Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение иммуномодулирующих свойств синтетических пептидов - фрагментов молекулы интерферона-альфа2 человека

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение иммуномодулирующих свойств синтетических пептидов - фрагментов молекулы интерферона-альфа2 человека"

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ КАРДИОЛОГИИ КАРДИОЛОГИЧЕСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАМН

На правах рукописи Таргони Олег Сергеевич

ИЗУЧЕНИЕ ИММУТШМОДУДИРУЮЩИХ СВОЙСТВ ШГГЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИЛОВ -ФРАГМЕНТОВ МОЛЕКУЛЫ ШГГЕРФЕР0НА-«2 ЧЕЛОВЕКА

03.00.25 - клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1994

Работа выполнена на кафедре клеточной физиологии и иммунологии

Биологического факультета 'МГУ им. М.В.Ломоносова Руководитель: доктор биологических наук

профессор М.В.Гусев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

профессор А.В.Зеленин

доктор биологических наук В.В.Терских

Ведущая организация: Институт вирусологии им.Ивановского РАМН

Защита состоится "_23_"_февраля_ 1994 г.

в 11 часов в Кардиологическом Научном Центре РАМН на заседании Специализированного Совета К 001.22.02 по адресу: г.Москва, ул. 3 Черепковская, 15 А С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КНЦ РАМ!

Автореферат разослан "22" января 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

Т.И.Венгерова

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Селективная регуляция пролиферации различных ' категорий иммунокомпетентных клеток представляет собой одну из основных задач иммунокорригирущей терапии. В настоящее время препараты, обладающие антипролиферативным действием, широко используются в клинической практике.

Ранее было показано, что пептид-фрагмент молекулы интерферона- «2 (ЙФН-а2) человека со 124 по 138 аминокислотные остатки (названный 2438) обладает биологической активностью: данный пептид, также как и нативная молекула ИФН, подавляет индуцированный под действием митогена пролиферативный ответ Т лимфоцитов периферической крови человека in vitro (Danilkovich et. al., 1992).

В противоположность ИФН, пептид 2438 не проявляет антивирусной активности' (Shevalier et. al., 1990) и не влияет на активность естественных кллерных клеток (Danilkovich et. al., 1992). Таким образом, .данный пептид обладает более узким, чем ИФН спектром .биологической активности. Использование синтетических пептидов является одним из подходов к изучению структурно-функциональной организации молекулы ИФН. Кроме того, такие биологически активные пептиды можно рассматривать как потенциальные препараты для применения в клинике.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью данной работы являлось изучение биологической активности синтетических пептидов-аналогов ранее обнаруженного пептида 2438, которые короче на 1-3 аминокислотных остатка с NHg-конца, в модельных системах in vitro.

Экспериментальные задачи исследования:

1. Выявить среди исследуемых пептидов - фрагментов молекулы ИФН-ой человека те, которые обладают биологической активностью и изучить их влияние на:

а. пролиферативный ответ лимфоцитов периферической крови человека, индуцированных поликлональным активатором;

б. Интерлейкин-2 (ИЛ-2)-зависимый путь активации Т лимфоцитов;

в. пролиферативный ответ лимфобластоидных клеточных линий человека с анализом распределения клеток по клеточному циклу.

2. Определить наличие специфических пептидных рецепторных структур на мембране лимфобластоидных клеточных линиий человека и определить параметры связывания'биологичеки-активных пептидов с данными структурами.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Впервые показано, что синтетические пептиды - фрагменты молекулы ИФН-а2 со 125, 12.6 и 127 по 138 аминокислотные остатки (2536, 2638 и 2738) подавляют пролиферацию активированных конканавалином А (КонА) лимфоцитов периферической крови человека и ингибируют ИЛ-2-зависимую пролиферацию лимфоцитов. Данные пептиды подавляют пролиферацию лимфобластоидных клеточных линий человека МТ4 и СЕМ, оказывая влияние на

■ - г -

распределение клеток по фазам клеточного цикла, и действие пептидов зависит от их длины.

Показано, что биологически активные пептиды 2538'; 2638 и 2738 специфически взаимодействуют с рецепторными структурами на поверхности клеток линий МТ4 и СЕМ и аффинность связывания коррелирует с длиной пептидов и их биологической акт шностью.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Данные пептиды-фрагменты молекулы ИФН-сй человека, обладающие узким спектром действия, могут Сыть использованы при изучении механизмов активации, пролиферации и дифференцировки по крайней мере лимфоидных клеток. Понимание этих процессов приведет к возможности их селективной регуляции при различных патологических состояниях. Полученные в результате таких исследований данные могут быть использованы при конструировании молекул ИФН с заранее определенными свойствами. Кроме того, изучаемые биологически активные синтетические пептиды могут рассматриваться как потенциальные антипролиферативные препараты для использования в медицине. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации докладывались' на заседании кафедры клеточной физиологии и иммунологии Биологического факультета МГУ, на семинаре лаборатории клеточной инженерии Института вирусологии РАМН и на межлабораторном семинаре НЖЭК КНЦ РАМН.

ПУБЛИКАЦИИ. Но материалам диссертации опубликовано 2 печатные работы.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы,. материалов и методов, результатов, обсуждения результатов,. выв^ов и списка цитируемой литературы (123 ссылки). Работа изложена на 94 страницах- машинописного текста, содержит 1 таблицу и 14 рисунков.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. МАТЕРИАЛЫ. Пептиды-фрагменты молекулы ИФН-«2 человека были синтезированы в Институте биоорганической химии (г.Москва) и в а/о "Вектор-биопродукт" (г.Новосибирск). Список и аминокислотные последовательности исследуемых пептидов представлены на рис 1 . В работе были использованы трансформированные' лимфобластоидные. клеточные линии . человека СЕМ и МТ4, предоставленные д.б.н.

A.A.Кущ (Институт вирусологии РАМН, г.Москва).

Моноглопальные антитела МЕМ140 к а-цепи рецептора ИЛ-2 и МЕМИ5 к молекуле CR4 человека были предоставлены доктором V.Horeisl (Институт молекулярной генетики, г.Прага,Чешская республика). Испольвовался рекомбинантный интерлейкин-2 фирмы Eurocetus

B.V.(Нидерланды) , рекомбинантный интерферон-а2 человека (Реафе-рон, производства государственного концерна "Биопрепарат").

Использовались радиоктивно меченные ■ реактивы фирмы RUNX' (Санкт-Петербург) и Amersham (Англия).Остальные реактивы были получены от фирм Sigma (США), Difco (США), Pharmacia (Швеция) и • Serva (ФРГ).

ВЫДЕЛЕНИЕ ЛИМФОЦИТОВ ИЗ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ. ' Мононуклеарные клетки выделяли центрифугированием в градиенте фиколла-верографина по методу (Boyum, 1968). УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК. Для культивирования клеток везде, если не указано иначе, использовали среду RPMI 1640. При культивировании клеточных линий среда содержала 10%. инактивиро-ванной СПК и 50 мкг/мл гентамицина, во всех остальных случаях -5Z инактивироваиной СПК. Клетки культивировали при 37° С во влажной атмосфере, содержащей 5Z СОг-РЕАКЦИЯ БЛАСТТРАНСФОРМАЦИИ. Суспензию мононуклеарных клеток (10® клеток/мл) инкубировали в среде, содержащей поликлональный активатор (КонА 2 мкг/мл или рекомбинантний интерлейкин-2 20 ЕД/мл) в присутствии синтетических пептидов (10"5 М), рекомби-нантного И5>Н-а2 человека (1000 ЕД/мл) в течение 75 часов в 96-луночных планшетах для культивирования клеток в объеме "00 мкл (количество повторностей не менее трех для каждого варианта обработки клеток). Лролиферативный ответ лимфоцитов оценивали по . включению в ДНК радиоктивно меченного предшественника 3Н-тимиди-на, который добавляли в последние 15 часов культивирования. В качестве контроля использовали нестимулированные поликлональ-ными активаторами клетки и стимулированные, но не обработанные синтетическими пептидами или ИФН-ой.

При построении дозозависимой кривой использовались концентрации пептидов от Ю-4 до 10~8 М.

При исследовании влияния пептидов на пролиферативный ответ активированных клеток, лимфоциты предварительно инкубировали в течение 48 часов с поликлональным стимуляторам КонА. ИНДУКЦИЮ СИНТЕЗА ИЛ-2 в культуре мононуклеарнач клеток периферической крови человека (2*106 клеток/мл/лунку) проводили в 24-х луночных планшетах. Клетки'инкубировали в течение 40 часов в присутствии КонА (2 мкг/мл) и пептидов(10_5М) или ИФН-«2- (1000 . ЕД/мл) .

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ИЛ-2 В КУЛЫУРАЛЬНЫХ СУПЕРНАТАНТАХ проводили используя КонА-бластные клетки мыши.

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОВ НА ИЛ-2-ЗАВИСИМУЮ ПРОЛИФЕРАЦИЮ ЛИШОЦИТОВ проводили в два этапа. Лимфоциты предварительно инкубировали с поликлональнш стимулятором КонА (2 мкг/мл) в течение 48 часов, в присутствии пептидов и ИФН или без .них. Затем пролит феративный ответ клеток на экзогенно добавленный ИЛ-2 и влияние

; на этот процесс пептидов и ИФН-сй определяли как описано в раз.. деле '.'реакция бласттрансформаоди".

ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОВ НА ЭКСПРЕССИЮ «-ЦЕПИ РЕЦЕПТОРА ИЛ-2 И ПРОЛИФЕРАЦИЮ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА. Лимфоциты периферической крови человека культивировали в течение 72 часов в присутствии КонА (2 мкг/мл) и пептидив (10-5М). Затем клетки окрашивали антителами против молекулы CD25 или против молекулы CD4 по методу, описанном у Воган и др., 1991.

ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОВ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ЛИМФОБЛАС-ТОИДНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ ЧЕЛОВЕКА определяли через 72 часа инкубации с пептидами подсчетом клеток на проточном цитофлуориметре.

ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОВ НА РАСПРЕДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК ПО КЛЕТОЧНОМУ ЦИКЛУ определяли через 72 часа инкубации по методу, описанному у Мо-раска и др., 198$.

ИОДИРОВАНИЕ ПЕПТИДА 8738 проводили с Na125I (20МБк) в присутс-. твии иодогена как описано Salasinski et. al., 1981.

СВЯЗЫВАНИЕ ИОДИРОВАННОГО ПЕПТИДА 2738 С ТРАНСФОРМИРОВАННЫМИ КЛЕТОЧНЫМИ ЛИНИЯМИ ЧЕЛОВЕКА.

Клетки линий СЕМ (1*10б на точку.) и KIT4 (0.5*106 на точку) ин-; кубировали с 1251-2738 (концентрации от 10~6 до Ю~8 М) в объеме 100 мкл 40 минут при 4°С в фосфатносолевом буфере, содержащем 0.02Z азида натрия и 11 бычьего сывороточного альбумина. После инкубации клетки центрифугировали в градиенте 10%-ной сахарозы и измеряли ассоциированную с клетками радиоактивность.

Неспецифическое связывание определяли по вытеснению 1251-2738 1000-кратным молярным избытком немеченного пептида 2738 .

МОТИВИРОВАНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ РАДКОАКТИВНОМЕЧЕННОГО ПЕПТИДА 2738 ДРУГИМИ ПЕПТИДАМИ - ФРАГМЕНТАМИ Ш>Н «2. В экспериментах по конкурентному связыванию клетки линии МТ4 (0.5л 10б в объеме 100 мкл) инкубировали при постоянной концентрации 2*1О-7 M 1251-2738 в присутствии различных веществ (концентрвации от 10""3 до 10~7 М).

СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ. Для оценки достоверности различий средних величин применяли t-критерий Стыодента (р= 0.05). Обработку данных по связыванию проводили с использованием программы' "QUATTRO PRO", количество параллельных.измерений в каждой экспериментальной точке равнялось двум, 1

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

В результате проведенных экпериментоБ было показано, что пептиды - фрагменты молекулы ИФН-ос2 человека со 125, 126 и 127. пс 138 аминокислотный остатки (соответственно 2538, 2638 и 2738) в концентрации 10-5М подавляют пролиферацию мононуклеарных клеток человека, индуцированную митогеном КонА, in vitro (рис.1). Такт/

образом, данные пептиды являются . биологически активными и их действие носит однонаправленный характер с действием ИФН и пептида 2438, антипролиферативная активность которого была обнаружена ранее (БапПкоУхсЬ е1. а1., 1992). Остальные изучаемые синтетические пептиды-фрагменты из участка со 124 по 144 аминокислотные остатки молекулы ИФН-«2 являются биологически инертными в используемой экспериментальной модели. Важно отметить, что прямого цитотоксического действия у исследуемых пептидов в зоне используемых концентраций выявлено не было.

Антипролиферативное действие пептидов 2538, 2638 и 2738 носит дозозависимьга характер и проявляется при концентрациях не ниже 10-6М. В работе 0ап11коу1сЬ е^ а1., 1992 было показано, что пептид 2438 ингибировал пролиферацию активированных митогеном лимфоцитов при концентрациях не ниже 10~7М. Таким образом, укорочение . пептида 2438 с конца приводит к снижению антипроли-феративного действия, которое практически не выявляется у пептида со 129 по 138 аминокислотный остаток (2938).

При изучении действия пептидов на ИЛ-2-зависимую пролиферацию лимфоцитов периферической крови человека было установлено, что добавление пептидов, также как и ИФН , на стадий генерации Ко-нА-активированных клеток в дальнейшем приводило к ингибированию ответа на экзогенно добавленный ИЛ-2 (рис. 2 В ).

Добавление исследуемых пептидов к уже активированным КонА клеткам одновременно с ИЛ-2 не оказывало влияния на пролиферацию, тогда как ИФН ее подавлял (рис. 2 А). Данные различия в действии ИФН и пептидов могут объясняться тем, что подавление ИЛ-2-зави-симой пролиферации уже активированных лимфоцитов ИФН, вероятно опосредуется его плейотропной активностью, тогда как пептиды обладают более узким спектром действия.

Таким образом, пептиды 2538, 2638 и 2738 ингибируют интерлей-кин-2-зависимую пролиферацию, но только в том случае, когда они добавлены на стадии генерации КонА-активированных клеток. При этом выявлено, что исследуемые пептиды не обладают селективным действием на С04+ и СБ4" субпопуляции Т лимфоцитов.

<0

я

Влияние синтетических пептидов - фрагментов ИФН на пролиферацию мононуклеарных клеток человека в присутствии конканазалина-А

Код Пептид

ИФН

2444 ШТ1ЛТКЕККУЗРСАТУЕУУР.А

2944 ЦСЕККУБР САТУЕУ7Р.Л

2438 ШИЛХКЕККУЗРСА

2538 ГПЛХКЕККУЗР СА

2638 ТГЛХКЕККУЭРСА

2738 ЬШСЕККУБРСА

2938 ЬКЕЮСУБРСА

2433 ШИЛХКЕКК

3444 УЭРСАТШП/КА

20

40

40

80

100

120

Пролиферация ( % от контроля)

о

I

е-

Интерлейкин-2 зависимая пролиферация э присутствии ИОН и пептидов

Икдукиия КонА-активированных клеток

* ИФН I • -1

/ 2444 1 • I !

2438

^ 2538 \ 2638 2738

ИФН

2444 А

0 го « вэ во юо 120

Интерлейхик—2 зависимая пролиферация

1

2438 <ч 2538 2638 А 2738

о £

ВО 100

Индукция КонА-активированных клеток в присутствии ИФН и пептидов Пролиферация (в ^ от контроля)

Известно, что при- активации клеток КонА происходит как индукция ' экспрессии рецептора ИЛ-2, так и синтез и секреция самого ШЬ2. Полученные нами экспериментальные данные позволяют предположить, что исследуемые пептиды препятствуют формированию высо-коаффинлого рецептора ИЛ-2. Следующим этапом нашей работы было' изучение влияния пептидов на экспрессию а-цепи рецептора ИЛ-2 -молекулы CD25.

Было установлено, что пептиды 2538, 2638 и 2738 снижают уровень экспрессии молекулы CD25, индуцируемый под действием КонА (рис. 3 ). Интересно отметить, что действие пептидов 2538, 2638 и 2738 убывает по мере укорочения их длины с NHg-конца.

Данные, описанные в литературе, относительно влияния ИФН на экспрессию ИЛ-2Р противоречивы. В работе Siegel et. al., 1986 было показано, что ИФН не влияет на экспрессию ИЛ-£Р, тогда как в работе Onji et. al., 1991 показана стимуляция экспрессии Ш1-2Р под действием ИФН. Основываясь на данных, полученных нами, можно предположить, что механизм действия пептидов на экспрессию ИЛ-2Рс< отличается от действия ИФН, по крайней мере в данной модельной системе.

В то же время пептиды 25S8 , 2638 и 2738, также'как и ИФН, не ингибируют секрецию Ш1-2 лимфоцитами в ответ на пол штопальный активатор.

Полученные нами данные согласуются с данными Klimpel et. al.,1990, Sone et al.,1988, которые показали, что ингибирование пролиферагивного ответа в присутствии митоге'нных стимуляторов под действием интерферона-сс не приводит к снижению уровня секреции ИЛ-2.

Таким образом, пептиды 2538, 2638 и 2738 ингибируют ИЛ-2-зави-симую пролиферацию лимфоцитов и влияют на экспрессию ü-цепи рецептора к ИЛ-2. Выраженность эффекта коррелирует с длиной пептидов: по мере укорочения аминокислотной последовательности ослабевает их влияние на экспрессию молекулы CD25 вплоть до полного исчезновения (пептид 2938).

Так как синтетические пептиды-фрагменты молекулы ИФН-а ингибируют пролиферативный ответ лимфоцитов периферической крови нор-. малыш донороЕ in vitro, было интересно выяснить, проявляют ли эти пептиды подобную активность по отношению к трансформирован--ным клеточным линиям человека лимфоидного происхождения. Таким образом, в дальнейшем в качестве второй модельной системы нами были использованы лимфобластоидные клеточные линии человека МТ4 И СЕМ.

При этом было показано, что пептиды 2538, 2638 и 2738 угнетают пролиферацию клеток перевиваемой линии МТ4 , что определялось

Ко нтропь

947. 67.

CD25- CD25 +

КонА*2538

'SO 7. 49.67. 0.47.

CD2S- CD2B + CD2S +

Ко я

КонА

267. ©17. 137.

CD25- C02S-T C02S+-

вШ 1Ж.

КонА+2638

"307. S0.17. 9.97.

cd as- COZS-f ' :D25+«

А->2738

34.57.

CD2S-

54.5*/.

CD25 +

ш

Ы>25<

РИС. 3

Шшянкэ иссяедуеиик пептидов па экспрессии а-цепм рецептора ИЛ-2.

Клетки после инкубации с КонА и пептидами окрашивали непрямым флуоресцентным методом моноклональныыи антителами против моле1сулы CD25. На графике по вертикали - количество клеток, по горизонтали - интенсивность флуоресценции.

Угнетение пролиферации клеток линии МТ-4 синтетическими пептидами - фрагментами интерферона -2 человека

Код Пептид

2538 ИЬУЬКЕККУЗРСА

2638 ТЬУЬКЕККУЗРСД

2738 ЬУЬКЕККУЗРСА

2938 ШЖКУБРСА

--1

з—I

оО

70

80

90

¡00.

Пролиферация ( % от контроля)

- и -

подсчетом клеток на проточном цитофлуориметре (рис. 4 ). Степень выраженности эффекта пептидов 2538, 2638 и 2738 на пролиферацию клеток линии МТ4 коррелировала с их длиной. В отличие от результатов, полученных на клетках линии МТ4, при изучении влияния пептидов на пролиферацию клеток перевиваемой линии СЕМ не обнаружено корреляции между выраженностью эффекта пептидов и их длиной. В случае клеточной линии СЕМ даже самый короткий из биологически активных пептидов 2738 угнетал пролиферацию клеток данной линии на 65£.

Для выяснения механизмов ингибирования пептидами 2538, 2638 и 2738 пролиферации клеточных линий МТ4 и СЕМ изучалось их влияние на распределение клеток по неточному циклу. При этом установлено, что пептиды 2538, 2638 и 2738 замедляют переход клеток из фазы Gi в S фазу клеточного цикла и препятствуют переходу из i' фазы в Q2/M, . снижая относительное число клеток линии МТ4 в фазе Вг/М клеточночного цикла. При этом действие пептидов зависит от их длины (рис. 5). В отличие от линии МТ4 пептид 2738 препятствует переходу клеток линии СЕМ только из фазы S в Go/M. • При этом данный пептид угнетает пролиферацию клеток линии СЕМ сильнее, чем линии МТ4.

С целью выявления на изучаемых клеточных линиях наличия рецеп-торных структур к пептидам и определения, существует ли корреляция между аффинностью связывания пептидов и их биологическим действием, самый короткий из биологически активных пептидов 2738 метился радиоактивным изотопом1251. Результаты- экспериментов были обработаны по методу Скэтчарда и на рис. 6 изображена кривая взаимодействия пептидов с рецепторами клеточной линии МТ4, построенная в координатах Скэтчарда. ■

Этот график имеет два линейных участка, что соответствует двум типам связывающих структур, характеризующихся различным сродством лиганда к рецептору. Для линии МТ4 Kdi= 1.32*1СГеМ, 2.69*10_6М ; число сайтов связывания на клетку 46067 и 555920 (рис. 6 ). Для линии СЕМ Kdi=6.4*10"9M и Kd2= 5.2*10~V, число сайтов связывания 1700 и 20000 соответственно.

Таким образом аффинность связывания пептида 2738 с клетками линии СЕМ выше, чем с клетками линии МТ4. По-видимому этим может объясняться тот факт, что данный пептид оказывает больший инги-бирующий эффект на пролиферацию клеток линии СЕМ, чем на МТ4. . Так как нами было показано, что действие изучаемых пептидов как на лимфоциты периферической крови нормальных доноров, таи и на лимфобластоидные клеточные линии человека, зависит от их длины предст вляло интерес изучение корреляции между длиной пептидов и

Линия МТ4 Контроль

Линия" МТ4 пептид 2538

61-53, ЗХ S-42,72, G2/M-4Z Линия МТ4 пептид 2738

Gl-40,87. S-48,4% G2/M-10.8X

61-35,57. S-50.8X G2/M-13,8%

Рис. 5

Влияние исследуемых пептидов еа расяр^еаюшэ клеток линии MI4 по клеточному

Клетки и нкубировали в присутствии пептидов • в течение 72 часов. Распределение клеток по клеточному циклу определялось по включению бромистого этидия в ДНК клеток. Обработку данных проводили с помощью программы DNA-System фирмы Scatron AS-(Норвегия). На графике по вертикали - количество клеток, по горизонтали - интенсивность флуорисценции.

- S3 -

Взаимодействие 2738 с клетками МТ-<1

Связанный (пМ)

Рис. б1

аффинностью их взаимодействия с рецептором. Для этого радиоактивно меченный пептид 2738 вытеснялся со своего рецептора как немеченным 2738, так и другими пептидами из района со 124 по 144 аминокислотный остатки молекулы ИФН-ой (рис. 7). из представленных графиков видно, что пептиды обладают разной вытесняющей способностью. Наиболее 'активно вытесняет пептид 2738 с его ре-' цептора пептид 2538, наименее активно - пептид 2433; остальные занимают промежуточное положение.

Для всех исследуемых пептидов вычислены константы ингибирова-ния. В зависимости от значения этих констант пептиды можно расположить в ряд по возрастанию их способности вытеснять меченный пептид 2738 с участков связывания. Значение К1 в данном ряду варьирует от 5.0*1СГ5 до 5.8*10~9 М. Сопоставление биологической активности и К1 для различных пептидов позволяет предположить о существовании корреляции между этими характеристиками.

Таким образом, пептиды 2538, 2638 и 2738 специфически взаимодействуют с одними и теми же рецепторными структурами на поверхности трансформированной клеточной линии МТ4 и аффинность связывания коррелирует с длиной пептидов и их биологической активностью.

Сопоставляя данные, полученные в экспериментах по пролиферации периферических лимфоцитов крови нормальных доноров 1п у^го и экспрессии на них а-цепи рецептора ИЛ-2 с результатами, полученными на клеточных линиях МТ4 и СЕМ, можно сделать■вывод о том, что аминокислотные последовательности синтетических пептидов 2438, 2538, 2638 и 2738 - фрагментов молекулы ИФН-«2 человека со 124' по 127 являются важными для.проявления ими биологической активности. При этом удаление аминокислотных остатков ' 125-127 полностью отменяет биологическую активность, присущую данным пептидам. Имеющиеся в настоящее время результаты о биологической активности пептидов - фрагментов С-концевой области ин-терферона-а2 человека не позволяют однозначно ответить, являются ли данные пептиды функционально важным эпитопом молекулы ИФН , либо они представляют собой самостоятельные .биологически активные соединения.

Как в случае положительного, так и в случае отрицательного ответа на этот вопрос, данные биологически активные пептиды-фрагменты молекулы ИФН-а2 человека могут быть использованы при изучении механизмов активации, пролиферации и дифференцировки _ по крайней мере лимфоидных клеток. Узкий спектр биологической ак-' тивности этих пептидов, отсутствие Токсичности, наличие специфических пептидных рецепторов на поверхности лимфоидных клеток -все это позволяет рассматривать их как антипролиферативные пре-

1 °5

Вытеснение пептида~1-2738 с участков связывания на клетках МТ-4 пептидами-аналогами

ю

- 100-

Вытеснение (в %)

75

50 -

-8 -7 -6 -5 -4 Ьо£ Концентрации пептидов

. - 16 -

параты, перспективные для использования в медицине.

ВЫВОДЫ

1. Синтетические пептиды-фрагменты молекулы ИФН-«2 человека со 125, 126, 127 по 138 аминокислотные остатки (2538, 2638 и 2738 соответственно) подавляют индуцированную конканавалином А пролиферацию лимфоцитов периферической крови здоровых доноров в модельной системе In vitro. Действие пептидов носит доаозависимый характер. . •

2. Исследуемые пептиды не обладают селективным действием на. CD4+ и CD4" субпопуляции Т лимфоцитов.

3. Пептиды 2538', 2638 и 2738 подавляют интерлейкин-2-8ависимую пролиферацию активированных КонА клеток и не оказывают влияния на секрецию ИЛ-2.

4. Пептиды 2538, 2638 и 2738 подавляют пролиферацию лимфоблас-тоидных клеточных линий МТ4, замедляя переход клеток из фазы Si в S фазу клеточного цикла и препятствуя переходу из S фазы в Бг/М, и СЕМ, препятствуя переходу из S фазы в 6г\М.

5. Радиоактивно меченый пептид 2738 специфически связывается с рецепторными структурами на поверхности клеточных линий МТ4 и СЕМ. Параметры связывания для МТ4 Kdi= 1.32*10"%, Kd2= 2669*10""® число'сайтов связывания 46067 и 555920; для СЕМ Kdl=6.4*10-SM, Kd2=5.2*10_7M, число участков связывания 17Q0 и* 20 ООО соответственно.

6. Пептиды-аналоги из района 124-144 аминокислотной последовательности ИФН а2 человека конкурируют за связывание с общей ре-цепторной структурой. Константа ингибирования варьирует от 5.0*10_5М для самого короткого до 5.8*10_ЭМ для самого длинного из пептидов.

7. Длина исследуемых пептидов коррелирует с аффинностью связывания с мембранной структурой и их биологической активностью. .

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. А.В.Данилкович, К.В.Фрезе, О.С.Таргони, А.Ю.Карулин, А.Ф.Шевалье, М.В.Гусев, Г.Т.Сухих. УГНЕТЕНИЕ'МИТОГЕН-СТИМУЛИРОВАННОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO СИНТЕТИЧЕСКИМИ ПЕПТИДАМИ - ФРАГМЕНТОВ а-2 ИНТЕРФЕРОНА. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины., 11, 1993.

2. А.В.Данилкович, К.В.Фрезе, О.С.Таргони, А.Ю.Карулин, А.Ф.Шевалье, М.В.Гусев, Г.Т.Сухих. УГНЕТЕНИЕ ИНТЕРЛЕЙКИН-2-ЗАВИСИМОЙ ' ПРОЛИФЕРАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 СИНТЕТИЧЕСКИМИ ПЕПТИДАМИ -ФРАГМЕНТАМИ а-2 ИНТЕРФЕРОНА. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,12, 1993.