Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Снижение уровня митохондриальных активных форм кислорода приводит к фенотипической нормализации клеток карциномы шейки матки человека

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Снижение уровня митохондриальных активных форм кислорода приводит к фенотипической нормализации клеток карциномы шейки матки человека"

На правах рукописи

ШАГИЕВА ГАЛИНА СЕРГЕЕВНА

СНИЖЕНИЕ УРОВНЯ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ПРИВОДИТ К ФЕНОТИПИЧЕСКОЙ НОРМАЛИЗАЦИИ КЛЕТОК КАРЦИНОМЫ ШЕЙКИ МАТКИ ЧЕЛОВЕКА

03.03.04. - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 НОЯ 2013

Москва 2013

005540254

005540254

Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики и в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.ВЛомоносова.

кандидат биологических наук Дугина Вера Борисовна

академик, профессор Скулачев Владимир Петрович

доктор биологических наук Глушанкова Наталия Александровна ФГБУ «РОНЦ имени Н.Н.Блохина» РАМН

кандидат биологических наук Гиоева Фатима Константиновна Институт белка РАН

Ведущая организация: ФГБУН Институт биологии

развития им.Н.К. Кольцова РАН

Защита диссертации состоится «17» декабря 2013 года в 15:30 на заседании диссертационного совета Д.501.001.52. при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу 119899, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.12, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.ВЛомоносова.

Автореферат разослан « » ноября 2013 года.

Научный руководитель:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ученый

секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

7

Калистратова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Механизмы, благодаря которым опухолевые клетки приобретают способность к миграции, на сегодняшний день изучены недостаточно. Опухолевая трансформация клеток часто связана с изменениями в организации цитоскелета, исчезновением или уменьшением клеточной адгезии и нарушением сигнальных путей, связанных с адгезией. Разрушение адгезионных межклеточных контактов у трансформированных клеток ведет к усилению пролиферации, миграции, инвазии и метастазированию.

Активные формы кислорода (АФК) влияют на процесс трансформации клеток, опухолевые клетки часто имеют повышенное содержание АФК. Поиск и изучение веществ, влияющих на содержание АФК в клетках, является важным направлением современных исследований. Митохондриально-направленные антиоксиданты (в дальнейшем мАО) являются новым классом синтетических антиоксидантов (АО), для которых характерно быстрое и обратимое накопление в митохондриях, что повышает эффективность их действия (Скулачев, 2007). Цель работы: исследование воздействия нового класса АО митохондриальной направленности на нормальные и опухолевые кератиноциты человека в культуральных условиях. Задачи исследования:

^Проанализировать изменения организации цитоскелетной системы и межклеточных адгезионных структур ^трансформированных и опухолевых кератиноцитов человека под действием мАО с помощью иммуно-флуоресцентной микроскопии;

2) Изучить воздействие мАО на пролиферацию нормальных и опухолевых кератиноцитов в культуре;

3) Провести количественную оценку изменения соотношения эпителиальных и мезенхимальных маркеров в клетках карциномы шейки матки под действием мАО с помощью иммуноблоттинга белков;

4) Изучить возможное влияние мАО на активацию МАР-киназных сигнальных молекул в клетках рака шейки матки.

Научная новизна и практическая значимость работы. Исследованию механизмов подвижности опухолевых клеток, их способности к инвазии и метастазированию посвящено множество научных работ. Важнейшую роль в этих процессах играет реорганизация актинового цитоскелета, межклеточных контактов, каскадов сигнальных молекул.

В настоящее время активно изучается функциональная разница изоформ актина, их роль в направленном движении клеток. Благодаря использованию уникальных специфических антител к цитоплазматическим изоформам актина впервые были исследованы изменения организации актинового цитоскелета опухолевых клеток после воздействия мАО. В данной диссертационной работе впервые были показаны различия в распределении изоформ актина в опухолевых клетках разной степени трансформации. Полученные данные указывают на различные роли цитоплазматических актинов в опухолевой прогрессии.

Актиновый цитоскелет тесно связан с межклеточными контактами. Наряду с перестройкой актинового цитоскелета после воздействия мАО группы БкС), мы наблюдали реорганизацию адгезионных контактов и повышение количества опухолевых супрессоров - белков адгезионных контактов, Е-кадгерина и а-катенина. Под действием БкС} опухолевые клетки формировали эпителиальные островки, характерные для нормальных кератиноцитов.

Исследование линий опухолевых клеток разной степени и этиологии трансформации позволило нам сравнить изменения морфологии и сигнальных каскадов, происходящие с клетками после воздействия мАО. Были выявлены новые закономерности, характерные для неопластически трансформированных клеток в целом, а также обнаружены различия влияния мАО на клетки разной степени трансформации.

Для реализации поставленных задач нами были использованы современные методы исследования, среди которых иммунофлуоресцентная световая и конфокальная лазерная микроскопии, проточная цитофлюориметрия,

иммуноблоттинг белков, измерение митохондриальных АФК с помощью лентивирусной конструкции с белковым сенсором перекиси водорода Hyper.

Важными научными вопросами является выяснение биологических функций окислительного стресса и его влияния на неопластическую трансформацию. Впервые были получены данные о том, что митохондриальные АФК воздействуют на сигнальный каскад EGFR/MEK/ERK в клетках рака шейки матки. Существует множество доказательств участия каскада ERK в патогенезе и прогрессии различных опухолей человека (Bodart et al., 2002), поэтому идет интенсивный поиск и тестирование новых ингибиторов этого каскада в качестве противоопухолевой терапии (Friday & Adjei, 2008; Roberts & Der, 2010; Wong, 2009). Согласно нашим данным, мАО подавляют активацию ERK1/2, тем самым блокируя этот сигнальный каскад.

Таким образом, нами была обнаружена фенотипическая нормализация клеток рака шейки матки при снижении уровня АФК с помощью мАО группы SkQ, а также изучен механизм действия SkQ на клеточный сигнальный каскад киназы ERK. Наше исследование имеет не только теоретическое, но и важное практическое значение. Полученные нами данные позволяют рассматривать мАО как потенциальные средства превентивной и поддерживающей противоопухолевой терапии.

Апробация результатов работы. Основные результаты работы были представлены и обсуждены на следующих конференциях: 1) XV Международная научная конференция «Ломоносов-2008», 8-11 апреля 2008 г., Москва, Россия; 2) XVI Евроконференция по апоптозу, 6-9 сентября 2008 г., Берн, Швейцария; 3) Всероссийская конференция «Фундаментальная онкология - Петровские чтения», апрель 2009 г., Санкт-Петербург, Россия; 4) Школа-семинар по проблемам организации внутриклеточного транспорта, цитоскелета и путей передачи сигнала, 16-17 ноября 2009 г., Санкт-Петербург, Россия; 5) IX Международный симпозиум «Биологическая подвижность», 11-15 мая 2010 г., Пущино, Россия; 6) Международная конференция «From Homo sapiens to Homo sapiens liberatnsy>, 25-26 мая 2010 г., Москва, Россия; 7) I Всероссийская

конференция "Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет", 11-13 октября, 2011 г., Санкт-Петербург, Россия; 8) 37-ой международный конгресс Федераций европейских биохимических сообществ, 4-9 сентября 2012 г., Севилья, Испания; а также на совместном заседании отделов биоэнергетики и математических методов в биологии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова 15.12.2011 г., на заседании кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова 15.11.2012 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих перечню ВАК РФ - 3, тезисов докладов и материалов конференций - 8.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка, 1 таблицу. Список литературы включает 243 источника, из которых 15 — на русском языке, 228 - на иностранном языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клеточные линии и питательные среды для роста клеток. Были использованы следующие культуры клеток: линия НаСаТ, спонтанно иммортализованные in vitro кератиноциты из гистологически нормального эпителия человека; культуры клеток рака шейки матки - С-ЗЗА (АТСС #НТВ-31), SiHa (АТСС #НТВ-35), Caski (АТСС #CRL-1550). Клетки культивировали на среде DMEM («ПанЭко», Россия) с добавлением 5% эмбриональной сыворотки телят («HyClone», США), антибиотиков пенициллина и стрептомицина (по 100 ед/мл, «ПанЭко») и глутамина (5мМ, «ПанЭко») при 37°С в увлажненной атмосфере 5%-ного СОг.

Реактивы и специфические агенты. В ходе работы использовались мАО SkQl и его аналоги (10-40нМ, «Митотехнологии», Россия); АО NAC (1мМ, N-acetyl-L-cysteine, «Sigma», США); разобщитель FCCP (carbonyl cyanide р-trifluoromethoxyphenylhydrazone, 0,5ц.М, «Sigma», США); эпидермальный фактор роста (ЭФР, 5-10 нМ, «Chemicon», США); высокоселективный ингибитор киназ МЕК1/2, U0126 (2-ЮмкМ, «Cell Signalling», США).

Для иммунофлуоресцентной микроскопии и иммуноблотгинга белков использовали следующие мышиные моноклональные антитела: к ß-актину (клон 4С2, IgGl), у-актину (клон 2АЗ, IgG2b; Dugina et al., 2009); Е-кадгерину, N-кадгерину («BD Transduction Laboratories», США), виментину (DAKO, США); а-тубулину («Sigma», США); крысиные моноклональные антитела к Snail («Cell Signalling», США); кроличьи поликлональные антитела к ERK1/2 (р42/44), р-ERK1/2 (р-р42/44) («Cell signalling», США), рецептору к эпидермальному фактору роста, РЭФР (EGFR), ф-РЭФР (p-EGFR) («Cell Signalling», США). В качестве вторых антител для иммунофлуоресценции использовали козьи флуоресцеин- и родамин-конъюгированные антитела к иммуноглобулинам IgG2a, IgG2b и IgGl мыши («Southern Biotechnology», США), козьи Alexa-488-конъюгированные антитела к иммуноглобулинам крысы («Molecular probes», США), ядра выявляли с помощью DAPI («Sigma», США). Для иммуноблотгинга белков вторыми антителами, связанными с пероксидазой хрена, служили козьи антитела к иммуноглобулинам IgG мыши и кролика («Sigma», США). Содержание АФК в клетке изучалось с помощью H2DCF-DA (диацетиловый эфир 5'-6'-хлорметил-2',7'-дихлордигидро-флуоресцеина, «Invitrogen», США). Иммунофлуоресцентная и лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. Для иммунофлуоресцентного окрашивания клетки культивировали на покровных стеклах, фиксировали 15 мин 1%-ным параформальдегидом, затем подвергали их экстракции-фиксации холодным метанолом при -20° в течение 5 мин для последующей окраски антителами. Иммунофлуоресцентное исследование проводили с помощью микроскопа Axioplan (объективы Plan-Neofluar 40х/0.75 иТ00х/1.3, «Carl Zeiss», Германия),

лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM510 (аргоновый (исходящая длина волны 488 пш) и гелий-неоновый (543nm) лазеры, объектив Plan-Neofluar 63x/1.4, «Carl Zeiss», Германия). Обработка изображений производилась при помощи программ LSM5 Image Examiner и Adobe Photoshop. Электрофорез и иммуноблоттинг белков проводили по стандартным методикам (Шагиева и др., 2012). Полученные пленки сканировали и проводили денситометр ический анализ в программе Image J 1,37С (NIH, http://rsb.info.nih.gov/ij/) с использованием а-тубулина для нормализации. Измерение продукции АФК методом проточной цитофлуориметрии. Для изучения содержания АФК клетки инкубировали с раствором H2DCF-DA в концентрации 1,8 мкМ в культуральной среде в течение 10 минут в темноте при 37°С. Флуоресценцию анализировали с помощью проточного цитофлуориметра Beckman Coulter Cytomics FC500. Для измерения митохондриальной продукции АФК использовали белковый сенсор перекиси НуРег, содержащий последовательность, кодирующую сигнальный пептид импорта в митохондрии («Eurogene», Россия). На основании данного сенсора была создана лентивирусная конструкция (pLCMVHyPer-mito, Е. Галимов, Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН). Для экспериментов использовали линию клеток SiHa, стабильно экспрессирующих направленный в митохондрии желтый флуоресцентный белок Hyper. Исследование интенсивности флуоресценции проводили с помощью микроскопа Axioplan (объектив Plan-Neofluar ЮОх/1.3) и программы ImageJ 1,37С. Подсчет количества клеток при изучении пролиферативных характеристик клеточных культур производился на единицу площади культурального матраса на сроках инкубации от 5 часов до 5 суток при помощи микроскопа Axioplan (объектив Plan-Neofluar 20х/0.50).

Статистический анализ. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего по результатам как минимум трех независимых экспериментов. Для проверки статистических гипотез был использован /-тест

Стьюдента, значения р < 0,001 (***) , р < 0,01 (**) и р < 0,05 (*) считались статистически достоверными.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Организация актиновых микрофиламентов в нормальных и опухолевых кератиноцитах. Влияние мАО на распределение изоформ актина. Из всех рассмотренных культур иммортализованные кератиноциты культуры НаСаТ наиболее близки по организации к нормальным эпителиальным клеткам. В цитоплазме клеток НаСаТ выявляется хорошо развитая система пучков Р-актиновых микрофиламентов. После инкубации с ЭкСН (40 нМ, 7 сут.) кольцевые пучки Р-актина на периферии островков становятся немного толще, радиальная система Р-актина в зоне межклеточных контактов выявляется лучше. Густая сеть у-актина в клетках НаСаТ после инкубации с мАО не меняется.

В неопластически трансформированных клетках, в основном, выявляется диффузный р-актин и лишь небольшая часть Р-актиновых микрофиламентов организована в тонкие короткие ненаправленные фибриллы. По периметру клеток видны ламеллярные участки с повышенным окрашиванием р-актина в раффлах (рис.1). Во всех культурах наблюдается интенсивное окрашивание густой кортикальной и ламеллярной сети у-актиновых филаментов. В результате инкубации клеток БМа, Саэкл и СЗЗА с мАО в течение 4-7 суток пучки Р-актина становятся толще. В клетках выявляется система тангенциальных и радиальных пучков Р-актина (рис.1). Распределение у-актина в неопластически трансформированных клетках после инкубации с мАО не меняется. Схожие изменения организации цитоскелета под действием мАО в вирус-содержащих (БМа и Саз1а) и безвирусной (СЗЗА) культурах, позволили сделать вывод о том, что механизм действия мАО не затрагивает белки вируса папилломы человека (ВПЧ).

Изменения экспрессии цитоплазматических изоформ актина в зависимости от степени трансформации клеток показаны на рис.2. Наблюдается увеличение экспрессии у-актина и достоверное снижение экспрессии Р-актина в более трансформированных клетках 81На, по сравнению с клетками НаСаТ.

Рис.1.

Организация

актинового

цитоскелета

в клетках

культуры ЭШа.

(3-Актин — зеленый;

у-актин - красный;

а, б) контроль;

в, г) БкС^ (40нМ, 7сут.),

Иммунофлуоресцентная

микроскопия.

В нашей работе (Шагиева и др., 2012) было показано снижение количества Р-актина при усилении трансформации клеток при помощи ЭФР in vitro и в опухолевых клетках гистологических срезов цервикальных интраэпителиальных неоплазий по сравнению с клетками нормального экзоцервикса.

12 Рис.2. Изменение

SiHa НаСаТ

а-тубулин (3-актин у-актин

экспрессии цито плазматических изоформ актина при трансформации _| кератиноцитов.

Экспрессия Р-актина в клетках 8Ша й^Г достоверно ниже, чем в НаСаТ (р<0,001).

Иммуноблоттинг белков.

Нарушение организации системы актиновых микрофиламентов вызывает изменения упорядоченности и ориентации клеток, неконтролируемый рост клеток, неправильный ответ на внешние стимулы, опухолевую трансформацию клеток (Prasad, 2005; Yamaguchi and Condeelis, 2007). Мы показали, что мАО вызывают реорганизацию актинового цитоскелета опухолевых клеток. После воздействия мАО в клетках карциномы появляются упорядоченные пучки Р-актина, образующие характерные для нормального эпителия структуры.

Учитывая роль актинового цитоскелета в поддержании и регуляции адгезионных контактов, следующим этапом нашего исследования было наблюдение за реорганизацией комплекса адгезионных межклеточных контактов в нормальных и опухолевых клетках под действием мАО. 2. Выявление белков межклеточных контактов в нормальных и опухолевых кератнноцитах. Разрушение адгезионных межклеточных контактов является ключевым шагом опухолевой прогрессии, приводящим к инвазии и метастазированию. Основными маркерами адгезионных межклеточных контактов являются белки Е-кадгерин, а- и р-катенины. Во многих опухолевых клетках отмечается значительное снижение или потеря экспрессии Е-кадгерина (\Vheelock е1 а1., 2001).

Рис.3. Е-кадгерин и Р-актин в клетках культуры НаСаТ.

Р-Актин- красный; Е-кадгерин-зеленый); а, б) контроль, в, г) 8к<31 (40нМ, 7 сут.); иммунофлуоресцентная микроскопия; д) уровень Е-кадгерина в клетках НаСаТ: контроль (7 сут.), 8кС>1 (40нМ, 7 сут.); иммуноблоттинг белков, статистически достоверных различий не выявлено; е) достоверное снижение уровня экспрессии Е-кадгерина в клетках опухолевых линий по сравнению с неопухолевыми кератиноцитами НаСаТ, р < 0,001 (***) и р <0,01 (**); иммуноблоттинг белков.

Е-кадгерин экспрессируется в большинстве нормальных эпителиальных тканей. В клетках культуры НаСаТ Е-кадгерин присутствует в больших количествах и концентрируется в зоне межклеточных контактов (рис.36), где он колокализован

9

с (3-актином (рис.За). Изменений в распределении и количестве Е-кадгерина в клетках НаСаТ после инкубации с МАО не наблюдалось (рис.Зг, д). С помощью иммуноблоггинга белков нам удалось выявить достоверную разницу уровней экспрессии Е-кадгерина в клетках опухолевых линий по сравнению с неопухолевыми кератиноцитами (рис.Зе).

В клетках культур БМа и Саз1о выявляется диффузное распределение Е-

кадгерина в цитоплазме, межклеточные контакты выявляются слабо, Е-кадгерин

концентрируется в ламеллах (рис.46, на примере 8Ша). После инкубации с мАО

Е-кадгерин локализуется в зоне межклеточных контактов (рис.4г).

Рис.4. Е-кадгерин и Р-актин в клетках культуры БШа. Р-Актин - красный. Е-кадгерин — зеленый, а, б) контроль; в, г) БкСЛ (40 нМ, 7сут.).

Иммунофлуоресцент-ная микроскопия.

а . 4: б

/ * li^BHi *

4* г

В Г

'Л

Методом иммуноблоттинга белков было показано повышение экспрессии Е-кадгерина в клетках SiHa после инкубации с мАО (рис.5а), а также с NAC (данные не показаны). Эффект имел дозозависимый характер (рис.56).

контр SkQl

Е-кадгерин

а-тубулин

SkQRl(nM), 7д О Е-кадгерин а-тубулин

1 5 10 20 40 100

Рис.5. Повышение количества Е-кадгерина в клетках 8Ма после инкубации с 8к<31: а) 7 сут. воздействия БкС? 1 (20нМ), р < 0,001 (***); контр ькО! б) зависимость повышения количества Е-кадгерина от концентрации ЭкСЖ1 (0 - ЮОнМ, 7 сут.). Иммуноблоттинг белков.

В состав адгезионных контактов

также входят Р- и а-катенины. Регуляция уровня цитозольного р-катенина важна, поскольку р-катенин может взаимодействовать с транскрипционными факторами и управлять транскрипцией генов, вовлеченных в пролиферацию. Для р-катенина в клетках SiHa характерна диффузная окраска. После инкубации с мАО интенсивная флуоресценция концентрируется в области межклеточных контактов (рис.6).

Рис.6. Распределение р-катенина в клетках культуры SiHa. а) контроль; б) SkQl (40 нМ, 7 сут.).

Иммунофлуоресцентная микроскопия.

ct-Катенин является связующим звеном между Е-кадгерином и актиновым цитоскелетом. Потеря или снижение уровня экспрессии а-катенина, как и Е-кадгерина, ведет к разрушению межклеточных контактов. Инкубация с мАО повышает количество а-катенина в клетках культур карциномы шейки матки. 3. Воздействие мАО на рост нормальных и опухолевых кератиноцитов в культуре. Для анализа воздействия мАО на пролиферацию опухолевых и нормальных кератиноцитов было подсчитано количество клеток на единицу площади (диаграммы зависимости количества клеток от времени инкубации с SkQI-pnc.7). Аналогичные данные были получены для других мАО.

а б

9 т J; ? | II*»

< D КОШ ПО. II. Щ -С КОПИЮ. II.

о SkOi И i ■ SkQi

- В i WN>

lira Щ ft fl III" . . . I I

= l.l 21 ii 5.) = l.i 21 J i <i

ллиге.п,поп ь икк-упщиш длительность инкубации

Рис.7. Воздействие мАО на рост клеток культуры НаСаТ и SiHa. мАО не влияли на пролиферацию неопухолевых НаСаТ (а), но подавляли пролиферацию опухолевых клеток SiHa (б), а) НаСаТ, SkQl (40 нМ); 6)SiHa, SkQl (40 нМ).

Инкубация клеток БШа с мАО ведет к замедлению скорости роста культуры (Рис.7 б). Эффект выражен на всех рассмотренных сроках инкубации с веществом, наибольшая разница наблюдается на пятые сутки инкубации (максимальный рассмотренный срок). На скорость пролиферации клеток культуры НаСаТ мАО не влияли (Рис.7 а).

Таким образом, при изучении клеток карциномы шейки матки в культуре, мы обнаружили изменение фенотипа опухолевых клеток с усилением признаков эпителиальной дифференцировки под воздействием мАО: реорганизации актинового цитоскелета и адгезионных контактов опухолевых кератиноцитов, замедлении их пролиферации, увеличении количества эпителиальных маркеров - опухолевых супрессоров Е-кадгерина и а-катенина (Таблица 1). Таблица 1. Влияние мАО на кератиноциты разной степени опухолевой

трансфо рмации

8к(2 вызывает

Линии клеток угнетение пролиферации реорганизацию актинового цитоскелета улучшение АК*

НаСаТ - + +

8Ша + + +

СаэИ + + +

СЗЗА - + +

*(адгезионные межклеточные контакты)

4. Изучение воздействия эпидермального фактора роста на актиновый цитоскелет и кадгерины в культурах опухолевых клеток. Инвазивные свойства опухолевых клеток связаны с понижением экспрессии молекул адгезионных контактов и повышением экспрессии мезенхимальных маркеров — процессом, названным эпителиально-мезенхимальным переходом (ЭМП). В культурах ЭМа и СаБк! признаки ЭМП хорошо выражены, поэтому мы выбрали их для дальнейших экспериментов. Для выяснения возможных механизмов фенотипической нормализации опухолевых клеток под действием 8к<31 и его аналогов мы моделировали дальнейшую активацию ЭМП в опухолевых клетках с помощью эпидермального фактора роста (ЭФР) и оценивали влияние МАО на активацию ЭМП.

Контрольные клетки Саек! - дисковидные или фибробластоподобные с выраженными псевдоподиями и диффузным Р-актином в цитоплазме и короткими тонкими пучками (3-актина в ламеллах (рис.8 а). Инкубация с 8к(^ индуцирует образование островков клеток с Е-кадгерин-позитивными адгезионными межклеточными контактами, (3-актин концентрируется в зоне межклеточных контактов (рис.8 б). Под воздействием ЭФР клетки Сав^ образуют многочисленные ламеллиподии на ведущем крае, плотных островков клеток не образуется, (3-актин диффузный с концентрацией в ламеллах (рис.8 в). Совместная инкубация с БкСЗ и ЭФР ведет к образованию островков клеток с Е-кадгерин-позитивными межклеточными контактами и концентрацией р-актина в области межклеточных контактов (рис.8 г).

Рис.8. Изменения актинового цитоскелета и адгезионных контактов клеток СазЫ после инкубации с МАО и стимуляции ЭФР. Р-Актин - зеленый, ДНК -синий, Е-кадгерин -красный, а) контроль;

б) Бкд1 (40 нМ,7 сут.);

в) ЭФР (5 нМ, 3 сут.);

г) 8к(31 (40 нМ, 7 сут.) с ЭФР (5 нМ, 3 сут.). Иммунофлуоресцентная микроскопия.

а > б ч 1

в г % - ->ч Г ^^ >.. л 4 л Юм км

Важным процессом при ЭМП является переключение типов синтезируемых кадгеринов с эпителиального Е- на ]\1-кадгерин, характерный для мезенхимальных клеток. В клетках СавЫ признаки ЭМП, такие как экспрессия мезенхимальных маркеров виментина и Ы-кадгерина, выражены наиболее ярко из всех исследованных культур. С помощью иммунофлуоресцентного окрашивания показано, что в контрольных клетках линии СаБк1 присутствуют в равной степени как Е-, так и М-кадгерин. С помощью иммунофлуоресценции и иммуноблоттинга белков мы обнаружили, что ЭФР и 8к0 влияют на

количественные соотношения двух типов кадгеринов в клетках Caski. После инкубации с МАО повышается уровень экспрессии Е-кадгерина и понижается уровень экспрессии N-кадгерина. ЭФР значительно повышает экспрессию N-кадгерина в клетках Caski. При совместном воздействии SkQ и ЭФР в межклеточных контактах преимущественно выявляется Е-кадгерин.

Виментин является маркером мезодермальных тканей. Появление этого маркера в клетках эпителиального происхождения свидетельствует о том, что клетки претерпели ЭМП. Для клеток Caski характерно наличие виментиновых филаментов (рис.9, а). По данным иммунофлуоресцентной микроскопии, инкубация с SkQ ведет к снижению уровня виментина в клетках (рис. 9, б), тогда как ЭФР увеличивает количество виментина в клетках по сравнению с контролем (рис.9, в). При совместном действии SkQl и ЭФР окрашивание антителами к виментину в клетках Caski снижается по сравнению с контролем (рис.9, г).

Инкубация с ЭФР вызывала усиление процесса ЭМП, сдвигая фенотип

исследуемых клеток к мезенхимальному типу. МАО частично подавляли

изменения, вызванные ЭФР. Это выражалось в увеличении экспрессии

эпителиального маркера Е-кадгерина, и уменьшении экспрессии

мезенхимальных маркеров, таких как Snail (см. далее), N-кадгерин, виментин.

Рис.9. Распределение виментина в клетках культуры Caski после стимуляции ЭФР и инкубации с мАО. Виментин — зеленый.

а) контроль;

б) SkQl (40 нМ,7 сут.);

в) ЭФР (5 нМ, 3 сут.);

г) SkQl (40 нМ, 7 сут.) совместно с ЭФР (5нМ, 3 сут.).

Иммунофлуоресцентная микроскопия.

а б

в г Юм км

ттт

5. Влияние ЭФР и мАО на транскрипционный фактор Snail и каскады МАР-киназ в клетках карциномы шейки матки. При различных видах опухолей затронуты разные механизмы подавления экспрессии Е-кадгерина (Peinado et al, 2007). Часто экспрессия Е-кадгерина подавляется транскрипционными факторами Snail, Slug, Twist, и др. (Bolos et al, 2003). Базовый уровень экспрессии белка Snail в опухолевых клетках SiHa и Caski значительно выше, чем у клеток НаСаТ (рис.10). Мы предположили, что мАО снижают общее содержание транскрипционного фактора Snail в клетках рака шейки матки, что может вызывать повышение экспрессии Е-кадгерина.

SiHa НаСаТ Caski |;

Snail

Рис.10. Экспрессия Snail в опухолевых SiHa и Caski выше, чем в неопухолевых клетках НаСаТ.

Silla НаС аТ Caski ИммунобЛРТТИНГ беЛКОВ.

Д=1.2

к....... SkOB = j—|

ТТ

KIIII11) SkQB = 1,2

1,1 1л

¿il,4

ЛМЙ* й

= II

кон I |i SkQRl ЭФР SkQKl )ФР

Рис.11. МАО и ЭФР меняют содержание Snail в SiHa. Snail - зеленый, ДНК -синий; а) контроль; б) SkQBerb (20 нМ,7 сут.); в) ЭФР (5 нМ, 3 сут.); г) SkQBerb (20 нМ, 7 сут.) + ЭФР (5 нМ, 3 сут.); иммунофлуоресцентная микроскопия, д) экспрессия Snail (SkQBerb, 20 нМ, 1 сут.); е) экспрессия Snail после инкубации с ЭФР (5 нМ, 3 сут.) и SkQRl (20 нМ, 7 сут.); иммуноблоттинг белков.

Выявление Snail в клетках SiHa методом иммуноблоттинга белков показало, что количество этого белка после инкубации с мАО снижается уже через 1 сутки

(рис.Пд). При стимуляции ЭФР уровень Snail в ядре увеличивался (рис.11в), этот эффект снимала прединкубация клеток с мАО (рис. 11г).

Каскады МАР-киназ играют важную роль в опухолевой трансформации и регуляции уровня Snail в различных типах опухолевых клеток (Bonavida & Baritaki, 2011; Montserrat et al, 2012; Nagarajan et al, 2012; Vergara et al, 2011). Сигнальный путь Ras/Raf/MEK/ERK регулирует экспрессию белков, контролирующих процессы пролиферации клеток, дифференцировки и апоптоза. Повышенное содержание фосфо-киназы ERK1/2 ^-ERKl/2) характерно для различных опухолевых заболеваний (Sivaraman et al, 1997; Gioeli et al, 1999; Tan et al, 2004; Lee et al, 2004; Milella et al, 2005). Существует двусторонняя связь между транскрипционным фактором Snail и МАР-киназными каскадами. Snail активирует сигнальные каскады Raf-1/MEK/ERK и NF-кВ (Bonavida and Baritaki, 2011). С другой стороны, активация белка Snail заметно снижается специфическими ингибиторами ERK, р38 или JNK, что указывает на роль каждой из этих МАР-киназ в регуляции Snail (Li et al, 2010). Мы обнаружили, что инкубация с мАО снижает уровень фосфорилированной киназы ф-ERKl/2 в клетках рака шейки матки (рис.12, на примере Caski). Уровень ф-Е1Ж1/2 в SiHa значительно повышался при инкубации клеток с ЭФР, мАО подавляли этот эффект. В клетках Caski ЭФР-индуцированное повышение содержания ф-Е1Ж1/2 не снималось прединкубацией с мАО, но подавлялось ингибитором МЕК1/2 -U0126 (рис.12). Уровень неактивной киназы ERK1/2 и фосфорилированной МАР-киназы ф-р38 под действием мАО и ЭФР в клетках Caski не менялся.

_ s

коптр SkQR! ЭФР SkQRl U0126 = +ЭФР +ЭФР •I'

а-тубулин (j)-ERKl/2

и

=й

J±L

нн

контр SkQRl

ЭФР SkQRl U0I26 +ЭФР +ЭФР

Рис.12. Влияние мАО и ЭФР на активацию МАР-киназ в клетках Сазкк Изменения содержания фосфорилированной МАР-киназы ф-Е1У<.1/2 в стимулированных ЭФР (5 нМ, 1 сут.) клетках Сазк1 после инкубации с ЭкС^!

(20 нМ, 5 сут.) и с ингибитором МЕК, Ш126 (10 мкМ, 2 сут.). Иммуноблоттинг белков.

6. МАО снижают уровень рецептора к ЭФР в опухолевых клетках. Известно, что при фосфорилировании рецептора к эпидермальному фактору роста (РЭФР) происходит активация каскада ЕЛК. Мы обнаружили, что МАО не влияют на уровень фосфорилирования РЭФР в первые минуты стимуляции с помощью ЭФР в клетках рака шейки матки. По предварительным данным, недельная инкубация с МАО приводит к снижению уровня РЭФР (рис.13), но не его фосфорилирования. Такой же эффект может быть достигнут с помощью ингибитора МЕК 1/2 -110126.

1.« ? 1.2

контр $к(21 РЭФР — - -а-тубулин " ф-ЕКК1/2 -

0.8 --

е- о,4 --©

*

-4=

Рис.13. Содержание РЭФР снижается после инкубации клеток ЭШа с8к(21 (20 нМ, 7 сут.). Иммуноблоттинг белков.

контр 8к<31

7. Изучение митохондриальной направленности и антиоксидантных свойств молекул семейства 8кС>. Для выявления клеточной мишени АО группы 8к<3, клетки культуры 8Ша прижизненно фотографировали с помощью флуоресцентного микроскопа после инкубации с мАО, обладающими флуоресцентными свойствами (8кС>Ги, 8к(ЗВегЬ и 8кС)Ра1т). Выявленное специфическое окрашивание указывает на локализацию вышеуказанных АО в митохондриях.

АО группы 8к(3 имеют в своем составе положительно заряженные ионы фосфония или родамина, соединенные с пластохиноном. Эти катионы отвечают за накопление мАО внутри митохондрий, эффективно понижая уровень митохондриальных АФК (Ап1:опепко е1 а1., 2008). Для проверки того, действительно ли митохондриальная направленность является необходимым условием вышеописанного действия 8к<3 на морфологию опухолевых клеток в культуре, мы провели опыты с разобщителем окислительного

фосфорилирования FCCP. После инкубации клеток культуры SiHa с FCCP совместно с мАО, наблюдалось нивелирование эффектов, индуцируемых мАО в трансформированных клетках. FCCP, деполяризуя митохондриальную мембрану, препятствует направленному действию антиоксидантов группы SkQ.

Чтобы проверить, вызывают ли мАО в используемых нами концентрациях снижение уровня АФК в клетках рака шейки матки, мы применяли метод проточной цитофлуориметрии с использованием специфического флуоресцентного красителя DCF (рис.14). Для выявления влияния мАО на митохондриальную продукцию АФК мы использовали линию клеток SiHa, экспрессирующих направленный в митохондрии желтый флуоресцентный белок Hyper, биосенсор АФК (рис.14). Достаточно высокий базовый уровень АФК в клетках SiHa позволил выявить флуоресцентное окрашивание митохондрий с помощью флуоресцентной микроскопии. SkQ понижал базовый уровень митохондриальных АФК. Инкубация клеток с ЭФР, напротив, стимулировала продукцию митохондриальных АФК.

Мы показали, что антиоксиданты группы SkQ имеют митохондриальную локализацию в клетках карциномы шейки матки и способны снижать как общий уровень АФК в опухолевых клетках, так и уровень митохондриальных АФК. Контрольные молекулы, содержащие проникающие катионы без пластохинона, не вызывали отмеченных для мАО изменений в исследованных клетках.

а ь

с

к

1,2 0.9

. 0.6 0,3

s

в

о

б

контр SkQRl

2 2 80 5

| I 60

3 F

" " m

а ч -">

о 2

S z

контр SkQI ЭФР SkQl +ЭФР

Рис.14. МАО

снижают уровень АФК в клетках 8Ша. а) снижение уровня цитоплазматических АФК после инкубации с 8кОИЛ (20 нМ, 7 сут.), р<0,01(**); статистический

анализ данных проточной цитофлуориметрии; б) измерение интенсивности флуоресценции биосенсора Hyper; статистический анализ данных иммунофлуоресцентной микроскопии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наличие сильно выраженного антиапоптозного эффекта SkQ, описанного в статье Антоненко и др. (2008), поставило вопрос о том, не обладают ли вещества семейства SkQ свойствами канцерогенов, поскольку апоптоз служит одним из главных механизмов антираковой защиты организма. Наши данные свидетельствуют против такой возможности. SkQ обнаруживает выраженный противопухолевый эффект. Можно предполагать, что несколько аспектов физиологии опухолей существенно зависят от продукции митохондриальных АФК. Во-первых, нейтрализация митохондриальных АФК с помощью SkQ ингибирует пролиферацию опухолевых клеток. Возможно, этот эффект определяется подавлением каких-либо АФК-зависимых митоген-активируемых сигнальных путей, таких например, как активация МАР-киназ (Wu, 2006; Nagai et al., 2007; Агапова и др., 2008). Во-вторых, SkQ вызывает процессы дифференцировки в различных опухолевых клетках. Нами были обнаружены координированные изменения морфологии, цитоскелета, организации межклеточных контактов в клетках эпителиальных опухолей. Возможно, гиперпродукция митохондриальных АФК стимулирует Ras-зависимый и другие сигнальные пути, ведущие к дедифференцировке и трансформированному фенотипу. Напротив, усиление дифференцировки опухолевых клеток может приводить к уменьшению инвазивности и общей агрессивности опухоли. Мы полагаем, что механизм действия SkQ может быть связан с активацией внутриклеточных фосфатаз (рис.15).

Получены предварительные данные о том, что SkQ вызывает увеличение содержания фосфатазы DUSP6, препятствуя активации ERK1/2. Влияние DUSP6 на процесс ЭМП и опухолевую прогрессию изучено мало. Значительное снижение экспрессии DUSP6 наблюдалось в клеточных линиях и образцах тканей эзофагального плоскоклеточного рака и рака носоглотки (Wong et al., 2012).

Возобновление экспрессии DUSP6 в клетках рака яичника значительно подавляло активность ERK1/2, пролиферацию клеток, способность к неприкрепленному росту и развитие опухолей у бестимусных мышей (Chan et al., 2008). Мы предполагаем существование механизма, благодаря которому накопление АФК при опухолевой прогрессии вызывает деградацию DUSP6, что ведет к постоянной активации ERK1/2, обеспечивающей онкогенность и устойчивость к химиотерапии раковых клеток. Для проверки нашей гипотезы проводятся дальнейшие эксперименты.

выводы

Митохондриально-направленные катионы группы ЯкС достоверно снижают уровень АФК в митохондриях и в цитоплазме. Снижение уровня митохондриальных АФК приводит к фенотипической нормализации опухолевых клеток, а именно:

1) восстановлению эпителиальной организации клеток рака шейки матки и торможению их пролиферации;

2) реорганизации пучков р-актиновых микрофиламентов и адгезионных межклеточных контактов в клетках рака шейки матки человека;

3) увеличению общего содержания опухолевых супрессоров Е-кадгерина и а-катенина в клетках карциномы;

4) уменьшению ядерной локализации и общего количества белка Snail в опухолевых клетках;

5) уменьшению количества рецептора к ЭФР и торможению фосфорили-рования MAP киназы ERK1/2 в клетках рака шейки матки;

6) предотвращению процесса ЭМП в культурах клеток SiHa и Caski.

Таким образом, мАО способны индуцировать процессы эпителиальной дифференцировки неопластически трансформированных клеток и предотвращать процесс ЭМП в культурах клеток рака шейки матки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах, соответствующих перечню ВАК РФ:

1. Агапова ЛС, Черняк БВ, Домнина ЛВ, Дугина ВБ, Ефименко АЮ, Фетисова ЕК, Иванова ОЮ, Калинина НИ, Хромова НВ, Копнин БП, Копнин ПБ, Коротецкая MB, Личиницер MP, Лукашев АЛ, Плетюшкина ОЮ, Попова ЕН, Скулачев MB, Шагиева ГС, Степанова ЕВ, Титова ЕВ, Ткачук В А, Васильев ЮМ, Скулачев ВП. SKQ1 подавляет развитие опухолей из р53-дефицитных клеток. (2008) Биохимия, 73, 1622-1640.

la. Agapova LS, Chernyak BV, Domnina LV, Dugina VB, Efimenko AY, Fetisova EK, Ivanova OY, Kalinina N1, Khromova NV, Kopnin BP, Kopnin PB, Korotetskaya MV, Lichinitser MR, Lukashev AL, Pletjushkina OY, Popova EN, Skulachev MV, Shagieva GS, Stepanova EV, Titova EV, Tkachuk VA, Vasiliev JM, Skulachev VP. Inhibitory effect of SkQl on tumor development from p53-deficient cells. Biochemistry (Mosc). 2008, 73:1300.

2. Черняк БВ, Антоненко ЮН, Галимов ЕР, Домнина ЛВ, Дугина ВБ, Звягильская РА, Иванова ОЮ, Изюмов ДС, Лямзаев КГ, Пустовидко АВ, Рокицкая ТИ, Рогов АГ, Северина ИИ, Симонян РА, Скулачев MB, Ташлицкий ВН, Титова ЕВ, Тренделева ТА, Шагиева ГС. Новые мито-хондриально-направленные соединения, построенные из природных веществ: конъюгаты растительных алкалоидов берберина и пальматина с пластохиноном. Биохимия, 2012, 77(9): 1186-1200.

2а. Chernyak BV, Antonenko YN, Galimov ER, Domnina LV, Dugina VB, Zvyagilskaya RA, Ivanova OY, Izyumov DS, Lyamzaev KG, Pustovidko AV, Rokitskaya TI, Rogov AG, Severina II, Simonyan RA, Skulachev MV, Tashlitsky VN, Titova EV, Trendeleva ТА, Shagieva GS. Novel mitochondria-targeted compounds composed of natural constituents: conjugates of plant alkaloids berberine and palmatine with plastoquinone. Biochemistry (Mosc). 2012, 77: 983-995.

3. Шагиева ГС, Домнина ЛВ, Чипышева ТА, Ермилова ВД, Шапонье К, Дугина ВБ. Реорганизация изоформ актина и адгезионных контактов при

эпителиально-мезенхимальном переходе в клетках цервикальных карцином. Биохимия, 2012, 77(11): 1513-1525.

За. Shagieva GS, Domnina LV, Chipysheva ТА, Ermilova VD, Chaponnier C, Dugina VB. Actin isoforms and reorganization of adhesion junctions in epithelial-to-mesenchymal transition of cervical carcinoma cells. Biochemistry (Mosc). 2012;77(11): 1266-1276.

Тезисы и материалы научных конференций:

4. Шагиева ГС. Изучение действия митохондриальных антиоксидантов на клетки карциномы шейки матки линии SiHa. Тезисы докладов XV международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2008». Секция «Биология». Москва, 2008, «Макс Пресс», с.29.

5. Domnina L, Ivanova О, Dugina V, Pletjushkina О, Popova Е, Shagieva G, EV Titova, BV Chernyak, Vasiliev Y, Skulachev V. Antioxidant SkQl leads to morphology differentiation of various transformed cells and protects mitochondria from H202 induced fragmentation. ECDO, 2008: 45.

6. Шагиева ГС, Домнина ЛВ, Дугина ВБ. Механизмы эпителиально-мезенхимального перехода в культуре клеток рака шейки матки. Цитология, 2012 54(1): 89-101.

7. Шагиева ГС, Попова ЕН, Домнина ЛВ, Плетюшкина ОЮ, Дугина ВБ. Изучение действия митохондриально-направленных антиоксидантов на культуры клеток рака шейки матки линий SiHa, СЗЗА и линии кератино-цитов человека НаСаТ. Вопросы онкологии, 2010, 56 (2): 54-55.

8. Шагиева ГС, Попова ЕН, Домнина ЛВ, Плетюшкина ОЮ, Дугина ВБ. Изучение действия МАО на культуры клеток рака шейки матки линии SiHa, СЗЗА и линии кератиноцитов человека НаСаТ. Цитология, 2010 (52) №3:268.

9. GS Shagieva, EN Popova, LV Domnina, OJu Pletjushkina, VB Dugina. The effects of mitochondria-targeted antioxidants on human cervical cancer cells. Biological Motility, 2010: 236-237.

10.GS Shagieva, EN Popova, LV Domnina, OJu Pletjushkina, VB Dugina, Skulachev VP. The effect of mitochondria-targeted antioxidants on human cervical cancer cells in culture. International Workshop "From Homo sapiens to Homo sapiens liberatus", 2010: 26-27.

11.Shagieva G, Domnina L, Chaponnier C, Dugina V. Actin isoforms and adhesion junctions reorganization in epithelial-mesenchymal transition of cervical carcinoma cells. FEBS Journal, 2012, Volume: 279, Pages: 317.

Подписано в печать: 07.11.2013

Заказ № 9034 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шагиева, Галина Сергеевна, Москва

Факультет биоинженерии и биоинформатики Московского государственного

университета имени М.В.Ломоносова Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени

М.В.Ломоносова

На правах рукописи

уда

0420136^14

ШАГИЕВА ГАЛИНА СЕРГЕЕВНА

СНИЖЕНИЕ УРОВНЯ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ПРИВОДИТ к ФЕНОТИПИЧЕСКОЙ НОРМАЛИЗАЦИИ КЛЕТОК КАРЦИНОМЫ ШЕЙКИ МАТКИ ЧЕЛОВЕКА

Специальность 03.03.04. - клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.б.н. В.Б. Дугина Научный консультант: акад. В.П. Скулачев

Москва 2013

СОДЕРЖАНИЕ

Список используемых сокращений........................................................5

¡.ВВЕДЕНИЕ......................................................................................7

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................12

2.1. Карцинома шейки матки человека............................................12

2.2. Механизмы действия вирусов папилломы высокого риска.............12

2.3. Активные формы кислорода..................................................14

2.4. Функции активных форм кислорода........................................14

2.5. Окислительный стресс и антиоксидантные системы клетки.............16

2.6. Синтетические митохондриально-направленные антиоксиданты.....18

2.7. Актиновый цитоскелет..........................................................21

2.7.1. Полимеризация актина.................................................21

2.7.2. Комплексы, отвечающие за нуклеацию актина...................22

2.7.3. Функции актинового цитоскелета.................................24

2.7.4. Изоформы актина......................................................25

2.7.5. Структуры клетки, образованные актином........................27

2.7.6. Изоформы актина при трансформации клеток....................28

2.8. Адгезионные контакты клеток................................................31

2.8.1. Контакты эпителиальных клеток.....................................31

2.8.2. Кадгерины, общие сведения и изоформы.........................32

2.8.3. Е-кадгерин...............................................................34

2.8.4. Ы-кадгерин................................................................35

2.8.5. Бета-катенин............................................................36

2.8.6. Альфа-катенин............................................................37

2.8.7. Модели образования адгезионных контактов....................38

2.9. Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП)...........................42

2.9.1. Процесс ЭМП............................................................42

2.9.2. Переключение изоформ кадгеринов при ЭМП..................43

2.9.3. Участие адгезионных контактов в процессе ЭМП..............44

2.10. Каскады МАР-киназ...........................................................45

2.10.1. Киназы, активированные митогенами............................45

2.10.2. ЕЮС-каскад.............................................................46

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................49

3.1. Материалы..........................................................................49

3.1.1. Клеточные линии и питательные среды для роста клеток......49

3.1.2. Реактивы и специфические агенты..................................50

3.2. Методы.............................................................................51

3.2.1. Иммунофлуоресцентная и лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.........................................................51

3.2.2. Электрофорез и иммуноблоттинг белков..........................51

3.2.3. Измерение продукции АФК методом проточной

цитоф лу ориметрии...................................................................52

3.2.4. Подсчет количества клеток при изучении пролиферативных характеристик клеточных культур................................................52

3.2.5. Статистический анализ.................................................53

4. РЕЗУЛЬТАТЫ...............................................................................54

4.1. Характеристика культур и морфологических изменений, вызванных антиоксид антами...............................................................................54

4.2. Влияние митохондриально-направленных антиоксидантов на рост нормальных и опухолевых кератиноцитов в культуре...............................57

4.3. Организация актиновых микрофиламентов в нормальных и опухолевых кератиноцитах.................................................................58

4.4. Выявление белков межклеточных контактов в нормальных и опухолевых кератиноцитах.................................................................66

4.5. Изучение воздействия эпидермального фактора роста на актиновый цитоскелет и кадгерины в культурах клеток карциномы шейки матки человека.............................................................................................72

4.6. Влияние ЭФР и митохондриально-направленных антиоксидантов на транскрипционный фактор Snail и каскады МАР-киназ в клетках карциномы шейки матки....................................................................................79

4.7. Митохондриально-направленные антиоксиданты снижают уровень рецептора к ЭФР в клетках карциномы шейки матки.................................83

4.8. Изучение митохондриальной направленности и антиоксидантных свойств молекул семейства SkQ...........................................................84

5. ОБСУЖДЕНИЕ............................................................................89

5.1. Опухолевая трансформация и окислительный стресс.....................89

5.2. Реорганизация актинового цитоскелета опухолевых клеток под воздействием митохондриально-направленных антиоксидантов..................91

5.3. Митохондриально-направленные антиоксиданты повышают экспрессию опухолевых супрессоров Е-кадгерина и альфа-катенина в клетках карциномы шейки матки....................................................................96

5.4. Подавление экспрессии транскрипционного фактора Snail в клетках карциномы шейки матки под воздействием митохондриально-направленных антиоксидантов................................................................................99

5.5. Влияние ЭФР и митохондриально-направленных антиоксидантов на активацию МАР-киназ.....................................................................100

5.6. Подавление пролиферации клеток карциномы шейки матки под воздействием митохондриально-направленных антиоксидантов..................102

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................104

7. ВЫВОДЫ..................................................................................107

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................108

Список используемых сокращений:

АФК - активные формы кислорода; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

МАР-киназы - (mitogen-activated protein kinases), киназы, активированные митогенами;

HPV - (human papillomavirus), вирус папилломы человека; мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

TNFa - (tumor necrosis factor alpha), фактор некроза опухоли-альфа; ЭФР - эпидермальный фактор роста;

BPV - (bovine papillomavirus), вирус папилломы крупного рогатого скота;

РЭФР - рецептор к эпидермальному фактору роста;

NADH - восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотида;

MCL-1 - (myeloid cell leukemia—1), белок миелоедной лейкемии-1;

HIF-1 а - (hypoxia-inducible factor-1 а), ген фактора, индуцируемого гипоксией,

1а;

VEGF - (vascular endothelial growth factor), фактор роста эндотелия сосудов.

АТФ - аденозинтрифосфат;

CAT - катал азы;

SOD - супероксид дисмутазы;

GST - глутатион S-трансферазы;

NF-kB - (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells), ядерный фактор «каппа-би»;

MnSod - магний-зависимая супероксидисмутаза; CoQ - кофермент Q, убихинон; АДФ - аденозиндифосфат;

АВР - (actin binding proteins), актин-связывающие белки; ЭМП — эпителиально-мезенхимальный переход; ТФР{3 - трансформирующий ростовой фактор бета; АК - адгезионные контакты;

ФРФ — фактор роста фибробластов;

NAC - (N-acetyl-L-cysteine), Т^-ацетил-Ь-цистеин;

БСА — бычий сывороточный альбумин.

1. ВВЕДЕНИЕ

Серьезной проблемой в лечении онкологических заболеваний является способность раковых клеток к инвазии в близлежащие ткани и метастазированию - распространению по всему организму с образованием вторичных очагов опухолевого роста. Механизмы, благодаря которым опухолевые клетки приобретают способность к миграции, на сегодняшний день изучены недостаточно. Опухолевая трансформация клеток часто связана с большими изменениями в организации цитоскелета, исчезновением или уменьшением клеточной адгезии и нарушением сигнальных путей, связанных с адгезией. Разрушение адгезионных межклеточных контактов у трансформированных клеток ведет к повышенной способности к пролиферации, миграции, инвазии и метастазированию.

Активные формы кислорода (АФК) влияют на процесс трансформации клеток, опухолевые клетки часто имеют повышенное содержание АФК. По данным ЬЫкста и коллег, мутации в митохондриальных ДНК, которые наблюдаются при различных видах опухолей, повышают способность опухолевых клеток к метастазированию. Различные мутации митохондриальной ДНК ведут к повышенной продукции АФК и регуляции генов, вовлеченных в процесс опухолевой прогрессии {ЬЫкста et а1., 2008; 5Ыйага е/ а\., 2005; РеКоэ е1 а1, 2005).

Поиск и изучение веществ, влияющих на содержание АФК в клетках, является важным направлением современных исследований. Антиоксиданты являются «антидотами» АФК. В ряде работ описывается влияние антиоксидантов на морфологию и пролиферацию опухолевых клеток (Р1еу'тИШпа et а1, 2006; А1ехапс1гоуа а а1., 2006).

Митохондриально-направленные антиоксиданты являются новым классом синтетических антиоксидантов, для которых характерно быстрое и

обратимое накопление в митохондриях, что повышает эффективность их действия {Kelso et al., 2001; Скулачев, 2007).

Целью данной диссертационной работы являлось изучение влияния митохондриально-направленных антиоксидантов на нормальные и опухолевые кератиноциты человека. Основные задачи исследования:

• Проанализировать изменения организации цитоскелетной системы и

межклеточных адгезионных структур ^трансформированных и опухолевых кератиноцитов человека под действием митохондриально-направленных антиоксидантов с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии;

• Изучить воздействие митохондриально-направленных антиоксидантов на

пролиферацию нормальных и опухолевых кератиноцитов в культуре;

• Провести количественную оценку изменения соотношения эпителиальных

и мезенхимальных маркеров в клетках карциномы шейки матки под действием митохондриально-направленных антиоксидантов с помощью иммуноблоттинга белков;

• Изучить возможное влияние митохондриально-направленных

антиоксидантов на активацию МАР-киназных сигнальных молекул в клетках рака шейки матки.

Научная новизна и практическая значимость работы. Исследованию механизмов подвижности опухолевых клеток, их способности к инвазии и метастазированию посвящено множество научных работ. Важнейшую роль в этих процессах играет реорганизация актинового цитоскелета, межклеточных контактов, каскадов сигнальных молекул.

В настоящее время активно изучается функциональная разница изоформ актина, их роль в направленном движении клеток. Благодаря использованию

уникальных специфических антител к цитоплазматическим изоформам актина впервые были исследованы изменения организации актинового цитоскелета опухолевых клеток после воздействия митохондриально-направленных антиоксидантов. В данной диссертационной работе впервые были показаны различия в распределении изоформ актина в опухолевых клетках разной степени трансформации. Полученные данные указывают на различные роли цитоплазматических актинов в опухолевой прогрессии.

Актиновый цитоскелет тесно связан с межклеточными контактами. Наряду с перестройкой актинового цитоскелета после воздействия митохондриально-направленных антиоксидантов группы SkQ, мы наблюдали реорганизацию адгезионных контактов и повышение количества опухолевых супрессоров — белков адгезионных контактов, Е-кадгерина и а-катенина. Под действием SkQ опухолевые клетки формировали эпителиальные островки, характерные для нормальных кератиноцитов.

Исследование линий опухолевых клеток разной степени и этиологии трансформации позволило нам сравнить изменения морфологии и сигнальных каскадов, происходящие с клетками после воздействия митохондриально-направленных антиоксидантов. Были выявлены новые закономерности, характерные для неопластически трансформированных клеток в целом, а также обнаружены различия влияния митохондриально-направленных антиоксидантов на клетки разной степени трансформации.

Для реализации поставленных задач нами были использованы современные методы исследования, среди которых иммунофлуоресцентная световая и конфокальная лазерная микроскопии, проточная цитофлюориметрия, иммуноблоттинг белков, измерение митохондриальных АФК с помощью лентивирусной конструкции с белковым сенсором перекиси водорода Hyper.

Важными научными вопросами является выяснение биологических функций окислительного стресса и его влияния на неопластическую

трансформацию. Впервые были получены данные о том, что митохондриальные АФК воздействуют на сигнальный каскад EGFR/MEK/ERK в раковых клетках. Существует множество доказательств участия каскада ERK в патогенезе и прогрессии различных опухолей человека (Bodart et al., 2002), поэтому идет интенсивный поиск и тестирование новых ингибиторов этого каскада в качестве противоопухолевой терапии (Friday & Adjei, 2008; Roberts & Der, 2010; Wong, 2009). Согласно нашим данным, митохондриально-направленные антиоксиданты подавляют активацию ERK1/2, тем самым блокируя этот сигнальный каскад.

Таким образом, нами была обнаружена фенотипическая нормализация клеток рака шейки матки при снижении уровня АФК с помощью митохондриально-направленных антиоксидантов группы SkQ, а также изучен механизм действия SkQ на клеточный сигнальный каскад киназы ERK. Наше исследование имеет не только теоретическое, но и важное практическое значение. Полученные нами данные позволяют рассматривать митохондриально-направленные антиоксиданты как потенциальные средства превентивной и поддерживающей противоопухолевой терапии.

Апробация результатов работы. Основные результаты работы были представлены и обсуждены на следующих конференциях:

1) XV Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», 8-11 апреля 2008 г., Москва, Россия;

2) XVI Евроконференция по апоптозу, 6-9 сентября 2008 г., Берн, Швейцария;

3) Всероссийская конференция «Фундаментальная онкология - Петровские чтения», апрель 2009 г., Санкт-Петербург, Россия;

4) Школа-семинар по проблемам организации внутриклеточного транспорта, цитоскелета и путей передачи сигнала, 16-17 ноября 2009г., Санкт-Петербург, Россия;

5) IX Международный симпозиум «Биологическая подвижность», 11-15 мая 2010 г., Пущино, Россия;

6) Международная конференция «From Homo sapiens to Homo sapiens liberatus», 25-26 мая 2010 г., Москва, Россия;

7) I Всероссийская конференция "Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет", 11-13 октября, 2011 г., Санкт-Петербург, Россия;

8) 37-ой международный конгресс Федераций европейских биохимических сообществ, 4-9 сентября 2012г., Севилья, Испания.

Апробация результатов работы состоялась на совместном заседании отделов биоэнергетики и математических методов в биологии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова 15.12.2011г., на заседании кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова 15.11.2012г.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Карцинома шейки матки человека

Рак шейки матки занимает второе место в мире среди женских онкологических заболеваний. Считается, что в большинстве случаев развитие заболевания вызывает вирус папилломы человека (human papillomavirus, HPV) (zur Hausen, 1996). Форма вириона HPV- икосаэдр, 55 нм в диаметре без оболочки. Капсид вириона, в котором находится геном вируса, состоит из 72 капсомеров. Кольцевая двойная цепочка ДНК содержит около 8000 нуклеотидных пар, она уложена при помощи гистонов, синтезированных клеткой хозяина. Для размножения вирус папилломы должен проникнуть в эпителиальную стволовую клетку человека. Затем, после деления зараженной стволовой клетки, ее потомки становятся дифференцированными клетками и проникают в верхние слои эпителия. В зараженных клетках, находящихся на последних стадиях дифференцировки, происходит активная транскрипция «поздних» генов вируса, синтезируются белки капсомера, происходит активное накопление вирусной ДНК. Наиболее часто в образцах рака шейки матки встречаются вирусы папилломы «высокого риска» - HPV16 и HPV18 (Zur Hausen, 1991; Zur Hausen, 2006).

2.2. Механизмы действия вирусов папилломы высокого риска

Вирусы папилломы человека высокого риска стимулируют к пролиферации эпителиальные клетки шейки матки при помощи трех онкогенов: Е5, Е6 и Е7 {Zur Hausen, 2002). Белок Е5 необходим на ранних стадиях развития инфекции. Он стимулирует деление клеток, формируя комплекс с рецептором к эпидермальному фактору роста (РЭФР), рецептором к фактору роста тромбоцитов и рецептором к колониестимулирующему

фактору-1 (Hwang et al., 1995). Также, E5 предотвращает апоптоз, вызванный повреждением ДНК {Zhang et al., 2002). При опухолевой прогрессии происходит интеграция вирусной ДНК в ДНК клеток хозяина. При этом значительная часть ДНК вируса, включая кодирующую Е5 последовательность, выбрасывается, таким образом, белок Е5 не обязателен для более поздних процессов опухолевой трансформации, вызванной вирусом папилломы человека {Schwarz et al., 1985).

Трансформирующим потенциалом обладают вирусные онкобелки Е6 и Е7. Большое число исследований было посвящено механизму работы онкобелка Е6. Его наиболее изученная функция - деградация опухолевого супрессора р53. Белок Е7 способствует продвижению по клеточному циклу, участвуя в деградации бел