Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение прооксидантного действия p66shc в клетках человека

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение прооксидантного действия p66shc в клетках человека"

005011125

На правах рукописи

ГАЛИМОВ ЕВГЕНИЙ РАФЛЭЛЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ПРООКСИДАНТІІОГО ДЕЙСТВИЯ РббЙНС В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 1 р 1Ш

Москва-2012

005011125

Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ физико-химической биологии имени Л.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в лаборатории пролиферации клетки Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук, Скулачев Владимир Петрович

профессор, академик РАН

доктор биологических наук, Чумаков Петр Михайлович

профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Лазаревич Наталья Леонидовна

профессор

кандидат биологических наук Белоусов Всеволод Вадимович

Ведущая организация: Институт биохимии имени АЛ. Баха РАН

Защита состоится «02» марта 2012 г. в 12-00 часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан «02» февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук ^ „ і__И'А' кРашеншшикоп

> \

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода А549 - клетки карциномы легких человека

DCF (CM-DCF-DA) - 5-(и-6)-карбокси-2\7'-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат

HDF - иммортализванные путем оверэкспрессии теломеразы кожные фибробласты человека

RKO - клетки карциномы толстой кишки человека

shRNA - короткие шпилечные РНК

SkQl - ЮЧб'-пластохинонил) децилтрифенилфосфоний

SkQRl - Ю-(б'-пластохинонил) децилродамин 19

рО клетки - клетки, не содержащие митохондриальной ДНК

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ

С появлением методов генетического нокаута в последние 20 лет был произведен прорыв в изучении генетики старения. У различных модельных организмов - дрожжей, нематоды, дрозофилы и мыши - выявлено несколько десятков генов, изменение активности которых замедляет скорость старения. К одним из наиболее интенсивно изучаемых относится белок p66shc. Относительно эволюционно "молодой", появившийся у позвоночных животных белок p66shc вовлечен сразу в два процесса тесно связанных со старением: передача сигналов в регуляторных путях, связанных с осью гормон роста/инсулиноподобный фактор роста-1 и развитие окислительного стресса. Мыши с генетическим нокаутом p66shc характеризуются увеличенной на 30% продолжительностью жизни и сохранением нормального фенотипа и фертильности, что делает эту модель особенно значимой для изучения физиологического и патологического старения млекопитающих. Делеция p66shc у мышей значительно повысила их устойчивость к окислительному стрессу и развитию связанных с ним патологий, таких, как атеросклероз, возрастное нарушение функций эндотелия сосудов, токсическое поражение печени, осложнения, возникающие при сахарном диабете. Изучение культур клеток мыши показало, что p66shc необходим дня развития окислительного стресса и апоптоза, вызванных различными индукторами. При этом обнаружено, что pôôshc может перераспределяться в митохондрии и, действуя в них как оксидоредуктаза, приводить к образованию перекиси водорода [Giorgio и др, 2005]. Эти данные свидетельствует в пользу генетически регулируемой роли митохондрий в старении.

1

В последнее время появляется много работ, свидетельствующих о роли рббБИс в канцерогенезе, особенно в развитии видов рака, зависимых от стероидных гормонов, таких распространенных как рак простаты и рак груди. Недавние исследования показали также, что высокий уровень экспрессии рббзЬс коррелирует с неблагоприятным прогнозом при раке толстой кишки. Таким образом, детальное изучение функций рбввЬс в развитии окислительного стресса и клеточной гибели может быть использовано в диагностике и фармакотерапии онкологических заболеваний и патологий, ассоциированных со старением.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью данной работы было исследование роли рббБЬс в различных моделях окислительного стресса клеток человека, опосредованного митохондриями. Были поставлены следующие задачи:

1. Получить стабильные линии клеток карциномы толстого кишечника человека ЯКО, карциномы легких человека А549 и иммортализованных кожных фибробластов человека НОР с генетическим нокдауном и оверэкспрессией рббвЬс.

2. Установить роль рббзЬс в накоплении эндогенных активных форм кислорода, при обработке перекисью водорода в клетках ЯКО и НОИ. Выявить роль митохондрий в этом процессе, используя митохондриально-направленные антиоксиданты и локализованный в митохондриях белок - сенсор перекиси Нурег-тко, а так же клетки с неактивной дыхательной цепью.

3. Изучить эффект изменения экспрессии рббзЬс на фрагментацию митохондриального ретикулума и гибель клеток, вызванную обработкой перекисью водорода, а также определить тип наблюдаемой клеточной смерти. Исследовать наблюдаемый эффект в клетках с неактивной дыхательной цепью.

4. Изучить роль рббзЬс в оксилительном стрессе, вызванным инкубацией в бессывороточной среде в клетках ЯКО и НОР. Определить участие митохондрий в этом процессе с помощью митохондриально-направленных акгиоксидантов, сенсора Нурег-тко и клеток с неактивной дыхательной цепью.

5. Проследить эффект изменения экспрессии рббБЬс на окислительный стресс и гибель клеток карциномы легких А549, индуцированные антараковым препаратом таксолом.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

В работе мы исследовали окислительный стресс в клетках ЯКО и НОИ, вызываемый перекисью водорода или культивацией в среде без сыворотки. Использование специфических антиоксидантов, направленных в митохондрии, а также белкового сенсора перекиси Нурег-тко позволило установить, что изучаемые стрессы в значительной степени определяются функционированием митохондрий в клетках человека. С помощью лентивирусных конструкций получены стабильные линии клеток карцином толстого кишечника и легких, а таюке иммортализованных фибробластов человека с генетическим нокдауном и оверэкспрессией рббзЬс.

Показано, что нокдаун рббвЬс ингибирует образование эндогенных АФК, индуцированных перекисью водорода в клетках карциномы толстого кишечника. Было таюке обнаружено, что этот эффект зависит от функциональной активности митохондриальной дыхательной цепи. Впервые установлено, что нокдаун рббзЬс в клетках человека предотвращает фрагментацию митохондриального ретикулума и защищает от каспаз-независимой гибели с признаками некроза, индуцированной перекисью водорода. Получены новые данные, свидетельствующие о роли рбввЬс в индукции опосредованного митохондриями окислительного стресса, вызванного инкубацией в среде без сыворотки. Впервые показано, что подавление экспрессии рббзЬс защищает от гибели и ингибирует накопление АФК в клетках карциномы легких А549, индуцированные противораковым препаратом таксолом.

Вместе, полученные данные указывают на то, что прооксидантное действие рббэЬс в клетках человека зависит от образования АФК в митохондриях. Изучение механизмов редокс-активности рббяЬс имеет большое значение для этиологии и лечения множества заболеваний, ассоциированных со старением и окислительным стрессом. Среди них атеросклероз, воспаление, инфаркт миокарда, различные ишемические состояния, нейродегенеративные заболевания, а также рак и диабет.

АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи. Результаты работы доложены на VI Международной крымской конференции "Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии", Судак, Украина 2010 г.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на £ ¿'^страницах и содержит следующие разделы: введение и цель работы, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован^^рисунками, ^ таблицами и содержит^ ссылок на литературные источники.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Окислительный стресс, вызванный перекисью водорода в клетках карциномы толстого кишечника человека К КО и в иммортализованных фибробластах.

Окислительный стресс, возникающий в результате дисбаланса генерации и удаления активных форм кислорода (АФК) относится к патологическим состояниям в физиологии клетки и является важным звеном в развитии старения и самых различных заболеваний человека. Возникающее при окислительном стрессе накопление АФК может приводить к повреждению клеточных структур и молекул, и, в то же время, регулировать разнообразные сигнальные пути. В нашей работе мы исследовали окислительный стресс в культуре клеток карциномы толстого кишечника человека ЮСО и в культуре ^трансформированных клеток, иммортализованных путем оверэкспрессии теломеразы кожных фибробластов человека НОР. В качестве индуктора использовали перекись водорода, которая накапливается при окислительном стрессе в различных тканях. Ранее в нашей лаборатории [Черняк и др., 2006] было обнаружено, что перекись водорода, добавленная к культуре клеток, разрушается в среде инкубации в течение получаса и вызывает медленное повышение уровня эндогенных АФК, которое достигает максимума через 2-3 часа. С помощью специфического флуоресцентного красителя СМ-ОСТ-РА (далее ИСР) мы показали, что перекись водорода вызывает значительную индукцию АФК в клетках ЮСО (рис. 1А).

Одним из источников АФК при окислительном стрессе являются митохондрии. Чтобы изучить их роль в наблюдаемом окислительном стрессе мы использовали специфические направленные в митохондрии антиоксиданты 8к<31 и разработанные в нашей лаборатории. 8к(Э1 состоит из обладающего антиоксидантными свойствами производного пластохинона и конъюгированного с ним катиона децилтрифенилфосфония, транспортирующего хинон в митохондрии за счет мембранного потенциала. В случае БкрШ в качестве катиона использовался децилродамик 19. Митохондрии являются единственным компартментом клетки, заряженным отрицательно относительно цитоплазмы. Способность антиоксидантов БкС)1 и Бкрш накапливаться в митохондриях за счет мембранного потенциала на внутренней мембране митохондрий определяет их высокую эффективность в чрезвычайно низких дозах. Преинкубация клеток Г(КО в течение 3-х дней с 2 нМ 5к(31 или с 0,2 нМ вкСШ значительно снижала накопление эндогенных АФК (рис. 1А, Б), вызванное обработкой перекисью водорода. Схожие результаты были получены на культуре ^трансформированных фибробластов НОИ (рис. 1В). Полученные данные подтвердили эффективность антиоксидантнов 5к<31 и БкСЗКЛ и митохондриальное происхождение эндогенных АФК, индуцированных перекисью водорода.

Без добавок

Н2О2

SkQR1

+SkQR1

Флуоресценция DCF, отн. ед.

д

RKO

, 0,80 ?

Необработанные 12С0цМ H202,6es 1200цМН202, 1200цМН202. 1200цМН202. 1200цМН202, SkQ SkQl, 2 нМ SkQl, 20 нМ SkQRl,0,2HM SkQRJ, 2нМ

0.76

ill

HDF

1200иМН202

1200иМ Н202. 2 1200цМ Н202,0,2 иМ SkQl HMSkQKl

Рис. 1. Направленные в митохондрии антиоксиданты ряда SkQ защищают от окислительного стресса, вызванного перекисью водорода в клетках RK.0 и HDF. Клетки RKO и HDF преинкубировагш с указанными концентрациями SkQl и SkQRl в течение 3-х дней. (А) Флуоресценцию DCF измеряли на проточном флуориметре Beckman Coulter Epix XL4. Черным контуром показано распределение клеток в контроле. Серый пик обозначает флуоресценцию в клетках, обработанных перекисью водорода. (Б) Уровень флуоресценции DCF в контрольных клетках RKO и в клетках, обработанных 1200 мкМ перекиси водорода в течение 3-х часов. (В) Уровень флуоресценции DCF в контрольных клетках HDF и в клетках, обработанных 900 и 1200 мкМ перекисью водорода в течение 3-х часов. Представлены средние значения интенсивности флуоресценции DCF, измеренные параллельно в трех культурах клеток. Здесь и на других рисунках: Анализ данных проточной флуоцитометрии производился с помощью программы Summit. Значимые различия между указанными группами определены с помощью парного Т-теста. Показаны значения стандартного отклонения; *р < 0.05.

Для дальнейшего изучения митохондриальной продукции АФК мы использовали белковый сенсор перекиси Hyper. Hyper - является первым генетически-кодируемым биосенсором, позволяющим проводить анализ изменений концентрации перекиси водорода - одной из основных АФК, образующихся в клетке при окислительном стрессе. Данный белковый сенсор сконструирован на основе желтого флуоресцентного белка, аминокислотная последовательность которого была вставлена в регуляторный домен белка OxyR из E.coli. Применение Hyper лишено некоторых недостатков, присущих измерению АФК с помощью DCF-DA. В нашей лаборатории была создана лентивирусная конструкция (pLCMVHyper-mito), где Hyper содержал последовательность, кодирующую сигнальный пептид импорта в митохондрии. Используя эту конструкцию мы получили стабильную линию клеток RKO, экспрессирующих направленный в митохондрии белок Hyper (рис. 2). Аналогичным образом мы получили линию клеток HDF, экспрессирующих Hyper-mito.

Используя полученные модельные клетки RKO и HDF мы показали, что под действием перекиси водорода происходит усиление флуоресценции Hyper, что говорит о повышенной продукции эндогенной перекиси водорода в митохондриях. Митохондриально-направленные антиоксидангы SkQl и SkQRl эффективно снижали в этой системе генерацию АФК (рис. 3).

Мы также изучили выживаемость клеток RKO, обработанных перекисью водорода. На рис. 4. представлены данные о дозозависимой гибели клеток через 20 часов после обработки перекисью водорода. Преинкубация с SkQl или SkQRl в течение 3-х суток значительно повышала выживаемость клеток.

Таким образом, исследование окислительного стресса, индуцированного перекисью водорода позволяет заключить, что продукция эндогенных АФК в клетках RKO и HDF в значительной степени имеет митохондриальное происхождение и играет важную роль в процессе гибели клеток RKO.

Hyper-mito

TMRM

Наложение

Рис. 2. Локализация белкового сенсора перекиси Hyper с сигналом импорта в митохондрии (Hyper-mito). Клетки визуализировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SP5. (А) Флуоресценция Hyper-mito в клетках RKO. (Б) Митохондрии клеток RKO, окрашенные специфическим потенциал-зависимым красителем тетраметилродамином (TMRM). (В) Колокализация Hyper-mito и митохондрий, окрашенных тетраметилродамином. Масштаб - 10 мкм.

¡Si ! I

«

I

RKO

1200 иМ H202, 6ei SkQ 1200 цМ H202, SkQl, 2

HDF

1200 |xM H2C2. Sl'QRl 0.2 xlU

Рис. 3. Направленные в митохондрии актиоксвданты Бк^) ингибируют накопление АФК в митохондриях, индуцированное перекисью водорода в клетках ЯКО и НОР. Клетки экспрессирующие Нурег-тЦо преинкубировали с указанными концентрациями БкС^] и 8кС>К1 в течение 3-х дней. Усиление флуоресценции Нурег-тЬо в клетках (А) ВДСО, (Б) НОР, обработанных 1200 мкМ перекиси водорода в течение 3-х часов. Представлены средние значения усиления флуоресценции Нурег-т^о, измеренные параллельно в трех культурах клеток. Данные воспроизведены в двух независимых опытах.

100 100 100

нгабргботаппые 900|iMH20?

Рис. 4. SkQl и SkQRl защищают клетки RKO от токсического действия перекиси водорода. Клетки преинкубировали с 2 нМ SkQl или 0,2 нМ SkQRl в течении 3-х суток. Выживаемость клеток RKO определяли после обработки 900 или 1200 мкМ перекисью водорода в течение 20 ч. Для измерения выживаемости здесь и в последующих экспериментах использовали реактив Cell Titer Blue и плашечный флуориметр Plate Chameleon V. Представлены средние значения выживаемости, определенные параллельно в пяти культурах клеток. Данные воспроизведены в двух независимых опытах.

Создание лентивирусных конструкций и получение стабильных линий клеток с генетическим нокдауном и оверэкспрессией рббвИс.

Следующим этапом нашей работы было получение стабильных линий с повышенной или со сниженной экспрессией белка рббвЬс. Чтобы получить клетки с генетическим нокдауном изоформы рвбвЫ;, мы создали конструкции на основе лентивирусного вектора рЬЗЬР, экспрессирующие две различные короткие шпилечные РНК (вЫША), нацеленные на уникальный для рбввЬс СН2-домен (конструкции рЬвЬРвЬ-р66(1) и рЬ8ЬРзЬ-р66(2), рис 5А). В то время как последовательность з11-р66(1) была ранее опубликована, вЬ-р66(2) была применена нами впервые.

Рис. 5. Карты лентивирусных конструкций (A) pLSLPsh-p66(2) и (Б) pLCMVpuro-p66shc. RSV LTR - длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса, содержащий промотор; HIV LTR - укороченный длинный концевой повтор вируса иммунодефицита человека, содержащий промотор; Gag, env -структурные белки вирусной частицы; сРРТ - центральный полипуриновый тракт; WPRE -посттранскрипционный регуляторный элемент га вируса гепатита Вудчака; З'-dLTR - З'-длинный концевой повтор вируса иммунодефицита человека; HI RNA - промотор для РНК-полимеразы III, под контролем которого находится транскрипция целевых shRNA; SV40 ori - ориджин репликации в эукариотических клетках вируса SV40; SV40 EEL poly(A)s - сигнал полиаденилирования вируса SV40; Puro - ген устойчивости к пуромицину (пуромицин N-ацетшпрансфераза); AmpR - ген устойчивости к ампицилину (В-лахтамаза); Ori - ориджин репликации для E coli \ Н4 - промотор гистона Н4 человека; NP promoter ТР53 -промотор гена р53 человека; CMV IE promoter - промотор ранних генов цнтомегаловируса человека.

Для каждой лентивирусной конструкции были получены вирусные стоки, которыми заражали клетки RKO, HDF и клетки карциномы легких А549. Фракцию клеток с интегрированной конструкцией выделяли путем селекции на среде с пуромицином. Степень подавления изоформы p66shc определяли с помощью Вестерн-блота, используя антитела anti-SHC (610082, "BD Biosciences"). Количественная оценка данных, представленных на рис. 6 (А и Б) показала, что экспрессия shRNAp66(l) приводила к снижению уровня белка p66shc на 87% от исходного уровня, a shRNAp66(2) - к почти полному подавлению его экспрессии. Использованные антитела выявляли также изоформы p52shc и p46shc. При этом в клетках, экспрессирующих shRNAp66, уровень этих белков не изменялся, что подтверждает высокую селективность выбранных shRNA. Высокая степень подавления экспрессии p66shc с помощью shRNAp66(2) была достигнута также в клетках А549 (на 94%, рис. 7А). В клетках HDF используя данную shRNA удалось снизить уровень p66shc на 55% (рис. 7Б).

При получении конструкции для оверэкспрессии p66shc, соответствующая кДНК была амплифицирована из препарата клеток RICO методом ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией). Затем полученная кДНК была клонирована в лентивирусный вектор pLCMV, в котором область, кодирующая p66shc, находилась под контролем сильного цитомегаловирусного промотора (CMV-промотора, рис 5Б). В качестве контроля был использован пустой вектор pLCMV. Для каждой из конструкций были получены вирусные стоки. После трансдукции была проведена селекция клеток RKO и HDF на среде с пуромицином. Результаты Вестерн-анализа, представленные на рис. 6В, указывают на повышение в 4.8 раза уровня изоформы p66shc в клетках RKO/pLCMVpuro-p66shc. Отмечено также появление дополнительной полосы, не соответствующей ни одной из изоформ, которая, вероятно, образуется в результате частичной деградации рекомбинантной изоформы p66shc в экстракте клеток. В клетках HDF с помощью полученной конструкции удалось добиться повышения экспрессии p66shc в -15 раз (рис. 7В).

А 5Ь-р66{1) Б 5Ь"С 5И-р66{2)

рбб (отн. ед.)

гафд - тт 4ЙШ ГАфд «■*■

Рис. 6. Иммуноблотинг белков - продуктов гена 5//С7 в стабильных сублиниях клеток ЯКО. Стабильные линии клеток были получены с помощью лентивирусной трансдукции конструкциями, кодирующими (А) контрольную зЬЯЫА - бЬ-С и бЬЯЫА против СН2-домена рббвЬс - зЬ-рбб(1), (Б) бЬ-С и 51\-р66(2), (В) рбб дикого типа. Содержание рбббЬс указано относительно контрольной линии клеток, либо экспрессирующей бЬ-С, либо содержащей пустой вектор рЬСМУ (V).

рбб-1

рбб -

вЪ-С $Ьр66|2)

Р52-р4б_

Количество рбб (отн. ед.)

¡■и 0,06

р52 ■ р46 .

Количество рбб (отн. ед.)

Количество рбб (отн. ед.) 1

ГАФД -

ГАФД -

Рис. 7. Иммуноблотинг белков - продуктов гена 5'ЯС/ в стабильных сублиниях клеток А549 и НВР. Стабильные линии были получены с помощью лентивирусной трансдукции конструкциями, кодирующими контрольную бЬЯЫА - 5Ь-С и вЫША против СН2-домена рббБЬс - зЬ-р66(2) в клетках (А) А549, (Б) ГОР, (В) рбб дикого в клетках НОР. Содержание рббзЬс указано относительно контрольной линии клеток, либо экспрессирующей зЬ-С, либо содержащей пустой вектор рЬСМУ (V).

Роль р66$Ьс в окислительном стрессе, индуцированном перекисью водорода.

Р66 известен как белок, негативно регулирующий продолжительность жизни у млекопитающих. В литературе влияние рббвЬс на старение преимущественно связывают с его прооксидантными свойствами. Показано, что у мышей рббвЬс может участвовать в развитии окислительного стресса через несколько механизмов, включающих снижение экспрессии антиоксидантных белков, активацию МАОРН-оксидаз, деградацию ферритина или неопосредованную оксидоредуктазную активность рббвЬс в митохондриях. Однако роль рббвЬс в клетках человека, в том числе и при окислительном стрессе изучена недостаточно.

Мы проверили, как влияет снижение или увеличение содержания рббвИс на внутриклеточный уровень АФК в ответ на окислительную нагрузку в клетках НТО и НОР. Окислительный стресс индуцировали путем инкубации с перекисью водорода, которая, как показано выше, сопровождается выработкой эндогенных АФК в митохондриях. В клетках ШСО с повышенным уровнем рббвЬс продукция АФК усиливалась, в то время как в клетках с подавленным синтезом рббвЬк; образование эндогенных АФК было значительно снижено (рис. 8). Аналогичные результаты были получены на двух линиях клеток ЯКО, экспрессирующих 5ЫША-р66(1) и вЬЮ^А-рвб^). В ^трансформированных клетках НОР изменение экспрессии рббэЬс приводило к схожему эффекту (рис. 9). При подавлении экспрессии изоформы рббвЬс в необработанных перекисью водорода клетках НОБ с введенньм 5ЬККА-р66(2) существенно снижался уровень АФК (рис. 9А). В клетках ШСО эффект нокдауна рбб был незначительным (рис. 8А, Б). Возможно, это связано с приспособительной реакцией клеток на подавление экспрессии рбб. Это противоречие планируется изучить в дальнейшей работе.

-Jh-C Ш sb-p66{2}

0,47

i I

Необработанные 900(jMH202 1200(jM H202

Необработанные

Рис. 8. Подавление p66shc ингибирует, а оверэкспрессия повышает образование эндогенных АФК, индуцированных перекисью водорода в клетках RKO. (А) Уровень флуоресценции DCF в обработанных перекисью водорода в указанных концентрациях в течение 3 ч. клетках, экспрессирукмцих (A) sh-C и sh-р66(1), (Б) sh-C и sh-p66(2), (В) р66 или содержащих пустой вектор (V). Представлены средние значения интенсивности флуоресценции DCF, измеренные параллельно в трех культурах клеток. Данные воспроизведены в трех независимых опытах. Здесь и на других рисунках: Клеткам с контрольной shRNA (sh-C) соответствуют светлые столбцы, клеткам, экспрессирующим sh-p66(l) или sh-p66(2) - черные столбцы. Клеткам с контрольным вектором pLCMV соответствуют светлые столбцы, клеткам, сверхэкспрессирующим рбб - темные столбцы.

sh-C ■ shp66(2)

Необработанные 90QnMHZ02

12

Рис. 9. Подавление рббБИс ингибирует, а оверэкспрессия повышает образование эндогенных АФК, индуцированных перекисью водорода в клетках 1ШР. Уровень флуоресценции ОСК в обработанных перекисью водорода в указанных концентрациях в течение 3 ч. клетках, экспрессирующих (А) бЬ-С и бЬ-р66(2), (Б) рбб или содержащих пустой вектор (V). Представлены средние значения интенсивности флуоресценции ГХТ, измеренные параллельно в трех культурах клеток. Данные воспроизведены в трех независимых опытах.

Чтобы изучить роль митохондрий в прооксидантном действии рббвЬс, путем длительной инкубации в среде, содержавшей бромистый этидий, пируват и уридин мы получили клетки ЮСО, не содержащие митохондриальной ДНК (р° клетки). В отсутствие митохондриальной ДНК (рис. 10) дыхательная цепь в этих клетках содержит дефекты и не может нормально функционировать, и, следовательно, служить источником АФК. С помощью лентивирусной трансдукции мы ввели в ЫКОрО клетки вЬ-р66(2). В полученных клетках нокдаун по рббвЬс не влиял на накопление АФК индуцированное перекисью водорода (рис. 11 А). Жизнеспособность р° клеток снижалась под действием перекиси водорода значительно сильнее, чем в контрольных клетках. Возможно, это происходит за счет известного для р° клеток повышения содержания ионов железа и других металлов. Выживаемость ЯКОр0 клеток обработанных перекисью водорода не изменялась при нокдауне по рббБИс (рис. 11В). Эти данные указывают на то, что прооксидантное действие рббвЬс связано с митохондриями.

Действие р6б$Ьс на фрагментацию митохондриального ретикулума, индуцированную перекисью водорода.

Одним из ранних маркеров окислительного стресса считается фрагментация митохондрий. В покое митохондрии имеют, как правило, вытянутую форму и образуют разветвленную сеть. Окислительный стресс, вызванный перекисью водорода, приводит к фрагментации митохондриальной сети в линии клеток ЮСО. Отмечена первоначальная частичная фрагментация митохондрий, после чего митохондрии распадались на множество шарообразных структур (рис. 12Б, отмечено стрелкой). Эти процессы наблюдались при сублетальных дозах перекиси водорода, когда гибель клеток не превышала 20-25% (рис. 13Б).

В необработанных перекисью водорода клетках, экспрессирующих либо

контрольную $Ь-С, либо 5Ир66(2), не отмечено изменений в митохондриальной сети (рис.

12А, В). При обработке умеренной дозой перекиси водорода (до 800 мкМ) клеток с

подавленным синтезом изоформы рббвЬс, фрагментацию митохондрий наблюдали в

значительно меньшей части клеток, чем в контроле (рис. 13А). При повышении

концентрации перекиси водорода до 1000 мкМ число клеток с фрагментированными

митохондриями резко возрастало, а защитный эффект нокдауна рббвЬс пропадал.

Возможно, в этих условиях основной причиной фрагментации митохондрий служило не

накопление АФК, а снижение мембранного потенциала. Известно, что антиоксиданты,

направленные в митохондрии, предотвращают фрагментацию митохондрий в клетках,

13

обработанных перекисью водорода, нейтрализуя АФК в митохондриях [Черняк и др., 2006]. Защитный эффект этих антиоксидантов, так же как при нокдауне рббэЬс, пропадал при повышенных концентрациях перекиси водорода.

Полученные данные указывают на то, что фрагментация митохондриальной сети при окислительном стрессе зависит от опосредованного рббвЬс накопления АФК в митохондриях.

Рис. 10. Окрашиевание ДНК с помощью специфической краски Sybr Green I (А) в клетках RKO и (Б) в клетках, не содержащих митохондриалыгую ДНК RK0p° Масштаб - 10 мкм.

А ^

S I

Ol О

jh-C

■ shp66(2)

0,61 1 °'5

0,37 MB

I I

в

200 viM Н202 400 \iM H202

100 100 I,

n

«r 14 « «SU

Jm i

* £2 К

ш го О

j5o

l s а

О 2 °f

> fe с,

#1g

ю u &

sh-C

3,70

■ shp66(2) у 313

Л

sh-C ■ shp66(2)

54

■ 31 33

I I

Необработанные 200 цМ Н202 400цМН202

Рис. 11. Ингибирование прооксидантных свойств рббэЬс в клетках ШСОр° с неактивной дыхательной цепью. (А) Уровень флуоресценци ОСР в клетках, обработанных перекисью водорода в указанных концентрациях в течение 3 ч. (Б) Уровень флуоресценции субстрата каспаз 3 и 7 2-ОЕУО-Ш10 в клетках ЯКОр°, обработанных в течение 20 часов 400 мкМ перекисью водорода. (В) Выживаемость клеток ЛКОр° через 20 часов после обработки перекисью водорода в указанных концентрациях. Представлены средние значения выживаемости, определенные параллельно в пяти культурах клеток. Данные воспроизведены в двух независимых опытах.

/ V

А В

/ Б я г •» ' Г

I*

X s

I I

111 i i * 5 s s s ? »

я 5

Рис. 12. Митохондриальная сеть в клетках линии RKO. (А) Необработанные клетки, экспрессирующие контрольную shRNA (sh-C). (Б) Клетки с контрольной sh-C, обработанные перекисью водорода (800 мкМ), в течение 20 ч. (В) Необработанные клетки, экспрессирующие shRNAp66-2. (Г) Клетки с shRNA рбб-2, обработанные перекисью водорода (800 мкМ), в течение 20 ч. Митохондрии окрашивали 100 нМ раствором Mitotracker Red в течение 15 минут при 37°С. Видно, что в контрольных клетках (А и В) имеются тяжи митохондрий, а после обработки перекисью (Б) эти тяжи фрагментированы (показано стрелкой). Масштаб - 10 мкм.

ЬОО мкМ H2Q2 300 мкМ Н202 1QOO мкМ Н202

■ Jh-tfei

35

Л

Рис. 13.Генетический нокдаун рббэЬс защищает митохондриальную сеть от фрагментации под действием перекиси водорода. (А) Содержание клеток с фрагментированными митохондриями после обработки перекисью водорода в указанных концентрациях в течение 20 ч. (Б) Выживаемость клеток после обработки перекисью водорода (800 мкМ) в течение 20 ч. Представлены средние значения выживаемости, определенные параллельно в пяти культурах клеток. Данные воспроизведены в трех независимых опытах.

Эффект изменения экспрессии р6б8Ис на гибель клеток, вызванную окислительным стрессом и аноикис.

Мы показали, что снижение уровня белка рббзЬс в клетках ЛКО человека значительно повышает их выживаемость при цитотоксическом действии перекиси водорода (рис. 14А). Аналогичное действие нокдауна рббзИс наблюдалось в клетках А549 (рис. 14В). Этот эффект согласуется со снижением окислительного стресса индуцированного перекисью водорода в клетках с подавлением экспрессии рббБЬс. В отличие от эффекта нокдауна, оверэкспрессия рбб не повлияла на гибель клеток ЮСО, под действием перекиси водорода (рис. 14Б). Возможно, это связано с высоким уровнем исходной экспрессии рббэИс в клетках МСО.

Чтобы изучить тип клеточной смерти, вызываемый высокими дозами перекиси водорода мы измерили активность эффекторных каспаз 3 и 7. Обработка перекисью

приводила к значительной активации каспаз 3 и 7 в клетках ЛКО, а подавление экспрессии рббвЬс несколько снизило эту активацию (рис. 15Б). Для определения роли каспаз в процессе гибели этих клеток мы использовали ингибитор каспаз широкого спектра действия гУАС-ГМК. Выяснилось, что преинкубация со XVАО не влияет на гибель этих клеток (рис. 15А). Кроме того, мы проверили возможна ли в данной системе клеточная гибель путем программируемого некроза («некроптоза»). Для этого мы преинкубировали клетки ЛКО с некростатином (N60-1), ингибитором киназы ЫР, играющей ключевую роль в развитии некроптоза. Однако некростатин также не оказал влияния на гибель клеток (рис. 15В). Так как ингибитор каспаз не повлиял на клеточную смерть, мы исследовали целостность мембран клеток, используя пропидий йодид, чтобы оценить степень некроза. Оказалось, что после обработки перекисью водорода около 50% процентов клеток были окрашены пропидий йодидом, что свидетельствует в пользу некротического типа клеточной смерти. В клетках ЯКО с подавленным синтезом рббвЬс пропидий-положительных клеток было существенно меньше (рис. 16).

Для исследования роли митохондрий в клеточной гибели, индуцированной перексиью водорода мы использовали клетки ЯКОр0. Как было указано выше, эти клетки оказались значительно более чувствительными к перекиси. Нокдаун рббвЬс не повлиял на выживаемость ЛКОр0 клеток, и лишь незначительно снизил активацию каспаз после обработки перекисью водорода, что соответствовало мальм гоменеиям уровня АФК (рис. 11).

Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что рббвЬс в клетках ЯКО действует как прооксидантный белок, индуцирующий образование эндогенных митохондриальных АФК под действием перекиси водорода и необходим дм развития клеточной смерти с признаками некроза.

RKO

66 * ii

9COUMH202

RKO

Необработанные 900gMH202

A549

900 uM H202 1200pM H202

Рис. 14. Генетический нокдаун рббзЬс защищает клетки ЯКО и А549 от цитотоксического действия перекиси водорода. Выживаемость после обработки перекисью водорода в течение 20 ч. клеток ИСО. экспрессирующих (А) бй-С и зЬ-р66(2), (Б) рбб или содержащих пустой вектор (V) или клеток А549 с введенными бЬ-С и зЬ-р66(2). Представлены средние значения выживаемости, определенные параллельно в пяти культурах клеток. Данные воспроизведены в трех независимых опытах.

Б

£ ° is

« D <

я- rii . :

? ^ 5

100 100 >| U

■ sh&66(2)

Н 66 « 64 У *

Inn

Необрлбчгмтиг 900ц М Н202 1200uMH202 900иМН202, 1200цМН2О2, 2VAD 2VAO

■и В

о ■ *с » ■ ""' i И **

■•WW) S? ■ амац

| i " I

L111 1 i I

М Н?02 ;700цМН?03

Рис. 15. Клеточная гибель, вызванная перекисью водорода в клетках RKO не зависит от активности каспаз и киназы RIP. Клетки обрабатывали 900 или 1200 мкМ перекиси водорода в течение 20 ч. (А) Влияние преинкубации с ZVAD-FMK (ЮОмкМ) в течении 40 мин на выживаемость клеток. (Б) Флуоресценция субстрата каспаз 3 и 7 Z-DEVD-R110 в клетках. (В) Влияние преинкубации с Nec-1 (100 мкМ) в течении 40 мин на выживаемость клеток. Представлены средние значения выживаемости, определенные параллельно в пяти культурах клеток. Данные воспроизведены в трех независимых опытах.

в „ „

Рнс. 16. Генетический нокдаун p66shc снижает количество клеток RK.0 окрашенных пропидий йодидом после обработки перекисью водорода. Клетки были обработаны 1200 мкМ перекисью водорода в течение 20 часов и окрашены пропидий йодидом (40 мкг/мл) и Sybr Green I (0,05х) (А) Клетки с введенной контрольной shRNA-C. (Б) Клетки, экспрессирующие shRNA-p66(2). (В) Результаты подсчета клеток окрашенных пропвдием йодида. Представлены средние значения, определенные параллельно в пяти культурах. Данные воспроизведены в двух независимых опытах.

Клинические исследования показали, что высокий уровень экспрессии p66shc коррелирует с неблагоприятным прогнозом при раке толстой кишки. В то же время показано, что p66shc способствует гибели клеток карциномы легких при отрыве от субстрата («аноикису»). В последнем случае эффект связан с тем, что p66shc усиливает активацию малой ГТФазы RhoA . Мы исследовали влияние p66shc на аноикис в клетках карциномы толстой кишки. Для изучения аноикиса использовали планшеты, обработанные полимером полиХЕМА, предотвращающим прикрепление клеток к субстрату. Мы выявили защитное действие нокдауна p66shc при аноикисе в клетках RKO (рис. 17). Этот результат согласуется с данными о том, что одной из причин аноикиса является избыточная продукция АФК в митохондриях.

Рис. 17. Генетический нокдаун рббзИс защищает от гибели клетки ЯКО, неприкрепленные к субстрату. Представлена выживаемость клеток ЯКО после культивации в течение 24 часов в планшетах, дно которых обработано полимером полиХЕМА. Представлены средние значения выживаемости, определенные параллельно в пяти культурах клеток. Выживаемость прикрепленных клеток принята за 100%. Данные воспроизведены в двух независимых опытах.

Роль p66shc в оксилительном стрессе, вызванном инкубацией в бессывороточной среде.

В качестве еще одной модели окислительного стресса мы использовали инкубацию клеток в среде без сыворотки. Известно, что попадание клеток в бессывороточную среду сопровождается окислительным стрессом, что может приводить к запуску апоптоза. Показано, что, при этом, по крайней мере, часть АФК вырабатывается в митохондриях, и за это отвечает митохондриальный белок Romol. Инкубация клеток RKO и HDF в среде без сыворотки также приводила к выраженной продукции АФК, которая была ингибирована под действием направленных в митохондрии антиоксидантов SkQl (рис. 18А, Б) и SkQRl (рис. 18Б, В). Эти результаты, вместе с данными литературы, свидетельствуют о митохондриальном происхождении АФК при стрессе, вызванном культивацией в среде без сыворотки.

сыворотки сыворотки сыворотки, сыворотки, сыворотки. сыворотки, сыворотки,

0.2 нМ $к<и 2 нМ 5к01 20 нМ ЭИ»

|, сыворотки, сыворотки, сыворотки.

6ез$к(3 безБкО 5к01,2нМ 5к01,20нМ 5кС№1,0,2 »01? I, 2нМ

1.00

сыворотки сыворотки сыворотки, сыворотки, сыворотки, 0,1 нМ 0.2 нМ 2нМ5к01?1 5И№1 Яс0«1

Рис. 18. Направленные в митохондрии актиоксиданты ряда БкО защищают клетки ЯКО и НОР от окислительного стресса, индуцированного инкубацией клеток в среде без сыворотки. Клетки ЯКО и НОР преинкубировали с указанными концентрациями БкС}! и БкС^Ш в течение 3-х дней, а затем в среде без сыворотки в течение 24 часов. Уровень флуоресценции ОСР в клетках НОР (А, В) и ЯКО (Б) после культивации в среде без сыворотки. Представлены средние значения интенсивности флуоресценции ОСР, измеренные параллельно в трех культурах клеток. Данные воспроизведены в трех независимых опытах.

Лишение клеток сыворотки относится к клеточным стрессам, возникающим при таких патологических состояниях как ишемия и рост опухолей. Нашей следующей задачей было выяснение действия рббэЬс на раковые и ^трансформированные клетки, культивируемые в среде без сыворотки. В данных стрессовых условиях в клетках ЮШ подавление синтеза рббБЬс приводило к существенному снижению как уровня цитоплазматических АФК, измеренного с помощью ОСР-ЭА (рис. 19А), так и уровня митохондриапьных АФК, измеренного с помощью Нурег-тко (рис. 20). В клетках ЯКОр0 защитное действие нокдауна рббзЬс не наблюдалось (рис. 19Б).

А

S . °.80

=г сп

І ф D

J І

u t

<u о

RKO

0.74 o.BO

—,-^-, o,cw

RKOrho-O

Рис. 19. Нокдаун p66shc ингибирует образование АФК, индуцированное инкубацией в среде без сыворотки в клетках. RKO, но не в клетках RKOp° с неактивной дыхательной цепью. Уровень флуоресценции DCF измеряли после 24 часов культивации в среде без сыворотки клеток (A) RKO, (Б) RKOp°. Представлены средние значения интенсивности флуоресценции DCF, измеренные параллельно в трех культурах клеток. Данные воспроизведены в трех независимых опытах.

Схожий результат был получен на ^трансформированных клетках НОР, в которых нокдаун снижал, в то время как оверэкспрессия рббэЬс, наоборот стимулировала образование эндогенных АФК (рис. 21 А, Б). Эти данные, наряду с результатами, представленными выше, свидетельствует в пользу митохондриального происхождения АФК, индуцированных инкубацией в среде без сыворотки и прооксвдантной роли рббвк; в митохондриях. Эффект нокдауна рббэк; в нормальных клетках оказался несколько слабее, чем в раковых. Аналогичная тенденция наблюдалась при индукции окислительного стресса перекисью водорода (сравн. рис 8 и рис. 9). Возможно, эти различия отражают больший вклад рббэЬс в продукцию АФК в раковых клетках.

• ! І

0 g с

х £ ■ - ; -

Ні

1 f

♦

1.39

I

Рис. 20. Нокдаун рббэЬс ингибирует накопление в митохондриях АФК, индуцированное инкубацией клеток ЯКО в среде без сыворотки. Показано усиление флуоресценции Нурег-шіїо в клетках ЯКО, инкубированных в среде без сыворотки в течение 24 часов. Представлены средние значения усиления флуоресценции Нурег-Міїо, измеренные параллельно в трех культурах клеток. Данные воспроизведены в двух независимых опытах.

гыеоротки 0!&(ыеорог*и ЮКсывороткИ 09»СЫвОГОТКИ

Рис. 21. Подавление рббу'пс ингибирует, а оверэкспрессия повышает образование эндогенных АФК, индуцированное инкубацией клеток ИГЛ' в среде без сыворотки. Уровень флуоресценции ОО' в клетках, культивируемых в среде без сыворотки в течение 24 часов и экспрессирующих (А) эЬ-С и з11-р66(2), (Б) рбб или содержащих пустой вектор (V). Представлены средние значения интенсивности флуоресценции [Х'Г, измеренные параллельно в трех культурах клеток. Данные воспроизведены в двух независимых опытах.

Окислительный стресс и гибель клеток карциномы легких А549, вызванные антираковым препаратом таксолом. Роль рббвЬс.

Одним из известных противораковых препаратов является таксол, который нарушает процесс митоза благодаря стабилизации микротрубочек веретена. Показано, что этот широко применяемый в лечении рака легких и груди препарат вызывает апоптоз. Механизмы индуцированного таксолом апоптоза малоизученны, однако известно, что необходимым этапом его развититя является окислительный стресс. Мы решили выяснить роль рббвЬс в цитотоксическом действии таксола. Было обнаружено, что нокдаун рббвИс защищал клетки карциномы легких А549 от гибели, вызванной высокими концентрациями таксола (рис. 22А). В нескольких работах было показано, что рббэЬс может способствовать пролиферации гормон-зависимых раковых клеток: карцином груди и простаты. Эффект нокдауна рббвЬс на пролиферацию клеток карциномы легких А549 мог бы объяснить его защитное действие в экспериментах с таксолом, так как неделящиеся клетки устойчивы к ингибиторам митоза. Для проверки этой возможности клетки А549 были клонированы и трансдуцированы лентивирусом, кодирующим вЬЮЧА-р66(2). Из рис. 23 видно, что нокдаун не повлиял на темпы роста этих клеток. В то же время подавление экспрессии рббвИс снижало индуцированную таксолом продукцию АФК (рис 22Б). Эти результаты согласуются с данными о роли АФК в таксол-зависимой клеточной смерти и указывают на то, что белок рбввИс принимает участие в ее развитии благодаря своему прооксидантному действию.

Рис. 22. Подавление экспрессии рббзЬс защищает клетки А549 от окислительного стресса и гибели, вызванных таксолом. (А) Выживаемость клеток А549 после обработки таксолом в течение 48 ч. Представлены средние значения выживаемости, определенные параллельно в пяти культурах клеток. (Б) Уровень флуоресценции ОСР в клетках, обработанных 1000 нМ таксолом в течение 24 ч. Представлены средние значения интенсивности флуоресценции БСИ, измеренные параллельно в трех культурах клеток. Данные воспроизведены в двух независимых опытах.

Б 3,20

* О 2,80 | 1 140 2,26 Т £

I Б 2 00 . 1 1

1 Iю 4; с Я 1.28 ■

;■ 2 о,во 1 »* Л 1 1

1-е сутки 2-е сутки 3-й сутки 4-е сутки

2-е сутки ¿-и

Рис. 23. Подавление экспрессии рббзЬс в клетках А549 не влияет на скорость их роста. (А) Крива роста и (Б) темпы прироста клеток А549 с введенными контрольной ¿МЗДА (бЬ-С) и 5Ь-р66(2).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование окислительного стресса, индуцированного добавлением экзогенных оксидантов или вызванного нарушением внутриклеточных сигналлингов свидетельствует о прооксидантной роли рббэЬс в культурах раковых и ^трансформированных клеток человека. Показано, что активность рббяЬс опосредована образованием эндогенных АФК в митохондриях и может приводить к фрагментации митохондриального ретикулума. Эти данные согласуются с результатами полученными на мышиных фибробластах, где рббвЬс может транслоцироваться в митохондрии и участвовать в образовании митохондриальных АФК.

Показано, что помимо стимуляции апогггоза, описанной в литературе, рббэЬс может участвовать в некротической гибели клеток при окислительном стрессе. Кроме того продемонстрировано, что в клетках карциномы легких рббзЬс участвует в клеточной гибели, вызванной таксолом. Полученные данные помогают составить более полное представление о прооксидантном действии рббзЬс, реализуемом в митохондриях. Понимание механизмов генерации АФК, а также регуляции их образования в митохондриях может быть использовано в фармакотерапии различных заболеваний и в борьбе со старением.

выводы

1. Под действием перекиси водорода или при лишении сыворотки происходит накопление эндогенных активных форм кислорода (АФК) в митохондриях клеток карциномы толстой кишки человека 11К0 и иммортализованных фибробластов кожи человека НОР

2. С помощью лентивирусных конструкций получены стабильные линии клеток ККО, карциномы легких человека А549 и иммортализованных фибробластов человека с генетическим нокдауном и оверэкспрессией рббвЬс. Получены клетки ККО, экспрессирующие белковый сенсор Нурег-тИо локализованный в митохондриях.

3. В клетках ЯКО и НИИ подавление рббйИс ингибирует, а оверэкспрессия повышает образование эндогенных АФК, индуцированных перекисью водорода или лишением сыворотки. В клетках с неактивной дыхательной цепью защитный эффект нокдауна по рббвЬс не наблюдается.

4. Генетический нокдаун рббБЬс предотвращает зависимую от образования митохондриальных АФК фрагментацию митохондрий и гибель клеток ПКО. Клеточная гибель не зависит от активности каспаз и имеет признаки некроза. Нокдаун рббзЬс не защищает клетки ККО с неактивной дыхательной цепью от гибели, вызванной обработкой перекисью водорода.

5. Подавление экспрессии рббБЬс в клетках А549 не влияет на скорость их роста, однако защищает от окислительного стресса и клеточной гибели, вызванных противораковым препаратом таксолом.

6. Данные, полученные на различных моделях окислительного стресса клеток человека свидетельствуют о том, что прооксидантное действие рббБЬс зависит от образования АФК в митохондриях.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Галимов Е.Р., Сидоренко A.C., Терешкова A.B., Плетюшкина О.Ю., Черняк Б.В., Чумаков П.М. Действие белка p66shc на устойчивость клеток рака толстого кишечника RKO к окислительному стрессу.// Молекулярная биология. 2012. Т. 46. № 1. С. 126-133.

2. Галимов Е.Р. Роль p66shc в окислительном стрессе и апоптозе.// Acta Naturae. 2010. Т. 2. №4. С. 49-57.

3. Галимов Е.Р., Черняк Б.В., Чумаков П.М., Скулачев В.П. Роль p66shc в регуляции митохондриальных активных форм кислорода.// VI Международная крымская конференция "Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии". Судак. Украина. 2010. Сборник тезисов. С. 11.

Подписано в печать 01.02.2012 г.

Заказ № 6594 Тираж: 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Галимов, Евгений Рафаэлевич, Москва

Московский государственный университет им, М. В. Ломоносова

Факультет биоинженерии и биоинформатики

61 12-3/572

Галимов Евгений Рафаэлевич

Изучение прооксидантного действия р66$Ъс в клетках

человека

Молекулярная биология (03.01.03)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: академик РАН, профессор В. П. Скулачёе

профессор П.М. Чумаков

Москва - 2012

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..............................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................8

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................................................................9

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................10

Окислительный стресс........................................... .................................................................10

Источники АФК в клетке......................................... ...........................................................11

НАДФН-оксидазы...............................................................................................................12

Производство АФК в митохондиях...................................................................................14

Роль комплекса I дыхательной цепи в продукции АФК.............................................................16

Роль комплекса III дыхательной цепи в продукции АФК...........................................................18

Антиоксидантная защита клетки...........................................................................................20

Неэнзиматические антиоксиданты....................................................................................20

Глутатион........................................................................................................................................21

Аскорбат.........................................................................................................................................21

а-токоферол.................................................................................................................................-21

Липоевая кислота..........................................................................................................................22

Убихинол (коэнзим Q10)............................................................................................................—22

Ферментативные системы защиты от окислительного стресса......................................22

Супероксиддисмутаза (СОД)........................................................................................................22

Каталаза..........................................................................................................................................23

Пероксиредоксины (Ргх)...............................................................................................................24

Глутатион-пероксидаза (GPx).......................................................................................................25

Глутатион трансфераза.................................................................................................................26

Тиоредоксин..................................................................................................................................27

Митохондриально-направленные антиоксиданты...............................................................30

Дробление митохондрий........................................... ..............................................................35

Белковый аппарат слияния митохондрий............................. ............................................36

Фрагментация митохондрий................................................. ..............................................38

Регуляция фрагментации митохондрий...................................... ......................................39

Механизмы гибели эукариотических клеток.................. ......................................................42

Некроз...................................................................................................................................42

Апоптоз.................................................................................................................................43

Участие каспаз в апоптозе............................................................................................................43

Активация апоптоза с участием мембранных рецепторов.......................................................45

Митохондриальный путь активации каспаз................................................................................48

Роль белков семейства Вс1-2 в апоптозе.....................................................................................49

Роль митохондриальной поры в клеточной смерти.........................................................52

РббзЬс........................................................................................................................................55

Р66, окислительный стресс и вызванный им апоптоз......................................................57

Механизмы рбб-зависимого повышения внутриклеточных активных форм кислорода ...............................................................................................................................................61

рбб-зависимая активация мембранных НАДФН-оксидаз..........................................................61

рббБИс и регуляция экспрессии антиоксидантных ферментов.................................................62

рббБИс и митохондриальный путь развития апоптоза...............................................................63

Митохондриальная локализация рббзЬс и его транспорт в митохондрии.............63

Оксидоредуктазная проапоптотическая активность рббзЬс, приводящая к образованию АФК.......................................................................................................64

Исследование изолированного СН2-СВ домена......................................................67

рббэЬс как редокс-сенсор............................................................................................68

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.........................................................................................70

Используемые реактивы и препараты:..................................................................................70

Используемые буферные растворы и среды:........................................................................71

Используемые расходные материалы:..................................................................................71

Оборудование..........................................................................................................................71

Использованные культуры клеток.........................................................................................72

Пересев клеток.....................................................................................................................72

Замораживаие и размораживание клеточных культур....................................................73

Пересев клеток для экспериментов...................................................................................73

Определение концентрации клеток с помощью камеры Горяева...................................73

Обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР).....74

Лентивирусные конструкции.................................................................................................75

Генноинженерные манипуляции...........................................................................................76

Получение лентивирусных частиц, заражение и селекция клеток.....................................76

Измерение активных форм кислорода..................................................................................77

Измерение выживаемости клеток..........................................................................................78

Определение активности каспаз 3 и 7...................................................................................78

Определение некротической гибели с помощью пропидий йодида.................................79

Определение колокализации белка Нурег-тко с митохондриями.....................................79

Окрашивание митохондриальной ДНК.................................................................................79

Окрашивание митохондрий и оценка степени дробления митохондрий..........................80

3

Определение кривой роста клеток.........................................................................................80

Выделение препарата белка из эукариотических клеток....................................................80

Метод «Western Blotting»........................................................................................................81

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.............................................................................82

Окислительный стресс, вызванный перекисью водорода в клетках карциномы толстого кишечника человека RKO и в иммортализованных фибробластах....................................82

Создание лентивирусных конструкций и получение стабильных линий клеток с генетическим нокдауном и оверэкспрессией p66shc...........................................................88

Роль p66shc в окислительном стрессе, индуцированном перекисью водорода................91

Действие p66shc на фрагментацию митохондриального ретикулума, индуцированную перекисью водорода................................................................................................................94

Эффект изменения экспрессии p66shc на гибель клеток, вызванную окислительным стрессом и аноикис..................................................................................................................96

Роль p66shc в оксилительном стрессе, вызванном инкубацией в бессывороточной среде. .................................................................................................................................................100

Окислительный стресс и гибель клеток карциномы легких А549, вызванные антираковым препаратом таксолом. Роль p66shc..............................................................103

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................................................106

ВЫВОДЫ...................................................................................................................108

БЛАГОДАРНОСТИ....................................................................................................109

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................110

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

A(iH+ - трансмембранная разность потенциалов ионов водорода

Л\|/ - митохондриальный мембранный потенциал

рО-клетки - клетки, не содержащие митохондриальной ДНК

АМРК - AMP-активируемая протеинкиназа

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

АФК - активные формы кислорода

ГТФ - гуанозинтрифосфорная кислота

ДМТМ - диметилтиомочевина

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК-ДНК-копия

ММП - межмембранное пространство митохондрий Н202 - пероксид водорода

НАДФН - восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат

О*- - супероксид анион радикал

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

СОД - супероксиддисмутаза

ТМФД - N,N,N',N'-TeTpaMemn -п- фенилендиамин

Трис - трис-(гидроксиметил)-аминометан

ФНО-а - фактор некроза опухолей-а

А549 - клетки карциномы легких человека

AGE - advanced glycation end products

AIF - апоптоз-индуцирующий фактор

Akt - протеинкиназа В

ANT - переносчик адениновых нуклеотидов

Apaf - фактор, активирующий апоптозные протеазы

АТР - аденозинтрифосфорная кислота

BIR - бакуловирусный 1АР-повтор

С12ТРР - додецилтрифенилфосфоний

CAD - ДНКаза, активируемая каспазами

CARD - домен, связывающий каспа)

Cdc42 - малая GTP-аза подсемейства Rho-GTP-аз; Cyt С - цитохром с CMV - цитомегаловирус

DCF (CM-DCF-DA) - 5-(и-6)-карбокси-2',7'-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат

DD - домен гибели

DED - эффекторный домен гибели

DID - индуцирующий смерть домен

DISC - сигнальный комплекс, индуцирующий гибель

DTT- 1,4-дитио-0,Ь-треитол

ERK - киназы, регулируемые внеклеточными сигналами FAD - флавинадениндинуклеотид

FCCP - карбонилцианид-п-трифторметоксифенилгидразон GFP - зеленый флуоресцирующий белок GPx - глутатионпероксидаза GR - глутатионредуктаза

Grb2 - белок, связывающий рецепторы ростовых факторов

Grx — глутаредоксин

GSH - глутатион

GSSG - дисульфид глутатиона

GST - глутатион-8-трансфераза

GTP - гуанозин-5'-трифосфат

GTPa3a - белок, гидролизующий GTP

HDF - иммортализванные путем оверэкспрессии теломеразы кожные фибробласты человека

HIV-1 - вирус иммунодефицита человека 1 HSP60 -белок теплового шока 60

Hyper-mito - белковый сенсор перекиси водорода, содержащий сигнал импорта в

митохондрии

IAP - ингибитор апоптоза

JNK - N-концевая протеинкиназа c-Jun

LA - липоевая кислота

МАРК - протеинкиназы, активируемые митогенами;

mHSP70 - митохондриальный белок теплового шока 70 кДа

MitoQ - 10-(6'-убихинол)децилтрифенилфосфоний

NADH - восстановленный никотинамидадениндинуклеотйд

NBP - нуклеотид-связывающий домен

N0 - оксид азота

NOX - НАДФН-оксидаза

Pin- 1 - пептидилпролил - цис/транс-изомераза

РКС - протеинкиназа С

PKCß - протеинкиназа Cß

РР2А - белковая фосфатаза 2

Ргх - пероксиредоксин

РТР -митохондриальная пора

PTP-PEST - специфичная для фосфотирозинов протеинфосфатаза с С-концевой последовательностью PEST QH2 - убихинол

Rac-1 - Ras-подобный субстрат 1 ботулотоксина СЗ RAS - онкоген вируса саркомы крыс REF-1 - редокс-фактор 1

RET - обратный перенос электронов в дыхательной цепи митохондрий

Ripl - белок, взаимодействующий с рецептором

RKO - клетки карциномы толстой кишки человека

Romol - "ROS modulator 1", регулятор активных форм кислорода 1

SDS - додецилсульфат натрия

shRNA - короткие шпилечные РНК

SkQl - 10-(6'-пластохинолил)децилтрифенилфосфоний

SkQRl - Ю-(б'-пластохинонил) децилродамин 19

Smac - вторичный митохондриальный активирующий фактор

SOS - фактор обмена нуклеотидов

SUMO - малые убиквитин-подобные модификаторы

tBHQ - третбутилгидрохинон

TIM - транслоказа внутренней мембран ы митохондрий;

ТОМ - транслоказа белков -предшественников внешней мембраны митохондрий

TRADD - домен смерти, ассоциированный с ФНО-а

TRAF - фактор, ассоциированный с рецептором ФНО-а

Тгх- тиоредоксин

TrxR - тиоредоксин редуктаза

UCP - разобщающие белки

VDAC - потенциал-зависимый анионный канал

zVAD-FMK - бензоксикарбонил - валил-аланил-аспарагил-(ОМе) флуорометилкетон

ВВЕДЕНИЕ

С появлением методов генетического нокаута в последние 20 лет был произведен прорыв в изучении генетики старения. У различных модельных организмов — дрожжей, нематоды, дрозофилы и мыши — выявлено несколько десятков генов, изменение активности которых замедляет скорость старения. К одним из наиболее интенсивно изучаемых относится белок рббзЬс. Относительно эволюционно "молодой", появившийся у позвоночных животных белок рббэЬс вовлечен сразу в два процесса тесно связанных со старением: передача сигналов в регуляторных путях, связанных с осью гормон роста/инсулиноподобный фактор роста-1 и развитие окислительного стресса. Мыши с генетическим нокаутом рббзЪс характеризуются увеличенной на 30% продолжительностью жизни и сохранением нормального фенотипа и фертильности, что делает эту модель особенно значимой для изучения физиологического и патологического старения млекопитающих. Деления рббэЬс у мышей значительно повысила их устойчивость к окислительному стрессу и развитию связанных с ним патологий, таких, как атеросклероз, возрастное нарушение функций эндотелия сосудов, токсическое поражение печени, осложнения, возникающие при сахарном диабете. Изучение культур клеток мыши показало, что рббзЬс необходим для развития окислительного стресса и апоптоза, вызванных различными индукторами. При этом обнаружено, что рббэЬс может перераспределяться в митохондрии и, действуя в них как оксидоредуктаза, приводить к образованию перекиси водорода. Эти данные свидетельствует в пользу генетически регулируемой роли митохондрий в старении.

В последнее время появляется много работ, свидетельствующих о роли рббзЬс в канцерогенезе, особенно в развитии видов рака, зависимых от стероидных гормонов, таких распространенных как рак простаты и рак груди. Недавние исследования показали также, что высокий уровень экспрессии рббзЬс коррелирует с неблагоприятным прогнозом при раке толстой кишки. Таким образом, детальное изучение функций рббзИс в развитии окислительного стресса и клеточной гибели может быть использовано в диагностике и фармакотерапии онкологических заболеваний и патологий, ассоциированных со старением.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью данной работы было исследование роли рббэЬс в различных моделях окислительного стресса клеток человека, опосредованного митохондриями. Были поставлены следующие задачи:

1. Получить стабильные линии клеток карциномы толстого кишечника человека ЯКО, карциномы легких человека А549 и иммортализованных кожных фибробластов человека ЬШБ с генетическим нокдауном и оверэкспрессией рббБЬс.

2. Установить роль рббзИс в накоплении эндогенных активных форм кислорода, при обработке перекисью водорода в клетках ПК О и НОР. Выявить роль митохондрий в этом процессе, используя митохондриально-направленные антиоксиданты и локализованный в митохондриях белок -сенсор перекиси Нурег-тко, а так же клетки с неактивной дыхательной цепью.

3. Изучить эффект изменения экспрессии рббзЬс на фрагментацию митохондриального ретикулума и гибель клеток, вызванную обработкой перекисью водорода, а также определить тип наблюдаемой клеточной смерти. Исследовать наблюдаемый эффект в клетках с неактивной дыхательной цепью.

4. Изучить роль рббэЬс в оксилительном стрессе, вызванным инкубацией в бессывороточной среде в клетках ККО и ИББ. Определить участие митохондрий в этом процессе с помощью митохондриально-направленных антиоксидантов, сенсора Нурег-шНо и клеток с неактивной дыхательной цепью.

5. Проследить эффект изменения экспрессии рббзЬс на окислительный стресс и гибель клеток карциномы легких А549, индуцированные антираковым препаратом таксолом.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Окислительный стресс

Метаболизм аэробных организмов сопровождается продукцией активных форм кислорода (АФК). АФК обладают высокой химической активностью и в повышенных нефизиологических концентрациях способны окислять молекулы ДНК, белков, углеводов и липидов, вызывая в клетке окислительный стресс. Таким образом, риск окислительного стресса - это цена, которую аэробным организмам приходится платить за более эффективный метаболизм [1].

Накопленные повреждения биомолекул могут привести к потере клеткой разнообразных функций и, в конечном счете, к клеточной гибели. Следовательно, АФК вовлечены развитие старения [2], а также в прогрессию различных патологических процессов, такие как, карциногенез [3], сердечно-сосудистые и нейродегенеративные заболевания, ревматоидный артрит, воспаление, диабет [4]. В дополнение к патологической функции в повреждении клеточных компонентов, в последнее время появляется множество данных, свидетельствующих, что некоторые АФК являются сигнальными молекулами, регулирующими экспрессию генов, рост, различные формы клеточной смерти.

К АФК относятся: супероксид анион радикал (CV), гидроксил радикал (-ОН) и нерадикальный пероксид водорода (Н2О2), а также синглетный кислород. АФК различаются по реакционной способности, времени полужизни и расворимости в жирах [5]. Гидроксил радикал является чрезвычайно реактивной мо