Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез и исследование иммуномодулирующих пептидов и их конъюгатов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Синтез и исследование иммуномодулирующих пептидов и их конъюгатов"

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИМ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОМ. БИОЛОГИИ НПО "ВЕКТОР"

На правах рукописи

ШЕВАЛЬЕ АЛЕКСАНДР ФЕДОРОВИЧ

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИШУНОМОДУЛИРУЕШИХ ПЕПТИДОВ И ИХ КОННГАТОВ

Специальность C3.Q0.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Кольцово - IS92

Работа выполнена в научно-исследовательском "институте молекулярной биологии

Научный руководитель: кандидат химических наук Самуков В.В.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Петренко В.А.

кандидат биологических наук Таранив A.B.

Ведущая организация: НИИ Экспериментальной кардиологии

КНЦ РАМ

Специализированного совета К 098.08.01 в Научно-исследовательсш институте молекулярной биологии по адресу: 633159, Новосибирская область, п. Кольцово, НПО "Вектор".

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ молекулярной биологии

Автореферат разослан $0 " 992 г.

Ученый секретарь"Специализированного совета, кандидат химических наук Шубина Т.Н.

Защита состоится

" Iwo-ruS 1992 г. в 3 на ааседании

Актуальность проблемы. Одной из актуальных задач современной молекулярной биологии является выяснение механизмов взаимодействия- иммунной (ИС) и центральной нервной (ЦНС) систем организма. Важнейшую роль в этом взаимодействии играют пептидные гормоны -(опиоидные пептида,, нейропептиды) и лимфокины (интерфероны, ин-терлейкиыы). Появляется все больше данных о том, что лимфокины, медиаторы ИС, оказывают непосредственное влияние на функции ЩС. И напротив, такие типичные медиаторы ЦНС, как опиоидные пептиды -р-эндорфин, динорфин, энкефалины - обладают иммуномодулирущими свойствами. Для понимания- природы взаимосвязи ИС и ВДС необходимо изучить механизмы обмена сигналами между этими системами на уровне взаимодействия гормонов и лимфокинов с клеточными рецепторами.

В изучении этого взаимодействия на молекулярном уровне применяются различные, методы: исследование активности фрагментов гормонов и лимфокинов, полученных путем ферментативного расщепления или химического синтеза, направленный мутагенез, химическая модификация, конструирование гибридных молекул. В последнее время активно развиваются иммунохимические метода. Установлено, что некоторые моноклональные антитела к лимфокинам и гормонам ингибиру-ют их биологическую активность, тогда как другие не оказывают такого влияния. Локализация эпитопов для антител обоих типов имела бы большое значение для построения моделей структурно-функциональной организации гормонов и лимфокинов и моделей их взаимодействия с клеточными рецепторами. Однако определение таких эпитопов связано со значительными экспериментальными трудностями и может приводить к неоднозначным выводам при использовании разных методов. Альтернативным подходом для иммунохимического изучения структурно-функциональной организации • молекул является использование антител, место связывания которых точно известно. Такие антитела могут быть получены путем иммунизации животных синтетическими пептидами - фрагментами нативных молекул.

Несмотря на принципиальную возможность получения антипэп-тядных антител иммунизацией.животных свободными пептидами, обычно для. этой цели используют конъвгаты пептидов с носителями, придающими им имиммуногенныэ свойства. В качестве таких носителей применяются белки, полиаминокислоты, некоторые В-клеточные митогены и т.д. Для присоединения пептидов к носителям обычно используют

реагенты, способные реагировать с различными функциональным! группами аминокислотных остатков. Это приводит тс избыточной модификации аминокислотных остатков, не участвующих в формированш ковалентных связей между пептидом и носителем, и к образованш сложной гетерогенной смеси полимеров. В результате искажается антигенная структура пептида и возникают нежелательные гаптеновы« группы с высокой иммуногенностью. Неадекватный мэтод синтеза пептидных конъюгатов может быть основной причиной отсутствия генерации антител желаемой специфичности, т. е, реагирующих как с пептидом, так и с нативной молекулой.

Цель работы заключалась в: (1) синтезе медиаторов ИС и ЦНС -опиоидных пептидов данорфина и р-зндорфина, а также фрагменте] р-зкдорфинз и ГРИ-а2 человека, потенциально вовлеченных в формирование иммуномодуляторных центров; (И) синтезе конъюгатов этга пептидов и получении антипептидных антител; (Ш) использованш полученных пептидов и антител для изучения • иммуномодулирующиз СВОЙСТВ ОПИОИДНЫХ пептидов И 1СТЬа2.

Научная новизна и практическая ценность. Предложена нoвaJ схема блочного синтеза пептидов, основанная на использованш ок-рзшенной 2-[4-(фенилазо)бензилсульфонил]атильной С-концевой защитной группы, облегчающей очистку синтезируемых пептидов. На основе предложенной схемы синтезированы опиоидные■пептиды динорфин I р-зндорфин человека, фрагменты человеческого . лейкоцитарногс интерферона а-2. Разработан новый эффективный способ синтеза бифункционального сшивающего реагента ы-оксисукцинкмидного эфир; з(2-пиридилдитио.)пропионовой кислоты (брор), образующего ковале-ктную связь между ■ е-аминогруппой. лизина и сульфгидрильной : груши цистеина. Разработан эффективный способ синтеза пептидных конъюгатов с белками и' производными и-ацетилмурамилдипептида (ВДП) ттучены антипептидные антитела к фрагментам р-эндорфина ] а-ин.стзферона, реагирукщие с целыми молекулами. С использование! синтезированных пептидов и полученных антител осуществлено функциональное картирована- р-чтадорфина и района 124-14. человеческого интерферона а2 .

Публикации и апробация работы. Но материалам дассертаци опубликовано 6 научных работ, Результаты работы докладывались н;

Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов в 1987Г и на научных конференциях ВНИИ МБ.

Объем работы и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста (содержит 85 страниц основного текста), состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы из 131 наименований , содержит 3 табливд и 16 рисунков.

Содержание работы.

1. Блочньй синтез пептидов.

I.I Стратегия синтеза пептидов.

Для синтеза пептидов были избраны схемы, сочетающие ступенчатое наращивание пептидной цепи активированными эфирами вос-аминокислот и конденсацию пептидных фрагментов в растворе. В качестве С-концевой защитной группы испол^. -вали 2-[4-(фенилазо)-бензилсульфонил]этильную (Pse) группу.

Эта защитная груша, удаляемая основаниями по механизму (3-элиминирования, впервые была использована для синтеза соматос-ТЭТИНа методом активированных ЭфироВ (Diaz et al, 1979). Наш интерес к этой защитной' группе определялся следующими ее достоинствами:

а). Оранжэвая окраска рзетгруппы позволяет легко анализировать полноту протекания реакций и чистоту продуктов ГСХ. •

б), pse-группа снижает .растворимость пептидов в большинстве органических растворителях, в то же время их растворимость в cmf и трифгоруксусной' кислоте остается удовлетворительной. Это позволяет- выделять синтезированные пептида осаждением из реакционной смеси и промыванием осадков водой и органическими растворителями. Такой метод синтеза позволяет сочетать достоинства классического жидкофазного метода синтеза ( небольшие избытки ацилирупцего компонента, возможность очистки промежуточнх продуктов ) с простотой, характерной для твердофазного метода синтеза пептидов.

Поскольку в работе Diaz et al. .Pse группу использовали в комбинации с щелочелабильннми боковыми защитными грушами, которые удалялись одновременно с нею, представляло интерес исследовать возможность сочетания этой группы с кислотолабильными защитными группами боковых радикалов аминокислот в блочном синтезе

пептидов.

В качестве временной n(а)-защитной труппы' в синтезе всех пептидов использовалась Вос-груша. Боковые функции трифункцио-нальных аминокислот, кроме цистеина,. защищались группами, стабильными в условиях удаления Вос-защиты и удаляемых одновременно действием I M трифторметансульфокислоты в трифторуксусной кислоте, содержащей 10% тиоанизола: О-бензил для тьг, ser, туг, 7-беНЗИЛОВЫЙ Эфир ДЛЯ Glu, e-бензилоксикарбонил ДЛЯ Lys, ыс-мезителенсульфонил для Arg. В синтезе фрагментов интерферона остатки ser и Thr вводили в пептидную .цепь с незащищенными гид-рОКСИЛЬНЫМИ Грушами, ДЛЯ Тгр-ИСПОЛЬЗОВаЛИ фОрМИЛЬНую (For) группу. Цистеин защищали s-ацетамидометильной группой, стабильной в условиях синтеза и кислотного деблокирования и селективно удаляемой ацетатом ртути (и).

pse-эфиры аминокислот получали .конденсацией Вое-аминокислот и pse-он с помощью дкциклогег.силкарбодиимида в пиридине с добавлением каталитических количеств 4-димэтиламинопиридина. Продукта очищали хроматографией на силикагелэ. Синтезированные производные аминокислот были гомогенными по данным ТСХ и имели удовлетворительный элементный состав.

Пептидные фрагменты синтезировали последовательным наращиванием с С-.конца п-нитрофениловыми-эфкрами защищенных аминокислот, в случае Boc-Arg(Mts) использовали пентахлорфениловый эфир. Вс всех случаях в качестве катализатора добавляли 2-кратный избыток hobt. Полноту реакции ацилирования анализировали ТСХ. Оранжевые пятна исходного аминокомпонента и продукта реакции хорошс видны на пластинке в видимом и УФ-СЕете. Окрашенная С-защитна* груша не только дала возможность легко наблюдать за протекание* реакций в ходе синтеза, но и придала пептидам слабую растворимость во многих органических растворителях, что позволило очищат! пептиды простым промыванием осадков. Эти наши наблюдения хорошс согласуются с данными Diaz et al.

Выбор длины пептидных фрагментов, синтезируемых методом активированных зфиров, в 5-6 аминокислотных остатков представляете нам оптимальным и дает возможность наиболее полно использоват! преимущества Pse-защитной группы. На первых циклах ацилировэш!

А

эта груша упрощает как выделение продуктов реакции, так и анализ реакционных смесей тонкослойной хроматографией: оранжевые пятна исходного аминокомпонента.и продукта ацилирования хорошо видны на пластинке в видимом и УФ-свете. С другой стороны, защищенные пептида такого размера возможно, в случае необходимости, очистить хроматографией на силикагеле. После удаления pse-группы растворимость фрагментов существенно повышалась, что позволило использовать значительные избытки С-компонента в блочном синтезе. В таблице I приведены последовательности всех защищенных пептидов, синтезированных методом активированных эфиров и блочным методом.

1.2 Ситез дикорфина (I-I3).

Принципиальную возможность использования Pse-ГруППЫ в блочном методе мы проверили на примере синтеза данорфина (1-13). Динорфин синтезировали по схеме: iii(a) + {и(а) + i}. Обозначение пепдидных блоков в соответствии с таблицей I.

Все три пептидных блока, синтезированные методом активированных эфиров, были гомогенны по ТСХ. Для удаления pse-грушзы раствор пептида в водном dmf обрабатывали небольшим избытком водной щелочи. После подкисления полученную смесь Вос-пептидз со свободной карбоксильной группой и 4-фенилазобензилсульфона разделяли колоночной хроматографией на силикагеле. Гомогенность пептидов анализировалась ТСХ и ВЭЖХ, структура подтверждена масс-спектрами/ записанными в режиме бомбардировки быстрыми атомами аргона (fab)...

Пептидные блоки конденюфовали dcc в . dmf в присутствии 5-кратного избытка hobt. Выделение, и анализ продуктов реакции конденсации проводили так же, как и при . ступенчатом методе синтеза. Выходы составили 85-90%.

Защищенный тридекапептид, после удаления Вое- и pse- груш, подвергали полному деблокированию обработкой 1 М CF3SO3H в трифтор-уксусной кислоте, содержащей ю% анизола. Деблокированный пептид очищали ионообменной хроматографией на СМ-целлюлозе. Рехроматог-рафия на TMS-силикагеле дала гомогенный динорфин с выходом 40% в расчете на полностью защищенный тридекапептид.

Гомогенность синтезированного пептида показана аналитической ВЭЖХ , структура подтверждена аминокислотным анализом и масс-спектром (fab), m/z ■ 1603 (М+Н+). Синтетический динорфин обладал.

Таблица I. Структура синтезированных защищенных пептидов.

I. Boc-Lys(Z)-Leu-Lys(Z)-OPse,

IX. Boc-Arg(Mts)-Arg(Mts)-Ile-Arg(Mts)-Pro-OPse IIa Boc-Arg(Mts)-Arg(Mts)-Ile-Arg(Mts)-Pro-OH

III. Boc-Tyr(Bzl)-Gly-Gly-ïhe-Leu-OPse lila Boc-Tyr(Bzl)-Gly-Gly-Phe-Leu-OH

IV. Boc-Arg(Mts)-Arg(Mts)-Ile-Arg(Mts)-Pro-Lys(Z)-Leu-Lys(Z)-OPse

V. Boc-Tyr < Bzl)-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg(Mts)-Arg(Mts)-Ile-Arg(Mts)-Pro-Lys(Z)-Leu-Lys(Z)-OPse

VI. Boc-Arg(Mts)-Ile-Thr-Leu-OPse Via Boc-Arg(Mts)-Ile-Thr-Leu-OPse

VII. Boc-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl )-Lys(Z}-lys(z)-OPse VIla Boc-Leu-Lys(Z)-Glu(OBz1)-Lys(Z)-Lys(Z)-OH VIII Boc-Tyr(Bzl)-Ser-Pro-Cys(Acm)-Ala-OPse VIII Boc-Tyr(Bzl)-Ser-Pro-Cys(Acm)-Ala-OH

IX. Boc-Trp(For)-Glu(OBzl)-Val-Val-Agr(Mts)-Ala-OPse

X. Boc-T-rp-Glu ( OBzl ) -Val-Val-Agr ( Mts ) -Ala-OPse

XI. Boc-Tyr(Bzl)-Ser-Pro-Cys(Acm)-Ala-Trp(For)-Glu(OBzl)-Val-Val-Agr(Mts)-Ala-OPse

XII. Boc-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)Tyr(Bzl)-Ser-Pro-Cys (Acm)-Ala-Boc-Trp(For)-Glu(OBzl^ Val-Val-Agr (Mts)-Ala-OPse

XIII Boc-Tyr(Bzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys( Z ) -

Туr(Bzl)-Ser-Pro-Cys(Acm)-Ala-Trp(For)-Glu(OBzl>-Val-Val-Arg(Mts)-Ala-OPse

XIV. Boc-Arg(Mts)-Ile-Thr-Leu-Tyr(Bzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl) Lys(Z)-Lys(Z)-Tyr(Bzl)-Ser-Pro-Cys(Acm)-Ala-Trp(For)-Glu(OBz1)-Val-Val-Arg(Mts)-Ala-OPse

XV. Boc-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Tyr{Bzl)-Ser-Pro-Cys(Acm)-Ala-OPse -

XVI. Boc-Tyr(Bzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Tyr(Bzl)-Ser-Pro-Cys(Acm)-Ala-OPse

XVII. Boc-Arg(Mts)-Ile-Thr-Leu-Tyr(Bzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl) Ly8(Z)-Lys(Z)-Туr(Bz1)-Ser-Pro-Cys(Acm)-Ala-OPse

XVIII Boc-Leu-Val-Thr(Bzl)-Leu-Phe-OPse

Таблица I (продолжение).

XVIIIa Boc-Leu-Val-Thr(Bzl)-Leu-Fhe-OH

XIX. Boo-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ly s (Z)-Ser(Bzl)-Gln-Thr( Bzl )-Pro-QPse '

XX. Boc-Tyr(Bzl)-Gly-Gly-Phe-Met(0)-OPse XX(a). Boc-Tyr(Bzl)-Gly-Gly-Phe-Met(0)-OH

XXI. Boc-Lys(Z)~Asn-Ala-Ïle-Ile-Lys(Z)-Asn-Ala-Туг(Bzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Gly-Gla(OBzl)-OPse

XXII. Boc-Leu-Val-Thr(Bzl)-Leu-Phe~Lys(Z)-Asn-Ala-Ile-Ile-Lys(Z)-Asn-Ala-Tyr(Bzl)-Lys{Z)-Lys(Z)-Gly-OPse

XXIII. Boc-Tyr(Bzl)-Gly-Gly-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Ser(Bzl)-Gln-Thr(Bzl)-Pro-OPse

XXIIIa Boc-Tyr(Bzl)-Gly-Gly-Flet(0)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Ser(Bzl)-Gln-Thr(Bzl)-Pro-OH

XXIV. Boc-Tyr(Bzl)-Gly-Gly-Met(0)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Ser(Bzl)-Gln-Thr(Bzl)-Pro-Leu-Val-Thr(Bzl)-Leu-Phe-Lys(Z)-Asn-Ala-Ile-Ile-Lys(Z)-Asn-Ala-Tyr(Bzl)-Lys( Z ) -Lys(Z)-Gly-Glu(OBzl)-OPse

полной биологической активностью в тестах на подвздошной кишке морской свинки. (Данные по биологической активности динсрфина (I-'13) получены А.А-.КолоКольцовым, ВНИИ МБ.)

1.3. Синтез р-эндорфима и его фрагментов.

Для синтеза последовательность р-эндорфина была разбита на 4 блока 1-5, 6-13, 14-18 и 19-31. Стратегия синтеза (хха + xix) + (xvnia + xxi) предусматривала получение перед заключительной конденсацией'двух крупных фрагментов, ххи и. ххш (обозначения согласно таблицы. I), которые можно было использовать з дальнейшей работе в качестве самостоятельных пептидных иммуноганоз. Имевшиеся в литературе к моменту начала нашей работы данные по связыванию укороченных с СООН-конца аналогов р-эндорфина (y- и а-эндорфины, эЕр(1-27)) с мембранными рецепторами Т-лимфоцитоз позволили предположить наличие иммуномодуляторного сайта з С-концевой части э-эндорфина. Мы планировали получить антитела к С-концевой части молекулы для картирования возможного иммуномодуляторного сайта э-эндорфина иммунохимическими методами.

Синтез фрагментов был осуществлен по стандартной для

РБе-пептидов схеме, хорошо зарекомендовавшей себя при синтезе ди-норфина. Бы.ча применена тактика максимальной защиты боковых .радикалов трифункциональных аминокислот.

При синтезе С-концевого фррагмента 19-31 возникли осложнения из-за низкой его растворимости. Это не позволило нам синтезировать фрагмент по схеме 8+5 - защищенный октапептид оказался плохо растворим во всех растворителях и их смесях. Удаление рве-группы не увеличило растворимость пептида. Низкую растворимость С-концевых фрагментов.р-эндорфина отмечали все авторы, осуществившие синтез пептида с использованием защитных групп бен-зильного типа. Поэтому было решено осуществить ресинтез .тридека-пептида последовательным наращиванием с С-конца п-нитрофенилсвыми зфирами защищенных аминокислот.

Конденсацию пептидных сегментов проводили ссс/новт методом. Основное внимание было уделено заключительной конденсации (фрагментов ХХШа и XXII). Чистота обоих фрагментов-была оценена аналитической ВЭЖХ после полного деблокирования аликвоты пептидов. Был исследован ряд параметров протекания реакции: время, растворители, избытки реагентов, температура. После обработки реакционной смеси стандартными для Рэе-пептадов методами, сырой продукт содержал значительный избыток сегмента ХХШа. После полного деблокирования з 1 II трифторметансульфокислоте в трифторуксусной кислоте, содержащей 10% тиоанизола, продукт очищали гель-хроматографией на колонке с тбк т»-40 , распределительной хроматографией на сефадексе в-25 в системе н-бутанол- пиридин- 0.1% уксусная кислота (5:3:11) и обращенно-фазовой хроматографией на колонке с Полисил С-8 в градиенте ацетонитрила в о,1% фосфорной кислоте.

Выделеный р-эндорфин был гомогенен по данным аналитической ВЭЖХ и имел удовлетворительный аминокислотный состав. Дополнительное подтверждение структуры получено последовательным отщеплением нескольких аминокислотных остатков с и-конца методом Эдма-на и сравнением с коммерческим препаратом аналитической ВЭЖХ а также по иммугохимическим свойствам

1.3. Синтез фрагментов последовательности

"человеческого лейкоцитарного интерферона а-2.

К настоящему временя накоплено достаточное количество данных, позволяющих предполагать о вовлечении С-концевой части молекулы iFN-a2 в проявление его биологических свойств. Выбор конкретной области 124-144 молекулы iFN-a2 для синтеза объясняется несколькими причинами, (i) аминокислотный остаток cys-138 вовлечен з формирование важной 'для проявления биологических функций iFN-a2 s-s связи,- (ii) Анализ гомологии последовательностей интерферонов показывает, что участок 120-145 консервативен во всем семействе лейкоцитарных интерферонов и более чем на 60% гомологичен соответствующему участку ifn-p . Интересно, что последовательность

129-133 ifn-a2 СОЗПЗД29Т С ПОСЛеДОБЗТвЛЬНОСТЬЮ 16-20 а-ТЙМОЗИНЗ и, кроме того, соответствует глобальному максимуму на профиле гидрофильности iFN-a2 (рис.1). Еесьма вероятно, что выбранный для синтеза участок аминокислотной последовательности может быть существенным для проявления биологической активности ifn-<x2.

Для ситнеза аминокислотная последовательность 124-144 iFN-a2 была разбита на 4 сегмента 124-127, 129-133, 134-138 и 139-144. Защищенные сегменты (vi)-(x) (см. таблицу I) синтезировали методом активированных зфиров в растворе. При разбиении на блоки (схема I) учитывали возможность синтеза субфрагоентов с различным расположением участка 130-135.

Синтез пептидов осуществляли также, как и синтез фрагментов динорфина и р-эндорфина. вос-защиту удаляли растворением пептидоз в безводной трифторуксусной кислоте при i-5°C, при деблокировании тирозин- и триптофан-содержащих пептидов добавляли 5% анизола и з% трифенилфосфина. Чистота пептидных блоков, использованных з синтезе фрагментов ОТ-а2, анализировалась ТСХ, структура подтверздена аминокислотным анализом.

Для получения пептидных сегментов со свободной карбоксильной группой, pse-защиту удаляли зо% пиперидином в диметилформамиде, смеси разбавляли этилацетзтом и экстрагировали 5% раствором лимонной кислоты для удаления пиперидина и его аддукта с 4-фенилазобензилвинилсульфоном. После упаривания растворителя получали Вос-пептиды, гомогенные по данным ТСХ и аналитической ВЭлХ. Строение синтезированных сегментов подтверждено данными аминокислотного анализа и масс-спектрами fab.

Е 6

о

«ъ

£

I

40 80

Номер аминокислоты

/

160 \

\

\

/

ин(т-1чч) IFW ¡.124-135) 1fn (124-138)

IFN (т-т)

IF N(<29-f38)

12ч т

«ITLYLKEK KYSPC (Acm) AWEVVRA RITLYLKEKK RITLYLKiKKY5PC(Acm) A

yspc(A&»i)AWE"vra LKEKKYSPC (Acm) AWEVVRA LK£KWSf C(Acm)A

Рис.I Профиль гкдрофкльности IPN-a.2, постоенный ПО Hoop & Woods. Для удобства профиль • поднят на три единицы. Ниже приведены последовательности синтезированных фрагментов.

Сборку пептидов 124-138, 129-144, 124-144, 124-133 и 134-144 из полученных запхшценных сегментов поводили бсс/новт методом в соответствии со схемой 1. Продукты конденсации очищали переосаждением из оме в ацетон или этилацетат. Гомогенность защищенных пептидов оценивали аналитической ВЭЖХ (с пептидов предварительно удаляли рэе- и Вас-защиты для повышения растворимости в хроматогрг фических системах).Выходы пептидов составили 85-95%, их аминокислотный состав соответствовал ожидаемому.

ю '

Схема I. Синтез фрагментов Г?Я-а2

По окончании синтеза с пентидов удаляли последовательно вос-и рзе-защитн и деблокировали I М метансульфокислотой в трифторук-сусной . кислоте, содержащей ю% тиоанизола и 5% м-крезола. После осаждения зфиром пептиды очищали гель-хрсматографиэй на сефадексз с-15 и препаративной обращенно-фазовой 1 хроматографией на тмг-силикагеле. Чистота пептидов, по данным аналитической ВЭЖХ, была не менее 97-98% структура подтверждена данными аминокислотного состава.

2. Синтез ши/щногвнныг ксныогатов 2.1 Сишез коньогапов петолЗов с белкам. В качестве общего подхода для получения конъюгатоз мы выбрали использование бифункционального реагента и-оксисукцикшидного эфира з-(2-пиридилдигио)пропионовой кислоты (брор), образующего козалентную связь между е-аминогруппами лизина и сульфгидрильными группами цистеина. Был разработан эффективный метод синтеза этого реагента из 3-меркаптопропионовой кислоты и г-пиридилсульфенил-

хлорида, получаемого хлорированием 2.2'-дипиридалдисульфида непо средственно перед синтезом. Ключевое соединение з-(2-пиридилдитио)пропионовая кислота, легко выделяется в крис таллическом виде с выходом 90%. Конденсация этой кислоты ы-оксисуквднимидом в присутствии осс дает целевой реагент брбр выходом 80%. Разработаная схема намного эффективнее оригинально го метода синтеза брор (каг18оп еЬ а1.,1978 ).

Ка первом этапе синтеза конъюгатов пептидов, с помощью брп ацилируют е-аминогруппы лизиков белка-носителя и получают ацили рованный белок, содержащий стабильные реакционносособные дитиопи ридильные (рор) группы. Ацилированный белок мошо хранить неог раниченное время, поэтому в серии экспериментов по синтезу имму ногенов можно использовать один и тот же препарат, что повышае воспроизводимость результатов при получении антисывороток.

Количество введенных в белок рор-групп в конечном счете оп ределяет эпитопную плотность антигена на белке-носителе, моменту начала настоящей работы не было описано получение высок нагруженных конъюгатов с помощью брор, что, возможно, и объяснял редкое использование реагента. В настоящей работе были получен носители, несуще эо-35 молекул рбр на 1 молекулу вэд. Степен модификации определяли по высвобождению тиопиридона при реакции дитиотреитом.

Предложенная схема синтеза конъюгатоз • предполагает наличи остатков суэ в аминокислотной последовательности пептида. В случае его отсутствия в природной структуре белка, остаток суэ дол жен быть введен в пептид с его ы- или С-конца.

В процессе синтеза пептидов сульфгидрильную группу цистеин защищали Б-ацетамидометильной (дет) группой, стабильной в ' уело виях синтеза и кислотного деблокирования и селективно удаляему] ацетатом ртути непосредственно перед получением конъюгатов. Ион нд2+ осаждали сероводородом и после удаления избытка н2б пепти, немедленно использовали для конъюгации. Оказалось, что для полу чения максимально нагруженных пептидом конъюгатов необходимы зна чительше избытки пептида по отношению к ацилированному белку Использование 14С-меченных пептидов показало, что не. происходи потери материала при осаждении нд?. Исследования с пептида

ifn(129-144) не выявили образования пептидных димеров в процессе удаления Acm-защитной группы. Возможной причиной низкой эффективности конъюгации является экранирование гидрофобных PDP-групп на молекуле белка-носителя. Действительно, конъюгация пептидов с ацилированным bsa в 7 M мочевине, хорошо растворяющей и пептиды и ацилированный bsa, значительно увеличила выход реакции . Количество связанного пептида определяли по накоплению в растзоре 2-тиопиридона, по данным аминокислотного анализа и по включению радиоактивной метки, причем все три метода дали практически одинаковые значения. Конъюгаты, полученные таким образом,- содержали 22-28 моль пептида на i моль белка.

2.2 Синтез бифункциональных штуногенов на основе МДП.

Стабильность и высокая специфичность дитиопиридильной группы позволяет включать ее В' состав различных кммуномодуляторов, например, производных Ы'Эцетилмурамилдипептида (МДП). Это дает возможность направленного синтеза пептидных кммуногенов, несущих в своем составе антигенную детерминанту и адьювзнтную часть. В настоящее время описаны бифункциональные антигены, со,держанию в качестве адьювантной части производные МДП ( seia et ai.) или полимерные полиэлектролиты (Р.В. Петров и др.). Tarais производные были получены с помощью неспецифических конденсирующих реагентов, что может приводить к изменение антигенных свойств пептидов. Мы предлагаем использовать для синтеза таких бифункциональных антигенов производные ЬЩП, несущие 2-тиопиридильные группы. Структуры этих производных и схемы синтеза показаны на рисунке 2. Дитиопи-ридильная группа в обоих производных присоединена через спейеер к карбоксильной группе остатка а-глутзминозой кислоты. В ряде рз?эт было показано, что концевая карбоксильная группа МДП может бкть этерифицирована или амидирована, или присоединена к другой аг-езю-кислоте без изменения биологической активности молекулы МДП. Следовательно, можно было ожидать, что синтезированные производив МДП должны сохранить эдыовантные свойства.

Полученные реакционноспособные производные ЫДП были использованы нами для синтеза конъюгатов с фрагментом 136-147 гемаг-глютинина вируса гриппа A/Âichi/2/68 (H3N2 серотип). Пептид Следующую структуру: Ala-Ser-Asn-Cys(Асш)-Lys-Arg-Gly-Pro-Giy-ser-Giy-Phe. Синтез прозодили блочным методом с использоза-

/ "НАС ' . сн ОН си^камяил-со-ж-си-св-лг

Ц (СНг)

к^Г^-он / X со**акоок

■/лис Г2-

сн,-сн-с0"(«-с1н»-ж-см-«н»н1 г (¿г—¿1—_

СН,

.¿ООН

МНР •

Схема I. Синтез ^аиетилиурамил-/-ал;>нил<4-изогл5ТЗМ11нид-/-5-(2-пнрн-днлтио)'цистсина (Л).

дрор ,

Ж

■ сн2ои

сн^сн-

I . .

Сдои 2. Синтез НК-ацетилиурамлл^алаш1л-й-нзоглуташшзиндо)-В-[-3-(2-[1ир||Дш-дитио)'пропно»лмидо] гексаиа (II).

Рис.2. Схемы синтеза активированных производных мор. нием рзе-грушш. Реакцию НА(136-147) с'производным МДП проводил:! в 1 М уксусной кислоте, продукт выделяли хроматографией на колон--ке с тбк на-4 о и анализировали ВЭЖХ.

3. Антигенные и шьщногекные свойства пептидов и конъюгатов.

Синтезированные Б-дст-фрагменты а-2 интерферона реагируют в твердофазном иммуноферментном анализе с иммуноглобулиновой фрак-

1 4

цией кроличьей антисыворотки против ifn-«2 (рис. 3). Специфичность реакции доказана методом конкурентного радиоиммуно-анализа (рис.4). В качестве 1^51-меченого пептида был выбран наиболее протяженный фрагмент 124-144, - содержащий 2 остатка тщзозина. Характер конкуренции пептидов 124-144 и 129-144 с [1 з -пептидом 124-144 сходен, пстоо ипгибирование связывания метки наблюдалось при низких концентрациях свободных пептидов. Полученные данные свидетельствуют о локализации в участке 124-144 как минимум одной антигенной детерминанты. Эта антигенная детерминанта, по-видимому, не является .иммунодоминантной, так как связывание пептидов в твердофазном КФА наблюдается только при высоких суммарных концентрациях иммуноглобулинов (рис. 3). Сопоставляя результаты по связыванию пептидов с высоким значением локальной гидрофильное^ района 124-144 (рис. I ), мы пришли к выводу, что профиль гидрофильности хорошо предсказывает поверхностную локализацию участков последовательности ifn-oi2, но не расположение иммунодоминантных эпитопов.

Иммунизация животных синтезированными пептидными конъюгатами привела к получению антипелтидных антител с высоким титром к свободному пептиду. Наиболее интересным было оценить перекрестную реакцию пептидных антител с нативными белками. Исследование. про-зеденное Мизенко Г.А. и Каргаполовой H.A., показало, что анткпеп-тидная антисыворотка к НА036-147) связывается с молекулой гемаг-глютинина (НА) и нейтрализует вирус A/AJchi/2/68 в тестах in vitro. Необходимо отметить, что одновременно с нашей работой, ряд исследовательских групп предпринимали безуспешные попытки получения антител к этому участку молекулы НА с использованием кснъюга-тов, синтезированных с помощью традиционных сшивающих реагентов. Полученные результаты по связыванию антител с НА свидетельствуют о преимуществах синтезированных нами коньюгзтов."

Антисыворотки, полученные к конъюгатгм фрагментов ifn(i24-

138) И IFN(129-144) С BSA, ВЗаИМСДвЙСТВуЮТ С XFN-a2, ЕММОбИЛИЗО-ванным на подложке. Связывание наблюдается при разведенки знти-сыворотки до 1:юооо (рис. 5) и специфически ингибируется добавлением свободного пептида, (рис. 6).

4. Функциональное картирование района 124-144 ГРК-а2 и С-концевого участка ß-энЗорфина.

1.5

1

0,5

Ц (ранение

Рпс. 2

"т J

J . 5 7

- (д [Ргз!еЗехи( антаснйоретт)

Рис. 4

Шзибани/ иппки, % 100

ЯТ -

ю ш

Рис. 3

>76 'л -Ез[«лшк?],И

Рис. 5

Рис.3.Связывание 8нтк-(1РИ-а2)-1еС с иммобилизованными антигенами^ 1РЫ-а2 (1), (124-144) (2), ОТ-(129-144)0), Ш-(124-138) (4) и с луккэмк планпетов, обработанных БСА (5). 125

Рпс.4.Конкурентное ингибироваиие связывания 1-меченного пептида 1?К-( 124-144) с ентк-(Ш.т-а2) пептидами ОТ-(129-144) (1) и ОТ-(124-138) (2)

Рис.5.Связывание иммобилизованного 1РК-а2 с кроличьими сыворотками* £л:т;:-1?П-(124-138) (1 ), анти-ОТ-(129-144)(2), нормальной сывороткой (3). Кр::ьыо показывает связываьг/э антипептидных сывороток с

.-/^•^м;: гглакгета без 1.-'1\'-о.2.

Рпс.б.'/.нгиб^сБэкпе пепткдеш: 1?И-( 124-138) и ,Ш.т-( 129-144) связыва-: г.? с зк г-:сго 1ГК-а2 с кроличьими сыворотками акти-1Г'Ы-(124-

'З?) (1), акт::-!-; М-(1 29-144) (2), нормальной сывороткой (З).ИнгиСиро-2с;;:;:;: определялось с ;::подьзовак;:е:.! того :т:э пептида, против которог гтслучвнэ данная акгпсивзрстка.

3

2

1

О

Антисыворотки к конъюгатам синтетических пептидов с bsa содержат поликлональные антитела, направленные к одному определенному участку молекулы ifn. Поэтому представлялось логичным сравнить влияние полученных наш антисывороток на ifn с имеющимися данными по действию моноклональных антител. Известно, что среди моноклональных антител (Мзь) к ifn одни ингибируют его антивирусную активность, тогда как. другие не оказывают такого влияния. В качестве критерия нейтрализующей активности ранее было предложено использовать количество единиц (н) активности ifn, уменьшающееся до единицы под действием определенной концентрации антител нейтрализующей активности. Для всех Mab существует предельнее значение Nmax, не увеличивающееся с дальнейшим ростом концентрации антител. Так™ образом, значение индекса Nmax может служить удобной количественной характеристикой нейтрализующей активности Mab и антипептидных антисывороток. При разведении 1:30 значение Nmax находится в пределах 40-60 для обеих антипептидных ак:исыво-роток. Для широко применяемых мэЬ кх-2, обладающих нейтрализующей активностью, значение Nmax равно ю. Для других антител значения лежат в пределах от so до 250 (рис 7). Таким образом, полученные антисыворотки ингибируют антивирусную активность ifn-<x2.

Чтобы выяснить, вовлечен ли участок 124-144 непосредственно в формирование функционально важных доменов, отвечающих за прояв-

150

{00

50

Н*

ЛИ

Рис.7 Ингибированиэ антивирусной активности XFN-a2 монок-лональными и антипептидными антителами. Значения Nmax для Mab приведены по Kawade У.,1985 1-анти-1ГЫ(156-165) г-анти-EPN(129-144)

3-aHTH-rPN<124-138)

4-Mab NK-2;

5-ЫаЪ 3001;

6-МаЬ 03; 7-Mab НТ1

ление антивирусной активности молекулой ifh-<x2, мы попытались определить антивирусную активность синтезированных пептидов. Ни один из пептидов в концентрации до 1 мг/мл не обладал такой активностью и не ингибировал антивирусную активность ifn-o2.

Из получаних нами данных трудно сделать однозначный вывод о причине нейтрализующей■активности антисывороток. В ' этом смысле интерпретация отрицательных результатов была бы более простой задачей. Так, ранее было показано, что для антипептидных антител к участку 156-166 значение ытах равно 1, т.е. эти антитела не ингибируют антивирусную активность интерферона. В результате был сделан вывод, что С-концевой участок 156-166 находится на поверхности, но в отдалении от функционально важных доменов. В последствии эти выводы были подтверждены методами локализованного мутагенеза.

Теоретические модели предсказывают существование в молекуле iFN-a2 не менее двух конформационных центров, отвечающих за ее антивирусную активность. Один центр"предположительно локализован з nh2-концевой части, второй может располагаться в СООН-конце молекулы. Почти во всех моделях функциональной организации интерферона в состав одного из этх центров вовлечены и некоторые аминокислотные остатки , входящие или примыкающие к области синтезированного нами фрагмента ifn. Нейтрализующий эффект антипептидных антисывороток можно объяснить стерическим .экранированием "активного центра", находящегося в непосредственной пространственной близости от синтезированного наш участка молекулы, либо взаимодействие с антителами препятствует конформациснным изменениям, необходимым для взаимодействия ifn со своим клеточным рецептором.

Для определения цитостатического действия фрагментов ifn-o2, Т-лимфоциты или мононуклеарные клетки из сыворотки здоровых доноров инкубировали с синтетическими пептидами или ifn-<x2 в присутствии ФГА и il-2. Оказалось, что пептид 124-138, как и целая молекула iFN-a2, ингибирует пролиферацию Т-лимфоцитов человека, индуцируемую поликлонзльными стимуляторами (рис.8).

Предварительная обработка клеток ФГА .или il-2 блокирует ан-типролифератизную активность как пептида 124-138, так и ifn-<x2.

tpmieao (ООО

£2

Ш

Z3456789

ч с ерш I0V0

СмГП 1003

-1—гтгтттп-г—г-гттгттг—г-г

10"

10"

10"

м

Рис.8 Антипролиферативное действие синтезированных в работе фрагментов 1РЯ-а2. ■ (Результат совместной работы с Данилкович A.B.) А.Б-пролиферация Т-лимфоцитов в присутствии ФГА, 2мкг- мл (А) или IL-2-,20 U мл и пептидов; I-пролиферация клеток только в среде, 2- в присутствии только мктогена; 3-ЮТ-а2; 4-XPW(124-144);5-n?N(129-144); 6-IFN(124-133); 7-IPN(129-138); 8-I?N(124-133); 9~IPN(134-144)-

М1/МИН 1000

öema— энЭ.

15

10

rfi

п

энЗ. 19-31

Дин А '-I3

А Б

д

1 - Cpeöa 2 - Kot*. Конценпрации беицестб : А

Рис.Э Антипролиферативное действие опиоидных пептидов.

-5

10 М: 5 - Ю М:

С - 10~7М: Д

10"® М

Интересно, что пептид 124-144, включающий в себя аминокислотную последовательность 124-138, антипролиферативной активностью не обладает. Возможно, что добавление гидрофобного фрагмента 139-144 препятствует взаимодействию пептида с клеточным рецептором.

Действия пептида хгм124-138 носят дозозависимый характер, причем зависимость пролиферативного ответа от концентрации пептида и :тт-а2 имеет идентичный характер, различается только диа-позон концентраций, в которых проявляется антипролиферативное действие. При совместном воздействии 1ЕЛ-а2 и пептида на Т-лимфоцг.ты наблюдается усиление анткпролиферативного эффекта.

Полученные данные позволяют предположить, что район 124-138 1гы-а2 непосредственно вовлечен в формирования активного центра, отвечающего за проявления антипролиферативного действия гга-иг. Доказательством такого предположения является обнаруженное ингибирование антипролиферативного действия и (124-138) знти-1ЕГ1-( 124-138) иммуноглобулинами. Одновременное влияние антипептидных антител на антивирусную и антипролиферативную активность' 1Ж-а2 хорошо согласуется с данными последних работ показавших, что моноклональные антитела, ингибирующие антивирусную активность 1РЫ, ингибхдэуют и его антипролиферативные свойства.

При воздействии на периферические Т-лимфоциты опиоидных пеп тидов динорфина, р-эндорфика и его С-концевого фрагмента также наблюдалось ингибирование пролиферативного ответа лимфоцитов на поликлональную -стимуляцию (рис. 9). Интересно, что антипролифера-тизное действие фрагмента р-эндорфица сравнимо с таковым для целой молекулы гормона, а антитела против фрагмента Ер(19-31) полностью блокируют влияние обоих пептидов на пролиферативный ответ Т-лимфоцитов. Эти наблюдения подтверждают гипотезу о локализации иммуномодуляторного сайта р-эндорфина именно в его С-концевой области. Необходимо также отметить, что, как видно на рис. 9, при уменьшении концентрации опиоидных пептидов, наблюдаемая картина оказалась сложнее: в зависимости от донора происходила либо активация, либо ингибирование пролиферативного ответа.

Вывода.

1. Предложена новая схема синтеза пептидов в растворе, основанная на использовании щелочелабильной 2-[4-(фенилазо)бен-зилсульфонил]этильной С-концевой защитной группы в сочетании с кислотолабильнкми защитными группами боковых радикалов трифункци-ональных аминокислот. На основании предложенной схемы осуществлен синтез динорфина (I-I3), р-зндорфина человека и пептидных фрагментов человеческого лейкоцитарного интерферона а2.

2. Разработан новый способ синтеза бифункционального спивающего реагента - N-окснсукцинкмидкого эфира 3-(2-придилдитио)про-пионовой кислоты. Предложены эффективные способы синтеза пептидных конъюгатов с белками и производными ы-ацетилмурамил-ь-алакнл-D-изоглутзмина.

3. Показано, что антитела к фрагментам 124-138 и 129-144 аминокислотной последовательности XFN-a2 обладают способностью ингибировать его/антивирусную и антипролкферативную активность.

4. Показано, что не один из фрагментов района 124-144 1?и-а2 нб обладает антивирусной активность®.

5. Показано, что из 6 синтезированных фрагментов ipic-o.2 только пептид, соответствующий аминокислотным остаткам I24-I3S последовательности ОТГ-<хг' обладает способностью кнгкб^овгт!-пролиферацию Т-лимфоцитов.

6. Обнаружено, что описидные пептида динорфин А, р-эндорфпн, а также С-концевой фрагмент 19-31 р-эндорфкка обладает способностью ингибировать индуцируемую митогенами пролиферацию Т-лимфоцитов.

7. Показано, что антитела к фрагменту 19-31 р-эндор^г-ка ингибируют антипролиферативную активность р-эндорфина и -его С-концевого фрагмента.

Основное содержание диссертации изложено в работах:

1. Самуков-В.В., Калашников В.В., Офицеров В.И., Швзлье А..Ф. Синтез пептидных фрагментов гемагглютинина вируса грипп A/Aichl /2/68 (H3N2)//Биооргач. химия.- 1985. Т.Н. К 8. C.I037-I047.

2. Самуков В.В., Офицеров В.И., Швалье А.Ф. Способ получения 3(2-тридилдитио )пропионовой кислоты.// A.c. СССР и II52953. Билл.

Изобр. N 16. 30.04.1985.

3. Швалье А.Ф., Офицеров В.И., Самуков В.В. Новый синтез 3(2-пиридилдитио)пропионовой кислоты //Журн. общ. химии. 1985. Т. 55. N.9. С.2152.

4. Шевалье А.Ф., Поздняков П.И., Самуков В.В. Синтез производных н-ацетилмурамил-1-аланил-а-изоглутамина, содержащего активированную дксульфидную связь.// Химия природ, соед. 1989. N.3 С.387-391.

Мизешсо Г.А., Колокольцов А.А. Иммунохимические и биологические свойства синтетических пептидных фрагментов последовательности 124-144 лейкоцитарного интерферона человека о2.// Биоорган, химия.- 1990. Т.16. N.7. С.916-926.

5. Danilkovich Д., Freze К., Shevalier A., Samukov v., Kirkin А., Gusev м. Synthetic peptide with antiproliferative activity: a short G-terminal fragment of the human interferon <*-2 molecule, //imminol. Letters. 1991. v:31. P.15-20.

4. Шевалье А.Ф., Самуков В.В., Офицеров В.И

• >

Калашников В.В.,