Прооксидантное и цитотоксическое действие тиолов в комбинации с витаминами B126 на опухолевые клетки in vitro

Фасхутдинова, Алсу Амировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Прооксидантное и цитотоксическое действие тиолов в комбинации с витаминами B126 на опухолевые клетки in vitro
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Прооксидантное и цитотоксическое действие тиолов в комбинации с витаминами B126 на опухолевые клетки in vitro"

На правах рукописи

Фасхутдинова Алсу Амировна

ПРООКСИДАНТНОЕ И ЦИТОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ТИОЛОВ В КОМБИНАЦИИ С ВИТАМИНОМ В12Ь НА ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ Ш ШЯО.

03 00 02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г Пущино.

Научные руководители: доктор физико-математических наук, профессор

Акатов Владимир Семенович кандидат биологических наук Соловьева Марина Евгеньевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Новоселова Елена Григорьевна доктор биологических наук Корыстов Юрий Николаевич

Ведущая организация. Институт физико-химической биологии

им А Н Белозерского МГУ

Защита состоится « -/^Г^ 2008 года в ¿¿Р на заседании совета Д 002 093 01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу 142 290, г Пущино, ул Институтская 3, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу 142 290, г Пущино, ул Институтская 3, ИТЭБ РАН

Автореферат разослан « Н » <*> и у» о ^¿^ьР2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат физико-математических наук Н Ф Ланина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проб гены. Тиол-содержащим соединениям принадлежит ведущая роль в защите белков клетки от окислительного стресса, в восстановлении их дисульфидных групп и при изучении свойств белковых молекут На основе тиоловых соединений создан целый ряд синтетических антиоксидантов, снижающих клеточные повреждения, радиопротекторов, лекарственных препаратов Тиолы широко применяются в медицине при исследовании и устранении пневмотоксичности, в лечении ревматоидного артрита, передозировки ацетаминофепа Вместе с этим, тиолы в концентрациях, обычно применяемых для защиты клеток от окислительного стресса, могут давать и неожиданный повреждающий эффект [Munday, 1989, Held et al, 1996, Tartier et al, 2000, Qanungo et al, 2004] Это обусловлено их двойственной природой, в частности, способностью дитиотреитота (DTT) [Spear, Aust, 1998, Taatjes et al, 1997], N-ацетидцистеина (NAC), глутатиона (GSH) [Held, Biaglow, 1994, Kwak et al, 1995, Held et al, 1996, Chan et al, 2001, Thibodeau et al, 2001, Sagrista et al, 2002, Bonsenko et al, 2004, Farombi et al, 2004], цистеина [Yang et al, 2000], цистеамина и других низкомолекулярных тиолов [Teitner et al, 1998] генерировать активные формы кислорода (АФК) в реакции с ионами переходных металлов (Fe, Си), либо с другими радикалами и самим становиться тиильными радикалами, что в итоге ведет к повреждению ДНК и других биомолекуч [Long, Halhwell, 2001] Аналогично этому окислите тьный стресс и цитотоксическое действие вызывают сочетания витаминов С и В^ь [Акатов и др, 2000, Akatov et al, 2000], или витамина С с фталоцианинами кобальта [Акатов и др, 2001], которые в последние годы внедряются в онкологию как противоопухолевые препараты [Волышн с соавт , 1998], а также витамина С с менадионом [Jamison et al, 2004] Недавно мы обнаружили усиление прооксидантного действия сочетания витаминов С и Bia добавлением дитиотреитола [Соловьева и др, 2005] и предположили, что в комбинации с Со3+, входящим в состав витамина Вщ,, тиолы, как и аскорбиновая кислота [Akatov et al, 2000], способны выступать в качестве прооксидантов Антиоксиданты, и в том числе тиолы, зачастую используются в медицине одновременно с витаминными препаратами В частности, фирмой Cobalz (UK) выпускается препарат Церефолин NAC, предлагаемый для лечения заболеваний нейроваскулярного окислительного стресса, васкулярной дименции, болезни Альцгеймера и ишемического шока В этом препарате NAC используется в сочетании с L-метилфолагом и кобаламином Как подчеркивают некоторые авторы, в антиоксидантной терапии нередко не учитывается сопутствующее поступтение соединений прооксидантного действия, что может привести к понижению ее эффективности и даже к повреждающему воздействию на клетки и ткани организма [Бобырев и др, 1994] С другой стороны, цитотоксический эффект сочетания тиолов с витамином Bi2b может быть взят за основу при разработке новых лекарственных (противоопухолевых) средств Поэтому изучение воздействия на клетки витамина Вцъ в сочетании с тиол-содержащими агентами является актуальным

Цель плботы. Целью данной работы было исследование прооксидантного и цитотоксического эффекта тиолов в сочетании с витамином Впь на опухолевые клетки in viti о

Основные задачи исследования.

1 Изучение цитотоксического эффекта тиолов в сочетании с витамином В]2ь на опухолевые клетки ш vitro

2 Изучение типа гибечи клеток, индуцируемой действием витамина В]2ь в сочетании с тиотами

1 N

3 Исследование прооксидантного эффекта сочетаний тиотов с Впь и установление роли активных форм кислорода в цитотоксическом действии этих сочетаний

4 Выяснение механизма клеточной гибели

Научная новизна работы. Впервые показано, 'по антиоксидаиты тиоты в сочетании с витамином Впъ образуют прооксидантные системы и вызывают гибель клеток Синергизм цитотоксического действия тиолов в сочетании с витамином В^ь выявляется при таких концентрациях веществ, при которых они в отдельности нетоксичны Установлено, что цитотоксическое действие системы «тиолы+Внь» обусловлено генерацией и накоплением перекиси водорода во внеклеточной среде, что вызывает внутриклеточный окислительный стресс и повреждение окислительно-восстановительной системы клеток Обнаружено, что система «тиолы+витамин В12Ь» оказывает генотоксическое действие на опухолевые клетки и индуцирует апоптоз Установтено, что гибель клеток осуществляется при участии внутриклеточного железа. Обнаружено, что ранними событиями в клетках в результате повреждающего действия тиолов в сочетании с витамином Впь являются дестабилизация лизосом, однонитевые разрывы ДНК и перекисное окисление липидов клеточных мембран

Практическая значимость. Данное исследование представляет практический интерес для онкологии и фармакотогии, а также для корректного использования витаминных и антиоксидантных препаратов в медицине Работа вносит вклад в развитие представлений о молекулярных и клеточных механизмах цитотоксического действия новых прооксидантных систем

Апробация диссертации Основные результаты диссертационной работы были представлены на 9 международной Пущинской школе-конференции молодых ученых, Пущино, 2005, на 8, 9, 10 международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, 2006, 2007, 2008 гг, на всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре», Санкт-Петербург, 2006, на всероссийских конференциях молодых ученых и школы им Академика Н М Эммануэля «Окисление, окислительный стресс и антиоксидаиты», Москва, 2006, 2008 гг Работа прошла апробацию на открытом заседании секции «Мо пекулярная, клеточная и радиационная биология, и окружающая среда» ИТЭБ РАН 30 июня 2008г

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи в рекомендованных ВАК РФ журналах

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 129 страницах печатного текста и состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, Выводов и Списка литературы (из 208 работ) Работу иллюстрируют 33 рисунков и 1 табчица

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Клеточные культуры. Клетки карциномы гортани человека НЕр-2, минимально трансформированных мышиные фибробласты МН ЗТЗ и клетки лимфолейкоза человека линии НЬ-60, полученные из Всероссийской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург), выращивали в среде ДМЕМ и ЯРМ1 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (НуС1опе), 80 мкг/мл гентамицина, 2,2 г/л бикарбоната натрия при 37°С и 5% С02 в газовой среде

Оценка цитотоксичпости Цитотоксичность клеток оценивали по их окраске кристаллическим фиолетовым с последующим фотометрированием [Мопиги е1 а1, 1995] Исследуемые вещества добавляли через 24 ч после посева 5 тыс кл/лунку в 96-луночном планшете Цитотоксичность оценивали по отношению количества живых клеток в опытных и контрольных (необработанных токсическими агентами) культурах после 48 ч культивирования после 2 и 48 ч инкубации клеток с агента?ш от

момента добавления агентов

Морфологический люминесцентный анализ anonmoia. Наличие аберрантного распределения хроматина, указывающего на апоптотический тип гибели клеток, оценивали методом люминесцентной микроскопии, окрашивая клетки одновременно красителями Bisbenzimide Hoechst 33342 (Н33342) с этидиум бромидом (EtBr) в концентрации по 1 мкг/мл Двойная окраска позволяет определить аберрантное распределение хроматина в живых (зеленая люминесценция) и погибших (красная люминесценция) клетках [Соловьева, и др, 1998, Meicille, Massie, 1994]

Анализ апоптоза методом проточной цитометрин. Наличие апоптотических клеток оценивали также методом проточной цитометрии по присутствию частиц в суб-Gj области на ДНК-цитограммах Клетки фиксировали 50% раствором этанола в растворе Эрла pH 7 2 ДНК клеток окрашивали красителем Bisbenzimide Hoechst 33258 в концентрации 5 мкг/мл Анализ ДНК-цитограмм проводили на проточном цитометре РARTEC Ш канал FL4 (425-475 нм)

ДНК электрофорез (мемнуклеосоиная фрагментация). Чтобы выявить межнуклеосомную фрагментацию, 1 мкг клеточной ДНК, экстрагированной фенолом, разделяли путем электрофореза в 1 2% агарозном геле согласно процедуре, описанной в работе [Ren et al, 2001] Гели окрашивали этидиум бромидом (0 5 мкг/мл) в течение 20 мин

Оценка кас пашой активности Определение активности каспазы-3 проводили с использованием специфического субстрата Acetyl-Val-Gln-Val-Asp-PNA (MP Biomedicals, США) на планшетном спектрофлуориметре Тесап

Анализ содержания перекиси водорода в среде с помощью кислородного эчектрода. Образование Н2О2 в ростовой среде, после добавления 25 мкМ В^ь и тиолов, определяли по увеличению концентрации кислорода в среде в закрытой измерительной ячейке после добавления 200 ед /мл каталазы [Akatov et al, 2000, Long, Hallroell, 2001]

АналиI генерации гидроксильныхрадикалов Генерацию гидроксильных радикалов оценивали по флуоресценции 7-гидрокси-кумарин-З-карбоновой кислоты (7-ОНССА) в фосфатном буфере (pH 7,4), возникающую в результате высокоселективного окисления красителя 3-ССА (0,1мМ) этим радикалом Измерения выполняли на планшетном спектрофлуориметре Тесап (Ех З60н.м/Ет 465нм) [Manevich and al, 1997]

Оценка внутриклеточной окислительной активности Внутриклеточную окислительную активность оценивали по флуоресценции зонда DCFHDA [Pantopoulos et al, 1997] с помощью проточного цитометра PARTECIII, канал FL1 (510-530 нм) в суспендированных клетках и планшетного спектрофлуориметра Тесап в прикрепленных культурах (Ех 485нм/Ет 530нм)

Анализ однонитевых разрывов ДНК (ко мета тест). Генотоксический эффект оценивали по образованию однонитевых разрывов и щелочно-лабильных сайтов в ДНК с помощью метода ДНК-комет одиночных клеток [Doulias et al, 2001]

Опредечение мембранного потенциала митохондрий Величину митохондриального мембранного потенциала оценивали по флуоресценции красителя JC-1 (отношение сигналов Ех 485нм/Ет 530нм к Ех 535нм/Ет 590нм, нормализованное к количеству клеток) на планшетном спектрофлуориметре Тесап

Выход цитохроча с ut митохондрий. Выход цитохрома с из митохондрий определяли, используя метод пермеабилизации клеток дигитонином, иммуноблоттинг

Определение дестабилизации лизосочальных мембран Дестабилизацию лизосомальных мембран оценивали по известной методике [Antunes et al, 2001]

Прикрепленные клетки окрашивали акридиновым оранжевым (5мкг/чч) в течение 15 мин, трижды отмывали, делали добавки исследуемых веществ и измеряли флуоресценцию на планшетном спектрофлуориметре Tecan (Ex 485nm/Em 53Опт) Дестабилизацию лизосом оценивали по изменению отношения интенсивностсй зеленой флуоресценции в опытных и контрольных (необработанных) клетках.

Анализ гидроперикисей липидое Гидроперекиси липидов определяли используя FOX II реагент по методике [Wolff, 1994] на планшетном спектрофлуориметре Тесап (535 нм)

Статистический опали; Результаты исследований представлены в виде среднего ± m, где m -квадратичная ошибка среднего Достоверность отличия средних значений оценивалась с помощью t-критерия Стъюдента

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Синергизм цитотоксического эффекта тиолов в сочетаниях с витамином Boh на опухолевые клетки in vitra

а) Ингибирование пролиферации и гибель клеток НЕр-2, HL-60 и NIH ЗТЗ в зависимости от концентрации тиолов при их раздельном и сочетанием применении с витамином Впь-

Концентрационные зависимости цитотоксичности тиолов оценивали без витамина В^ь и в сочетании с витамином Оценивали цитотоксичностъ 2-х часового и 48-часового воздействий сочетаний Изучение цитотоксичности двухчасового воздействия пар тиол/витамин Виь было обусловлено тем, что при использовании этих веществ в качестве противоопухолевого препарата, либо в антиоксидантной терапии время полувыведения/фармакокинетика этих препаратов, после введения в организм составляет около 2 ч

Витамин В|2ь в исследованных нами концентрациях 0,1-25 мкМ в отдельности и тиозы GSH и NAC в концентрациях 0,03-10 мМ были нетоксичными для клеток НЕр-2 Цитотоксичностъ Впь обнаруживалась при концентрации около 3 мМ и выше

Синергизм цитотоксического эффекта 25 мкМ витамина В|2ъ в комоинации с GSH и NAC наблюдался в культуре клеток НЕр-2 при концентрациях тиолов 1 мМ и выше как после 2-х, так и после 48 часового воздействия сочетаний Концентрация NAC и GSH, при которой количество клеток после культивирования было 50% относительно контроля (1Ста) при сочетанном применении с 25 мкМ витамина В)2ь снижалась до 3 мМ (Рис 1)

Таким образом, длительное и кратковременное воздействие бинарных сочетаний витамина В^ь с тиолами GSH и NAC, взятых в фармакологической дозе, были токсичными для клеток НЕр-2

Цитотоксическое действие DTT при инкубации клеток с ним в течение 48ч обнаружилось при концентрациях тиола около 2 мМ и выше (Рис 1) Двухчасовое воздействие DTT в концентрациях до 30 мМ с последующим отмыванием и культивированием в течении 48 ч было не токсичным для клеток Синергизм цитотоксичего эффекта DTT в сочетании с 25 мкМ витамина В12Ь был выявлен при концентрациях тиола выше 0,3 мМ как после кратковременного (2 ч), так и длительного (48 ч) воздействия Величина 1С50, уменьшалась в 4-5раза в результате совместного применения с витамином Впъ при длительном (48 ч) воздействии и более чем в 60 раз после кратковременного (2 ч) воздействия сочетания, и составляла 0,30,5 мМ Следовательно, витамин Впь сдвигает цитототоксичность DTT в область низких концентраций (Рис 1)

Аналогично, витамин BI2l) значительно усиливал цитотоксичность исследованных тиолов по отношению к клеткам лимфолейкоза человека HL-60 и клеткам минимально-трансформированных фибробластов мыши NIH ЗТЗ.

На основе полученных данных были выбраны концентрации тиолов (1 мМ DTT, 5 мМ NAC и 5 мМ GSH), и 25 мкМ витамина Bi2b, которые использовали в дальнейшем в исследовании механизма цитотоксического действия исследуемых бинарных систем и формы клеточной гибели, инициируемой ими.

0,01 0.1 1 10 100 0.01 0.1 1 10

[GSH], мМ [DTT], мМ

Рис. 1. Усиление цитотоксического эффекта GSH и DTT в результате еочетанного действия с 25 мкМ витамина Bia, на клетки НЕр-2 при кратковременном (2 ч) и длительном (48 ч) воздействии вешеств. По оси абсцисс - концентрация тиолов, мМ; по оси ординат -отношение числа живых клеток в опытных и контрольных (без добавок) культурах через 48 часов после добавления сочетаний, %.

б) Изучение кинетики клеточной гибели, индуцированной сочетаниями тиолов с витамином Вць-

Изучение кинетики гибели клеток НЕр-2 в результате действия комбинации витамина В12ь с тиолами показало, что число живых клеток НЕр-2 сохраняется на уровне контрольных значений в течение 4-5 ч после добавления 25 мкМ В12Ь в сочетании с 5мМ GSH, 5 mMNAC, 1 мМ DTT.

Увеличение числа погибших клеток начинается через 4-7 ч после добавления витамина в сочетании с тиолами, и через сутки их количество достигает 80%. Через двое суток после добавления витамина и тиолов, количество живых клеток составляет около 10-12 % от общего количества (Рис.2).

Рис. 2. Кинетика гибели клеток под действием 5 мМ GSH, 5 мМ NAC и 1 мМ DTT в сочетании с 25 мкМ витамина Виь. По оси ординат - доля живых клеток в процентах от общего количества.

в) Зависимость цитотоксического действия толов в сочетании с витамином В12ь от посевной концентрации клеток НЕр-2.

Известно, что при возрастании плотности клеточных культур, при росте клеток в мультислоях или сфероидах наблюдается резистентность опухолевых клеток к цитотоксическим агентам, которая зависит от адгезивных контактов клеток с субстратом, с окружающими клетками, что значительно влияет на их метаболизм и повышает выживаемость в неблагоприятных условиях.

Нами было установлено, что клетки линии НЕр-2 при возрастании плотности клеточной культуры также приобретают повышенную устойчивость к повреждающему действию бинарной системы тиол/витамин В^ь- В плотных культурах (200 тыс.кл/мл) клетки НЕр-2 обладают резистентностью к действию сочетания тиолов с витамином В)а>. Цитотоксическое действие выявляется при плотности посева около 50- 100 тыс. кл/мл (Рис.3).

50 тыс. кл/мл ешшз 200 тыс. кл'мл

Рис.З. Зависимость цитотоксического действия тиолов: 5 мМ C-SH, 5 мМ NAC и 1 мМ DTT в сочетании с 25 мкМ витамина В!2ь от посевной концентрации клеток НЕр-2 после 48 ч инкубации клеток с веществами.

GSH/B12b NAOB12b DTT/BI2b

Исходя из этих данных, можно сказать, что при изучении цитотоксического действия прооксидантных систем необходимо учитывать плотность клеточных культур, от которой зависит проявление повреждающего эффекта на клетки. В нашей работе, мы использовали плотность посева 50 тыс. клеток/мл.

г) Зависимость гибели клеток под действием тиолов в сочетании с витамином Вт от времени инкубации.

Чтобы определить время инициации гибели клеток бинарными системами тиол+В12Ь, проводили замену среды с сочетаниями тиол+В12Ь на среду без добавок после 15, 30, 45, мин; 1, 2, 4 ч воздействия 25 мкМ витамина В^ь в сочетании с тиолами на клетки НЕр-2. Исследования показали, что после 15 мин воздействия бинарной системы тиол+В12ь и последующего 48-часового культивирования клеток без сочетания жизнеспособность клеток и пролиферативная активность сохраняются на уровне контрольных значений, а после 30-45 мин воздействия наблюдалась инициация гибели 50% клеток (Рис.4). Воздействие бинарной системы гиол+В12ь на клетки НЕр-2 в течение 1,5-2 ч вызывало цитотоксический эффект такой же, как при постоянной экспозиции клеток с сочетанием тиол/В^ь-

О 15 30 45 60 90 120 мин

Время воздействия

Рис.4. Зависимость цитогоксического эффекта сочетания 1мМ ОТТ с 25мкМ витамина В|2ь от времени его воздействия на клетки. Время воздействия ограничивали ттем замены культуральной среды с 25 мкМ витамина В|2ь в сочетании с гиолами на культуральную среду без добавок. Цитотоксичность оценивали через 48 часов после добавления ОТТ и В]2ь, как отношение числа живых клеток в опытных и контрольных (без добавок) культурах.

Таким образом, инициация гибели основной части клеток происходит в течение 30-60 мин и к концу 2 часа достигает значений, как при постоянной экспозии клеток с бинарной системой тиол/В^ь (48 ч). Гибель клеток начинает проявляться через 4-7 ч. Через 48 ч количество живых клеток составляет около 10% по сравнению с контролем.

Изучение типа гибели клеток, индуцируемой действием витамина В|7Ь в сочетании с тиолами.

Известно, что многие цитотоксические вещества в зависимости от концентрации способны индуцировать как апоптическую. так и некротическую гибель клеток в культуре. Для потенциальных противоопухолевых агентов существенным является инициация гибели клеток путем апоптоза, заканчивающаяся полной элиминацией клеток без развития воспалительного процесса. Учитывая возможность применения нашей системы в онкологии, мы решили изучить тип гибели клеток, индуцируемой бинарной прооксидантной системой тиол/В^ь-

а) Морфологичский анализ апоптоза. Увеличение доли апоптотических и погибших клеток.

При изучении типа гибели клеток, вызываемой сочетанным действием тиолов с витамином В,2ь, обнаружили увеличение доли клеток с уменьшенным объёмом и фрагментированным, а также конденсированным хроматином, что является характерным морфологическим признаком апоптоза. Увеличение процента апоптотических клеток с фрагментированным и конденсированным хроматином наблюдали методом двойного окрашивания (Рис.5).

Достоверное увеличение доли апоптотических клеток отмечали уже после 4 ч действия тиола и витамина В|2ь- В качестве примера на Рис.6 представлены данные для сочетания Bi2b с NAC. Конденсированный и фрагментированный по апоптотическому типу хроматин был обнаружен как в погибших клетках, так и в сохраняющих целостность плазматической мембраны, т.е. ещё живых клетках. Доля клеток с конденсированным хроматином превышала долю клеток с фрагментированным хроматином, которая в опыте составляла обычно не более 20% от общего числа клеток. Доля некротических клеток не превышала 3%, в контроле она составляла 1.5%. Доля клеток с аберрантным распределением хроматина,

характерный для апоптоза, достигала 40-65% через 10—16 ч для исследованных сочетаний по сравнению с 2% в контрольной культуре.

Апоптоз

и конденсированный хроматин в мертвых клетках)

Некроз Нормальные клетки

Апоптоз

(фрагментированный хроматин в живых клетках)

Рис.5. Морфологический критерий апоптоза. Двойное окрашивание клеток НЕр-2 ядерными люминесцентными красителями: Е^Ьегшпнёе Н33342 и ЕЙЗг. Увеличение - х400. В каждом препарате (300 клеток) подсчитывали количество погибших (некротических и апоптотических, оранжевая люминесценция) и живых клеток (в том числе апоптотических, зеленая люминесценция).

Время воздействия, ч

Рис.6. Увеличение количества апоптотических и погибших клеток НЕр-2 в результате воздействия сочетания 25 мкМ В12ь с 5 мМ NAC. К апоптотическим относили погибшие и живые клетки с фрагментированным и конденсированным хроматином.

Число погибших клеток определяли как сумму погибших апоптотических и некротических клеток. Контроль -необработанные клетки (0 ч). * -различия с контролем недостоверны, р>0.05.

б) Оценка апоптоза но суб-С, области ДНК цитограмм клеток.

Изучение типа гибели клеток под действием витамина В^ь в сочетании с тиолами по присутствию суб-01 области на ДНК цитограммах показало, что к 7 часам происходит потеря клетками части ДНК, на что указывает появление клеток с субдиплоидным набором ДНК (Рис.7).

600

о 300

G2/M

I; s. Д

J Wi^ \

О 500 1000

Флуоресценция, ота.ед.

0 500 1000

Флуоресценция, отн.ед.

а) Контроль б) 5 мМ GSH/25 мкМ В12ь

Рнс.7. Гистограмма распределения ктеток НЕр-2 по содержанию ДНК после их инкубации с сочетанием тиол/В^ь в течение 7 ч.

в) Межнуклеосомная фрагментация ДНК.

Характерным признаком апоптоза, как известно, является межнуклеосомная фрагментация ДНК хроматина. Согласно данным ДНК-электрофореза, бинарные сочетания тиол (NAC, DTT, GSH) + В^ь вызывали в клетках НЕр-2 и HL-60 межнуклеосомную фрагментацию ДНК. Образование крупных фрагментов ДНК наблюдали после 6-7 часов инкубации клеток с системами тиол+витамин В^ь. В дальнейшем, к концу 10ч происходит образование низкомолекулярных фрагментов, и межнуклеосомная фрагментация наблюдается к 12-16ч инкубации клеток с сочетаниями тиол+Вщ,: на электрофореграммах ДНК отчетливо видны полосы, соответствующие ее фрагментам (Рис.8). Таким образом, бинарные системы тиол+В|2ь вызывали фрагментацию ДНК характерную для апоптоза.

Рис.8. Межнуклеосомная

фрагментация ДНК клеток НЕр-2 (а) и НЬ-60 (б) вызываемая инкубацией с сочетанием 25 мкМ витамин Впь/тиол. Дорожка 1 - контроль, 2, 3, 4, 5 -7, 10, 12 и 16 ч с 5мМ NAC+B¡2ь (1) и с 1мМ ОТТ+ В,2ь (2). Дорожка 6-маркеры ДНК, кратные 100 пар оснований, натанается со 100 пар оснований.

г) Определение активности каспазы 3.

Известно, что при инициации апоптоза в клетке одним из ключевых моментов является ранняя активация каспазы-3. Мы определяли активность этой протеазы в клетках НЕр-2, обработанными парами тиол+витамин В12Ь. Было установлено, что инкубация клеток линий НЕр-2 сочетаниями уже через час приводила к активации каспазы-3, сопоставимой с ее активацией в клетках обработанных известным индуктором апоптоза с участием каспазы 3 - этопозидом (Рис.9а). Более длительная (7 ч) инкубация клеток с бинарными системами показала дапьнейшее увеличение активности протеазы. В то же время цитотоксический эффект сочетаний подавлялся ингибитором каспазы 3 и б (Рис.9б). Полученные результаты

свидетельствуют о том, что бинарные системы тиол/В12ь, инициируют в клетках апоптоз, который реализуется при активации каспазы 3, и ингибирование каспаз-зависимого сигнального пути реализации апоптотической программы подавляет цитотоксическое действие бинарных систем.

DTT+B12b ZDQMD

а) 6)

Рнс.9. Повышение активности каспазы 3 после воздействия бинарных систем 1мМ DTT+25 мкМ Bi2b, 5мМ GSH+25 мкМ В^ь, а также 25 мкМ этопозида (положительный контроль) на клетки НЕр-2; контроль - культура без воздействий (а), и снижение цитотоксичности бинарной системы 1мМ DTT+ 25 мкМ Впъ для клеток Нер-2 в результате добавления вместе с тиолом и витамином ингибитора каспаз ZDQMD (200мкМ) (б). * -различия с контролем (DTT+ Вць, 24 часа воздействия) достоверны. р<0.05.

3.3. Исследование прооксидантного эффекта сочетаний тиолов с витамином В,„, и установление роли активных форм кислорода в цитотоксическом действии этих сочетаний.

Ранее было установлено, что сочетание аскорбата с витамином Bi2b активно восстанавливает кислород и генерирует перекись водорода в физиологических растворах и культуральных средах [Акатов и др., 2000]. В данной работе мы изучали, в какой степени сочетания тиолов с витамином В]2ь обладают такими свойствами.

а) Генерация Н202 в ростовой среде тиолами в сочетании с витамином Bl2i,.

Известно, что антиоксидантный эффект тиолов реализуется посредством прямого перехвата АФК. Действительно, при добавлении в клеточную культуру Н202 тиолы GSH и NAC в концентрации 5мМ ускоряют его элиминацию в 3 раза (Рис.10). К 10 мин наблюдается практически полная элиминация ЮОмкМ Н202 в среде. Без

тиолов перекись водорода восстанавливается существенно медленнее и этот процесс определяется антиоксидантной активностью кутьтуральной среды, сыворотки, каталазной и пероксидазной активностью клеток Таким образом, тиолы удаляют перекись водорода из среды

С другой стороны мы обнаружили, что тиолы в комбинации с витамином активно катализируют восстановление кислорода На Рис 11а это продемонстрировано для ОТТ ИТТ в концентрациях до ЗмМ хотя и восстанавливает кислород в среде, но делает это очень медленно Добавление к ОТТ 25 мкМ витамина В12Ь резко ускоряет восстановление кислорода Например, добавление В12Ь к 1мМ БТТ полностью восстанавливает растворенный в среде кислород (около 270 мкМ) в течение 10 мин (Рис 11а) Исходя из этих результатов, можно ожидать, что кобальт в составе витамина В12ь будет катализировать образование АФК тиолами

H2o,+Nac Н,02 (100 мкМ)

0 20 40 60 Время после добавзения, мин

Рис.10. Антиоксидантное

действие тиотов (5мМ GSH и 5мМ NAC) по отношению к 11202, добавленной в культуру клеток НЕр-2 через 1 сутки после посева клеток (50 тыс кл./мл)

Образование Н202 в среде, содержащей тиолы+В^ь, оценивали количественно с помощью кислородного электрода Сами тиоты практически не вызывали образования Н202 в среде обнаружено менее 8 мкМ Н202 при 2-ч инкубации с NAC и DTT, и не более 5 мкМ - с GSH, что согласуется с отсутствием их токсичности Накопление Н202 наблюдали в присутствии тиолов совместно с витамином В12Ь В среде содержащей 1мМ DTT+Bi2b концентрация Н202 увеличивалась в первые 7-10 мин до 250 мкМ Затем, к концу первого часа происходило постепенное уменьшение концентрации Н202 в среде до значений близких к нулю (Рис 116) По всей видимости, такая кинетика обусловлена тем, что комбинация DTT+Bi2b в течение первых 10 мин восстанавливает весь кислород в среде (Рис 11а) до перекиси водорода Дальнейшее разложение перекиси водорода является медленным процессом, с часовой кинетикой, и кроме того полная элиминация перекиси водорода в среде может сдерживаться медленным поступлением кислорода из газовой фазы и его восстановлением (Рис 116) Следует отметить, что кинетика накопления перекиси водорода и ее последующей элиминации в культуральной среде с клетками и без клеток отличается Это отличие может быть обусловлено каталазной и пероксидазной активностью в клетках, и зависит от их концентрации

Кинетика аккумуляции и элиминации перекиси водорода в среде содержащей 25 мкМ Впь в сочетании с NAC (5чМ) и с GSH (5мМ) была совершенно отличной от описанной выше для DTT с 25 мкМ Bi2b В этом случае, в первые 7-10 мин также происходит быстрое накопление Н202 до 30-40 мкМ, но затем подъем концентрации Н202 прекращается, хотя к этому времени концентрация кислорода остается на

высоком уровне Затем концентрация перекиси водорода остается в течение 2 ч наблюдения около 25-35 мкМ (Рис 12) Такой характер катализа указывает на влияние продуктов реакции, в частности Н2О2, на скорость реакции, и для его понимания требуется углубленное физико-химическое исследование Кинетики накопления и поддержания перекиси водорода в среде с сочетаниями ОБН+В^ь и КАС+В^ь были идентичны

—ОТТ+В12Ь' среда с клетками о— ОТТ среда с кпетеами о— ШТ+В12Ь среда без клеток •— ОТТ, среда бе* клеток

ОТТ

В12Ь

О гч

д «о

О 5 10 15 Время, мин

о)

Время посче добав1ения веществ, мин б)

Рис 11. Восстановление кислорода в культуральной среде сочетанием ОТТ с 25 мкМ В12ь(а) и генерация Н2О2 и ее накопление в ростовой среде после добавления 1мМ ОТТ с 25 мкМ витамина В!2ь(о)

5 К 30

сч

■ С$Н+В12Ь-сРеДа^езклеток

■ СЬН+В] 25, среда с клетками 0$Н, среда без клеток

• 6511, среда с клетками

Рис.12. Прооксидантное

действие сочетания 05Н (5мМ) с 25 мкМ Впь, выражающееся в генерации и накоплении Н2О2 в ростовой среде с клетками и без клеток после добавления ОБН и Вщ,

О 30 60 90 120 Время после добавчения веществ, мни

Согласно данным литературы и нашим данным, однократная добавка 30-40 мкМ перекиси водорода, оказывает незначительный цитотоксический эффект, но длительное (1-2 ч) поддержание таких концентраций сопоставимо по токсическому действию с однократной добавкой Н2О2 в высоких концентрациях (200-300 мкМ) [РагПорои1о$ й а1, 1997] Это позволило предположить, что длительное поддержание концентрации перекиси водорода в культуральной среде сочетаниями ОЭН+В^ь и ИАС+Впь на уровне около 30 мкМ было причиной вызываемого ими цитотоксического эффекта

б) Генерация i идроксн л радикала

Извесшо, что главную роль в окислительном повреждении клеток играет не Н202, а шдрокенльныи радикал ( ОН), который образуется в реакции Н202 с редокс-активными ионами металлов переменной валентности, в частности меди, железа (реакция Фентон) или с 02 " при посредничестве этих ионов (реакцм Хабер-Вайсса) Исходя из предыдущих опытов, показавших накопление в среде перекиси водорода, мы предположили, что следующим этапом развития реакции должна быть генерация гидроксил радикала

Действительно, мы обнаружили, что в среде содержащий 1мМ DIT и 25 мкМ витамина В12ь происходит активная генерация гидроксил радикала, сравнимая по величине с генерацией ОН радикала сочетанием аскорбата с сернокислым железом (Рис 13а) Удивительно то, что в отличие от данных для DTT+B13b мы обнаружили, что цитотоксические сочетания 5 мМ GSH+B^b и 5 мМ NAC+Впь не вызывают окисление ЗССА в PBS (Рис 13а), несмотря на данные о генерации ими перекиси водорода Можно предположить, что гидроксильный радикал все-таки образуется этими бинарными системами и приводит к окислению ЗССА до флуоресцирующего продукта, 70НССА, но затем 70НССА восстанавливается тиолами Однако наши исследования показали, что тиолы не восстанавливают 70НССА

Можно предположить также, что концентрация тиолов в этих сочетаниях слишком велика, и они перехватывают радикалы, препятствуя тем самым окислению ЗССА Однако снижение в сочетаниях концентрации GSH и NAC с 5 до 1мМ, как и увеличение концентрации ЗССА в пять раз не способствовало окислению красителя С другой стороны, добавление 1мМ NAC к сочетанию 1мМ DTT и 25 мкМ В121, сдерживало окисление ЗССА, но не подавляло его полностью (Рис 136) Следовательно, способность перехвата гидрокеш радикала тиолом NAC не столь велика, чтобы полностью предотвратить окисление флуоресцентного зонда ЗССА Все эти результаты указывают на то, что сочетания GSH+Впь и NAC+Впь практически не образуют гидроксильный радикал

Ж а

и и а о

1ммтт/в12Ь

5мМПТТЛ312Ь C/Fe

"¡MMGSWB^b 5MMNAC,B12b

4«"

Iя

U U X

о со ¿8ooûoooocûogqooooooooooooûqooo

10 20 за « 50 60

Время, мин

l\iMDTT/B|2t,

1чМ DTT/Bj 2Ь+ 1мМ N \С

1мММ.АС/В1;ь

Время, мин

а) 6)

Рис.13. Кинетика накопления 7-ОНССА (индикатора окисления флуоресцентного зонда 3-ССА (0,1мМ) гидроксил радикалом) в PBS pH 7 2 после добавления DTT (1мМ), GSH (5 мМ) и NAC (5 мМ) в сочетании с 25 мкМ В]2ь (В качестве положительного контроля использовали сочетания 0,1 чМ FeSOi с 2 мМ витамина С) (а) Влияние 1 мМ NAC на кинетику накопления 7-ОНССА после добавления к 1мМ DTT в сочетании с 25м-Л1 Вгь(б)

в) Внутриклеточная окислительная активность.

Обнаружив внеклеточный окислительный стресс, вызванный сочетаниями тиолов с витамином В^ь, мы предположили, что это вызовет внутриклеточное повышение окислительной активности.

Повышение внутриклеточной окислительной активности (в 2-2.5 раза по сравнению с контролем) наблюдали после 1 ч инкубации с бинарными системами СКН+В^ь и ЫАС+Виь клеток НЕр-2, предварительно окрашенных зондом ВСНБВА (Рис, 14). Тиол ОТТ совместно с витамином В12Ь вызывал повышение внутриклеточной активности АФК в 2.5 раза уже через полчаса воздействия.

Флуоресценция, отн.ед.

Рнс.14. Повышение внутриклеточной окислительной активности в клетках НЕр-2 после добавления 25 мкМ витамина В[2ь и 5 мМ NAC. Клетки в суспензии окрашивали внутриклеточным зондом DCHFDA, отмывали зонд, инкубировали с веществами 1 ч и затем анализировали на проточном цитофлуориметре.

Эндогенная окислительная активность, которую оценивали по флуоресценции клеток, окрашенных БСНРОА после обработки сочетаниями тиол/В^ь, в первый час инкубации клеток с прооксидантными бинарными системами не отличалась от контроля. Двухчасовое воздействие сочетаний тиол/В12ь приводило к значительному повышению продукции АФК эндогенного происхождения, которое свидетельствует о повреждении окислительно-восстановительной системы клеток. После 3-4 ч инкубации наблюдали появление клеток с интенсивностью флуоресценции, превышающей контрольную в 7-10 раз (Рис.15). В качестве положительного контроля на Рис.15 показано увеличение флуоресценции клеток, инкубированных с 2мМ Н202 в течение 0.5 ч, до 20 раз по сравнению с необработанными клетками.

GSH

B,WGSH

2ММН,02 30 мым

Флуоресценция, отн. ед.

Рис.15. Изменения внутриклеточной окислительной активности эндогенного происхождения после инкубации клеток НЕр-2 с сочетаниями 25 мкМ В12Ь с 5мМ 05Н. Клетки инкубировали с витамином и тиолом, отмывали от агентов, затем окрашивали внутриклеточным зондом БСОТИА и проводили измерение на проточном цитофлуориметре.

Исходя из этих результатов, можно сделать вывод, что редокс система клеток в течение первого часа действия сочетаний тиол+В^ь остается неповрежденной, и повышение внутриклеточной окислительной активности в это время обусловлено экзогенной перекисью водорода, проникающей в клетку. В последующем, в ходе реализации апогпотической программы, инициированной сочетаниями тиол+В]2Ь, происходит повреждение редокс системы клеток и увеличение эндогенной окислительной активности.

г) Влияние нетиоловых янтиоксидантов на цитотоксическое действие тиолов в сочетании с витамином В,л,.

Чтобы проверить, действительно ли цитотоксическое действие каталитической пары осуществляется через генерацию Н202, мы добавляли в среду с клетками нетиоловые антиоксиданты, невзаимодействующие с В121): пиру ват и каталазу. Антиоксиданты пиру ват (10 мМ) и каталаза (200 ед/мл), при внесении на 2 ч с сочетаниями 08Н+В12ь, ИАС+В12ь и ОТТ+Вць полностью ингибировали их цитотоксическое действие: доля живых клеток при этом составляла около 100 % (Рис. 16). Исходя из этого, можно сделать вывод, что экзогенный окислительный стресс является необходимой составляющей цитотоксического действия сочетаний тиол+В12Ь.

Р- 120

NAC/B12Ь

Рис.16. Влияние нетиоловых антиоксидантов на цитотоксический эффект комбинаций 5мМ GSH, 5мМ NAC или 1мМ DTT с 25 мкМ витамина В]2ь-

3.4. Выяснение механизма клеточной гибели.

Известно, что токсичность перекиси водорода в клетке связана с внутриклеточным железом. Учитывая, что прооксидантная система тиол+В12Ь вызывает генерацию перекиси водорода в среде, которая проникает в клетки, мы решили выяснить участвует ли железо в цитотоксичком действии сочетаний тиол+В|2ь-

а) Действие хелагоров железа.

Добавление хелаторов железа-фенангролина (PTL), связывающего Fe~+ (50 мкМ), и дефероксамина (DFO) (0.3 мМ), более прочно связывающего Fe [На Hi well and Gutteridge, 1986; Byrnes, 1996], за 0.5-1 ч до внесения сочетания В^ь с исследуемыми тиолами достоверно устраняли цитотоксический эффект сочетаний (Рис.17) и морфологические признаки апоптоза, снижая фрагментацию ядер в 5-6 раз, практически до уровня контроля. Хелатор меди неокупроин (NC) в концентрациях до 10 мкМ не устранял гибели клеток, а при повышении концентрации оказывал собственное цитотоксическое действие (Рис.17). Важно отметить, что накопление Н202 в среде с сочетаниями тиол+В]2ъ устранялось каталазой и пируватом, но не PTL

и ЭТО (Рис.18). Опыты с хелаторами металлов указывают на то, что в инициации ( апоптоза окислительным стрессом, вызванным сочетаниями тиолов с витамином В]2ь, участвует внутриклеточное железо.

И'""'"'»! NAC+B]2b вшш dtt+b [ 2ь

OV0

<rtV

Рис.17. Влияние хелаторов железа DFO: (1мМ) и PTL (50мкМ) и хелатора меди-NC (ЮмкМ) на цитотоксическое действие тиолов GS1I (5мМ), NAC (5мМ), DTT (1мМ) в сочетании с витамином Bi2b (25 мкМ). Увеличение числа живых клеток в результате добавления к ним DFO и PTL достоверно, р<0.05.

Рис.18. Влияние каталазы (200 ед/мл), пирувата (10 мМ), и хелаторов железа PTL (30 мкМ) и DFO (0.3 мМ) на накопление перекиси водорода в культуральной среде к 30 мин при инкубации с GSH (5мМ) и NAC (5мМ), добавленных в бинарном сочетании с витамином В]2ь (25 мкМ) ■"-подавление антиоксидантами

аккумуляции перекиси водорода, обусловленной указанными

сочетаниями, достоверно, р< 0.05.

б) Кинетика накопления однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК.

Для выяснения механизма цитотоксического действия прооксидантных систем тиол+Впь мы оценивали ранние события в повреждении клеточных структур. В частности, исследовали кинетику накопления однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК во время действия бинарной системы тиол-витамин В12Ь методом комета тест.

Комета тест показал, что уже в первые 5 минут действия сочетания тиол+В12ь осуществляется быстрое накопление однонитевых разрывов и щелочно-лабильных сайтов в ДНК. В то время, как доля ДНК в хвосте комет контрольных клеток не превышала 5%, для большинства поврежденных клеток этот показатель был выше 50%. Повреждения ДНК, возникшие при инкубации клеток с бинарной системой тиол+В]2ь в течение 5 и 15 мин, эффективно репарировались после 4-ч инкубации клеток в ростовой среде без сочетания тиол+В12Ь. Повреждения ДНК после 30 и 60 мин экспозиции клеток с тиол+В^ь не элиминировались в ходе их последующей

инкубации в свежей ростовой среде без повреждающих агентов. Причиной этого могло быть развитие апоптотической программы, которая инициируется в первые 3060 мин действия сочетания тиол+В^ь- Повреждения ДНК предотвращались, если в инкубационную среду добавляли 1 мМ хелатора железа БРО за 1 час до внесения пар тиол+В,2Ь (Рис.19).

С8Н+В|2Ь

С5Н+В]2Ь + 4 часа репарации ОРО+ЫАС+В] 2Ь , 60 мин

0 5 30 60 120 DFO

Время воздействия, мин

Рис. 19. Кинетика накопления однонитевых разрывов ДНК после добавления 5мМ ОБИ и 25 мкМ витамина В|2Ь в культуру клеток НЕр-2. Отличие от данных для времени 0 (контроль) достоверны за исключением данных по репарации после 5 мин экспозиции с сочетанием, и результатов с добавлением ЭРО р<0.05

в) Оценка состояния митохондрий.

Анализ имеющихся в литературе данных указывает на участие митохондрий в инициации апоптотической гибели клеток [Бииап е1 а1.. 1996; Владимиров, 1998|. Мы решили на примере сочетания БТТ+В^ь изучить роль митохондрий в окислительном стрессе и в запуске гибели клеток по типу апоптоза по падению митохондриального потенциала (А*Рт) и по выходу цитохрома с из митохондрий. Как видно из Рис.20а, в первые 2 часа инкубации с бинарной системой ОТТ+В,2ь не происходит падения митохондриального потенциала. Изменения начинаются после 6 часов инкубации с сочетанием ОТТ+В^ь- Обработка клеток валиномицином в течение 1 ч, показала резкое падение митохондриального потенциала (положительный контроль).

Выход цитохрома с из митохондрий наблюдали только на длительных (2, 4 ч) временах инкубации клеток с парой ОТТ/Впь- Кратковременная экспозиция, в течение 30 мин, не приводила к выходу цитохрома с из митохондрий (Рис.206).

120 -

40 -

О I 2 4 6 16 Val Время инкубации с DTT+B ]2Ь (ч)

я)

Цитохром с (15 KDa)

Время, ч 0,5 2

Митохондриальная фракция

Цитозольная фракция

Рис.20. Изменение митохондриального потенциала по флуоресценции зонда .1С-1 (см. Материалы и методы) (а) и иммуноблот выхода цитохрома с из митохондрий (б) клеток НЕр-2 обработанных 1 мМ ОТТ в сочетании с 25 мкМ витамина В |2ь.

На основе этих данных можно сделать вывод, что на ранних этапах развития апоптоза, вызванного сочетанием DTT+B12b, запуск гибели происходит без открытия митохондриальных пор, а значит и без участия митохондрий Митохондрии повреждаются на более поздних этапах гибели клетки В то же время митохондрии участвуют в развитии апоптотической программы, на что указывает выход цитохрома с в цитозоль без повреждения митохондрий

г) Дестабилизация лизосом.

Из литературных источников известно, что повреждение лизосом во время ОС и выход из них лизосомального железа играет важную роль в реализации ответа клетки на повреждающее действие [Kurz et al, 2004] Мы оценивали влияние исследуемых прооксидантных систем на стабильность лизосомальных мембран, нарушение которой может указывать на выход лизосомального железа в цитозоль Для этого использовали известный факт локализации красителя акридинового оранжевого в лизосомах и выход красителя в цитозоль в результате дестабилизации их мембран с повышением люминесценции в зеленой области спектра [Kurz et al, 2004, 2006]

Повышение интенсивности зеленой флуоресценции, свидетельствующее о вытекании красителя из лизосом в цитозоль после обработки клеток парой тиол+В12ь, наблюдали уже в первые минуты после добавления веществ (Рис 21) Прединкубация (1ч) с хелатором железа DFO (1 мМ) не предотвращал дестабилизацию лизосомальных мембран, но достоверно устранял цитотоксический эффект сочетаний тиол+Впь Это показывает, что несмотря на то, что хелатор железа предотвращает цитотоксический эффект бинарных систем тиол/В]2Ь, он не защищает лизосомы от повреждающего действия прооксидантных систем тиол/В^ь, в результате чего происходит повреждение лизосомальных мембран и выход лизосомального железа в цитозоль Подавление цитотоксического эффекта в этом случае, по-видимому, связано с хелатированием вышедшего из лизосом железа в цитозоле По отдельности витамин В12Ь не вызывал такой дестабилизации, но NAC дестабилизировал лизосомы (Рис 21) Хелатор внутриклеточного железа DFO защищал лизосомы от действия NAC Действие NAC обусловлено, вероятнее всего, его способностью свободно проникать в клетки, в лизосомы и вступать в реакцию с лизосомальным железом, что сопровождается образованием активных форм кислорода и может быть причиной дестабилизации лизосом Учитывая этот результат можно предположить, что сочетание NAC+B]2b вызывало дестабилизацию лизосом, не только за счет генерации перекиси водорода в среде, но и за счет самого NAC В результате, эффект дестабилизации сочетанием NAC+Bi2b был сильнее, чем NAC отдельно, и не ингибировался DFO

В целом, можно сделать вывод, что системы тиол+В12ь вызывают дестабилизацию лизосомальных мембран, что указывает на выход лизосомального железа в цитозоль

• N\C+I)i2b

v NAC

. DrO-NAC->Bi2b a DPONAC

P»c21 Вытекание красшеля акридин оранжевого из лизосом в результате инкубации с сочетанием 5мМ NAC+25 мкМ Виы указывающее на дестабилизацию лизосомальных мембран Дестабилизацию оценивали по увеличению интенсивности фчуоресценщш (Ех 485нм/Ет 530нм) прикрепленных клеток, окрашенных акридин оранжевым, испочьзуя планшетный спектрофлуориметр Tecan DFO добавляли за 1 л до NAC и Bl2b

О А

Ж С

а о s

Ж ,0

н ж К

О 10 20 30 40 60 60

Время инкубации, мин

д) Оценка гидроперекисей липидов

При превышении физиологического уровня интенсивности ПОЛ происходит повреждение морфофункцисшального состояния мембран и разнообразные нарушения внутриклеточного обмена Одним из результатов длительного неконтролируемого повышения уровня ПОЛ является запуск механизмов апоитоза Мы решили оценить, в какой степени бинарная каталитическая система тио1+В)2ь приводит к интенсификации процессов ПОЛ

Увеличение количества перекисей липидов в клетке было обнаружено уже после 10 мин их инкубации с сочетанием NAC+B12b Наиботыиее количество перекисей чипидов обнаружили после 30 мин инкубации В дальнейшем наблюдалось их уменьшение, хотя концентрация перекиси водорода в среде, генерируемой сочетанием NAC+Впь, оставалось на достаточно высоком уровне (около 30 мкМ) в течение нескольких часов Сама перекись водорода (100 мкМ), а также известный генератор перекиси водорода и гидроксил радикалов, сочетание аскорбата с сернокислым железом, взятые в качестве положительного контроля, также вызывали активацию ПОЛ в клетках (Рис 22) Хелатор железа DFO предотвращал ПОЛ, индуцированный сочетанием NAC+B12b Необходимо отметить, что сам NAC также вызывал увеличение липидных перекисей в клетке при инкубации клеток с ним в течение 30 мин Это мопо быть обусловлено его свободным проникновением в цитозоль, в лизосомы с последующим восстановлением лизосомального железа и дестабилизацией лизосомальных мембран, что согласуется с представленными выше данными DFO, добавленный к паре NAC+BI2b, подавлял ПОЛ не полностью, а именно до этих же значений, эффективно предотвращая цитотоксичность сочетания NAC+Bi2b Удивление вызывает снижение ПОЛ до нетоксичного уровня после 4 часов инкубации с сочетанием NAC+Bi2b, то есть в ходе реализации апоптотической программы Возможно, это связано с активацией удаления липидных перекисей в это время (адаптационный ответ), чтобы не допустить быстрого нарушения проницаемости плазматической мембраны клетки, то есть ее некротической гибели

п.

Рис. 22. Образование липидных перекисей в клетках НЕр-2 во время их инкубации с сочетанием 5мМ КАС+25 мкМ Виъ, В качестве положительного контроля приведены результаты обработки клеток в течение 30 мин с 100 мкМ Н2Оо и 60 мин с 0,1 мМ БеЗО., в сочетании с 2мМ витамина С. Во всех случаях отличие от контроля (уровень перекисей липидов в необработанных клетках, время - 0 часов) достоверно, р<0.05.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Комбинация витамина В12ь с тиолами образует бинарную каталитическую систему, генерирующую активные формы кислорода, о чем свидетельствуют наши данные о восстановлении кислорода и генерации перекиси водорода. Цепь каталитических реакций может быть представлена аналогично таковой для сочетания аскорбата с витамином В12ь [Вольпин и др., 1998].

2Вi2b(Co3+) + 2RSH -> 2 Bi2b(Co2+)+ 2Н* + RSSR (1)

2B,2b(Co3V HSRSH -» 2B12b(Co2+)+ 2Н+ + RSS (2)

В1гь(Со2+) + О, -» В12Ь(Со3+) + 02" (3)

В12Ь(Со2+)+ 02" + 2Н+ В,2ь(Со,+)+ Н,02 (4)

В12Ь(Со2+) + Н202 В]2(Со3+) + ОН" + ОН (5)

На первом этапе тиолы, содержащие 1 тиольную группу (GSH, NAC) (реакция 1) или 2 тиольные группы (DTT) (реакция 2) восстанавливают Со'+ в составе витамина Впь- Восстановленный кобальт восстанавливает кислород до супероксид аниона (реакция 3) и затем до перекиси водорода (4) и наконец, до высокореакционного гидроксил радикала (реакция Фентон, 5). По-видимому, в целом эта схема правильно отражает набор реакций, однако наши данные указывают на то, что детальный ход реакций гораздо сложнее. Об этом говорит и прекращение увеличения концентрации перекиси водорода, сочетаниями NAC+B12b и GSH+B12b после достижения 30-40 мкМ. На это указывает тог факт, что бинарная система DTT+Bi2b генерирует гидроксил радикал (реакция 5), а в системах GSH+ В|2Ь и NAC+ В!2ьтак°й генерации не обнаруживается. Все это указывает на сложный характер влияния перекиси водорода, тиолов, промежуточных состояний их взаимодействия с кобальто.м витамина B[2b на ход указанных реакций. Непонятно, почему монотиолы (GSH, NAC) в комбинации витамином В121> обеспечивают длительную генерацию перекиси водорода с умеренной активностью, a DTT, содержащий две тиоловые группы, подобно аскорбату, также имеющий две восстановительные группы, вызывают

NAC+Bi-n,

10 30 60 240 30 30 30 60 30

Время воздействия, мин

взрывной кататиз тирании перекиси ьодорода По-видимому, в каждом конкретном случае, с каждым конкретным веществом могут бънь свои особенности химических реакций

Механизм инициации цишюксического действия бинарных систем тиол+витамин В^ь сопаспо по 1ученным результатам может быть описан следующей схемой (Рис 23)

Рис 23 Механизм инициации апоптотической гибели клеток сочетаниями тиол + В12ы

В первые 5-10 мин действия сочетаний тиол+витамин В12Ь происходит быстрое накопление перекиси водорода в среде до 250 мкМ (DTT-B^h) и 30- 40 мкМ (для пар GSH+B!2b, NAC4B12b) В первый час окислительно-восстановительная система клетки остается неповрежденной, но она не справляется с потоком экзогенной перекиси, в результате чего в клетке наблюдается окислительный стресс Перекись водорода, проникшая в клетку, вызывает дестабилизацию лизосом, выход лизосомального железа в цитозоль, где оно может восстанавливаться такими восстановителями как внутриклеточный глутатион, и катализировать восстановтение перекиси водорода до гидроксидьного радикала [Halliwell, Gurtendge, 1986, Held, Biaglow, 1994, Yang et al, 2000, Köllen, Nyska, 2002] вблизи ДНК, вызывая ее повреждение, и клеточных мембран, что приводит к возрастанию ПОЛ Окислительный стресс, дестабилииция лизосом, а также зависимые от внутриклеточного железа повреждение ДНК и возрастание ПОЛ начинают развиваться с первых минут действия бинарных систем тиол+В12ь По всей видимости, именно повреждение ДНК и возрастание ПОЛ являются главными причинами инициации апоптоза, поскольку хелаторы железа ингибируют эти процессы (но не окистигетшын стресс в среде и в клетках, вызванный сочет'иямз!

ллоптоз

тиол/В]2ь) и предотвращают клеточную гибель Повреждение митохондрий, как и выход цитохрома с из них, наблюдаются гораздо позже инициации апоптоза, и не могут рассматриваться ключевыми событиями инициации апоптоза системами тиол+Впь Эти процессы в нашем случае характерны для стадии реализации апоптотической программы

Разные бинарные системы могут иметь свои особенности в путях инициации апоптоза, как и в генерации АФК. Например, система NAC+Bi:b может вызывать дестабилизацию лизосом и выход железа из них в цитозоль не только за счет экзогенной перекиси водорода, но и за счет самого NAC Однако определяющим в циготоксическом действии этих сочетаний является действие экзогенной перекиси водорода, которая генерируется либо взрывным образом, как в бинарной системе DTT+B[2b, либо поддерживается на не очень высоком уровне, но длительное время («медленное горение», системы NAC+B]2 и GSH+B12)

ВЫВОДЫ

1 Обнаружен синергизм цитотоксического действия тиолов GSH, NAC и DTT в бинарных сочетаниях с витамином В12Ь Витамин В12Ь многократно, до 100 раз, усиливает цитотоксичность тиолов

2 Время инициации гибели клеток сочетаниями NAC+B12b и GSH+Bi2b и DTT+B]2b составляет 30-60 мин

3 Витамин В12Ь катализирует восстановление кислорода и генерацию перекиси водорода во внеклеточной среде в сочетаниях NAC+Вш,, GSH+Bi2b и DTT+Bi2b Сочетание DTT+B12b генерирует гидроксил радикал Не обнаружена генерация гидроксил радикала системами NAC+Впь и GSH+Bi2b

4 Внеклеточная перекись водорода, генерируемая сочетаниями тиол+В12Ь, вызывает внутриклеточный окислительный стресс

5 Подавление аккумуляции перекиси водорода в среде антиоксидантами каталазой и пируватом предотвращает токсичность бинарных систем тиол +В]2Ь

6 Сочетания тиол+В12Ь, во время инициации гибели клеток, вызывают дестабилизацию лизосом, повреждение ДНК и перекисное окисление липидов, но не повреждение митохондрий

7 Хелаторы железа предотвращают повреждение ДНК, ПОЛ и апоптотическую гибель клеток, но не предотвращают окислительный стресс и дестабилизацию лизосом, вызванные бинарными системами тиол+В|2Ь

8 На основе полученных результатов сформулировано представ пение о механизме цитотоксического действия бинарных каталитических систем генерации АФК тиол+В)2Ь Ключевыми моментами в механизме инициации апоптотической гибели клеток сочетаниями тиол+В^ь являются генерация ими перекиси водорода, ее проникновение в клетку, дестабилизация лизосом, выход лизосомального железа в цитозоль, образование гидроксильного радикала в результате взаимодействия перекиси водорода с восстановленным железом в клетке, повреждение ДНК, усиление ПОЛ и инициация апоптоза

Список работ, опубликованных по теме диссертации Ci.iibii

1 Соловьева M Ii, Соловьев В В , Фасхутднновл А А , Кудрявцев А А , Акатов В С Прооксидантное и цитотоксическое действие тиолов и витамина Впь Докл Акад Наук 2005 404(5) 704-706

2 Соловьева M Е , Соловьев В В , Фасхутдинова А.А , Кудрявцев А А , Акатов В С Исследование прооксидантного и цитотоксического действия тиоюв NAC и GSH в сочетании с витамином В1:ь Цитология, 2007, № 1, 7078

3 Фасхутдинова А А , Акатов В С , Соловьева M Е , Соловьев В С , Чаилахян Л M Механизм цитотоксического действия ацетичцииеина в сочетании с витамином В12ь Докл Акад Наук 2008 422(4) (в печати)

Тезисы конференций

1 Фасхутдинова А.А, Сотовьева M Е, Соловьев В В, Акатов В С Исследование механизмов инициации апоптотической гибели опухолевых клеток, вызываемой сочетанием тиолов-антиоксидангов и витамина В12ь Тезисы 9-й международной Пущинской школы конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» Пущино, Россия, 2005, стр 99

2 Фасхутдинова A.A. Прооксидантное и цитотоксическое действие антиоксиданга глутатиона в комбинации с витамином Впь Тезисы докладов XIII международной конференции студентов, аспирантов и мотодых ученых «Ломоносов-2006», секция «Биология», Москва, Россия, 2006 стр 231

3 Фасхутдинова А.А, Соловьева M Е, Соловьев В В, Акатов В С Прооксидантныи эффект тиолов и аскорбиновой кислоты в сочетании с гидроксикобаламином Тезисы докладов всероссийской конференции молодых ученых и II школы им Академика II M Эммануэля «Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты» Москва, Россия, 2006 стр 199

4 Соловьева M Е, Фасхутдинова А.А , Соловьев В В, Кудрявцев А А , Акатов В С Прооксидантное и цитотоксическое действие тиолов в сочетании с витамином Bi2b Тезисы докладов и сообщений всероссийского симпозиума «Биология клетки в культуре» Санкт-Петербург, Россия Цитология, 2006 Том 48, стр 801

5 Фасхутдинова А А. Сочетание антиоксидантов-тиолов с витамином В]2ь индуцирует апоптоз в клетках HL-60 Тезисы докладов XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоноеов-2007», секция «Биология», Москва, Россия, 2007 стр 151

6 Фасхутдинова A.A. N-ацетилцистеин является прооксидантом в сочетании с витамином В]2ь Тезисы докладов XV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», секция «Биология», 8-11 апреля, Москва, Россия, 2008 стр 247

7 Фасхутдинова A.A., Акатов В С Механизм цитотоксического действия тиолов N-ацетилцистеина и глутатиона в сочетании с витамином В,21, Тезисы докладов всероссийской конференции молодых ученых и III школы им Академика H M Эммануэтя «Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты» Москва, Россия, 2008 (в печати)

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (грант 04-04-97285)

Список используемых сокращений

ОБН-восстановченный глутатион, МАС-1М-ацетилцистеин, ОТТ-дитиотрейгол, АФК-активные формы кислорода, ОС-окислительный стресс, ПОЛ-перекисное окисление липидов, АО-антиоксиданты, Е1Вг-этидиум бромид, ББО-дефероксамин мезилат, РТЬ-фенантролин, ЖГ-неокупроин, БСНРОА-

2',7'дихлородигидрофлуоресцеин диацетат, ССС-кумарин-З-карбоновая кислота, РВБ-фосфатный буфер, Д*Рт-митохондриальный потенциал

Подписано в печать 29 08 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 671 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фасхутдинова, Алсу Амировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Окислительный стресс.

1.2. Виды клеточной гибели при окислительном стрессе.

1.3 .Окислительный стресс как индуктор апоптоза.

1.4. Антиоксиданты и прооксиданты.

1.5. Значение ионов металлов с переменой валентностью в образовании и метаболизме АФК.

1.6. Бинарные каталитические системы генерации АФК на основе сочетаний АО и металлов переменной валентности.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы.

2.2. Клеточные культуры.

2.3. Оценка цитотоксичности.

2.4. Морфологический люминесцентный анализ апоптоза.

2.5. Анализ апоптоза методом проточной цитометрии.

2.6. ДНК электрофорез (межнуклеосомная фрагментация).

2.7. Оценка каспазной активности.

2.8. Анализ содержания перекиси в среде с помощью кислородного электрода.

2.9 Анализ генерации гидроксильных радикалов.

2.10 Оценка внутриклеточной окислительной активности.

2.11 Анализ однонитевых разрывов ДНК (комета тест).

2.12 Определение мембранного потенциала митохондрий.

2.13 Выход цитохрома с из митохондрий/Иммуноблоттинг.

2.14 Определение стабильности лизосомальных мембран.

2.15 Анализ перекисей липидов клеточных мембран

2.16 Статистический анализ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Синергизм цитотоксического эффекта тиолов в сочетаниях с витамином В]2ь на опухолевые клетки in vitro. а) Ингибирование пролиферации и гибель клеток НЕр-2, HL-60 и ЗТЗ в зависимости от концентрации тиолов при их раздельном и сочетанном применении с витамином Bi2b. б) Изучение кинетики клеточной гибели, индуцированной сочетаниями тиолов с витамином В]2ь. в) Зависимость цитотоксического действия тиолов в сочетании с витамином В]2ь от посевной концентрации клеток НЕр-2. г) Зависимость гибели клеток под действием тиолов в сочетании с витамином В]2ь от времени инкубации.

3.2. Изучение типа гибели клеток, индуцируемой действием витамина Bi2b в сочетании с тиолами. а) Морфологичский анализ апоптоза. Увеличение доли апоптотических и погибших клеток. б) Оценка апоптоза по присутствию частиц в суб-Gi области на ДНК цитограммах. в) Межнуклеосомная фрагментация ДНК. г) Определение активности каспазы 3.

3.3. Исследование прооксидантного эффекта сочетаний тиолов с витамином В]2ь и установление роли активных форм кислорода в цитотоксическом действии этих сочетаний. а) Генерация Н2О2 в ростовой среде тиолами в сочетании с витамином Bi2b. б) Генерация гидроксил радикала. в) Внутриклеточная окислительная активность. г) Влияние нетиоловых антиоксидантов на цитотоксическое действие тиолов в сочетании с витамином В^ь.

3.4. Выяснение механизма клеточной гибели сочетаниями тиолов с В^ьа) Действие хелаторов железа. б)Кинетика накопления однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК. в) Оценка состояния митохондрий. г) Дестабилизация лизосом. д) Оценка гидроперекисей липидов.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Прооксидантное и цитотоксическое действие тиолов в комбинации с витаминами B126 на опухолевые клетки in vitro"

- Тиол-содержащим соединениям принадлежит ведущая роль в защите белков клетки от окислительного стресса, в восстановлении их дисульфидных групп и при изучении свойств белковых молекул. На основе тиоловых соединений создан целый ряд синтетических антиоксидантов, снижающих клеточные повреждения, радиопротекторов, лекарственных препаратов. Тиолы широко применяются в медицине при исследовании и устранении пневмотоксичности, в лечении ревматоидного артрита, передозировки ацетаминофена. Вместе с этим, тиолы в концентрациях, обычно применяемых для защиты клеток от окислительного стресса, могут давать и неожиданный повреждающий эффект [Munday, 1989; Held et al., 1996; Tartier et al., 2000; Qanungo et al., 2004]. Это обусловлено их двойственной природой, в частности, способностью дитиотреитола (DTT) [Spear, Aust, 1998; Taatjes et al., 1997], N-ацетилцистеина (NAC) и глутатиона (GSH) [Held, Biaglow, 1994; Kwak et al., 1995; Held et al., 1996; Chan et al., 2001; Thibodeau et al., 2001; Sagrista et al., 2002, Borisenko et al, 2004; Farombi et al., 2004], цистеина [Yang et al., 2000], цистеамина и других низкомолекулярных тиолов [Jeitner et al., 1998] генерировать активные формы кислорода (АФК) в реакции с ионами переходных металлов (Fe, Си), либо с другими радикалами и самим становиться тиильными радикалами, что в итоге ведет к повреждению ДНК и других биомолекул [Long, Halliwell, 2001]. Аналогично этому окислительный стресс и цитотоксическое действие вызывают сочетания витаминов С и В^ь [Акатов с соавт., 2000, Akatov et al., 2000], или витамина С с фталоцианинами кобальта [Акатов с соавт., 2001], которые в последние годы внедряются в онкологию как противоопухолевые препараты [Вольпин с соавт., 1998], а также витамина С с менадионом [Jamison et al., 2004]. Недавно мы обнаружили усиление прооксидантного действия сочетания витаминов С и В^ь добавлением дитиотреитола [Соловьева и др., 2005] и предположили, что в комбинации с Со , входящим в состав витамина В^ь, тиолы, как и аскорбиновая кислота [Akatov et al., 2000], способны выступать в качестве прооксиданта. Антиоксиданты, и в том числе тиолы, зачастую используются в медицине одновременно с витаминными препаратами, в частности с В^ь- Как подчеркивают некоторые авторы, в антиоксидантной терапии нередко не учитывается сопутствующее поступление соединений прооксидантного действия, что может привести к понижению её эффективности и даже к повреждающему воздействию на клетки и ткани организма [Бобырев и др., 1994]. С другой стороны, цитотоксический эффект сочетания тиолов с витамином Bi2b может быть взят за основу при разработке новых лекарственных (противоопухолевых) средств. Поэтому изучёние воздействия на клетки витамина Bi2b в сочетании с тиол-содержащими агентами является актуальным.

Целью данной работы было исследование прооксидантного и цитотоксического эффекта тиолов в сочетании с витамином Виь на опухолевые клетки in vitro.

В соответствии с целью были поставлены основные задачи:

1. Изучение цитотоксического эффекта тиолов в сочетании с витамином Bi2b на опухолевые клетки in vitro.

2. Изучение типа гибели клеток, индуцируемой действием витамина В^ь в сочетании с тиолами.

3. Исследование прооксидантного эффекта сочетаний тиолов с Bi2b и установление роли активных форм кислорода в цитотоксическом действии этих сочетаний.

4. Выяснение механизма клеточной гибели.

Научная новизна.

Впервые показано, что антиоксиданты тиолы в сочетании с витамином Впь образуют прооксидантные системы и вызывают гибель клеток. Синергизм цитотоксического действия тиолов в сочетании с витамином Впь выявляется при таких концентрациях веществ, при которых они в отдельности нетоксичны. Установлено, что цитотоксическое действие системы тиол+В^ь обусловлено генерацией и . накоплениием перекиси водорода во внеклеточной среде, что вызывает внутриклеточный окислительный стресс и повреждение окислительно-восстановительной системы клеток. Обнаружено, что система тиол+В^ь оказывает генотоксическое действие на опухолевые клетки и индуцирует апоптоз в клетках НЕр-2, HL-60 и NIH ЗТЗ. Установлено, что гибель клеток осуществляется при участии внутриклеточного железа. Обнаружено, что ранними событиями в клетках в результате повреждающего действия тиолов в сочетании с витамином Bi2b являются дестабилизация лизосом, однонитевые разрывы ДНК и перекисное окисление липидов клеточных мембран.

Практическая ценность работы.

Данное исследование представляет практический интерес для онкологии и фармакологии, а также для корректного использования витаминных и антиоксидантных препаратов в медицине. Работа вносит вклад в развитие представлений о молекулярных и клеточных механизмах цитотоксического действия новых прооксидантных систем.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Фасхутдинова, Алсу Амировна

выводы

1. Обнаружен синергизм цитотоксического действия тиолов GSH, NAC и DTT в бинарных сочетаниях с витамином В^ь- Витамин Bi2b многократно, до 100 раз, усиливает цитотокеичность тиолов.

2. Время инициации гибели клеток сочетаниями NAC+B^'b и GSH+B^b и DTT+B]2b составляет 30-60 мин.

3. Витамин В 12ь катализирует восстановление кислорода и генерацию перекиси водорода во внеклеточной среде в сочетаниях NAC+B^b, GSH+B]2b и DTT+B]2b- Сочетание DTT+B]2b генерирует гидроксил радикал. Не обнаружена генерация гидроксил радикала системами NAC+Bi2b и GSH+Bi2b

4. Внеклеточная перекись водорода, генерируемая сочетаниям тиол+В]2ь вызывает внутриклеточный окислительный стресс.

5. Подавление аккумуляции перекиси водорода в среде антиоксидантами каталазой и пируватом предотвращает токсичность бинарных систем тиол +b]2bj

6. Сочетания тиол+В^ь, во время инициации гибели клеток, вызывают дестабилизацию лизосом, повреждение ДНК и перекисное окисление липидов, но не повреждение митохондрий.

7. Хелаторы железа предотвращают повреждение ДНК, ПОЛ и апоптотическую гибель клеток, но не предотвращают окислительный стресс и дестабилизацию лизосом, вызванные бинарными системами ТИ0Л+В]2Ь

8. На основе полученных результатов сформулировано представление о механизме цитотоксического действия бинарных каталитических систем генерации АФК тиол+В]2ь- Ключевыми моментами в механизме инициации апоптотической гибели клеток сочетаниями тиол/В^ь являются генерация перекиси водорода бинарными системами тиол+В^ы ее проникновение в клетку, дестабилизация лизосом, выход лизосомально^ железа в цитозоль, образование гидроксил радикала, в результате взаимодействия перекиси водорода с восстановленным железом, повреждение ДНК, усиление ПОЛ и инициация апоптоза. г

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фасхутдинова, Алсу Амировна, Пущино

1. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокислительные вещества. М.: Наука. 1985. 150 с.

2. Андреева Л.И., Иванова Л.И., Титова М.В., Петрова B.C. Биохимические механизмы апоптоза. Программированная клеточная гибель. СПб.: Наука. 1996. с. 51-71.

3. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма. Методические рекоменднации. СПб.: Фолиант. 2000. 104 с.

4. Барышникова А.Ю., Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза. М.: Эдиториал УРСС. 2002. 320 е.I

5. Борисенкова С.А., Гиренко Е.Г., Калия O.JI. Механизмы окисления аскорбиновой кислоты и проблемы каталитической (темновой) терапии рака. Российск. химич. жури. 1998. Т. 42, № 5, с. 111-115.

6. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.Н. Свободные радикалы в живых системах. Биофизика. Итоги науки и техники. М.: ВИНИТИ, 1991. Т. 29, с. 1-252.

7. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты. Всстн. РАМН. 1998. №7, с. 43-51.

8. Вольпин М.Е., Крайнова Н.Ю., Левитин И.Я., Митяева З.Я.,I

9. Новодарова Г.Н., Оганезов В.К., Панкратов А.А., Чиссов В.И., Якубовская Р.И. Соединения ряда Вп в сочетании с аскорбиновой кислотой как потенциальные противоопухолевые агенты. Российск. химич. журн. 1998. 42(5): 116-127.

10. Гамалей И.А., Клюбин И.В. Перекись водорода как сигнальная молекула. Цитология. 1996. Т. 38, № 12, с. 1233-1247.

11. Голубев В.Л., Левин Я.И., Вейн A.M. Апоптоз программированная смерть клеток. М.: «Медпресс». 2000. 180 с.

12. Еропкин М.Ю., Еропкина Е.М. Культуры клеток как модельнаяiсистема исследования токсичности и скрининга цитопротекторных препаратов. СПб.: МОРСАР АВ, 2003. 240 с.

13. Зайцев В.Г., Островский О.В., Закревский В.И. Связь между химическим строением и мишенью действия как основа классификацииантиоксидантов прямого действия. Эксперим. клин, фармакол. 2003. Т.66, № 4, с. 66-70.

14. Залесский В.Н., Гавриленко Т.Д., Фильченков А.А. Апоптоз при ишемии — реперфузии миокарда. Врач. дело. 2002. №1, с. 8-15.

15. Залесский В.Н., Великая Н.В. Механизмы цитотоксических эффектов активных молекул кислорода и развитие апоптоза. Соврем, пробл. токсикол. 2003. № 1, с. 42-53.

16. Зенков Н.К., Панкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты. М.: МАИК «Наука/Интерпериодика". 2001. 343 с.I

17. Кокряков В.Н. Биохимические основы антимикробной активности нейтрофильных гранулоцитов. Л.: ИЭМ. 1988. с. 12-51.

18. Коршунов A.M., Преображенская И.С. Виды смерти клеток -Программированная смерть клеток Апоптоз. Неврологический журнал. 1998. №1, с. 40-47.

19. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: Ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза. Биохимия. 2000. Т. 65, № 1, с. 5-33.

20. Костина Е.М., Крылова Н.Ю. Лечение дисциркуляторных расстройств различного генеза. Гедеон Рихтер в СНГ. Научно-информационный медицинский журнал. 2002. № 4(12).

21. Лушников У.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). М.: Медицина. 2001. 192 с.

22. Новикова B.C. Программированная клеточная гибель. СПб: Наука. 1996. 276 с.

23. Овчинников Ю.А. Биорганическая химия. М.: Просвещение. 1987. 815 с.

24. Осипов А. Н., Азизова О. А., Владимиров Ю. А. Активные формы кислорода и их роль в организме. Успехи биол. химии. 1990. Т. 31, с. 180208.

25. Рыжов С.В., Новиков В.В. Молекулярные механизмы1апоптотических процессов. Рос. Биотерапевт. Журн. 2002. Т. 1, № 3, с. 733.

26. Сафронов Г.А., Пшенкина Н.Н., Ивницкий Ю.Ю., Панина Е.В. Возможные пути влияния химических агентов и ионизирующих излучений на процессы апоптоза. Программированная клеточная гибель. СПб.: Наука. 1996. с. 209-216.

27. Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло. Соросовский образовательный журнал. 1996. №3, с. 4-10.

28. Скулачев В.П. Феноптоз: запрограммированная смерть организма. Биохимия. 1999. Т. 64, №12, с. 1679-1688. |

29. Скулачев В.П. Явления запрограмированной смерти. Митохондрии,клетки и органы: роль активных форм кислорода. Соросовскийtобразовательный журнал. 2001. Том 7, № 6, с. 4-10.

30. Соловьева М.Е., Акатов B.C., Лещенко В.В., Кудрявцев А.А. Механизм гибели клеток миеломы NS/0 в культуре. Изв. Акад. Наук, сер. биол. 1998. №2, с. 194-199.

31. Соловьева М.Е., Соловьев В.В., Фасхутдинова А.А., Кудрявцев А.А., Акатов B.C. Прооксидантное и цитотоксическое действие тиолов и витамина В,2ь- Докл. Акад. Наук. 2005. 404(5):704-706.

32. Тронов В.А. Репарация ДНК и апоптоз. Цитология. 1999. 41(5): 405411.

33. Фильченков А.А., Завелевич М.Н., Бутенко З.А. Индукция апоптоза в злокачественных лимфоидных клетках человека ДНК-повреждающими препаратами с различным механизмом действия. Эксперементальная онкология. 2001. № 23, с. 170-174.

34. Фильченков А.А. Каспазы: регуляторы апоптоза и других функций. Биохимия. 2003. 68(4): 453-466.

35. Якутова Э.Ш., Осипов А.Н., Костенко О.В. Взаимодействие гипохлорита с оксигемоглобином приводит к освобождению железа в каталитически активной форме. Биофизика. 1992. 37(6): 1021-1028.

36. Adamson I.Y.R. Sienko A., Tehenbein М. Pulmonary toxicity of deferoxamine in iron-poisoned mice. Toxicol, and Appl. Pharmacol. 1993. Vol. 120, p. 13-19. '

37. Ahammadsahib K.I., Jinna, R.R., Desaiah D. Protection against cadmium toxicity and enzyme inhibition by dithiothreitol. Cell. Biochem. Funct. 1989. Vol. 7, p. 185-192.

38. Akatov V.S., Solov'eva M.E., Leshchenko V.V., Teplova V.V. Oxidativestress in HEp-2 human laryngeal carcinoma cells induced by combination ofvitamins Bi2b and C. Bull Exp Biol Med. 2003. Vol. 136(3), p. 279-82.

39. Akgun E. Caliskan C., Celik H.A., Ozutemiz A.O., Tuncyurek M., Aydin H.H. Effects of N-acetylcysteine treatment on oxidative stress in acetic acid-induced experimental colitis in rats. J. Int. Med. Res. 2005. Vol. 33(2), p. 196206.

40. Antunes, F., Cadenas, E., Brunk, U.T. Biochem. J. 2001. Vol. 356, p. 549-555.

41. Arends M.Y., Morris R.G., Wyllie A.N. Apoptosis: The role of endonuclease. Am. J. Pathol. 1990. Vol. 136, 593 p.

42. Ashkenazi A., Dixit V.M. Death receptors: Signaling and modulations. Science. 1998. Vol. 281, p. 1305-1308.

43. Auroma O.I. Characterization of drugs as antioxidant prophylactics. Free Radic.Biol.Med. 1996. Vol. 20, p. 675-705.

44. Auroma О. I. Free radicals, oxidative stress and antioxidants in human health and disease. JAOCS. 1998. Vol. 75(2), p. 199-212.

45. Balla G., Jacob H.S. Ferritin-a cytoprotective antioxidant strategem of endothelium. J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267, p. 18148-18153.

46. Bast A., Haenen G.R.M.M., Doelman C.J.A. Oxidants and antioxidants: State of the art. Amer. J. Med. 1991. Vol. 91, p. 2S-13S.

47. Bates S., Vousden K.H. Mechanisms of p53-mediated apoptosis. Cell. Mol. Life Sci. 1999. Vol. 55, p. 28-37. (

48. Beeh K.M., Beier J., Koppenhoefer N., Buhl R.Increased. Glutathione disulfide and nitrosothiols in sputum supernatant of patients with stable COPD. Chest. 2004. Vol. 126(4), p. 1116-1122.

49. Bissonnette R.P., Echeverri F., Mahoubi A., Green D.R. Apoptotic cell death induced by c-myc is inhibited by bcl-2. Nature. 1992. Vol. 359, p. 552554.

50. Bono D.P., Yang W.D. Exprosure to loul concentrations of hydrogen peroxide cayses delayed endotnelial cell death and inhibits proliferation of surviving cells. Atherosclerosis. 1995. Vol. 114, p. 235-240.

51. Bortner C.D., Oldenberg N.B.E., Cidlowski J.A. The role of DNA fragmentation in apoptosis. Trends Cell Biol. 1995. Vol. 5., p. 21-26.

52. Brunk UT., Zhang H., Dalen H., Ollinger K. Exposure of cclls to nonlethal concentrations of hydrogen peroxide induces degeneration-repair mechanisms involving lysosomal destab'ilization. Free Radic Biol Med. 1995.I1. Vol. 19(6), p. 813-22.

53. Brunk U., Neuzil J., Eaton L. Lisosomal involvement in apoptosis. Redox. Rep. 2001. Vol. 6, p. 91-97.

54. Bryan S.E., Vizard D.L., Beary D.A. Partitioning of zinc and copper within subnuclear particles. Nucl. Acids Res. 1981. Vol. 9, p. 5811-5823.

55. Bustamante J., Slater A.F.G., Orrenius S. Antioxidant ingibition ofithymocyte apoptosis by dihydrolipoic acid. Free Radical Biology & Medicine. 1995. Vol. 19(3), p. 339-347.i

56. Byrnes R.W. Evidence for involvement of multiple ,iron species in DNA single-strand scission by H2O2 in HL-60 cells. Free Rad. Biol. Med. 1996. Vol. 20, p. 399-406.

57. Calderon P.В., Cadrobbi J., Marques C., Hong-Ngoc N., Jamison J.M., Gilloteaux J., Summers J.L., Taper H.S. Potential therapeutic application of the association of vitamins С and КЗ in cancer treatment. Curr Med Chem. 2002. Vol. 9(24), p. 2271-85.1

58. Carmody R.J., Cotter T.G. Signalling apoptosis a radical approach. Redox Rep. 2001. Vol. 6, p. 77-90.

59. Chan E.D., Riches D.W., White C.W. Redox paradox: effect of N-acetylcysteine and serum on oxidation reduction-sensitive mitogen-activated protein kinase signaling pathways. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 2001. Vol. 24 (5), p. 627-632.

60. Christensen J.G., Goldsworthy T.L., Cattley R.S. Dysregulation of apoptosis by c-myc in transgenic hepatocytes and effect of growth factors and nongenotoxic carcinogens. Mol. Carcinogen. 1999. Vol. 25, p. 273-284.

61. Cleland, W.W., Dithiothreitol, a new protective reagent for SH groups. Biochemistry. 1964. Vol. 3, p. 480-482.

62. Сое J.P., Rahman I., Sphyris N., Clarke A.N. Glutathion and p53 independently mediated responses against oxidative stress in cells. Free Radic Biol Med. 2002. Vol. 32(2), p. 187-96.

63. Coles H.S.R., Burne J.F., Raff M.C. Large-scale normal cell death in the developing rat kidney and its reduction by epidermal grwth factor. Development. 1993. Vol. 118, p. 777-784.

64. Conrad M.E., Umbreit J.H. Iron Absoiption and Transport. Am.J.Hematol. 2000. Vol. 64, p.287-298.

65. Dayuan G., Makoto H., Hiroyuki У., Hiromu S. Direct reaction between shikonin and thiols induces apoptosis in HL60 cells. Biol. Pharm. Bull. 2002. Vol 25(7), p. 827-832.

66. De Flora S., Izzotti A., DAgostini F. Balansky R. Mechanism of N-acetylcysteine in the prevention of DNA damage and cancer, with special reference to smoking-related end-points. Carcinogenesis. 2001. Vol. 22, p. 9991013.t

67. Doulias PT, Barbouti A, Galaris D, Ischiropoulos H. SIN-1-inducedj

68. DNA damage in isolated human peripheral blood lymphocytes as assessed by single cell gel electrophoresis (comct assay). Free Radic Biol Med. 2001. Vol. 30(6), p. 679-85.

69. Duke R.C., Cohen J.J. IL-2 addiction: Withdrawal of growth factor activates a suicide program in dependent T cells. Limphokine Res. 1986. Vol. 5, p. 289-294.

70. Eaton J.W. Catalases and peroxidases and glutathione and hydrogeniperoxide: Mysteries of the besiary. J. Lab. and Clin.Med. 1991. Vol. 118, p. 3-4.

71. Eisenstein R.S. Iron regulatory proteins and the molecular control of mammalian iron metabolism. Ann. Rev. l^utr. 2000. Vol. 20, p. 627-62.

72. Ercal N., Treeratphan P., Lutz P., Hammond T.C., Matthews R.H. N-acetylcysteine protects Chinese hamster ovary (CHO) cells from lead-indused oxidative stress. Toxicology. 1996. Vol. 108(1-2), p. 57-64.

73. Enokicdo Y., Araki Т., Tanaka K. Involvement of p53 in DNA strand break-induced apoptosis in postmitotic CNS neurons. Eur. J. Neurosci. 1996. Vol. 8(9), p. 1812-1821.

74. Farombi E.O., Moller P., Dragsted L.O. Ex-vivo and in vitro protective effects of kolaviron against oxygen-derived radical-induced DNA damage and oxidative stress in human lymphocytes and rat liver cells. Cell Biol. Toxicol. 2004. Vol. 20(2), p. 71-82.

75. Ferrari R., Ceconi C., Curello S. Oxygen free radicals and miocardial damage: Protective role of thiol-containing agents. Amer. J. Med. 1991. Vol. 91, p. 95-105.J

76. Flora S.J., Pande M., Kannan G.M., Mehta A. A lead induced oxidative stress and its recovery following co-administration of melatonin or N-acetylcysteine during chelation with succimer in male rats. Cell Mol Biol. 2004. Vol. 50, p. OL543-OL551.

77. Frank J., Giordano C. Oxygen, oxidative stress, hypoxia, and heart failure. J Clin Invest. 2005. Vol. 115(3), p. 500-508.

78. Freeman B.D. Biological sites and mechanisms of free radical production. Free Radicals Molecular Biology, Aging and Disease. N.Y.: Raven Press, 1984. P.43-52.i

79. Gamaley I.A., Klyubin I.V. Roles of reactive oxygen species: signaling and regulation of cellular function. Int. Rev. Cytol. 1999. Vol. 188, p. 203-255.

80. Girotti A.W. Lipid hydroperoxide generation, turnover and effector action in biological system. J. Lipid. Res. 1998. Vol. 39, p. 1529-1542.

81. Gilloteaux J., Jamison J.M., Arnold D., Taper H.S., Summers J.L.

82. Ultrastructural aspects of autoschizis: a,new cancer cell death induced by theisynergistic action of ascorbate/menadione on human bladder carcinoma cells. Ultrastruct Pathol. 2001. Vol. 25(3), p. 183-92.

83. Guerin J.C., Leophonte P., Lebas F.X., Terrioux P., Boulanger P. Oxidative stress in bronchpulmonary disease: contribution of N-acetylcysteine (NAC). Rev. Pneumol. Clin. 2005. Vol. 61(1), p. 16-21.г

84. Gutteridge J. M. C., Paterson S. K., Segal A. W., Halliwell B. Inhibition of lipid peroxidation by the iron-binding protein lactoferrin. Biochem. J. 1981. Vol. 99, p. 259-261.

85. Hale A.J., Smith C.A., Sutherland L.C. Apoptosis: Mol'ecilar regulation of cell death. Europ. J. Biochem. 1996. Vol. 236, p. 1-26.

86. Halliwell В., Gutteridge J. M. C. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease. Biochem J. 1984. Vol. 219, p. 1-14.

87. Halliwell В., Gutteridge J.M.C. Oxygen free radicals and an iron in relation to biology and medicine: some problems and concepts. Arch. Biochem. Biophys. 1986. Vol. 246, p. 501-514.

88. Halliwell В., Gutteridge J.M. Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an overview. Methods Enzymol. 1990. Vol. 186, p. 1-85.

89. Halliwell В., Gutteridge J.M., Crofes C.E. Free radicals, antioxidants andihuman disease: where are we now? J.Lab.Clin.Med. 1992. Vol. 119(6), p. 598620.

90. Halliwell В., Gutteridge J.M. Antioxidant defences. Free Radicals in Biology and Medicine. 3rd ed. Oxford: Clarendon Press; 1999. P. 105-245.

91. Hamada Т., Sasaguri Т., Tanimoto A. Apoptosis of human kidney 293 cells is promoted by polymerized cadmium-metallothionein. Biophysical Research Communications. 1996. Vol. 219(3), p. 829-34.

92. Harrison P.M., Banyard S.H., Hoare R.J., Russell S.M., Treffry A. The structure and function of ferritin. Ciba. Found. Symp. 1976. Vol. 7-9;(51), p. 19з

93. Healy A., Dempsey M., Lally C., Ryan M.P. Apoptosis and necrosis: Mechanisms of cell death induced by Cyclospoprine A in a renal proximal tubular cell line. Kidney International. 1998. Vol. 54, p. 1955-1966.

94. Held K.D., Biaglow J.E. Mechanisms for the oxygen radical-mediated toxicity of various thiol- containing compounds in cultured mammalian cells. Radiat. Res. 1994. Vol. 139 (1), p. 15-23/i

95. Held K.D., Sylvester F.C., Hopcia K.L., Biaglow J.E. Role of Fenton chemistry in thiol-induced toxicity and apoptosis. Radiat. Res. 1996. Vol. 145 (5), p. 542-553.

96. Henle E. S. Formation, prevention, and repair of DNA damage by iron/hydrogen peroxide. The Journal of Biological Chemistry. 1997. Vol. 272(31), p. 19095-19098.

97. Higuchi Y., Matsukawa S. Active oxygen mediated chromosomal 1-2 Mbp giant DNA fragmentatin into internucleosomal DNA fragmentation inapoptosis of glioma cells indused by glutamate. Free radical biology and<

98. Medicine. 1998. Vol. 24(3), p. 418-426. .

99. Honda K., Smith M.A., Zhu X. Ribosomal RNA in Alzheimer disease is oxidised by bound redox-active iron. J Biol Chem. 2005. Vol. 280, p. 20978-86.

100. Ни H., Moller G., Abedi-Valugerdi M. Thiol compounds inhibit mercury-induced immunological and immunopathological alterations in susceptible mice. Clin. Exp. Immunol. 1997. Vol. 107, p. 68-75.

101. James S.J., Melnyk S., New E., Pogribna M., Jernigan S. Thimerosal neurotoxicity is associated with glutathione depletion: protection with glutathione. Neurotoxicology. 2005. Vol. 26(1), p. 1-8.

102. Jamison J.M., Gilloteaux J., Nassiri M.R., Vcnugopal M., Neal D.R., Summers J.L. Cell cycle arrest and autoschizis in a human bladder carcinoma cell line following Vitamin С and Vitamin КЗ treatment. Biochem Pharmacol. 2004. Vol. 67(2), p. 337-351.

103. Jeitner T.M., Delikatny E.J., Bartier W.A., Capper H.R., Hunt N.H. Inhibition of drug-naive and -resistant leukemia cell proliferation by low molecular weight thiols. Biochem. Pharmacol. 1998. Vol. 55, p. 793-802.

104. Jendrossek V., Handrick R., Belka C. Celecoxib activates a novel mitochondrial apoptosis signaling pathway. FASEB. J. 2003. Vol. 17(11), p. 1547-1549.

105. Jones D.P., Brown L.A.S., Sternberg P. Variability in glutathione-dependent detoxication in vivo and its relevance to detoxication of chemical mixtures. Toxicology. 1995. Vol. 105(2-3), p. 267-274.t

106. Jonson R.J., Alpers C.E., Pruchno C., Schulze M, Baker P.J., Pritzl P., Couser W.G. Mechanisms and kinetics for platelet and neutrophil localization in immune complex nephritis. Kidney Int. 1989. Vol. 36, p. 780789.

107. Kachur A.V., Held D.K., Koch C.J., Biaglow E. Mechanizm of production of hydroxy 1 radicals in the copper-catalyzed oxidation of dithiothreitol. Radiat. Reseach. 1997. Vol. 147, p. 409-415.

108. Kehrer J.P. Cause-effect of oxidative stress and apoptosis. Teratology. 2000. Vol. 62, p. 235-246.

109. Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer. 1972. Vol. 26, p. 239-257.

110. Kim H.Y., Yokozawa Т., Cho E.J., Yamabe N. Protective effects of the Chinese prescription Hachimi-jio-gan against diabetic oxidative stress. Sheng Li Ke Jin Zhan. 2004. Vol. 56(10), p. 1299-1305.

111. Kohen R., Nyska A. Oxidation of biological systems: oxidative stressIphenomena, antioxidants, redox reactions, and methods for their quantification. Toxicologic Pathology. 2002. Vol. 30, p. 620 650.

112. Koksel О., Ozdulger A., Ercil M., Tamer L., Ercan В., Atik U., Cinel L.,

113. Cinel I., Kanik A. Effects of N-acetylcysteine on oxidant-antioxidant balance inioleic acid-induced lung inj'ury. Exp Lung Res. 2004. Vol. 30(6), p. 431-446.

114. Kondo, H., Iseki, Т., Goto, S., Ohto, M., Okuda, K. Effects of cobalamin, cobalamin analogues and cobalamin binding proteins on P388D. mouse leukemic cells in culture. Intern. J. Hemat. 1992. Vol. 56, p. 167-177.

115. Kotamraju S., Hogg N., Joseph J., Keefer L. Inhibition of oxidized low-density lipoprotein-induced apoptosis in endothelial cells by nitric oxide. J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, p. 17316-17323.

116. Koury M.J., Bondurant M.C. Eritropoetin retards DNA breakdown and prevents programmed death in eritroid progenitor cells. Science. 1990. Vol. 246, p. 378-380.

117. Kurz Т., Leake A., Von Zglinicki Т., Brunk UT. Relocalized redox-active lysosomal iron is an important mediator of oxidative-stress-induced DNA damage. Biochem J. 2004. Vol. 378, p.1039-1045.

118. Kurz Т., Gustafsson В., Brunk UT. Intralysosomal iron chelation protects against oxidative stress-induced cellular damage. FEBS J. 2006. Vol. 273(13), p. 3106-3117.

119. Kurz Т., Terman A., Gustafsson В., Brunk T. Lysosomes in iron metabolism, ageing and apoptosis. Histochem. Cell Biorn. 2008. Vol. 129, p. 389-406.

120. Kwak H.S., Yim H.S., Chock P.В., Yim M.B. Endogenous intracellular glutathionyl radicals are generated in neuroblastoma cells under hydrogen peroxide oxidative stress. Proc Natl Acad Sci USA. 1995. Vol. 92(10), p. 45824586.

121. Lazebnik Y.A., Kaufman., Desnoyers S. Cleaveage of poly(ADF-ribose) polymerase by proteinase with properties like ICE. Nature. 1994. Vol. 376, p. 346-347.

122. Li W., Dehnade F., Zafarullah M. Thiol antioxidant, N-acetylcysteine, activates extracellular signal-regulated kinase signalling pathway in articular chondrocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. Vol. 275, p. 789-794.

123. Lieberthal W., Levine S. Mechanisms of apoptosis and its potential role in renal tubular epithelial cell injui;. Am.J.Physiol. 1996. Vol. 271, p. F477-F488.

124. Liu J., Shen HM., Ong C.N. Role of intracellular thiol depletion, mitohondrial disfunction and reactive oxygen species in Salvia miltiorrhiza-induced apoptosis in human hepatoma HepG2 cells. Life Sci. 2001. Vol. 69(16), p. 1833-1850.

125. Long L.H., Halliwell B. Oxidation and generation of hydrogen peroxide by thiol compounds in commonly used cell culture media. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. Vol. 286, p. 991-994.

126. Loschen G., Azzi A., Richter C., Flohe L. Superoxide radicals as precursors of mitihondrial hydrogen peroxide. FEBS Lett. 1974. Vol. 42, p.68-72.

127. Majno G., Joris I. Apoptosis, oncosis, and necrosis: an overview of ccll death. Am. J. Pathol. 1995. Vol. 146, p. 3-15.

128. Makris A., Powles T.J., Dowsett M. P53 protein overexpression and chemosensitivity in breast canser. Lancet. 1995. Vol. 245, p. 1181-1182.

129. Manevich Y., Held K., Biaglow J. Coumarin-3-carb6xylic acid as detector for hydroxyl radicals generated chemically and by gamma radiation. Radiation res. 1997. Vol. 148, p. 580-591,.t

130. Maulik N., Yoshida Т., Das D.K. Oxidative stress developed during the reperfusion of ischemic myocardium induces apoptosis. Free Radic. Biol. Med. 1998. Vol. 24, p. 869-875.

131. Mercille, S., Massie, B. Induction of apoptosis in nutrient-deprived culture of hybridoma and myeloma cells. Biotech. Bioeng. 1994. Vol. 44, p. 1140-1154.

132. Morita A., Werfel Т., Stege H. Evidence that singlet oxygens induced human T-helper cell apoptosis is the basic mechanism of ultraviolet A radiation phototherapy. J. Exptl. Med. 1997. Vol. 186, p. 1763-1769.

133. Munday R. Toxicity of thiols and disulphides: involvement of free-radicals species. Free Radic. Biol. Med. 1989. Vol. 7, p. 659-673.

134. Murray D., Prager A., Vanankeren S.C., Altschuler E.M., Kerr M.S., Terry N.H., Milas L. Comparative effect of the thiols dithiothrcitol, cysteamine and WR-151326 on survival and on the induction of DNA damage in cultured

135. Chinese hamster ovary cells exposed to gamma-radiation. J Radiat Biol. 19901. Vol. 58(1), p. 71-91.

136. Nackerdien Z., Olinski R., Dizdaroglu M. DNA base damadge in chromatin of y-irradiation cultured human cells. Free Radical Res. Commun. 1992. Vol. 16, p. 259-273.

137. Nagata S. Apoptotic DNA fragmentation. Exp. Cell Res. 2000. Vol. 256, p. 12-18.

138. Namavati U.B., Pawliezak R., Doniger J. Oxidant-induced cell death inrespiratory epithelial cells is due to DNA damage and loss of ATP. Exp. Lung Res. 2002. Vol. 28(2), p. 591-607.

139. Narasimhan P., Fujimura M., NoshitaN. Role of superoxide in poly(ADPribose)polymerase upregulation after transient cerebral ischemia. Brain Res.

140. Mol. Brain Res. 2003. Vol. 113, p. 28-36.

141. Neal R., Matthews R.H., Lutz P., Ercal N. Antioksidant role of N-acetylcysteine isomers followong high dose irradiation. Free Radical Biology & Medicine. 2003. Vol. 34(6), p. 689-695.

142. Oliver F.J., Menissier-de Murcia J., Nacci C. Resistance to endotoxic shock as a consequence of defective NF-kappaB activation in poly(ADP-ribosc)polymerase-1 deficient mice. EMBO L. 1999. Vol. 18(16), p. 4446-4454.

143. Packham G., Bello-Fernandez C., Cleveland J.L. Position and orientation independent transactivation by c-Myc. Cell. Mol. Biol. Res. 1994. Vol. 40, p. 699-706. ,

144. Pantopoulos K., Mueller S., Atzberger A., Ansorgc W., Stremmel W.,

145. Hentze M.W. Differences in regulation of iron regulatory protein-1 (IRP-1) byiextra- and intracellular oxidative stress. J. Biol. Chem. 1997j Vol. 272,p. 98029808.

146. Pantopoulos K, Hentze MW. Activation of iron regulatory protein-1 by oxidative stress in vitro. Proc Natl Acad Sci USA. 1998. Vol. 95(18), p. 1055910563.

147. Persson HL., Yu Z., Tirosh O., Eaton JW., Brunk UT. Prevention of oxidant-induced cell death by lysosomotropic iron chelators. Free Radic Biol Med. 2003. Vol. 34(10), p. 1295-1305. 1

148. Pezzano H., Podo F. Structure of binary complexes of mono- and polynucleotides with metal ions of the first transition group. Chem. Rev. 1980. P. 787-791.

149. Pryor W.A. Oxy-radicals and related spesies: their formation, lifetimes and reactions. Annu. Rev. Physiol. 1986.,Vol. 48, p. 657-667.t

150. Puppo A., Halliwell B. Formation of hydroxyl radicals in biological systems. Does myoglobin stimulate hydroxyl radical formation from hydrogen peroxide? Free Radical Res. Commun. 1988. Vol. 4, p. 415-422.

151. Radi R., Beckman J.S., Bush K.M. Peroxynitrite-induced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide. Arch. Biochem. Biophys. 1991. Vol. 288(2), p. 481-487.

152. Raff M.C. Social controls on cell survival and cell death. Nature. 1992. Vol. 356, p. 397-400.

153. Ren J.-G., Xia H.-L., Just Т., ^ai Y.-R. Hydroxyl radical-induccd apoptosis in human tumor cells is associated with telomere' shortering but not telomerase inhibition and caspase activation. FEBS Lett. 2001. Vol. 488, p. 123-132.

154. Ribeiro M.G.L., Pedrenho A.R., Hasson-Voloch A. Electrocyte (Na+ K+)ATPase inhibition indused by zinc is reverted by dithiothreitol. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2002. Vol. 34(5), 516524.

155. Richard M.J. Micronutriments et radicaux libres. Alcoologie. 1996. Vol. 18(2), p. 137-143.i

156. Rinne D.B., Larebeke N. Endogenose DNA damage in humans: a review of quantitative data. Mutegenesis. 2004. Vol. 19(3), p. 169-185.

157. Safa O., Hensley K., Smirnov M.D. Lipid oxidation enhances the function of activated proteinkinase C. J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, p. 1829-1836.

158. Sagrista M.L., Garcia A.E., Africa De Madariaga M., Mora M. Antioxidant and pro-oxidant effect of the thiolic compounds N-acetyl-L-cysteineJand glutathione against free radical-induced lipid peroxidation. Free Radic Res. 2002. Vol. 36(3), p. 329-340.

159. Sandstrom P.A., Tobbey P.W. Lipid hidrope roxides induce apoptosis in T cell displaying a HIV-associated glutatione peroxidase deficiency. J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269, p. 798-804.

160. Saton K., Ida Y., Hosaka M., Arakawa H., Maeda M., Ishihara M., Kunii Y., Tguchi M., Sakagami H. Inducyion of apoptosis by cooperative action vitamins С and E. Anticancer Res. 1998. ,Vol. 18(6A), p. 4371-4375.

161. Savill J. Apoptosis and the Kidney. J.Am.Soc Nephrol. 1994. Vol. 5, p. 12-21.

162. Sies C. Oxidative stress-From basic research to clinical application. Amer. J. Med. 1991. Vol. 91, p. S31-S38.

163. Skulachev V. P. Why arc mitochondria involved in apoptosis? Permeability transition pores and apoptosis as selective mechanisms to eliminate supcroxide-producing mitochondria and cell. FEBS Lett. 1996.' Vol. 397(1), p. 7-10.

164. Solovieva M.E., Soloviev V.V., Akatov V.S. Vitamin В.2ь increases theicytotoxicity of short-time exposure to ascorbic acid, inducing oxidative burst and iron-dependent DNA damage. Eur J Pharmacol. 2007. Vol.566(1-3), p.206-214.

165. Spear N., Aust S.D. The effects of different buffers on the oxidation of DNA by thiols and ferric iron. J. Biochem. Mol. Toxicol. 1998. Vol. 12(2), p. 125-132.

166. Stoiana I., Orosb A., Moldoveanub E. Apoptosis and Free Radicals. Biochemical and Molecular Medicine. 1996. Vol. 59, p. 93-97.

167. Suh Y., Arnold R.S., Lasseque B. Cell transformation by the superoxide-generating oxidase. MOX-1. Nature. 1999. Vol. 401, p. 79-82.I

168. Sugiyama H., Kashihara N., Makino H., Yamasaki Y., Ota Z. Apoptosis in glomerular sclerosis. Kidney International. 1996. Vol. 49, p. 103-111.»

169. Takahashi A., Earnshaw W.C. ICE-related proteases in apoptosis. Curr. Opin. Develop. 1996. Vol. 6, p. 50-55.

170. Tartier L., McCarey Y.L., Biaglow J.E., Kochevar I.E., Held K.D. Apoptosis induced by dithiothreitol in HL-60 cells shows early activation ofcaspase 3 and is independent of mitochondria. Cell Death Differ. 2000. Vol. 7t10., p. 1002-1010.

171. Tenopoulou M., Doulias PT., Barbouti A., Brunk U., Galaris D. Role of compartmentalized redox-active iron in hydrogen peroxide-induced DNA damage and apoptosis. Biochem J. 2005. Vol. 387(Pt 3), p.703-710.

172. Thibodeau P.A., Kocsis-Bedard S., Courteau J., Niyonsenga Т., Paquette B. Thiols can either enhance or suppress DNA damage induction by catecholestrogens. Free Radic. Biol. Med. 2001. Vol. 30 (1), p. 62-73.

173. Thornberry N.A., Lazebnik Y. Caspases: enemies within. Science. 1998. Vol. 281, p. 1312-1316.i

174. Tian H., Zhang G., Li H., Zhang Q. Antioxidant NAC and AMPA/KA receptor antagonist DNQX inhibited JNK3 activation following global ischemia in rat hippocampus. Neuroscience Research. 2003. Vol. 46(2), p. 191-197.

175. Toyokuni S., Sagripanti J.L. Iron-mediated DNA damage: sensitive detection of DNA strand breakage catalyzed by iron. J. Inorg. Biochem. 1992. Vol. 47(3-4), p. 241-248.

176. Troy C.M., Shelansky M.L. Down-regulation of copper/zinc superoxide dismutase causes apoptotic death in PC 12 neuronal cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. Vol.14, p. 6384-6387.

177. Udupi V. Rice- С. Thi'oJ«c,omp£>unds as protective agents in erythrocyte under oxidative stress. Free Radical Res. Commun. 1992. Vol. 16, p. 315-323.

178. Uedaa J. Saitob N., Ozawaa T. Detection of Free Radicals Produced from Reactions of Lipid Hydroperoxide Model Compounds with Cu(II) Complexes by ESR Spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 1996. Vol. 325, p. 65-76.

179. Valentine J.S., Wertz D.L., Lyons, T.J., Liou L.L., Goto J.J., Gralla E.B. The dark side of dioxygen biochemistry. Curr.Opin.Chem. Biol. 1998. Vol. 2, p. 253-262.

180. Venugopal M., Jamison J.M., Gilloteaux J., Koch J.A., Summers M., Hoke J., Sowick C., Summers J.L. Synergistic antitumour activity of vitamins С and КЗ against human prostate carcinoma cell lines. Cell Biol Int. 1996. Vol. 20(12), p.787-797.

181. Von Gruenigen V.E., Jamison J.M., Gilloteaux J., Lorimer H.E., Summers M., Pollard R.R., Gwin C.A., Summers J.L. The in vitro antitumor activity of vitamins С and КЗ against ovarian carcinoma. Anticancer Res. 2003. Vol. 23(4), p. 3279-3287.

182. Widmann C., Gerwins P., Jonson N.L. MEK kinase 1, a substrate for DEVD-directed caspases, is involved in genotoxin-induced apoptosis. Mol. Cell. Boil. 1998. Vol. 18(4), p. 2416-2429.

183. Wolff S. Ferrous ion oxidation in presence of feme ion indicator xylenol orange for measurement of hydroperoxides. Methods of enzymology. Vol. 233, p. 182-189.

184. Wu J., Muldon L.^-^euweJiL E. The chemoprotectve agen N-acetylcysteine blocks cisplantin-induced apoptosis through caspase signalling pathway. . Pharmacol. Exp. Ther. 2005. Vol. 312, p. 424-431.

185. Yan LJ. Traber M.G., Kobuchi H., Matsugo S., Tritschler H.J., Packer L. Efficacy of hypochlorous acid scavengers in the prevention of protein carbonyl formation. Arch Biochem Biophys. 1996. Vol. 327(2), p. 330-334.

186. Yang E.Y., Campbell A., Bondy S.C. Configuration of thiols dictates their ability to promote iron-induced reactive oxygen species generation. Redox. Rep. 2000. Vol. 5(6), p. 371-375.i

187. Yu B.P. Cellular defenses against damage from reactiVe oxygen species. Physiol. Revs. 1994. Vol. 74, p. 139-162.

188. Yu Z., Persson L., Eaton J., Brunk U. Intralysosomal iron: a major determinant of oxidant-induced cell death. Free Rad. Biol. And Med. 2003. Vol. 34(10), p. 1243-1252.

189. Zachwieja J., Zaniev M., Bobkowski W. Beneficial in vitro effect of N-acetyl-cysteine on oxidative stress and apoptosis. Pediatr Nephrol. 2005. Vol. 20(6), p. 725-31.

190. Zafarullah Y., Li W., Sylvester J.,f Ahmad M. Molecular mechanisms of N-acetylcysteine actions. Cell Mol Life Sci. 2003. Vol. 60, p.6-20.

191. Zdolsek JM., Svensson I. Effect of reactive oxygen species on lysosomal membrane integrity. A study on a lysosomal fraction. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 1993. Vol. 64(6), p. 401-406.

192. Zoratti M. Szabo I. The mitochondrial permeability transition. Biochim. Biophys. Acta. 1995. Vol. 1241(2), p. 139-176.

193. Qanungo S., Wang M., Nieminen A.L. N-Acetyl-L-cysteine enhances apoptosis through inhibition of nuclear factor in hypoxic murine embryonic fibroblasts. J. Biol. Chem. 2004. Vol. 27^(48), p. 50455-50464.

194. Список работ, опубликованных по теме диссертации1. Статьи I

195. Соловьева М.Е., Соловьев В.В., Фасхутдинова А.А., Кудрявцев А.А., Акатов B.C. Прооксидантное и цитотоксическое действие тиолов и витамина В^ь- Докл. Акад. Наук. 2005. 404(5): 704-706.

196. Соловьева М.Е., Соловьев В.В., Фасхутдинова А.А., Кудрявцев А.А., Акатов B.C. Исследование прооксидантного и цитотоксического действия тиолов NAC и GSH в сочетании с витамином В 12ь- Цитология, 2007, №: 1, 70-78.

197. Фасхутдинова А.А., Акатов B.C., Соловьева М.Е., Соловьев B.C., Чайлахян JI.M. Механизм цитотоксического действияIацетилцистеина в сочетании с витамином В^ь- Докл. Акад. Наук. 2008. 422(4): {в печати).

198. Фасхутдинова А.А. Сочетание антиоксидантов-тиолов с витамином Впь индуцирует апоптоз в клетках HL-60. Тезисы докладов XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007», секцияI

199. Биология», Москва, Россия, 2007. стр. 151.

200. Фасхутдинова А.А. N-ацетилцистеин является прооксидантом в сочетании с витамином В.2ь. Тезисы докладов XV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», секция «Биология», 8-11 апреля, Москва, Россия, 2008. стр. 247.

Информация о работе

Фасхутдинова, Алсу Амировна
кандидата биологических наук
Пущино, 2008
ВАК 03.00.02

Диссертация

Прооксидантное и цитотоксическое действие тиолов в комбинации с витаминами B126 на опухолевые клетки in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы