме 10-ти минут доза высокоинтенсивного ЛИ составляла 106, 2 Дж/см , а при 2х-минутном облучении -21,2 Дж/см2, тем самым суммарная доза 10-ти сеансов в первом случае составила 1062 Дж/см2, а во втором - 212 Дж/см2.

Для исследования изменений в опухолевой ткани и крови при развитии экспериментальной опухоли и после воздействия ЛИ использовались биохимические и морфологические методы.

Биохимические методы исследования. Для биохимического исследования использовалась ткань опухоли, плазма крови и эритроциты.

Интенсивность ПОЛ оценивали по содержанию малонового диальдегида (МДА) в тесте с тиобарбитуровой кислотой по методу Андреевой Л.И. и др. (1988).

Для оценки деятельности системы АОЗ использовали звено ферментативных антиоксидантов, анализируя активность супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, глутатионредуктазы (ГР), глутатионтрансферазы (ГТ).

Определение активности СОД проводили по методу Дубининой Е.Е. (1989) и Nishikimi М. (1972); активности каталазы, ГТ и ГР оценивали по Карпищенко А.И. (1999). Активность антиоксидантных ферментов (АОФ) и уровень МДА пересчитывались на 1 мг белка для опухолевой ткани. Определение белка проводили по методу Брэдфорда [Bradford М.М, 1976].

Морфологические методы исследования. Опухолевый материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали в спиртах, заключали в парафин [Меркулов Г.А., 1969]. Из парафиновых блоков изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилин-эозиноном [Елисеев В.Г., 1967]. Для морфометрического исследования применялась компьютерная видео-тест система с программой денситофотометрии «Mecos С1». При анализе гистологических срезов производился расчет удельного объема опухолевой паренхимы, удельного объема опухолевой стромы, удельного объема участков некроза, митотического и апоптотического индексов. Апоптотические клетки определяли по Автандилову Г.Г. (1990) и Манских В.Н. (2004).

Статистическая значимость полученных результатов оценивалась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия между группами считали достоверными при р<0,05.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика роста опухоли Прививаемость опухоли составляет около 90%. Продолжительность жизни мышей с экспериментальной опухолью в среднем около 2,5-3 месяцев. В течение эксперимента наблюдался единичный падеж мышей с РШМ-5, количество павших животных увеличивается в динамике прогрессирования опухоли, начиная с 40-х суток после трансплантации.

Время после трансплантации опухоли Рис. 1. Динамика роста опухоли экспериментального рака шейки матки (РШМ-5)

7

РШМ-5 на инбредных мышах, локализованный подкожно, имеет сравнительно недолгий латентный период (6-12 дней), после чего опухоль интенсивно растет, на 21-ые сутки достигая среднего объема 0,55 см\ к 30-м суткам увеличиваясь еще вдвое, а к 40-м. практически, втрое (рис.1). Спонтанного рассасывания опухоли в течение эксперимента не наблюдалось.

Анализ системы ПОЛ-АО в эритроцитах, плазме крови и неоплазме мышей в динамике прогрессировать экспериментальной опухоли РШМ-5

Изучение уровня ПОЛ в эритроцитах мышей с экспериментальной опухолью показало, что у животных с РШМ-5 происходит статистически значимое увеличение содержания МДА с 219,65±7,57 мкмоль/л в контроле до 295,05-ь 15.33 мкмоль/л на 20-ые сутки после перевивки опухоли. В динамике прогрессирования РШМ-5 уровень МДЛ продолжает увеличиваться, достигая значения 325,94±14,36 мкмоль/л на 30-ые и 334,801-12,98 мкмоль/л ¡1а 40-ыс сутки после трансплантации опухоли.

Для оценки ферментативного звена системы АОЗ в эритроцитах оценивали уровень СОД, каталазы, ГТ, ГР.

СОД - фермент, катализирующий реакции дисмутации активных супероксидных радикалов с образованием перекиси водорода и воды. Он работает в каскаде с ферментами, способными разлагать перекись водорода - кагалазой и глутатионпероксидазой. По нашим данным, активность СОД в эритроцитах мышей с РШМ-5 на 20-ыс сутки после трансплантации опухоли увеличивается относительно контроля. В динамике роста опухоли на 30-ые сутки уровень СОД соответствует значению контроля, а на 40-ыс сутки достигает 2,55±0.13 у.е. (рис.2).

80

70

60

50

2.55*

40

30

20

10

2,5

и

У

■г а

0,5

40 сутки

Сроки после трансплантации опухоли

шаакатюаза, тюль с л СПЭГР. ммоль мин л 1^тТТ, .ммоль мин л —в—СОЛ-V.е.

Примечание: * - данные, статистически значимо отличающиеся от данных контроля. р<0,05

Рис. 2. Активность ферментов системы АОЗ в эритроцитах мышей на разных сроках после трансплантации РШМ-5

Полученные результаты соответствуют данным ряда исследователей о незначительном увеличении активности фермента на стадии интенсивного роста РШМ [Антонеева И.И., 2010].

Активность каталазы, по результатам нашего исследования, в эритроцитах мышей с РШМ-5 стабильно возрастает с увеличением сроков роста опухоли (рис. 2), что соответствует данным ряда исследований о повышении каталазной активности эритроцитов в процессе роста опухоли [Чулкова C.B., 2011; Антонеева И.И., 2010; Розенко Л.Я., 2010].

ГТ и ГР являются глутатионзависимыми ферментами. ГТ - фермент системы антиоксидантной защиты класса трансфераз, который катализирует реакции обезвреживания свободных радикалов, проходящие с участием глутатиона восстановленного GSH. ГР — фермент, катализирующий НАДФ'Н-зависимое восстановление окисленного глутатиона GSSG и поддерживающий внутриклеточный пул глутатиона в восстановленном состоянии [Noctor G., 2002].

Уровень ГТ достоверно увеличивается в динамике роста РШМ-5 и составляет 0,39±0,06 ммоль/мнн/л на 20-ые, 0,56±0,06 ммоль/мин/л на 30-ые и 0,64±0,08 ммоль/мин/л на 40-ые сутки после трансплантации опухоли (против 0,14±0,02 ммоль/мин/л в контроле). Уровень ГР в эритроцитах контрольных и опытных мышей изменяется аналогично уровню ГТ (рис. 2), что может быть связано с повышением содержания глутатиона окисленного.

Концентрация МДА в плазме крови, возможно, отражает активность процессов перекисного окисления липидов в организме [Арутюнян A.B., 2000]. Результаты наших исследований показали, что уровень МДА в плазме крови статистически значимо возрастает относительно контроля только на 30-ые сутки после перевивки опухоли и продолжает увеличиваться к 40-ым (рис. 3).

интактный 20 сутки 30 сутки 40 сутки

контроль

Сроки после трансплантации опухоли

Примечание: * - данные, статистически значимо отличающиеся от данных контроля, р<0,05

Рис. 3. Уровень МДА в плазме крови мышей на разных сроках после трансплантации РШМ-5

Ферментативная активность Г'Г в плазме крови мышей с РШМ-5 увеличивается с ростом опухоли. Уровень ГР в плазме мышей с РШМ-5 достоверно выше, чем в контроле, па 20-ые и 40-ые сутки после перевивки опухоли, однако, на 30-ые сутки наблюдается заметное понижение активности 'этого фермента. Каталаза меняет свою активность в динамике прогрессирования РШМ-5, принимая достоверные значения то выше, то ниже контроля (табл. 2).

Таблица 2

Уровень компонентов АОЗ в плазме крови мышей в динамике прогрессирования опухоли РШМ-5

лоф. ед. изм. Сроки после перевикки"\ Каталаза Ммоль/с/л ГР Ммоль/мин/л ГТ Ммоль/мин/л

Контроль 0.100±0.019 0,014±0,004 0,016±0,003

20 сутки (п=18) 0,053±0,087 0.040±0.008* 0.027±0,003*

30 сутки (п=14) 0,211±0,061* 0,005±0,001 * 0,038±0,003*

40 сутки (п—16) 0,035±0,043* 0.039+0.002* 0.043±0.002*

Примечание: * - данные, статистически значимо отличающиеся от данных контроля, р<(), 05

Результаты исследования свидетельствуют о накоплении МДА в крови опухолевых животных при прогрессировании опухоли. Анализ компонентов антиоксидантной системы в эритроцитах и плазме крови показал, что их активность изменяется разнонаправлено на разных стадиях развития опухоли. В эритроцитах наблюдается статистически значимое повышение антиоксидантной активности (АОА). Изменения активности антиоксидантов в плазме крови в процессе роста опухоли не соответствуют таковым в эритроцитах: уровень каталазы и ГР изменяется волнообразно, в отличие от нарастающей динамики в эритроцитах. Разнонаправленная динамика изменений в системе АОЗ может свидетельствовать о нарушении равновесия в системе 1 ЮЛ-АО.

Показатели уровня океидативного стресса в ткани опухоли играют важную роль в оценке ее развития.

Наши исследования показали достоверное увеличение показателей уровня МДА с ростом опухоли (рис. 4), что не противоречит данным литературы об усилении ПОЛ при прогрессировании неоплазмы [Антонеева И.И.. 2005; Кондакова И.В.. 2005]. В то же время существует мнение, согласно которому активность процессов ПОЛ в опухолевых клетках снижена [Моисеенко Т.И., 2009; Manju V., 2005].

% 40

з

а

V

е.

2

£ 30

О

2

5

О

а. 20

и

55,17*

36,30

!7,94

10

20

30

, мкмоль/мг

— 40

50

60

Примечание: * - данные, статистически значимо отличающиеся от данных контроля, р<0,05

Рис. 4. Уровень МДА в неоплазме мышей на разных сроках после трансплантации РШМ-5

Активность АОФ в неоплазме в процессе развития РШМ-5 менялась неоднородно. Из данных, представленных в табл. 3, следует, что активность ряда ферментов АОЗ зависела от стадии развития опухоли.

Таблица 3

Показатели АОЗ в неоплазме мышей в динамике прогрессирования РШМ-5

АОФ, \ед. изм. Сроки после перевивкй\ СОД у.е./мг Катал аза ммоль/с/мг ГР ммоль/мин/мг ГТ ммоль/мин/мг

20 сутки (п=19) 9,23±0,93 0,747±0,345 0,235±0,008 0,465±0,076

30 сутки (п=18) 26,57±6,00* 0,537±0,100* 0,212±0,016 1,502±0,292*

40 сутки (п=16) 27,10±4,70* 0,592±0,160* 0,218±0,018 1,603±0,152*

ые сутки после трансплантации опухоли, р<0,05

При этом в неоплазме достоверно зозрастает активность СОД и ГТ. Уровень каталазы, напротив, снижается с увеличением сроков роста опухоли; количество ГР значимо не изменяется. Таким образом, в динамике прогрессирования РШМ-5 имеет место возрастание уровня МДА в неоплазме при одновременном увеличении активности СОД и ГТ и снижении активности каталазы.

Воздействие ФСЛИ на показатели про- антиоксидантной системы организма интактных мышей и мышей с РШМ-5

Воздействие ФСЛИ изменяет показатели системы ПОЛ-АО в опухолевой ткани и на уровне организма в целом как у интактных мышей, так и у мышей с РШМ-5.

При облучении интактных мышей ФС лазером в дозах 2,4 Дж/см2 и 3,6 Дж/см2 в эритроцитах статистически значимо возрастает уровень МДА (рис.5).

интакгные мыши 20 сутки РШМ-5 30 сутки РШМ-5

Сроки после трансплантации опухоли

Е222ФСЛП (2,4 Дж/см2) СГЗФСЛП (3.6 Дж/см2) —без облучегам

Примечание: * - данные, статистически значимо отличающиеся от данных без облучения, р<0,05

Рис. 5. Влияние различных доз ФСЛИ на уровень МДА в эритроцитах мышей с РШМ-5 на разные сроки после трансплантации опухоли

Облучение ФС лазером в разных дозах на 20-ые сутки после трансплантации опухоли, практически, не изменяет уровень МДА в эритроцитах. На 30-ые сутки после трансплантации опухоли воздействие ФСЛИ в дозе 2,4 Дж/см2 увеличивает, а в дозе 3,6 Дж/см2 уменьшает уровень МДА в эритроцитах (рис. 5).

В исследованиях Нао Не (2009) установлено, что механизм генерации АФК фемтосекундным лазерным излучением в ближнем инфракрасном диапазоне в клетках животных осуществляется через тепловой эффект и через генерацию свободных электронов. ФСЛИ с Х= I ООО нм имеет небольшой тепловой эффект, но освобождает значительное количество свободных электронов в клетках [Нао Не, 2009].

Воздействие ФСЛИ дозозависимо на 20-ые сутки роста опухоли достоверно повышает активность СОД в эритроцитах, а на 30-ые сутки снижает ее (рис. 6).

Облучение интактных мышей в дозе 2,4 Дж/см2 приводит к достоверному увеличению уровня СОД в эритроцитах.

3,5

2,5

и 1,5

1

! °-5

I

! 1

1

интактные мыши 20 сутки РШМ-5 30 сутки РШМ-5 Сроки после трансплантации опухоли

Е2ЭФСЛИ<2,4 Дж/см2) Е22ЭФСЛ11 (3,6 Дж/см2) —»—без облучения

Примечание: * - данные, статистически значимо отличающиеся от данных без облучения, р<0,05

Рис. 6. Влияние различных доз ФСЛИ на уровень СОД в эритроцитах мышей с РШМ-5 на разных сроках после трансплантации опухоли

Активность катапазы в эритроцитах при облучении интактных мышей увеличивается (рис. 7). Уровень фермента также повышается при воздействии ФСЛИ на мышей с РШМ-5 на 20-ые сутки после трансплантации. На 30-ые сутки после трансплантации опухоли ФСЛИ не вызывает видимых изменений уровня каталазы в эритроцитах мышей (рис. 7)

и 60

3 50

г

г 40

я

я 30

я

5 20

ьг

10

без облучения 2,4 3.6

Доза ФСЛИ, Дж/см2 ^контроль -»-20 сутки РШМ-5 -»»30 сутки РШМ-5

Примечание: * - данные, статистически значимо отличающиеся от данных без облучения, р<0,05

Рис. 7. Влияние различных доз ФСЛИ на активность каталазы в эритроцитах мышей с РШМ-5 на разных сроках роста опухоли

Уровень ГТ при воздействии ФСЛИ на интактных животных повышается, а при облучении животных с РШМ-5 снижается (рис. 8).

без облучения 2,4 3,6

Доза ФСЛИ, Дж/см2

^^шттактный контроль сутки РШМ-5 сутки РШМ-5

Примечание: * - данные, статистически значимо отличающиеся от данных без облучения, р<0,05

Рис. 8. Влияние различных доз ФСЛИ на активность ГТ в эритроцитах мышей с РШМ-5 на разных сроках роста опухоли

Активность ГР в эритроцитах после воздействия ФСЛИ изменяется аналогично активности ГТ (табл. 4).

Таблица 4

Активность ГР (ммоль/мин/л) в эритроцитах мышей на разных стадиях развития РШМ-5 после воздействия ФСЛИ

^\Доза ФСЛИ Сутки...... ...... после перевивки-.......^ Без облучения 2,4 Дж/см2 3,6 Дж/см2

Контроль (п=20) 0,43±0,03 0,61±0,04* 0,63±0,07*

20 сутки (п=12) 0,63±0,05 0,35±0,04* 0,40±0,03*

30 сутки (п=12) 0,61±0,06 0,48±0,06* 0,46±0,04

Примечание: * - данные, статистически значимо отличающиеся от данных без облучения, р<0,05

Содержание МДА в плазме крови при облучении интактных мышей ФС лазером дозозависимо возрастает относительно контроля (табл. 5).

Аналогично повышается уровень МДА в плазме крови животных-опухоленосителей на 20-ые сутки после трансплантации опухоли. А на 30-ые сутки после трансплантации РШМ-5 уровень МДА увеличивается при воздействии ФСЛИ в дозе 2,4 Дж/см2 и уменьшается при повышении дозы облучения до 3,6 Дж/см2 (табл. 5).

Таблица 5

Показатели системы ПОЛ-ЛО в плазме крови мышей на разных стадиях развития РШМ-5 после воздействия ФСЛИ_

~~ Показатель Эксп. группа —^ МДА Мкмоль/л Катал аза Ммоль/с/л ГР Ммоль/мин/л ГТ Ммоль/мин/л

Интактный контроль п=20 без облучения 2,95±0,24 0,100±0,019 0,014±0,004 0,016±0,003

2,4 Дж/см2 4,57±0,50* 0,590±0,020* 0,024±0,006 0,045±0,010*

3,6 Дж/см2 4,67±0,18* 0,478±0,007* 0,022±0,004 0,041±0,002*

мыши с РШМ-5 (20 сутки) п=12 Без облучения 2,64±0,30 0,053±0,090 0,033±0,008 0,027±0,003

2,4 Дж/см2 3,40±0,59* 0,501±0,062* 0,020±0,005 0,03 6±0,004*

3,6 Дж/см2 4,65±0,44* 0,133±0,069* 0,018±0,004* 0,049±0,005*

мыши с РШМ-5 (30 сутки) п=12 без облучения 6,23±0,31 0,172±0,061 0,005±0,001 0,03 8±0,003

2,4 Дж/см2 6,99±0,48 0,168±0,060 0,026±0,006* 0,031±0,003

3,6 Дж/см2 5,02±0,67 0,163±0,076 0,017±0,005* 0,042±0,004

Примечание: * - данные, статистически значимо отличающиеся от данных без облучения. р<0,05

Облучение интактных мышей ФС лазером в дозах 2,4 Дж/см2 и 3,6 Дж/см2 вызывает значительное повышение уровня каталазы и ГТ в плазме крови.

Облучение мышей на 20-ые стуки после трансплантации РШМ-5 в дозе 2,4 Дж/см повышает активность каталазы в плазме крови. На 30-ые сутки - облучение ФС лазером не приводит к достоверным изменениям в активности каталазы. Динамика изменений ГТ в плазме крови мышей с опухолью после облучения однонаправлена с динамикой активности каталазы. Уровень ГР на 20-ые сутки после перевивки после облучения снижается, а на 30-ые сутки после трансплантации опухоли изменяется волнообразно при разных дозах облучения (табл. 5).

Уровень МДА в неоплазме возрастает при воздействии ФСЛИ на 20-ти суточную опухоль и снижается при воздействии на опухоль через 30 суток после трансплантации (табл. 6)

Таблица 6

Уровень МДА (мкмоль/мг) в неоплазме экспериментального РШМ при воздействии разных доз ФСЛИ_

~ -доза ФСЛИ сроки опухолТГ^—^ Без облучения Эсрсл.-2,4 Дж/см2 Эсред.=3,6 Дж/см2

20 сутки п=12 27,94±1,60 32,17±1,15* 33,92±2,78*

30 сутки п=12 36,30±1,22 32,44±0,96* 33,81±1,49

Примечание: * - данные, статистически значимо отличающиеся от данных без облучения, р<0,05

Изучение активности системы АОЗ в неоплазме может являться биохимическим критерием эффективности ФС лазерного облучения.

Таблица 7

Активность ферментов АОЗ в опухолевой ткани РШМ-5 на разных сутках после трансплантации опухоли при воздействии разных доз ФСЛИ

\ РШМ 20 суток РШМ 30 суток

Хгруппы показателях Без облучения п= 20 Эсред- 2,4 Дж/см2 п= 12 Эср[Д. 3,6 Дж/см2 п= 12 Без облучения п= 20 'Э =24 -'сред* *-1' Дж/см2 п= 12 Эсред. 3,6 Дж/см2 п= 12

ГР ммоль/мин /мг 0,24±0,008 0,240±0,009 0,250±0,006 0,210±0,016 0,170±0,004* 0,140±0,005*

ГТ ммоль/мин /мг 0,470±0,076 0,750±0,070* 0,560±0,077 1,50±0,292 1,74±0,120 0,64±0,06S*

СОД у.е./мг 9,23±0,93 12,92±1,92* 17,10±1,40* 26,57±2,00 8,15±О,20* . !4,86±3,41*

Катал аза ммоль/с/мг 0,750±0,345 0,530±0,110 1,050±0,169 0,540±0,100 0,450±0,073 0,8)0±0,019*

Примечание: * - данные, статистически значимо отличающиеся от данных без

облучения, р<0,05

Облучение ФС лазером на 20-ые сутки после трансплантации РШМ-5 не влияет в неоплазме на активность ГР, одновременно увеличивая активность СОД. Уровень каталазы и ГТ изменяется волнообразно в зависимости от дозы облучения. На 30-ые сутки после перевивки опухоли активность ГТ и ГР снижается при возрастании активности СОД и каталазы.

Влияние воздействия ВКР-лазера на показатели про- антиоксидантной системы организма интактных мышей и мышей с РШМ-5

Облучение ВКР-лазером интактных мышей приводит к достоверному дозозависимому увеличению уровня МДА в эритроцитах относительно контроля при одновременном повышении уровня ферментов АОЗ (табл. 8).

У мышей с РШМ-5 на 30-ые сутки после трансплантации опухоли облучение лазером ВКР в дозе 212 Дж/см2 снижает уровень МДА, активность ГТ и каталазы. Уровень СОД и ГР колеблется в пределах коридора нормы (табл. 8).

Показатели системы ПОЛ-АО в плазме крови при облучении лазером ВКР имеют разнонаправленную динамику (табл. 9). Наблюдается повышение уровня МДА при одновременном повышении ГТ и неизменных показателях остальных АОФ у интактных мышей при облучении в дозе 212 Дж/см2. Доза в 1062 Дж/см2 вызывает уменьшение уровня МДА и снижение активности АОФ в плазме крови интактных мышей.

У мышей на 30-ые сутки после трансплантации РШМ-5 отмечено снижение уровня МДА в плазме крови после облучения ВКР-лазером в дозе 212 Дж/см2 и его повышение при облучении в дозе 1062 Дж/см2. Динамика активности ферментов АОЗ при облучении в 1-й дозе разнонаправлена, а при облучении во 2-й -

16

достоверно не изменяется. Это позволяет предполагать возможность развития оксидативного стресса в плазме крови животных-опухоленосителей при ВКР-излучении в дозе 1062 Дж/см2.

Таблица 8

Показатели системы ПОЛ-АО в эритроцитах мышей с экспериментальным РШМ после воздействии ВКР-лазером в различных дозах

Показатель Эксп. группа МДА Мкмоль/л СОД у.е. Катал аза Ммоль/с/л ГР Ммоль/ мин/л ГТ Ммоль/ мин/л

Интактный контроль п= 12 без облучения 219,65±7,57 1,46±0,10 17,13±0,64 0,43+0,03 0,14+0,02

212 Дж/см2 279,66±13,32* 2,04±0,12* 55,51+4,62* 0,53+0,04* 0,26+0,01*

1062 Дж/см2 376,07±16,78* 1,64±0,18 74,32± 18,56* 0,52±0,04* 0,24+0,03*

Мыши с РШМ-5 (30 сутки) п= 12 без облучения 325,94±14,36 1,46±0,14 60,09+3,02 0,61 ±0,06 0,56±0,06

212 Дж/см2 260,86+18,22* 1,22+0,23 49,41±1,77* 0,72+0,09 0,18+0,01*

1062 Дж/см2 318,50±27,91 1,25+0,12 65,93*6,04 0,783:0,09 0,70+0,08

Примечание: * - данные, статистически значимо отличающиеся от данных без облучения, р<0,05

Таблица 9

Показатели системы ПОЛ-АО в плазме крови мышей с РШМ-5 после облучения лазером ВКР в дозах 212 и 1062 Дж/см2_

Показатель Эксп. группа*""^-^^ МДА Мкмоль/л Катал аза Ммоль/с/л ГР Ммоль/мин/л ГТ Ммоль/мин/ л

Интактный контроль п— 12 без облучения 2,95±0,24 0,100^0,019 0,014±0,004 0,016±0,003

212 Дж/см2 3,82±0,20* 0,104±0,037 0,016±0,008 0,033±0,005*

1062 Дж/см2 1,03±0,03* 0,040±0,007* 0,019±0,003 0,006±0,002*

мыши с РШМ-5 (30 сутки) п= 12 без облучения 6,23±0,31 0,172±0,061 0,005±0,001 0,038±0,003

212 Дж/см2 1,82±0,46* 0,070±0,040* 0,022±0,004* 0,036±0,004

1062 Дж/см2 10,7±1,26* 0,099А0,060 0,005±0,001 0,035±0,002

Примечание: * - данные статистически значимо отличающиеся от данных без облучения, р<0,05

Облучение ВКР-лазером мышей с РШМ-5 в дозе 212 Дж/см2 на 30-ые сутки после трансплантации опухоли достоверно уменьшает уровень МДА в неоплазме (табл. 10). Динамика активности ферментов АОЗ разнонаправлена: наблюдается снижение активности ГР при повышении активности ГТ и значимо не меняющихся показателях уровня каталазы и СОД. Облучение ВКР-лазером в дозе 1062 Дж/см2 на тех же сроках роста опухоли вызывает противоположные изменения в системе

ПО Л-АО (табл. 10): отмечается повышение уровня МДА в неоплазме и одновременное статистически значимое снижение активности СОД и ГТ, при достоверно не изменяющемся уровне ГР и каталазы. Такая динамика позволяет предполагать возможность развития оксидативного стресса в опухолевой ткани при облучении ВКР-лазером в дозе 1062 Дж/см2.

Таблица 10

Показатели системы ПОЛ-АО в неоплазме мышей на разных сутках развития РШМ-5 после облучения лазером ВКР в дозах 212 и 1062 Дж/см2_

Группа Показатель\^ РШМ 30 суток

Без облучения п=16 Э = 212 Дж/см2 п™16 Э= 1062 Дж/см2 п=12

МДА мкмоль/мг 36,3±1,22 21,81±1,25* 43,53±2,53*

ГР ммоль/мии/мг 0,212±0,016 0,418±0,013* 0,238±0,023

ГТ ммоль/мин/мг 1,502±0,292 0,509±0,051* 0,602±0,078*

СОД у.е./мг 26,57±6,00 29,01±1,25 8,48±0,24*

Катал аза ммоль/с/мг 0,537±0,100 0,442±0,083 0,667±0,287

Примечание: * - данные статистически значгшо отличающиеся от данных без облучения, р<0,05

Морфометрическая оценка показателей при прогрессироеании экспериментального РШМ

При анализе гистологических срезов опухолевой ткани РШМ-5 установлено, что с увеличением сроков роста опухоли имеет место достоверное снижение удельного объема опухолевой паренхимы с 76,81±2,01% на 20-ые сутки, до 65,34±2,78% на 30-ые и 43,09±7,58% на 40-ые сутки после трансплантации опухоли. Одновременно снижается и удельный объем опухолевой стромы с 1,207±0,158% на 20-ые сутки после перевивки до 0,200±0,036% на 30-ые и 0,070±0,025% на 40-ые сутки. Уменьшение площади паренхимы, вероятно, обусловлено увеличением зон некроза (21,99±2,05%; 34,64±2,76%; 53,35±11,06% на 20-ые, 30-ые и 40-ые сутки, соответственно). С ростом опухоли возрастает число и размеры участков некроза, выявляемых как в центральных, так и в периферических отделах опухолевой ткани. Апоптотический и митотический индексы достоверно не изменяются в динамике прогрессирования опухоли. При этом апоптотический индекс составляет на 30-ые сутки 67,00±4,25%о, на 40-ые сутки 82,25±9,74%о относительно 20-х суток (87,00±3,76%о). Митотический индекс, практически, одинаковый на всех сутках после трансплантации опухоли (87,00±3,76; 67,00±4,25; 82,25±9,74% на 20-ые, 30-ые, 40-ые сутки после трансплантации опухоли, соответственно) (рис. 9-11).

Рис. 11. Опухоль РШМ-5 на 20-ые су тки

после трансплан тации. Окраска гематоксилин-эозином. Микрофото х400

Полученные данные позволяют заключить, что, начиная с 20-х су ток после перевивки опухоли, происходит снижение удельного объема опухолевой паренхимы, стромы и возрастание удельного объема участков некроза.

Вероятно, через 40 суток после трансплантации опухоли модель РШМ-5 нецелесообразно использовать для оценки биологического портрета опухоли.

Морфометрические показатели опухолевой ткани после воздействия лазерного излучения

Воздействие ФСЛИ в обеих дозах на разные сутки после трансплантации опухоли вызывает достоверные изменения в морфомстрических показателях опухолевой ткани (табл. 1 1).

На 20-ые сутки после трансплантации опухоли ФСЛИ приводит к уменьшению удельного объема опухолевой паренхимы, стромы. митотического и апоптотического индексов (табл. 11). Однако при облучении мышей ФС лазером вдвое возрастает удельный объем участков некроза, что позволяет предполагать о том, что ФСЛИ является активатором некротических процессов в опухолевой ткани экспериментального РШМ (рис. 12). На 30-ые сутки после трансплантации опухоли воздействие ФС лазером вызывает те же изменения, ч то и на 20-ые сутки после перевивки, за исключением изменений в удельном объеме опухолевой стромы: на 30-ые сутки облучение ФС лазером дозозависимо увеличивает объем опухолевой стромы.

Рис. 9. Опухоль РШМ-5 на 20-ые сутки

после трансплантации. Окраска гематоксилин-эозином. Микрофото х400

Рис. 10. Опухоль РШМ-5 па 30-ые сутки

после трансплантации. Окраска гематоксилин-эозином. Микрофотох400

Таблица 11

Морфометрические показатели опухолевой ткани после облучения ФСЛИ

группа показатели 20 сутки 30 сутки

Без облучения ФС 2,4 Дж/см2 ФС 3,6 Дж/см2 Без облучения ФС 2,4 Дж/см2 ФС 3,6 Дж/см2

удельный объем опухолевой паренхимы (%) 76,81±2,01 57,39±0,41* 53,59±3,73* 65,34±2,78 41,22±3,22* 56,02±5,34*

удельный объем опухолевой стромы (%) 1,21±0,16 0,49±0,04* 0,25±0,01* 0,2±0,036 0,38±0,01* 0,50±0,21*

удельный объем участков некроза (%) 21,99±2,05 42,12±0,37* 46,17±3,73* 34,64±2,76 58,41±3,22* 43,50±5,14*

митотический индекс (%о) 18,00±1,40 15,63±5,63 9,38±3,13* 18,00±3,18 6,25±2,50* 5,00±0,01*

апоптотический индекс (%о) 87,00±3,76 33,75±6,25* 23,13±1,88* 67,00±4,25 26,25± 10,00* 23,13±1,88*

Примечание: * - различия достоверны относительно данных без облучения, р<0,05

Результаты данного исследования позволяют предполагать, что ФСЛИ в исследуемых дозах способно изменять морфометрические показатели опухолевой ткани. Выявлено, что у мышей, облучаемых ФС лазером, наиболее выражен некроз опухоли на фоне снижения остальных показателей, чем у мышей не подвергавшихся воздействию ФСЛИ.

Воздействие лазером ВКР на 30-ые сутки после трансплантации опухоли при увеличении удельного объема опухолевой стромы приводит к понижению апоптотического индекса. Митотический индекс, удельный объем участков некроза и опухолевой паренхимы при этом достоверно не изменяются (табл. 12). Следовательно, можно сделать вывод о том, что облучение лазером ВКР на 30-ые сутки после трансплантации опухоли не приводит к процессам, являющимся причиной разрушения и распада опухоли

Таблица 12

Морфометрические показатели опухолевой ткани после облучения лазером ВКР в дозах 212 иЮ62Дж/см2___

___________ Доза облучения Показатели ———___ Без облучения ВКР 212 Дж/см2 ВКР 1062 Дж/см2

удельный объем опухолевой паренхимы (%) 65,34±2,78 58,24±3,99* 56,79±18,80

удельный объем опухолевой стромы (%) 0,20±0,04 0,32±0,04* 0,36±0,11

удельный объем участков некроза (%) 34,64±2,76 41,45±3,96 42,86±18,73

митотический индекс (%о) 18,00±3,18 16,88±3,13 16,25±1,25

апоптотический индекс (%о) 67,00±4,25 31,25±5,00* 41,88-4:1,88*

Примечание: * - данные статистически значимо отличающиеся от данных без облучения, р<0,05

1С < ранснлантации опухоли

без облучении

30-ые сутки после трансплантации опухоли

Рис. 12. Опухоль РШМ-5 до и после воздействия ФСЛИ на разные сутки после трансплантации опухоли. Окраска гематоксилин-эозином. Микрофото хЮО

Таким образом, результаты морфомстрического исследования опухолевой ткани в динамике прогрессирования РШМ-5 показали, что в процессе роста опухоли увеличивается удельный объем участков некроза при одновременном снижении удельного объема опухолевой паренхимы и стромы. ФСЛИ в обеих дозах приводи! к заметному увеличению участков некроза на стадиях интенсивного роста опухоли при снижении всех остальных показателей.

ВЫВОДЫ

1. При нрогрессировании Р111М-5 нарастает уровень МДА в неоплазме, плазме-крови и эритроцитах. При этом в неоплазме значимо увеличивается активность СОД и ГТ; в эритроцитах нарастает активность СОД. ГТ, ГР и каталазы; в плазме увеличивается активность каталазы, ГР, ГТ. что свидетельствует о переходе системы ПОЛ-АО на другой уровень функционирования и не позволяет предполагать развитие оксидативного стресса.

2. Влияние ФСЛИ на интактных мышей имело дозозависимый характер. При лозе 2,4 Дж/см- имеет место максимальное повышение уровня МДА и активности всех изученных АОФ в эритроцитах и плазме крови.

3. Влияние ВКР-лазера на мышей имело дозозависимый характер. Излучение в дозе 212 Дж/см" увеличивало уровень МДА при одновременном повышении активности каталазы и ГТ в плазме крови и эритроцитах. Облучение в дозе 1062 Дж/см приводило к значимому увеличению уровня ПОЛ в эритроцитах при

одновременном уменьшении в плазме крови интактных животных. Активность АОФ при этом также увеличивалась в эритроцитах и снижалась в .плазме крови. Полученная динамика параметров системы ПОЛ-АО позволяет предполагать, что ^ исследуемые источники ЛИ в организме интактных животных вызывают переход системы ПОЛ-АО на другой уровень функционирования, не стимулируя при этом возникновения оксидативного стресса.

4. При воздействии ФСЛИ на мышей с РШМ-5 на разных сроках развития -опухоли в плазме крови возрастает уровень МДА, каталазы и ГТ на 20-е сутки

после трансплантации опухоли. На 30-е сутки изучаемые показатели колебались в пределах нормы. В эритроцитах уровень МДА не изменяется, но значительно изменялась активность АОФ, что может свидетельствовать о возможности возникновения оксидативного стресса в эритроцитах. В опухолевой ткани после ЛИ возрастает уровень МДА на 20-е сутки после трансплантации опухоли при одновременном увеличении активности некоторых АОФ. На 30-е сутки уровень МДА в неоплазме изменяется в пределах коридора нормы и одновременно уменьшается уровень АОА, что может свидетельствовать о наличии оксидативного стресса в ткани опухоли.

5. Воздействие излучения лазера ВКР на мышей с РШМ-5 зависит от дозы облучения. При облучении ВКР-лазером в дозе 212 Дж/см2 на 30-ые сутки после трансплантации опухоли отмечено понижение уровня МДА и активности АОФ в эритроцитах, плазме крови и неоплазме. Увеличение дозы облучения до 1062 Дж/см2 на 30-ые сутки после трансплантации опухоли приводит к повышению уровня МДА при сниженной АОА в плазме крови и неоплазме, показатели в эритроцитах при этом значимо не изменяются. Данные исследования позволяют предположить о возникновении оксидативного стресса в организме животных при облучении ВКР-лазером в дозе 1062 Дж/см2.

6. Фемтосекундное лазерное облучение неоплазмы РШМ-5 дозозависимо повышает удельный объем некрозов при снижении удельного объема паренхимы, митотического и апоптотического индексов. Непрерывное излучение ВКР-лазера в тех же условиях не вызывает значимых морфологических изменений в неоплазме.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в журналах из списка ВАК:

1. Арсланова Д.Р. Мембрандеструктивное влияние фемтосекундного лазера на эритроциты млекопитающих in vitro / Д.Р. Арсланова, О.С. Воронова, Ю.В. Бешенова// Медицинский альманах, 2011г. - С.210.

2. Антонеева И.И. Ферменты антиоксидантной защиты в опухолевой ткани при раке шейки матки / И.И. Антонеева, Е.Г. Сидоренко, О.С. Воронова// Сибирский онкологический журнал, 2011. - Приложение №1. - С.13.

3. Сидоренко Е.Г. Мембрандестабилизирующее влияние фемтосекундного лазерного излучения на эритроциты in vitro / Е.Г. Сидоренко, О.С. Воронова, Д.Р. Арсланова// Вестник РГМУ, 2011. - С. 224.

4. Воронова О.С. Влияние фемтосекундного лазерного излучения на показатели оксидативного стресса в опухолевой ткани при экспериментальном

раке шейки матки/ О.С. Воронова, Т.П. Генинг, В.В. Светухин// Фундаментальные исследования, 2012. - №1. - С. 24-27.

5. Воронова О.С. Морфометрические показатели опухолевой ткани при прогрессировании рака шейки матки (в эксперименте) / О.С. Воронова, С.О. Генинг, H.A. Никитина// Материалы VII Международной (XVI Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых учёных: Москва; Вестник РГМУ, 2012. - специальный выпуск, №1. - С. 31-32.

Публикации в прочих изданиях:

6. Воронова О.С. Влияние высокоинтенсивного фемтосекундного лазерного излучения на эритроциты крыс/ Т.П. Генинг, И.О. Золотовский, О.С. Воронова и др.// Сборник материалов Международной научной конференции "Наука и образование: фундаментальные основы, технологии, инновации", Оренбург, 2010. -С.200-204.

7. Воронова О.С. Параметры системы «перекисное окисление липидов -антиоксиданты» в эритроцитах и плазме животных экспериментальными опухолями/ О.С. Воронова, Д.Р. Арсланова, Т.П. Генинг // Материалы Ш-й Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и наука XXI века». Ульяновск, 2010. - С. 174-176

8. Gening Т.Р. Effects of femtosecond laser radiation on blood cell suspensions / T.P. Gening, A. Sysolyatin, O.S. Voronova// SPIE BiOS Symposium, San Francisco, January 2011. - V. 2

9. Воронова О.С. Уровень малонового диальдегида и ферментативное звено антиоксидантной системы плазмы крови и эритроцитов при экспериментальном раке шейки матки/ О.С. Воронова, JI.B. Полуднякова, Д.Р. Арсланова// Материалы X Всероссийской молодежной научной конференции Института физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, г. Сыктывкар,2011. - С. 170-172.

10. Арсланова Д.Р. Свободнорадикальные реакции в эритроцитах онкологических больных при фемтосекундном лазерном облучении / Д.Р. Арсланова, Т.В. Абакумова, О.С. Воронова// Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс», г. Барнаул, 2011. - С.6-7.

И. Воронова О.С. Показатели перекисного окисления липидов и ферментативного звена антиоксидантной системы в плазме крови мышей с экспериментальным раком шейки матки/ О.С. Воронова, Д.Р. Арсланова, J1.B. Полуднякова// Материалы X Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых по медицине, г. Тула, 2011г. - С. 24-25.

12. Арсланова Д.Р. Про- и антиоксидантная активность в эритроцитах человека при фемтосекундном лазерном излучении различной интенсивности / Д.Р. Арсланова, О.С. Воронова, Т.В. Абакумова// Сборник статей юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию доктора медицинских наук, профессора Захарова Г.А., г. Бишкек, 2011. - С. 123-126.

13. Воронова О.С. К вопросу о возможности использования фемтосекундного лазерного излучения в экспериментальной и клинической онкологии/ О.С. Воронова, И.И. Антонеева, Е.Г. Сидоренко// Материалы VII Российской научно-практической конференции с элементами научной школы для молодежи «Модниковские чтения» (г. Ульяновск, 20-21 октября 2011г.) - С. 31-34.

14. Генинг Т.П. Свободнорадикальные процессы в неоплазме при воздействии фемтосекундного лазерного излучения/ Т.П. Генинг, О.С. Воронова, Д.Р. Арсланова// Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицины/ Сб. статей под ред. А.П. Кудинова, Б.В. Крылова: С.-Пб., 2011. - Т. 1. - С. - 30-32.

15. Генинг Т.П. Свободнорадикальные процессы в неоплазме при фемтосекундном лазерном излучении/ Т.П. Генинг, Т.В. Абакумова, О.С. Воронова// Материалы VII съезда Казахского физиологического общества с международным участием: «Современная физиология: от клеточно-молекулярной до интегративной - основа здоровья и долголетия», посвященного 100-летию академиков АН КАЗССР Н.У. Базановой и Ф.М. Мухамедгалиева: Алмааты, 2011 -С. 79-80.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В АВТОРЕФЕРАТЕ

АОА - антиоксидантная активность;

АОЗ - антиоксидантная защита;

АОФ - антиоксидантные ферменты;

АФК - активные формы кислорода;

ВКР - вынужденное комбинационное рассеивание;

ГР - глутатиокредуктаза;

ГТ - глутатионтрансфераза;

ЛИ - лазерное излучение;

МДА - малоновый диальдегид;

ПОЛ - перекисное окисление липидов;

ПОЛ-АО - перекисное окисление липидов - антиокеиданты;

РШМ - рак шейки матки;

СКЭ - светокислородный эффект;

СОД - супероксиддисмутаза;

ФС - фемтосекундный;

ФСЛИ - фемтосекундное лазерное излучение.

Подписано в печать 11.04.2012. Формат 60 х 84/16. Гарнитура Times New Roman. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 59

Отпечатано с оригинал-макета в Издательском центре Ульяновского государственного университета 432017, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Воронова, Ольга Сергеевна, Ульяновск

61 12-3/1140

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет»

На правах рукописи

ВОРОНОВА ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА

ПРО- И АНТИОКСИДАНТНЫЙ СТАТУС В ДИНАМИКЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО РАКА ШЕЙКИ МАТКИ ПРИ ДЕЙСТВИИ

ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

03.03.01 - физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Т.П. Генинг

Ульяновск-2012

СОДЕРЖАНИЕ:

Список сокращений........................................................5

Введение..................................................................^

Глава I. Обзор литературы..........................................................11

1.1. Система «перекисное окисление липидов - антиоксиданты» в норме и при патологии................................................................ц

1.1.1. Перекисное окисление липидов в норме......................... 11

1.1.2. Роль антиоксидантной системы в организме......................15

1.1.3. Повреждающее значение свободнорадикального окисления.........19

1.2. Современные представления о механизмах канцерогенеза при раке шейки матки........................................................................22

1.3. Система «перекисное окисление липидов - антиоксиданты» в динамике прогрессирования РШМ-5. Зависимость процессов перекисного окисления липидов и статуса антиоксидантной системы от стадии опухоли......................................................................................25

1.4. Лазерное излучение в онкогинекологии.........................30

1.4.1. Общие механизмы действия лазерного излучения на биологические объекты............................................................30

1.4.2. Классификация лазерного излучения по интенсивности.......33

1.4.3. Использование лазерного излучения в онкогинекологии.......35

1.4.3.1. Низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ) в онкогинекологии................................................................37

1.4.3.2. Высокоинтенсивное лазерное излучение (ВИЛИ) в онкогинекологии............................................................................40

Глава II. Материал и методы исследования.........................44

2.1. Экспериментальные животные.............................. 44

2.2. Схема эксперимента....................................................................44

2.3. Характеристика и перевивка опухолевого штамма................ 48

2.4. Источники лазерного излучении и дозы..................................49

2.4.1. Источники излучения........................................49

2.4.2. Дозы излучения................................................5 ^

2.5. Методы исследования................................................52

2.5.1. Биохимические методы исследования.......................52

2.5.2. Морфологические методы исследования..............................54

2.6. Методы статистической обработки данных..........................56

Глава III. Результаты собственных исследований и их обсуждение . . . . 57

3.1. Характеристика РШМ-5....................................57

3.2. Анализ системы «перекисное окисление линидов - антиоксиданты» в эритроцитах, плазме крови и неоплазме мышей в динамике прогрессирования экспериментальной опухоли РШМ-5 59

3.2.1. Показатели системы «перекисное окисление липидов - антиоксиданты»

в эритроцитах и плазме крови мышей с РШМ-5 на разных стадиях развития опухоли................................................^

3.2.2. Показатели системы «перекисное окисление липидов - антиоксиданты» в неоплазме РШМ-5 на разных стадиях развития РШМ-5...............70

3.3. Влияние фемтосекундного лазерного излучения (ФСЛИ) на

показатели про- антиоксидантной системы организма здоровых мышей и мышей с РШМ-5.

...............................................74

3.3.1. Уровень продуктов перекисного окисления липидов и компонентов антиоксидантной системы в крови животных-опухоленосителей и интактных животных после воздействия ФСЛИ......................................74

3.3.2. Уровень продуктов перекисного окисления липидов и компонентов антиоксидантной системы в неоплазме РШМ-5 после воздействия ФСЛИ...80

3.4. Влияние излучения лазера вынужденного комбинационного рассеивания (ВКР) на показатели про- антиоксидантной системы организма здоровых мышей и мышей с РШМ-5 83

3.4.1. Уровень продуктов перекисного окисления липидов и компонентов антиоксидантной системы в крови животных-опухоленосителей и интактных животных после облучения ВКР-лазером....................................83

3.4.2. Уровень продуктов ПОЛ и компонентов антиоксидантной системы в неоплазме РШМ-5 после воздействия ВКР-лазера.................... 85

3.5. Морфометрические показатели опухолевой ткани в динамике

прогрессирования РШМ-5 до и после воздействия ФСЛИ и излучения ВКР-лазера..........................................^

3.5.1. Морфометрическая оценка показателей опухолевой ткани при прогрессировании экспериментального РШМ-5..........................87

3.5.2. Морфометрические показатели опухолевой ткани после воздействия ФСЛИ и излучения ВКР-лазера..............................................8 8

Заключение....................................^

Выводы........

...................................................101

Список литературы.....................

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ПОЛ-АО - перекисное окисление липидов - антиоксиданты

РШМ - рак шейки матки

АКМ - активные кислородные метаболиты

АОА - антиоксидантная активность

АОЗ - антиоксидантная защита

АОС - антиоксидантная система

АОФ - антиоксидантные ферменты

АФК - активные формы кислорода

ВИЛИ - высокоинтенсивное лазерное излучение

ГР - глутатионредуктаза

ГТ - глутатионтрансфераза

ДК- диеновые конъюгаты

ЛИ - лазерное излучение

МДА - малоновый диальдегид

НИЛИ - низкоинтенсивное лазерное излучение

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СК - синглетный кислород

СОД - супероксиддисмутаза

СРО - свободнорадикальное окисление

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ФС - фемтосекундный

ФСЛИ - фемтосекундное лазерное излучение ФСЛО - фемтосекундное лазерное облучение

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Необходимость исследования биомедицинской модели опухолевых заболеваний в настоящее время диктуется высокой распространенностью и смертностью от рака. Проблема злокачественного роста является на сегодня одной из самых актуальных в биологии и медицине [Максимов, 2009]. Показана роль активных форм кислорода (АФК) и инициируемого ими перекисного окисления липидов (ПОЛ) в механизмах канцерогенеза [Панкин, 2001; Das, 2002]. АФК являются основным источником свободных радикалов, избыточное образование которых приводит к повреждающему действию на клетки [Фархутдинов, 2011]. Важную роль в защите клеток от повреждающего действия АФК играет система антиоксидантной защиты (АОЗ) [Смирнова, 2002]. Снижение активности антиоксидантной системы или ее несостоятельность способствует повышению активности ПОЛ, что в конечном итоге приводит к мембранопатологическим процессам [Алексеева, 2000]. Состояние, при котором происходит активация ПОЛ на фоне депрессии или недостаточности естественных антиоксидантных систем называется окислительным стрессом. Соотношение про- и антиоксидантного статуса организма играет важную роль в возникновении и развитии неоплазмы [Чеснокова, 2004].

Рак шейки матки (P1IIM) - одна из актуальных проблем онкогинекологии. По данным ВОЗ ежегодно в мире выявляется около 500 тысяч новых случаев, более 270 тысяч женщин умирают от РШМ [Waggoner, 2003]. В России в последние десятилетия отмечается высокий показатель запущенности РИТМ и увеличение числа больных молодого возраста [Морхов, 2009].

Широкому использованию лазеров в онкологической клинике препятствует отсутствие единой точки зрения на возможность стимуляции пролиферации опухолевого узла и процессов метастазирования, невозможность воздействия в точных границах опухоли без повреждения

здоровых тканей, а также отсутствие данных об изменении биологического портрета злокачественных опухолей различной тканевой организации при воздействии лазерного излучения (ЛИ) с различными параметрами.

В коррекции рака исходным повреждающим агентом преимущественно считают синглетный кислород, что объяснятся его высокой химической активностью [Захаров, 1999], который может участвовать в цепных свободно-радикальных реакциях, окислять аминокислоты в белках, гуанин в ДНК, инициировать ПОЛ [Schweitzer, 2003]. Итогом подобных нарушений при превышении репаративных возможностей клетки становится ее деструкция. Светокислородный эффект (СКЭ) заключается в активировании или повреждении биосистем оптическим излучением (в зависимости от световой дозы) посредством прямого фотовозбуждения растворенного в них молекулярного кислорода в синглетное состояние [Захаров, 1999]. Л.В. Кореи с соавт. (2009) в работах по воздействию ЛИ на клетки опухоли установили, что облучение на длине волны 1268 нм приводит к образованию синглетного кислорода и индуцируемых им реакций окисления, так как ближний инфракрасный диапазон является спектром поглощения кислорода [Иванов, 2003; Амбарцумян, 2004].

Показано, что существует определенная предельная мощность антиоксидантной системы клеток и (или) организма - антиоксидантная система успешно справляется только с определенным количеством свободных радикалов, появляющихся в единицу времени [Кореи, 2009]. Если этот порог превысить, то можно ожидать появления необратимых повреждений, которые при достаточном количестве могут вызвать гибель клеток. Для увеличения СКЭ, вероятно, требуется увеличение интенсивности ЛИ, что возможно за счет увеличения импульсной мощности при сохранении средней мощности [Не, 2009].

В соответствии с вышеизложенным, целью исследования было изучение про- и антиоксидантного статуса в динамике экспериментального

РТТТМ при действии ЛИ.

Основные задачи исследования:

1. Изучить активность компонентов системы ПОЛ-АО в эритроцитах, плазме крови и опухолевой ткани мышей на разных стадиях роста РШМ-5;

2. Оценить влияние фемтосекундного лазерного излучения (ФСЛИ) на параметры системы ПОЛ-АО в эритроцитах и плазме крови интактных

мышей;

3. Оценить влияние излучения лазера вынужденного координационного рассеивания (ВКР) на параметры системы ПОЛ-АО в эритроцитах и плазме

крови интактных мышей;

4. Исследовать влияние ФС лазера на параметры компонентов системы ПОЛ-

АО в эритроцитах, плазме крови и неоплазме мышей с РШМ-5;

5. Определить изменения в системе ПОЛ-АО в эритроцитах, плазме крови и неоплазме мышей с РШМ-5 после облучения лазером ВКР;

6. Оценить морфометрические показатели опухолевой паренхимы и стромы в динамике роста опухоли и после воздействия лазерного излучения.

Научная новизна. Получены новые данные об изменении уровня ПОЛ и динамики показателей ферментативного звена АОС в эритроцитах, плазме крови и опухолевой ткани у мышей в динамике экспериментального РШМ. Проведена оценка влияния излучения фемтосекундного импульсного волоконного эрбиевого лазера с длиной волны 1550 нм и пиковой мощностью 6 кВт и излучения непрерывного высокоинтенсивного волоконного лазера ВКР с рабочей мощностью 5,5 Вт и длиной волны 1265 нм, являющегося уникальной совместной разработкой института общей физики РАН и Центра Нанотехнологий УлГУ, на параметры системы ПОЛ-АО в эритроцитах, плазме крови и неоплазме мышей с экспериментальным

РШМ.

Научно-практическая значимость. Полученная в итоге проведенного фундаментального исследования система новых физиологических данных об особенностях процессов ПОЛ в динамике прогрессирования РШМ-5 представляет интерес для теоретических и прикладных разделов физиологии и патофизиологии, а также экспериментальной онкологии. Данные по состоянию системы ПОЛ-АО в процессе роста опухоли можно применять в эксперименте и клинике, в частности, при использовании антиоксидантной терапии и изучении патогенеза заболеваний. Исследования по использованию ЛИ могут быть положены в основу изучения практических аспектов применения этого физического фактора в качестве адъюванта эффективности специфического противоопухолевого лечения.

Положения, выносимые на защиту:

1. При прогрессировании экспериментального рака шейки матки система ПОЛ-АО в неоплазме, а также в плазме крови и эритроцитах организма-опухоленосителя переходит на более высокий уровень функционирования.

9 и

2. ФСЛИ с пиковой интенсивностью 1910,8 Вт/см^ и средней интенсивностью 0,398 мВт/см2 повышает уровень функционирования системы ПОЛ-АО в эритроцитах и плазме крови интактных мышей при дозе облучения 2,4 Дж/см2. Влияние непрерывного излучения ВКР-лазера со средней интенсивностью 0,177 Вт/см2 на интактных мышей имеет дозозависимый характер, повышает уровень функционирования системы ПОЛ-АО и не стимулирует в организме возникновение оксидативного стресса.

3. Воздействие ФСЛИ на мышей с экспериментальным РШМ на стадии интенсивного роста опухоли в дозах 2,4 и 3,6 Дж/см2 стимулирует в последней возникновение оксидативного стресса. Непрерывное облучение ВКР-лазером в дозе 1062 Дж/см2 мышей с экспериментальным РШМ стимулирует возникновение оксидативного стресса в неоплазме в фазу интенсивного роста опухоли.

4. Воздействие фемтосекундного лазера на неоплазму РШМ-5 дозозависимо повышает удельный объем некрозов при снижении удельного объема паренхимы, митотического и апоптотического индексов. Непрерывное излучение ВКР-лазера в тех же условиях не вызывает значимых

морфологических изменений в неоплазме.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на Международной научной конференции "Наука и образование: фундаментальные основы, технологии, инновации" (Оренбург, 2010), Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и наука XXI века» (Ульяновск, 2010), БРШВЮЗЗутрозшт (ЗапРгапсаБсо, 2011), Всероссийской молодежной научной конференции Института физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН (Сыктывкар, 2011), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс» (Барнаул, 2011), Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых по медицине (Тула, 2011), Российской научно-практической конференции с элементами научной школы для молодежи «Модниковские

чтения» (Ульяновск, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в

том числе 5 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 рисунками и 11 таблицами. Список используемой литературы содержит 269 источников, из которых 120 иностранных.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Система «перекисное окисление липидов - антиоксиданты» в

норме и при патологии

1.1.1. Перекисное окисление липидов в норме

Кислород — один из самых распространенных (наряду с водородом, углеродом) химических элементов биосферы, его соединения входят в состав всех живых организмов. Около 90% потребляемого человеком молекулярного кислорода вовлекается в реакции окислительного фосфорилирования, вместе с тем во всех живых организмах постоянно протекают реакции с образованием активированных кислородных метаболитов (АКМ) - О/1, Н202, НО', ОСГ, Я02', N0' - и др. Многие из этих соединений являются радикалами, т. е. имеют неспаренный электрон, поэтому их называют свободными радикалами. Связанные радикалы, такие как компоненты цепи транспорта электронов в митохондриях, также широко представлены в клетках, однако их локализация в определенных структурах ограничивает "свободное" взаимодействие с другими молекулами.

Применительно к биологическим системам понятия "свободные радикалы" и "АКМ" не совпадают — неспаренный электрон может быть расположен на атомах углерода, серы, азота. С одной стороны, для живых организмов большое значение имеют тиильные радикалы глутатиона (ОБ ) или радикалы мочевой кислоты с локализацией электрона на атомах Б и N. С другой стороны, такие кислородсодержащие молекулы, как перекись водорода, синглетный кислород, гипогалоиды, не являются радикалами, хотя и взаимодействуют с органическими молекулами через радикальные механизмы. Чтобы объединить данные соединения в одну группу с радикалами, вводят понятие "активные формы кислорода" (АФК), которым обозначают ферментативные продукты активации кислорода. По аналогии с активными формами кислорода иногда говорят об "активных метаболитах

азота", подразумевая NO-радикал и продукты его преобразования (N02,

ONO-, ONOOH и др.) [Краснов, 2005].

Свободные радикалы и процессы с их участием довольно широко представлены в организме и обладают большим спектром физиологических

эффектов [Голиков, 2003; Кулинский, 1999].

Еще в 1931 г. появились работы L. Michaelis, в которых было показано, что свободные радикалы являются важнейшими участниками большинства реакций, происходящих в живых клетках. Помимо нормальных окислительных ферментативных реакций, в тканях, хотя и с очень малой скоростью, непрерывно протекают процессы свободнорадикального (перекисного) окисления (СРО) с образованием АФК, альдегидов, кетонов и др. Все они в физиологических концентрациях или при умеренном повыш