Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитотоксическое действие конъюгатов блсомицина с инсулином и пептидами, содержащими последовательность RGD

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Цитотоксическое действие конъюгатов блсомицина с инсулином и пептидами, содержащими последовательность RGD"

^ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

° НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ

иэ ИНСТИТУТ БИОМЕДИЦИНСКОЙ химии

На правах рукописи УДК 615.355:577.152.34].03:617.7

БОЩИННИКОВ Евгений Исаакович

"Цитогоксичсскос действие кеншогатои блсомицина с инсулином и пептидами, содержащими последовательность

(специальность 03.00.04 - биологическая химия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1996

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В НИИ БИОМЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: академик РАМН, профессор А.И. Арчаков

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

зав. лабораторией модификаторов и протекторов .противоопухолевой терапии Московского научио-исслсдоватсиьского онкологического института им. П.А. Герцена, д.б.н., профессор Р.И. Якубовская;

зав. лабораторией биосинтеза белков НИИ биомсдицинской химии РАМН, д.б.н. А.Е. Берма!I.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова.

Защита диссертации состоится "¿^ " ^ 1996 р. в № часов на

заседании Диссертационного Совета Д 001. 10. 01 при НИИ биомсдицинской химии РАМН по адресу: 119832, Москва, ул. Погодинская, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ биомсдицинской химии РАМН.

Автореферат разослан "¿0" роА}^1996 г.

Ученый секретарь Диссер тационного Сове кандида т биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Направленное уничтожение клеток определенного тина является одной из важных задач этиотропной терапии различных заболеваний. Идея о возможности направленного уничтожения чужеродных клеток в организме "магическими пулями", представляющими еобой токсические вещества, связанные с носителями, была высказана еще в начале века П. Эрли-хом (Ehrlich Р., 1956) и получила развитие в 70-е годы благодаря изучению механизмов действия растительных и бактериальных токсинов, лекарственных препаратов, разработке методов ковалентпого конъюгирования белков и получению'высокоснсцифичных конъюгатон антител.

Цитотоксипы направленного действия - это особый тин фармакологических препаратов, позволяющий избирательно убивать клетки-мишени. Они представляют собой гибридные молскулГл, или копъюгаты, состоящие из кова-лентпо связанных токсического и адресного фрагментов, причем последний обеспечивает направленную доставку токсина к клсткс-мишепи (LoBuglio & Salch, 1992). В качество адресного фрагмента питотоксинов обычно используют лсктипы, гормоны, антитела и их РаЬ-фрагмепгы. В качестве токсических фрагментов используют токсины растительного и бактериального происхождения (абрин, рицин, модецип). Кроме того, широко исследуется направленная доставка к клеткам-мишеням ферментативно-активпых веществ (например, пнокозоок-сидазы, генерирующей перекись водорода), лекарственных препаратов, таких как антимстаболиты (мстотрсксат), алкилирующис агенты (хлорамбуцил), некоторые антибиотики.

Однако разрабатываемые до последнего времени цитотоксипы направленного действия обладают высокой молекулярной массой. В литературе имеются примеры использования пизкомолскулярных веществ в качестве токсических частей конъюгатон с адресными фрагментами белковой природы, но практически отсутствуют исследования, посвященные цитотоксинам с пизкомолску-

ляриыми адресными фрагментами. Тем не менее, именно высокий молекулярный нее обуслашшпает существенные недостатки имеющихся на сегодняшний день цитотоксинов направленного действия. Они вызывают значительный иммунный ответ, в большой степени подвержены протеолизу и самоипактивации, что уменьшает их время циркуляции в организме. Требуются их значительные дозы для достижения терапевтического эффекта. В связи с этим, несмотря на активные исследования в области создания высокомолекулярных нитогоксинов, в клинической практике они не применяются. Поэтому^главной задачей данного исследования являлось создание цитотоксинов, обе части которых имеют малый молекулярный все, и исследование их в экспериментах па куль туре клеток.

В качестве пизкомолскуляркого токсического фрагмента коныогатов был выбран антибиотик блсомицин, относящийся к классу гликопептидов. Блсоми-цип, хслатируи ионы металлов переменной валентности, генерирует активные формы кислорода в окислительно-восстановительном цикле, подобном моноок-сигспазпому циклу цитохрома Р-450 (Murugcsan ct al, 1983; Burger el al., 1994), которые способны повреждать различные клеточные структуры в каталитическом режиме.

В качестве пизкомолекулнрпых адресных фрагментов цитотоксинов решено было использовать низкомолскулярпыс пептиды. Первым шагом па пути создания низкомолскулярных селективных цитотоксинов является синтез кошло-гата блсомиципа с инсулином - полипецтидным гормоном, рецепторы для которого экснрсссируются, в частности, клетками лимфоцитарпого ряда. Цитоток-сичсская активность этого копъюгата при действии на гимоциты мышей оказалась в 3 раза выше активности псконыогированпого блсомицина.

Однако, поскольку инсулин является достаточно крупным природным полипептидом, решено было исследовать цитотоксичсскую активность конъюгатов блсомицина с синтетическими низкомолскулярными пептидами, содержащими последовательность RGD. Рецепторы, лигапды которых содержат последовательность RGD, экспрсссируются клетками, способными к адгезии (фиб-

робластами, зпитслиоцитами, тромбоцитами и др.) (D'Souza ct al„ 1991). В качестве адресных компонентов конъюгатов были синтезированы следующие RGD-содсржащис пептиды: RGD, RGDS, е-аминокапройл-RGD, е-аминокаироил-RGDS и цикло-RGDdFK (где dF обозначает D-фспилалапип).

При синтезе высокомолекулярных цитотоксинов исследо7шсли, как правило, не определяют конкрегного места связывания копыогируемых белков и их точного соотношения. При синтезе низкомолекулярных конъюгатов неконтролируемая модификация реакционно-способных групп пептидов и блсомипипа можег привести к потере активности обоих компонентов конъгогата. В связи с этим была поставлена задача выбрать участки снизывания блсомиципа с адресными пептидами, оптимальные для сохранения биологической активности как блсомипипа, так и пептидов, и разработать метод синтеза выбранной структуры. Необходимо было определить состав получаемого коныогата и выяснить, какие рсакциопно-еиособцыс группы участвуют в реакции конъюгации. Таким образом, одной из важнейших задач при синтезе коныогата блсомипипа с пептидами являлась возможно более точная характерист ика получаемого продукта реакции.

Цель настоящего исследования: Получить коныогаты блсомипипа с инсулином, пептидами RGD, RGDS, е-аминокапроил-RGD, е-аминоканроил-RGDS и цикло-RGDdFK, обладающие повышенной, по сравнению с блсомици-ном, цитотоксичеекой активностью.

Конкретные задачи исследовании:

1. Синтезировать пептиды RGD, RGDS, Е-аминокапроил-RGD, е-амино-капроил-RGDS и цикло-RGDdFK.

2. Получить цитотоксичсски активные коныогаты блсомиципа с инсулином, пептидами RGD, RGDS, е-амииокапроил-RGD, Е-аминокапроил-RGDS и цикло-RGDdFK.

3. Исследовать циготоксичсскую активность конъюгатов блсомиципа с

/

инсулином, пептидами RGD, RGDS, Е-аминоканроил-RGD, е-аминоканроил-

RGDS и никло-R-GDdFK 11а культурах клеток и сравнить сс с активностью нсконъюгированного блсомипина.

Научная новизна и практическая значимость предлагаемой работы состоит в том, что впервые были получены цитотоксины направленного действия, обе части которых представляют собой низкомолскулярныс сосдиниепия.

Была выбрана определенная структура коныогатов блсомицина с пептидами, при образовании которой сохраняются цитотоксичсские свойства блсомицина и адгезивная активность пептидов. Разработан метод ковалептиого связывания блсомицина с пептидами, при использовании которого в реакции конъюгации участвует- амипогру!ша концевого амина молекулы блсомицина и аминогруппы пептидов.

Получены копыогаты блсомицина с инсулином, пептидами RGD, RGDS, е-аминокацроил-RGD, Е-амипокапроил-RGDS и цикло-RGDdFK. Копъгогат блсомицина с инсулином оказался а 3 раза более активным по сравнению с нскопъюгировапным блсомицином. При использовании линейных RGD-содер-жащих пептидов в качестве адресных фрагментов коныогатов не было получено увеличения цитотоксичсской активности по сравнению с псконъюгироваипым. блсомицином, в то время как использование циклического пептапентида цикло-RGDdFK в качестве адресного фрагмента позволило добиться увеличения цитотоксичсской активности в 8.3 раза.

Таким образом, показана возможность создания копыогатов-цитотокси-нов направленного действия, обе части которых, и токсическая, и адресная, представляют собой низкомолскулярныс вещества.

Апробации диссертации состоялась 9.10.1996 на совместной конференции НИИ биомедицинской химии РАМН и и кафедры биохимии медико-биологичс-ского факультета РГМУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы.

Структура н объем работы. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, включая 27 рисунков и 4 таблицы. Состоит из введения, обзора литературы, глав, содержащих описание материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Пептиды RGD, RGDS, е-аминокапроил-RGD и е-амипокапроил-RGDS были синтезированы с использованием методов классического пептидного синтеза в растворе. Продукта очищались с помощью высоковольтного электрофореза на бумаге.

Пептид RGDdFK был син тезирован твердофазным методом с использованием Fmoc-стратсгии. Была использована кислотолабильная смола с присоединенной нерпой аминокислотой Fmoc-Lys(Boc)-Sasrin-Rcsin. Пептид был снят со смолы с сохранением боковых защитных групп и циклизован по концевым амипо- и карбоксильной 1руппам с образованием пептидной связи с использовД-пием дифснилфосфорилазида в качестве конденсирующего агента. На каждой стадии синтеза продукты очищались с помощыо высокоэффективной обратно-фазовой хроматографии.

Синтез кош.югатод блсомицина с RGD-содсржащими пептидами осуществлялся двумя способами. При синтезе конъюгата блсомицина с RGD-пепти-дом твердофазным методом RGD-псптид был синтезирован но Fmoc-стратсгии. Далее иммобилизованный пептид сукцинилировался и к нему добавлялись медный комплекс блсомицина, 1,3-диизопропилкарбодиимид и оксибензотриазол, взятые в 3-кратном избытке. Снятие со смолы и удаление боковых защитных групп проводилось с помощью реагента состава ТФУ:тиоанизол: анизол:этан-ди гиол 90:5:2:3. Очистку продукта проводили с помощыо препаративного электрофореза па бумаге.

При синтезе копыогатов блеомицина с пептидами RGD, RGDS, е-амино-капроил-RGD, Е-амипокапроил-RGDS и HHKno-(RGDdFK) в растворе блсоми-цин предварительно сукципилировался. Кснгыогат блеомицина с пептидами получали путем карбодиимидной конденсации в водном растворе с использованием водорастворимого карбодиимида. Продукт реакции очищали с помощью препаративного электрофореза на бумаге. Соотношение блеомицина и пептида в конъюгатс определялось с помошыо аминокислотного анализа.

Ковалснтное связывание блеомицина с инсулином проводилась с использованием бифуикциопальиого сшивающего реагента димстиладипимидата (Hordcn et al., 1979). Реакционную смесь обсссоливалй'на колонке 0.9x60 см с сс-фадекеом G 25 "Superfine", уравновешенной 100 мМ Na-фосфатным буфером, рН 7.5. Очистку копъюгата блеомицина с инсулином проводили методом высокоэффективной гель-проникающей хроматографии; в качестве стандартов использовали цитохром с (12.5 kD), блеомицип (1.5 kD), инсулин (5.1 kD).

Аналитический и препаративный высоковольтный электрофорез пептидов, сукципилировашюго блеомицина и конъюгатов проводился в горизонтальном приборе при градиенте потенциала 24 Всм-1 в 1М ацетатном буфере, рН 2.4, в течение 3 часов. После проведения препаративного электрофореза фракции элюировали с помощью 0.5% уксусной кислоты и лиофилшировали.

Определение аминогрупп блеомицина и сукципилировашюго блеомицина проводилось с номошыо2,4,6-тринитробснзилсульфоновой кислоты (ТНБС). В качестве стандарта использовали глицин. Оптическую плотность продуктов определяли па длине волны 340 им с использованием спектрофотометра HP 8451А фирмы Hewlett Packard.

Определение количества реакционно-способных карбоксильных групп в молекуле сукципилировашюго блеомицина проводилось с помошыо синтеза его пара-нитрофенилового эфира. В качестве конденсирующего агента использовали дициклогексилкарбодиимид. Нитрофсииловый эфир сукципилировашюго блеомицина гидролизовали в 0.1М NaOH. Спектры поглощения гидролизага

эфира, сукципидировапного блсомиципа и нитрофенола снимали с использованием спектрофотометра HP 8451Л фирмы Hewlett Packard при концентрации па-ра-нитрофспола и сукципилировапного блсомиципа 20 цМ.

Аминокислотный анализ кошлогато» проводился путем гидролиза конъ-югагов (0.1-0.2 мг) или стандарта блсомиципа (0.2 мг) в 6М HCl / 0.02% меркап-тоэтанол в вакуумировапных ампулах в течение 24 часов при температуре ПОоС. Пробы анализировали с помощью высокоэффективной обратнофазовой хроматографии с прсдколоночпой модификацией ортофталсвым альдегидом с использованием флуоримстра Shimadzu RF-535 с проточной микрокюветой; длины волн возбуждения и эмиссии 330 и 452 им соответственно.

Активность блсомиципа и копыогатов в реакции дсмстилировапия N-ди-мстилапилипа определялась по накоплению формальдегида (Nash, 1953). В качестве донора редокс-эквивалсптов в нашем эксперименте выступала перекись водорода. Оптическая плотность продукта определялась па длине волны 412 им с использованием спектрофотометра HP 8451А фирмы Hewlett Packard.

Выделение тимопитон мышей линии СВА проводили по методике Фримс-ля (1987).

Цитотоксичсскос действие препаратов па тимоциты тестировали с помощью реактива Hoechst 33342 (бис-бснзимида), котороый, иптеркалируя и ДНК клеток, флуоресцирует па длине волны 450 им при длине волны возбуждения 350 нм. При повреждении клеток и дсспирализации суперскручсиной ДНК флуоресценции уменьшается. К суспензии клеток, предварительно инкубированных с реагентом Hoechst 33342 и отмытых, добавляли блсомицин или его конъ-гогат с инсулином в виде эквимолярного комплекса с Fc(II) и инкубировали 10 минут. Измерение флуоресценции проводилось на спсктрофлюоримстре "Baird Nova", Великобритания.

Исследование цитотоксичсской активности блсомиципа и его коныогатов с RGD-содсржашими пептидами проводили путем окрашиваня монослоя клеток кристаллвиолетом. Блсомицин и его коныогат с инсулином использовали в

виде эквимолярных комплексов с Fe(II). Суспензию клеток L-929 обрабатывали препаратами в различных концентрациях в течение 10 мин при 37оС, затем клетки пассировали в 24- или 48-лупочныс планшеты. Через 24 ч монослой отмывали и обрабатывали 0.1% раствором кристаллвиопсга в смеси этанол:укеуспая кислота 9:1. Затем краситель экстрагировали и интенсивность окрашивания раствора б каждой лунке измеряли па длине волны 590 им с использованием спектрофотометра HP 8451А фирмы Hewlett Packard.

Исследование циготоксичсской активности препаратов по разрушению РНК в клетках. Клетки линии L-929 в состоянии монослоя в их экспоненциальной фазе роста культивировали в присутствии 14С-уридина, затем клетки от мывались и рссусисндировались. Суспензия обрабатывалась препаратами в различных концентрациях в течение 10 мин., затем клегки пассировали в 24- или 48-лупочпые планшеты. После инкубации клегок в течение 24 ч. определяли радиоактивность аликвог срсды инкубации с использованием р-счстчика Raebcta фирмы LKB.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Синтез и исследование цитотоксичеекой активности конъюгата блсомиципа с

инсулином.

На первом этане создания низкомолскулярных селективных цитотокси-нов в калссгос адресного фрагмента был использован природный полипептид-пый гормон инсулин.

На рис. 1 показана зависимость цитотоксичсского действия комплекса блсомицип-Ре(Н) от его концентрации на тимоциты. При концентрации комплекса 40 цМ кривая концентрационной зависимости выходит на плато, то есть дост игается повреждение всех клеток.

Для синтеза конъюгата блсомиципа с инсулином был использован бифункциональный сшивающий реагент димстиладипимидат с длиной спсйссрной ча-

сти 0.86 им, реагирующий с концевой аминогруппой блеомицина и с амино1руп-иой боковой печи лизина в молекуле инсулина. Соотношение блеомицина и инсулина в коныогате составляло 1:1.

Концентпации тэепа'оатоз: ИМ

Гисунок 1. Заниеимосгь паления интенсивности флуоресценции рсактииа IIocchsL 33342 при разрушении 1ИМОМИТО» от концентрации комплекса блсомиции-Ь'е(11) (—5S-) и сульфата желеча (I!) ( X ■)

Чтобы проверить, сохраняет ли бпеомицип в составе коныогага с инсулином способность генерировать активные формы кислорода, сравнивались активности нсконыогированпого блеомицина и его конъюгата с инсулином в реакции дсмстилирования N-димстилаиилипа. Результаты, представленные на рис. 2, показывают, что активности блеомицина и его конъюгата с инсулином одинаковы.

Для изучения цитотоксичсской активности конъюгата блеомицина с инсулином тимоииты инкубировались с различными концентрациями блеомицина и его коныога га с инсулином в составе комплексов с ионами двухвалентного железа. На рис. 3 представлены зависимости цитотоксичсской активности блеомицина и его конъюгата с инсулином от их концентраций. Для сравнения цитоток-сичсских активностей блеомицина и его конъюгата е инсулином были опрсдслс-

Оптическая плотность

Боемя инкубации, мин.

Рисунок 2. Заииеимость накопления формальдегида н реакции дсметидироьания >,г-диметилапилина под действием блсоминина ( I ) и его конъюгала с инсулином ( ) от времени. В качссгнс контроля использовались пробы, содержащие инсулин (—Ж—).

Флуоресценция , относительные единицы

Концентрации препаратов , цМ

Рисунок 3. "¡анисиМ1Хл ь падения интенсивности флуоресценции реактива НоесИк! 33342 при разрушении тимоцитон от концентрации комплекса блсомицин-Кс(И) ( • ), колъюгага блеомицина с инсулином в пидс комплекса е Ре(И) ( % ) и инсулина ( I

пы значения концентраций препаратом, при которых происходит 50% повреждение клеток (ИЦ50). Для некопъюгированного блсомицина эта величина оказалась равной 6+0.5 (лМ, в го время как для конъгогата блсомицина с инсулином ИЦ50 равно 2+0.5 дМ. Следовательно, питогокснчсская активность копъюгата блсомицина с инсулином оказалась в 3 раза больше активности нскопъюгироваппого блсомицина.

Использование RGD-содсржапшх пептидов в качестве адресных фрагментов.

Хотя коныогат блсомицина с инсулином имсег значительно меньший молекулярный нее но сравнению с иммупогоксипами, инсулин все же представляет собой достаточно крупный природный полипептнд. Поэтому следующим этапом пашей работы но созданию пизкомолскулярных селективных питотоксипов было использование синтетических пептидов в качеетве адресных фрагментов. Были синтезированы конъюгаты блсомицина с RGD-еодсржащими пептидами и исследована их цит о токсическую активность. Рецепторы для RGD-содсржапшх лигандов экснресеиругогся различными клетками, склонными к адгезии (фиб-робластами, эпдотслиоцитами, тромбоцитами и др.) (Souza ct al., 1991). Были синтезированы следующие варианты RGD-содсржапшх пептидов в качестве адресных молекул: RGD, RGDS, е-аминоканроил-RGD, Е-аминоканроил-RGDS и цикло-RGDdFK.

При выборе мсгода конъюгации необходимо сохранить активность как 'токсической, так и адресной частей копъюгатов. Имеется большое количество исследований, в которых изучается взаимосвязь между структурой и активностью RGD-содсржаншх пептидов. Данные литературы (Chcrny ct al., 1993; Samancn ct al., 1990; Gurrath ct al., 1992; Pfaff ct al., 1994) показывают, что сохранение пемодифицироваиных боковых цепей аспарагиповой кислоты и аргинина важно для проявления аффинных свойств пептидов, содержащих последовательность RGD. В то же время, возможна модификация №Чамипогрунпы аргинина.

Поэтому модификация пептидов ири синтезе копыогатов производилась за счсг Na-KOimciiOÜ аминогруппы аргинина или с-аминоканропоиой кислоты в случае линейных пептидов и за счет е-аминогрупны боковой цепи лизина в случае циклического пептида.

Первоначально предполагалось проводить син тез копыогатов блсомици-па с линейными пептидами твердофазным методом. Преимущества твердофазного синтеза состоят в простоте и стандартности процедур синтеза и очистки получаемого продукта. Кроме того, твердофазный метод обеспечивает защиту реакционно-способных карбоксильных групп пси гидов, модификации кот орых привела бы к уменьшению или потере сродства. Метод был применен при синтезе копыогата блеомицина и RGD-иепт ида. С помощью аминокислотного анализа было определено соотношение блеомицина и пептида и кон'ыопис. оказавшееся равным 1:1. Способность блеомицина в составе копыогата генерироват ь активные формы кислорода была проверена в реакции дсмстилирования N-димс-тиланилипа (рис. 4). Из рисунка видно, что копыогат не проявлял активности в этой реакции. Кроме того, полученный копыогат не обладал способностью хеджировать ионы Fc(ll) и Cu(Ii). По-видимому, потеря активности произошла па с тадии снятия со смолы в довольно жест ких условиях (90%ТФУ).

Таким образом, единственно возможным является многостадийный синтез, включающий синтез свободного пептида, сукпипилнрованис блеомицина и карбодиимидиую конденсацию блеомицина и пеш идо» с незащищенными боковыми группами в водной среде с использованием водорастворимого карбодии-мида. Однако отсутствие защиты карбоксильных групп acnapaiиповой кислоты в этом случае предъявляет жест кие требования к выбору условий проведения реакции. Для селективного проведения реакции карбодиимидной конденсации но концевой аминогруппе пептидов были подобраны условия (рН 8.5), при которых гуапидиновая группа аргинина образует внутреннюю соль с карбоксильной группой аспарагнповой кислоты. Кроме того, .тля предотвращения модификации карбоксильных групп пептидов в процессе реакции сначала проводилась

активации карбоксильной группы блсомицииа, а затем к реакционной смеси добавлялся раствор пептида.

0. О.

о. 0.

О 10 20 30 40 ' 50 60 70 80 90

Зремя ик^бапии, мин.

Рисунпк 4. Записи \кчл|. накопления формальдегида и реакции дсметилироиания димегилапилипа иод дейемшем блсомицииа-1;е(II) ( ■ ) и его копыогага с К(1|)-не1пидом ( Ж ), сишсчиронаипмм тер [офашым методом, о г времени.

Модификация блсомицииа при синтезе сто копыогатон с пептидами.

При создании шпогоксицов, состоящих из адресного вектора и антибиотиков, одной из самых серьезных, проблем является значительное снижение ци-готоксичсекой активности антибиотиков при конъюгации. Число работ, посвященных созданию конъюгатон с антибиотиками, невелико, что объясняется небольшим количеством рсакциопноспособных групп в молекулах пизкомолску-лярнмх цитотокеипов, которые могут быть вовлечены в реакцию конъюгации без изменения их активности.

При синтезе высокомолекулярных конъюгатон, как правило, исследователи не определяют конкретного места связывания конъюгирусмых белков и их соотношения. В лом случае часто образуется смесь продуктов с различными

Оптическая плотность

участками связывания. В нашем случае это могло бы привести к потере активности обоих компонентов конъюгата. В связи с этим была поставлена задача определить участки связывания блеомицина с адресными пептидами, оптимальные для сохранения биологической активности фрагментов, и разработать метод синтеза выбранной структуры. Необходимо было разработать методы контроля за составом коныогата.

Молекула блеомицина содержит 2 первичные аминогруппы рахшчной реакционной способности. Из литературных данных (Sugiyama й а1., 1994: ТакаЬахЫ Й а1., 1994) известно, что аминогруппа, принимающая участие в хсла-тировапии ионов металлов, необходима для проявлении активности блеомицина как генератора активных форм кислорода. Поэтому при синтезе конъюгата необходимо было модифицировать только аминогруппу концевого амина, сохраняя аминогруппу координационного центра.

А)

3.5 2.0 1.5 1.0 0.6 о.о

Воемя элеции, мин.

2.5 2.0 1.Б 1.0 0.6 0.0

Зсемя элюции, мин.

Рисунок 5. Высокоэффектинмая обрашо-фазовая хроматография блеомицина до (А) и после (Б) проведения реакции сукципилировапии.

Для того, чтобы уменьши ть вероятность образования коныогатов блсо-мицип-блеомицип и пемтид-пентид был использован метод карбодиимидпой конденсации, при котором п реакцию вступают карбоксильная и аминогруппы молекул. В связи с этим было решено сукцинилировать аминогруппу блсомици-па с образованием карбоксильной группы. Полнота прохождения реакции контролировалась с помощью высокоэффективной обратно-фазовой хроматографии (рис. 5). При этом добашшшс янтарного ангидрида к реакционной смеси прекращали. когда весь пемодифицированный блсомицин (А) переходил в сукцини-лированпый блсомицин (Б). А)

Оптическая плотность

Длина волны, нм

Б)

Оптическая плотность

Рисуиок 6. Сасктры поглощения комшсксон блсомииина (-) и сукпипилиронапного

блсомипииа (---) с Си(И) (Л) и Ь'сЦП) (Б).

Определение количества аминогрупп в продукте реакции проводилось с

/

использованием 2,4,6-тринитробснзилсульфонопой кислоты (ТНБС); при этом в

продукте реакции аминогруппы не обнаруживались. Таким образом, оба метода показали, что реакция сукцииилироваиия идет до конца.

Для того, чтобы проверить, сохраняется ли исмодифицированной аминогруппа координационного центра, исследовалась способность сукципилиро-ваппого блсомиципа образовывать комплексы с ионами меди (II) и железа (III). Как показано на рис. 6, спектры поглощения комплексов сукцинилироваиного блсомиципа не отличались от спек тров исходных комплексов.

Кроме того, продукт реакции сукцииилироваиия комплекса блсомицин-Си2+ анализировался с помощью высокоэффективной обрагио-фазовой хроматографии, условия проведении которой (pH 2.1) приводят к разрушению комплексов. При этом времена удержания продуктов реакции совпадали с временами удержания продукта, полученного при сукпшшлировапии свободного блсомиципа.

Для определения количества карбоксильных групп, образовавшихся при сукципилиронании блсомиципа был синтезирован пара-питрофениловый эфир сукцинилироваиного блсомиципа. При гидролизе нара-питрофспилового эфира

образуется окрашенный продукт (максимум поглощения при доинс волны 402

>

им). В качестве стандартов использовались пара-питрофенол и сукнипилированный блсомицип (рис. 7). По спектрам поглощения стандартов (А) и продукта реакции (Б) было определено соотношение сукцинилироваиного блсомиципа и иа-ра-пит рофспила в молекуле эфира, которое оказалось равным 1:1.

Таким образом, было показано, что при химической модификации блсомиципа с использованием реакций сукцииилироваиия и карбодиимидпой коп-дснсании в реакцию вступает только концевая аминогруппа, что необходимо для сохранения активности блсомиципа. Вероятно, это связано со сгсричсскими затруднениями » ходе реакции и малой доступностью аминогруппы координационного центра при данных условиях проведения реакции.

Плина нопны. им

Рисунок 7. Спектры поглощения сукцииилиронашкно блсомицина и иара-нитрофенола (Л) и пара-нитрофнзпилоиого эфира сукциншшронаппого блсомицина (Б).

Синтез коныогатов блсомицина е RGD-солержащими пептидами и исследование их питотоксичсской активности.

В поисках оптимальной структуры пизкомолскулярных цитотоксинов нами были син тезированы следующие варианты RGD-еодсржащих пептидов в качестве адресных молекул: RGD, RGDS, е-аминокапроил-RGD, е-аминокапро-ил-RGDS и цикло-RGDdFK.

На первоначальном этане исследования были синтезированы коиыотаты с простейшими линейными пептидами RGD и RGDS. Способность блсомицина в составе коныогатов с пептидами RGD и RGDS генерирова ть активные формы кислорода была проверена в реакции дсмстшшроваиияЛЧ-ди мстил анилина. Бы-

ло показало, что после конъюгации с пептидами RGD и RGDS блсомицип сохранял способность генерировать активные формы кислорода (рис. 8).

Оптическая плотность

Всемя инкубации, мин.

1'исушж 2. Зависимость накопления формальдегида в реакции демстилироиания N-диметилатемна иод дейстием блсомицииа ( I ) и его кот.югагои с RGD ( 1 ) и RGDS ( П ) ох времени. В качестве контроля исполыонались пробы, содержащие RGD (—^—) и RGDS

Цитотоксичсская активность блеомиципа и его копъюгата с пептидами исследовалсь в системе in vitro с использованием трансформированных фиброб-ласгов линии L-929, которые экспрсссирутот большое количество рецепторов для RGD-содсржащих лигапдов. Для исследования цитотоксичсской активности использовались два методических подхода: метод окрашивания монослоя с последующей экстракцией красителя и измерением оптической плотности (Kcung et al., 1989) и метод с предварительной инкубацией клеток с 14С-уриди-ном, в котором циготоксичиость оценивалась по выходу из клеток низкомолс-кулярных фрагментов радиоактивпо-мечеппой РНК (Shopsis & Eng, 1985),

На рис. 9 показаны зависимости плотности монослоя клеток линии L-929 от концентраций добавленных блеомиципа и его копыогатов с пептидами RGD

и 1ЮОЗ. На рис. 10 продемонстрировано цитотоксичсскос действие этих препаратов па клетки по выходу '^С-уридИна. Как видно из рисунков, повреждение 50% клеток наблюдалось при концентрации блеомйцина и копъюгатов 1 цМ. При концентрации блсомиципа и конмогатов около 600 цМ наблюдалось разрушение всех клегок.

Концентрации препаратов , цМ

Рисунок 9. Зависимости, плотности мошк^тоя клеток линии L929 от концентрации добавленных блсомипина-Кс(П) ( 1 ), его копъюгатов с пептидами RGD (" I и RODS ( X ) и пептидов RGD (-*-) и RODS (-В-).

Оба методических подхода показали, что блсомицин и его конъюгаты с пептидами RGD и RGDS обладают одинаковой цитотоксической активностью. Вероятно, отсутствие различий в активностях препаратов связано с потерей аффинности пептидами в составе копъюгатов из-за экранирования пептидов молекулой блсомиципа.

Возможным методическим подходом для решения этой проблемы может быть удлинненис линкерпой части в конъюгате. Поэтому решено было синтезировать конъюгаты блсомиципа с удлииненными пептидами s-аминокапроил-RGD и Е-аминокапроил-RGDS.

Активность этих конъюгагов как генераторов активных форм кислорода была исследована с использованием реакции дсмстилир'ования N-диметилани-

Радиоактивность , ерш/1000 клеток

Концентрации препаратов , |JM

Рисунок 10. Заииси.мшлъ выхода 14С-уридипа в среду инкубации клеток линии L929 от концентрации добавленных блсомицина-Кс(П) ( ■ ), его копъюгатов с пептидами RGD ( I-) и RCJnS ("*-) и пептидов RGD (-*-) и RGDS (-В-).

липа. Было показано, что активности коныогатов н этой реакции не отличались от активности неконыогироваппого блсомицина (рис. 11).

Однако и в этом случае циготоксичсскис активности копъюгатов не отличались от цитотоксичпости пеконъюгировапного блсомицина. Таким образом, удлинчсиис линкериой чаеги копыогата в данном случае ис приводит к увеличению сродства, а огсутсгвис увеличения активности связано с малой аффинностью самих линейных пептидов.

Учитывая, что линейные пептиды RGD и RGDS обладают невысоким сродством к рецепторам на поверхности клегок, мы воспользовались исследованиями Gurrath et al. (1992), Pfaff et al. (1994), Noiri et al. (1994), Kessler et al. (1995), изучавшими пептид цикло-RGDdFV и показавшими, что этот пептид обладает более высокой активностью, чем его линейные аналоги засчет стабилизации наиболее активной копформации в жестком цикле. Для того, чтобы имегь возможность провести реакцию конъюгации, вместо пептида цикло-RGDdFV использовался пептид цикло-RGDUFK, в котором валин, линкерная аминокис-

О.б

Оптическая плотность

0.1

0.4

о.г

0.1

с

О 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Всемя инкубации, мин.

Рисунок 11. Занисимосгь накопления формальдегида и реакции дсмстилировапии даметилапилипа под дсйспжем блсомиципа ( ' ) и его коныогатов с е-амипокаироил-КОО ( I ) и е-аминокапроил-КООй ( П ) о г премени. В качестве контроля исполглонались пробы, содержащие е-амипоканроил-КОГ) (—) ие-амшюкапроил-К(Ю8 ( X ).

лота цикла, заменена на лизин, обладающий реакционно-способной аминогруппой.

Копыогат блсомиципа с пептидом пикло-ГШОЛ-'К. был исследован в реакции демстилировапия N-димcтилaнилиIia. Было обнаружено, что в составе кошлогата блеомицин сохраняет способность генерировать активные формы кислорода.

Цитотоксичсская активность копъюгата блеомицина с пептидом цикло-1ЮО<1НК исследовалась с использование метода окрашивания монослоя клеток с последующей экстракцией красителя (рис. 12) и метода оценки выхода низкомолекулярных фрагментов РНК (рис. 13). Оба метода показали, что активность коиъюга га блсомиципа с пептидом пикло-1Ю011НК оказалась выше активности нсконъюгироваппого блсомиципа. Величина ИЦ50 конъгогата блеомицин - цик-ло-1ЮОс1Ь'К оказалась равной 0.12+0.01 цМ, в то время как ИЦ50 нсконъюгироваппого блсомиципа равен 1+0.05 цМ. Таким образом, цитотокси-

0.1 1 10 100

Концентрации препаратов , цМ

Рисунок 12. Зависимое!!. плошости монослоя клеток линии Ь92У от конце][трапии добавленных блеомипина-Ь'с(11) О-его конъюгага с пептидом пикло-КСЛЭЛНК ( К ) и пептида цикло-

Радиоактивность, срл/1000 клеток

Концентрации препаратов , цМ Рисунок 13. Зависимость накопления 14С-уридина клетками линии Ь929 от концентрации добавленных блсоминина-Ь'с(Н) ), сто копыогата с пептидом цикло-ЯООс1КК (—I-) и пептида цикло-К(;ШКК (—).

чсская активность копыогата в 8.5 раз больше цитотоксичсской активности

нскопъюгированно! о блсомицина.

Полученные данные свидетельствуют о том, что блсомицин может быть использован в качестве токсической части низкомолекулярных цитотокеинов без потери способности генерировать активные формы кислорода в каталитическом режиме. При этом конъюгация блсомицина с инсулином и пептидом цикло-1ЮО(1РК. с активной конформацией, закрепленной в жестком цикле, позволила увеличить цитотоксичсскую активность антибиотика.

Таким образом, показано, что возможно создание цитотокеинов направленного действия, обе части которых представляют собой низкомолскуляриыс соединения.

выводы.

1. Синтезированы пептиды Е-амипокапроил-ЯСО, Е-ами-ноканроил-1Ю08 и цикло-РСгОёРК.

2. Путем подбора условий проведения реакции получены копъюгаты блсомицина с инсулином, пептидами КО ОБ, е-аминокапроил-РСЮ, Е-ами- " покапроил-КООБ и цикло-ГШПёНК., в составе которых блсомицин не терял своей способнос ти генерировать активные формы кислорода.

3. В результате исследования цитогоксичсской активности полученных конъюгатов и свободного блсомицина было показано, что при тестировании в клеточных культурах цитотоксичсская активность копъюгата блсомицина с инсулином в 3 раза выше активности неконтлогированпого блсомицина; активность копъюгата блсомицина с пептидом цикло-1ШОёРК. в 8.5 раз выше цито-токсичсской активности нскопъюгировашюго блсомицина и его конъюгатов с линейными пептидами.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. I.E. Matkhanov, Yu.V. Galanova, E.I. Voschinnikov, and A.I. Archako\ Cytotoxic EiTcct of Free Bleomycin A5-Iron (II) Complex and Its Conjugates wit: Coneanavalin A, Insulin and Calcitonin on Mouse Thymocytes. BBRC, v.191 N1, 1993, pp. 85-91

2. Vozncscnsky A.I., Voschinnikov E.I., Galanova J.V., Archakov A.I., Sticr A Huoranthcnc can be used for monitoring of the oxygenase activity of cytochrom P-450 models. Abstracts of II Symposium "Drug" metabolizing enzyme systems' Varna, 1989.

3. А.И. Вознесенский, Е.И. Вощшшиков, Ю.В. Галанова, А.И. Арчакоя А.Штир. Флуорантсн может использоваться при изучении модслс! цитохрома Р-450. Тезисы V Всесоюзной конференции "Цитохром P-450 i модификация макромолекул", Ялта, 1989, с.241.