Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование на клеточных культурах молекулярных механизмов антипролиферативного и цитотоксического действия витамина К3

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коваленко, Дмитрий Владимирович, Москва

■. • у ..-л-

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ имени В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

ИССЛЕДОВАНИЕ НА КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ АНТИПРОЛИФЕРАТИВНОГО И ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ВИТАМИНА КЗ

(специальность 03.00.03. - молекулярная биология)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: проф. A.B. Зеленин

Москва 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 6

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

1. Молекулярные механизмы апоптоза - общая характеристика. 11

1.1. Морфологические и биохимические

признаки апоптоза. 12

1.2. Каспазы - эффекторные молекулы апоптоза. 16

2. Система Раз-рецептор / Рав-лиганд в контроле апоптоза. 24

2.1. Структурно-функциональная характеристика РаБ-рецептора и Раэ-лиганда. 25

2.2. Роль РаБ-системы в контроле программированной

клеточной гибели в естественных условиях. 30

2.3. Роль РаБ-системы в контроле искусственно

вызываемого апоптоза. 35

2.4. Роль РаБ-системы в апоптозе, вызываемом действием противоопухолевых химиопрепаратов. 41

3. Витамины группы К как противоопухолевые химиопрепараты. 45

3.1. Химическая структура и физиологическая

роль витаминов К. 45

3.2. Противоопухолевая активность витаминов К

и струтурно близких к ним соединений. 47

3.3. Молекулярные механизмы цитотоксичности

витаминов К. 51

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 59

1. Реагенты. 59

2. Аденовирусные векторы и вирусная трансдукция. 59

3. Клеточные культуры. 59

4. Обнаруждение разрывов в клеточном хроматине и анализ фрагментации ДНК. 61

5. Измерение клеточной пролиферации и

анализ синтеза геномной ДНК. 62

6. Анализ экспрессии РНК с помощью Нозерн-блоттинга. 62

7. Детекция апоптоза. 64

8. Иммуноблоттинг. 65 Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 67

1. Исследование влияния ВКЗ на клеточную

пролиферацию и синтез ДНК. 68

2. Обнаружение повреждений в клеточном хроматине и

анализ фрагментации геномной ДНК при действии ВКЗ. 70

3. Исследование влияния восстановленной формы глютатиона и азидотимидина на антипролиферативное

действие ВКЗ. 72

4. Селекция клеточных клонов линии Дигка^ устойчивых

к цитотоксическому действию Баз-лиганда. 74

5. Анализ развития апоптоза под влиянием ВКЗ

в исходной клеточной популяции и полученных клонах. 76

6. Определение активации каспазы-3 при действии ВКЗ. 77

7. Анализ уровня экспрессии Баз-рецептора и

секреции Баз-лиганда при действии ВКЗ на клетки 1игка1;. 78

8. Исследование развития апоптоза, индуцированного ВКЗ, в спленоцитах линий мышей,

дефектных по функционированию Гав-системы. 80

9. Влияние растворимой формы Баз-рецептора на апоптоз, вызываемый ВКЗ в спленоцитах мышей линии С57ВЬ/6. 81

10. Определение зависимости жизнеспособности клеток

при действии БаБ-лиганда или ВКЗ от активности ЫБ-кВ. 82

Глава IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 85

ВЫВОДЫ 96

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 98

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВКЗ - витамин КЗ

АЗТ - 3'-азидо-З'-дезокситимидин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов противоопухолевого действия химиотерапевтических препаратов является актуальной задачей современной молекулярной биологии. В последнее время возросший интерес к этой проблеме связан прежде всего с открытием и разработкой механизмов, лежащих в основе такого явления как программированное самоубийство клетки или апоптоз [4]. Одной из центральных систем, контролирующих развитие апоптоза, является система Раз-рецептор/Раз-лиганд (Раз-система), принадлежащая к суперсемейству фактора некроза опухоли [30]. Недавние исследования показали, что Раз-система играет важную роль в индукции программированной клеточной гибели под действием гамма- и ультрафиолетового излучения, окислительного стресса, теплового шока, а также некоторых противоопухолевых химиотерапевтических препаратов [31-35]. Также было установлено, что феномен множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток можно связать с поломкой в функционировании данной системы [58].

Витамины группы К, являющиеся кофакторами в синтезе протромбина и других факторов системы свертования крови, обладают также выраженными цитотоксическими свойствами, что позволило исследовать их химиотерапевтический потенциал [62]. Витамин КЗ -

клинически апробированный как противоопухолевый препарат 5 обладает антипролиферативным и цитотоксическим действием на многие типы опухолевых клеток как in vitro так и in vivo [83]. Основой теории, объясняющей цитотоксические свойства витамина КЗ, является способность витамина быть индуктором окислительныго стресса [100]. В то же время, как недавно было установлено, окислительный стресс является одной из причин и характерным атрибутом апоптоза, опосредованного Fas-системой [55].

Поэтому представлялось целесообразным изучить роль Fas-системы в развитии апоптоза при действии витамина КЗ в комплексе с исследованием других молекулярных процессов, лежащих в основе антипролиферативной активности витамина.

Без все более глубокого понимания молекулярных механизмов противоопухолевой активности как известных так и новых химиопрепаратов невозможно улучшение терапии неоплазий за счет целенаправленного подбора наиболее эффективных комбинаций противоопухолевых препаратов, а также борьбы с феноменом множественной лекарственной устойчивости.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение на клеточных культурах молекулярных механизмов, ответственных за антипролиферативные свойства витамина КЗ, а также

выяснение роли системы Раз-рецептор/Раз-лиганд в индукции апоптоза

при действии витамина КЗ.

В ходе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Исследовать влияние витамина КЗ на пролиферацию клеток линии 1игка1 и синтез геномной ДНК в данной клеточной культуре.

2. Выявить повреждающий эффект действия витамина КЗ на геномную ДНК клеток 1игка1

3. Установить характер влияния комбинаций витамина КЗ с восстановленной формой глютатиона или азидотимидином на клеточную пролиферацию.

4. На клеточной линии 1игка1 показать способность витамина приводить к развитию апоптоза.

5. Путем культивирования исходной клеточной линии Ритка! в присутствии Баз-лиганда получить клеточные клоны, устойчивые к его цитотоксическому действию.

6. Определить уровень апоптоза, возникающего под действием витамина КЗ в ряде клеточных культур (полученные клоны клеточной линии 1игка1:, первичные культуры спленоцитов двух линий мышей с функциональными нарушениями в Раз-системе), и сравнить его с уровнем апоптоза в контрольных культурах (исходная линия 1игка1 и спленоциты мышей дикого типа).

7. Исследовать влияние витамина на уровень экспрессии мРНК Баз-рецептора и секрецию Баз-лиганда.

8. Изучить способность растворимой формы Баз-рецептора ингибировать цитотоксичность витамина КЗ.

9. Определить зависимость снижения жизнеспособности клеток при действии Баз-лиганда или витамина КЗ от активности транскрипционного фактора ЫБ-кВ.

Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе впервые исследовано влияние витамина КЗ на пролиферацию и жизнеспособность клеток линии 1игка1:. Показана способность витамина КЗ снижать рост популяции клеток данной клеточной линии, что, в частности, связано с установленным фактом ингибирования синтеза геномной ДНК.

В экспериментах с восстановленной формой глютатиона подтверждена связь антипролиферативного действия витамина с его способностью быть индуктором окислительного стресса. Показано образование разрывов в геномной ДНК под влиянием витамина КЗ, что также можно связать с развитием окислительного стресса при действии витамина.

Впервые исследованная в данной работе комбинация витамина КЗ и азидотимидина имела синергический ингибирующий эффект на пролиферацию клеток ]игка1, что возможно послужит основой для

дальнейшего изучения эффективности данной комбинации препаратов в противоопухолевой терапии.

В работе показана способность витамина КЗ вызывать апоптоз в клеточной культуре линии 1игка^ что было подтверждено как на морфологическом, так и на биохимическом уровне. При этом впервые установлена роль системы Раз-рецептор/Таз-лиганд в индукции апоптоза под действием витамина КЗ: на трех клеточных культурах показано, что устойчивость клеток к индуцированному Баз-лигандом апоптозу коррелирует с устойчивостью их к цитотоксическому действию витамина КЗ; выявлено, что витамин вызывает усиление экспрессии мРНК гена Баз-рецептора и высвобождение Баз-лиганда из клеток в культуральную среду; установлено, что конкурентное ингибирование взаимодействия Баз-лиганда с Баз-рецептором с помощью растворимой формы Раз-рецептора приводит к снижению цитотоксического действия витамина КЗ.

Таким образом, данная работа, направленная на дальнейшее понимание молекулярных механизмов противоопухолевого действия витамина КЗ как химиотерапевтического препарата, представляет не только научный, но в перспективе и практический интерес, связанный с дальнейшим использованием витамина КЗ в медицинской практике.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АПОПТОЗА -ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА.

Регуляция баланса между пролиферацией и гибелью клеток является небходимым условием развития многоклеточного организма и поддержания его клеточного гомеостаза. Этот баланс, с одной стороны, связан с регуляцией процессов клеточного деления, позволяющих наращивать и обновлять клеточный состав организма, с другой стороны, требует удаления части избыточной клеточной массы, что достигается механизмами физиологической или запрограммированной клеточной гибели - процессом, получившим название апоптоза [1]. Апоптоз контролируется эволюционно консервативными молекулярными механизмами сходными как у беспозвоночного червя СаепогИаЬШШ е^ат, так и у человека [2]. Открытие и разработка этих механизмов позволило стать данной области исследования одним из наиболее интенсивно развивающихся направлений современной молекулярной биологии, так как оно объедило в себе как фундаментальные исследования биологии развития и клеточной физиологии, так и открыло новые пути решения прикладных задач, основанные на возможности целенаправленного влияния на процессы клеточной гибели. Как было выяснено, нарушения в регуляции апоптоза, связанные как с

генетическими мутациями, так и с рядом других причин, способствуют патогенезу многих пролиферативных либо, наоборот, дегенеративных заболеваний у человека, таких как рак, вирусные инфекции, включая СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита), аутоиммунные и нейродегенеративные заболевания [3].

1.1. Морфологические и биохимические признаки апоптоза.

Апоптоз - это активный клеточный ответ на ряд физиологических и патологических факторов, связанный с реализацией определенной клеточной программы (программы самоубийства) [4]. В целом, эта программа представляет собой активизацию специфических эндогенных протеиназ, разрушающих жизненноважные белковые субстраты клетки и нуклеаз, расщепляющих геномную ДНК. Для ее реализации требуется затрата энергии, запасенной в виде АТФ (аденозин 5'-трифосфатов) и, иногда, белковый синтез, так как ингибиторы трансляции в ряде случаев препятствуют развитию апоптоза. Этими своими характеристиками апоптоз отличается от другого хорошо охарактеризованного пути гибели клетки - некроза, представляющего собой процесс лизиса клеток при грубых клеточных повреждениях, таких, например, как повреждение целостности цитоплазматической мембраны.

Некроз не зависит от реализации какой бы то ни было внутриклеточной программы, не контролируется внутриклеточными

процессами и не требует потребления АТФ. На морфологическом уровне эти два процесса также хорошо различаются. Для некроза характерно разбухание клетки, лизис клеточной мембраны и высвобождение внутриклеточного содержимого, включая органеллы, в окружающее

пространство (Таб. 1).

Признаки Некроз Апоптоз

Причины Токсины, гипоксия, условия истощения АТФ, повреждения целостности цитоплазматической мембраны Физиологические и патологические условия без истощения АТФ

Зависимость от АТФ Нет АТФ-зависимый процесс

Морфологические признаки Разбухание клеток, лизис цитоплазматической мембраны Сжатие цитоплазмы, конденсация хроматина, формирование апоптических телец

Биохимические признаки Случайное расщепление геномной ДНК Специфическая фрагментация ДНК, активация каспаз и связанное с этим расщепление некоторых белков

Воспаление Есть Нет

Таблица 1. Основные отличия апоптоза и некроза.

Начальные этапы гибели клетки по механизму апоптоза на морфологическом уровне выражаются в сжатии клетки, увеличении гранулярности цитоплазмы и конденсации ядерного хроматина. Дальнейшее развитие апоптоза приводит к формированию так называемых

апоптических телец - окруженных цитоплазматической мембраной фрагментов клетки.

Важно подчеркнуть, что образованные в результате апоптической фрагментации ядра и цитоплазмы клеточные фрагменты, тем не менее, остаются окруженными хотя и протекающей (проницаемой для некоторых красителей и низкомолекулярных соединений), но все же целостной цитоплазматической мембраной. Таким образом, при апоптозе не происходит "раздевания" внутриклеточных структур и выхода их за пределы клеточной мембраны. С этим связано то, что на уровне целого организма апоптические тельца, в отличие от некротических клеток, не вызывают воспалительных реакций со стороны иммунной системы организма (в частности, млекопитающего) и быстро фагоцитируются окружающими клетками и макрофагами. Отсутствие воспалительного ответа на апоптические клетки имеет важное физиологическое значение, так как, например, у человека каждый день происходит обновление примерно 1011 клеток [5]. В частности, зрелые гранулоциты существуют в периферической крови человека только в течении 1-2 дней, а затем вступают в апоптоз и элиминируются [6]. Как показали исследования, посвященные изучению роли транскрипционного фактора ОТ-кВ в ревматоидном артрите, в ткани сустава - синовиуме - в норме наблюдается высокий уровень апоптических клеток без каких бы то заметных

воспалительных реакций, в то время как при индукции артрита (у крыс) этот уровень существенно снижался, что коррелировало с разрастанием синовиума, характерного для артрита [7]. В согласии с этими данными находятся недавно прошедшие успешную проверку ряд подходов для терапии экспериментально вызываемого артрита у животных, основанных на так называемой молекулярной хирургии - искусственном удалении клеточной массы синовиальной ткани сустава с помощью введения внутрь сустава ряда факторов (цитокинов и протеосомальных ингибиторов), вызывающих или способствующих развитию апоптоза [8].

В естественных условиях апоптоз играет важную роль также, например, в формировании центральной нервной системы (ЦНС) у млекопитающих. В ходе развития ЦНС образуется намного больше нейронов, чем потом остается у взрослого организма. Избыточные нейроны погибают апоптически [6]. При экспериментальном нарушении одного из механизмов апоптоза (см. ниже) у животных наблюдается гиперплазия в мозге.

Для завершения сравнения апоптического и некротического путей гибели клетки следует выделить еще одно важное отличие: при апоптозе активируются специфические нуклеазы, одни из которых разрезают геномную ДНК на домены величиной от 50 до 300 тысяч пар оснований, другие же вносят разрывы по межнуклеосомным участкам в хроматине,

образуя фрагменты, которые при разделении в условиях гель-электрофореза видны как серия дискретных полос, кратных примерно 180 парам нуклеотидов (ДНК, намотанная на гистонные белки нуклеосомы, имеет размер около 145 пар оснований) [4]. Это так называемая "апоптическая лесенка", долгое время служившая единственным строгим биохимическим критерием апоптического процесса. При некрозе же геномная ДНК расщепляется случайным образом с образованием недискретных фрагментов.

Программированная клеточная гибель может быть вызвана широким набором различных воздействий: от ионезирующей радиации до гипертермии, от вирусной инфекции до иммунных реакций [3]. Таким образом, апоптоз является одним из универсальных конвергентных клеточных ответов на широкий спектр как физиологических условий, так и искусственных воздействий.

1.2. Каспазы - эффекторные молекулы апоптоза.

Как было выяснено, молекулярные механизмы апоптоза имеют сходный характер у различных представителей подцарства многоклеточных. Центральным эффекторным звеном в этом процессе является каскадная активация специфических внутриклеточных цистеиновых протеиназ, получивших название каспаз [5]. Было установленно, что активированные каспазы расщепляют белки

цитоскелета, такие как актин и фодрин, а также белок