Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Тимоцитотоксическая активность свободного и конъюгированного с адресными молекулами Блеомицина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Тимоцитотоксическая активность свободного и конъюгированного с адресными молекулами Блеомицина"

РГб од

4 П Ш.П ТСПЗ

.....______ Н1ЩСТЕРС1БО. ЗДРАБОоХРА!ЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ лшЁгаиЁт

уда 577.113 На правах рукописи

МАТХАНОВ Иршгмй Эдуардович

ТШОЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СВОБОДНОГО И КОНЫОГИРОВАНШГО С АДРЕСНЫМИ МОЛЕКУЛАМ БЛЕОМВДНА.

03.00.04 - сиои-хии

Автореферат

жс.пртаоия ! •» Л»скг-Ш)'3 у-«*Ч» Я степени кандидата биологических наук

•Москва Т9ЭЗ

Работа выполнена на кафедре биохимии медичо-биологического факультета Российского государственного медицинского университета.

Научный руководитель:

академик РАМН, профессор АРЧАКОВ Александр Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Бачманова Г.И. доктор медицинских наук Терентьвв A.A.

Ведущая организация -

Институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского.

Защита диссертации состоится ..............1993 г.

в 14 чес. на заседании специализированного Ученого Совета К 084 14 05 РПДГ по адресу: 117437, Москва, ул.Островитянова, I.

Автореферат разослан ................1993 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИШ.

Ученый секретарь специализированного Ученого совета,

кандидат медицинских наук КЛУШИНА Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальное!___щюблемы. Проблема направленного транспорта

лекарств, была впервые поставлбина еще в начале столетия номе^сим ученым Паулем Эрлихом, который предложил концепцию гипотетической "магической пули". Такая пуль должна находить пораженное место в организме и воздействовать только на него (Ehrlich Р., 1956К

Особое внимание обращают на себя селективные цитотоксиш -препараты проявляющие избирательную кпллорну» активность. Эти препарата направленного действия представляет собой гибридные молекулы, состоящие из двух частей: токсического и адресного фрагментов.

В качестве адресного фрагментав таких молекулах используют антитела н их РаЪ-фрагменты, лектины, гормоны. В качестве токсического фрагмента используют токсины растительного и бактериального происхождения (абрин, рицин, модецин и др.), ферменты (глюкозооксидаза) и лекарственные препараты, ^антиметаболиты, алкилируюцие агенты, некоторые антибиотики).

Довольно перспективным направлением в этой области исследований является использование низкомолекулярных генераторов активных форм кислорода для направленного разрушения кяэток-мишеней (Arohakov & Baohmanova, 1990).

Известно, что в организме активные форш кислорода осуществляют окислительную модификацию и деградацию структурных и транспортных белков, ферментов,• нуклеиновых кислот, инициируют торохчеиое окисление ненасыщенных лшидоэ, вызывают повреждение биологических мембран (Fligiel et al., 1994; HalliwellA GuUeridgo, i984; Pridovioh, 1986; Hun et al., 1968; Arohakov Baohmanova, 1990). Довольно хорошо изучено цитотоксичоское

действие активных форм кислорода на различные вида штатом : фагоциты, эпителиальные клетки, эритроциты, культуры опуходищ клеток И Т.Д. (Sadwey & Karnovaky, 1980; Nathan 4 Cohn, t§80{ Weise & Lobugllo, 1982; Whorton et al.t 1985; Voanesenskil ot ai., 1991).

Таким образом, использование низкомолекулярных генораторор активных форм кислорода для направленного разрукимня клеток-мишеней позволяем сочэтать широкий спектр возмскящ повреждений с точной клеточной адресацией. Кроме того, несомненным преимуществом низкомолекулярных генераторов является то, что они могут работать в каталитическом реюша, используя присутствуйте в организме восстановителыше агенты (аскорбкшзйГО кислоту, глутатион и др.), и непрерывно вырабатывать актщщэ формы кислорода вплоть до полного разрушения клэтки-мшзави.

В качестве низкомолокулярного генератора активных £ррм кислорода нами был выбран антибиотик блеомицин, относящийся к классу гликояептидов. Блеомицин, хелатируя металлы перемалюй валентности, генерирует активные формы шюлородо ,в окислительно-восстановительном цикле, подобном нонсюксигвназ^оиу шилу цитохрома Р-450 (Bürger et al., 1983; Murugesan et al., 1983). Мишенью в клетке для Олеомицина является молекула жтеркалируя в ДНК, блеомицин генерирует разрушающие ату молекулу активные формы кислорода (Stubbe.1988). Помимо разрывов ДНК, блеомицин оказыеает повреждающее действие на мембранные структуры клеток за счет инициации перекисного окисления липидов, ~ с последующей агрегацией белков (GIri et ai., 1983; Omaye epd Cappel, 1984; Rosan et al., 1983).

Лель исследования: Предполагалось путем связывания блеомиодаэ

с адресными белками с .здать гибридные молекулы, обладанию большей цитотоксической активностью, чем свободныйблеомицин:

В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать повреждающее действие блеомицина на тимоциты мышей с целью выяснения роли различных форм кислорода в этом процессе.

2. Разработать метод кэвалеитного связывания блеомицина с белком с сохранением его способности активировать молекулярный кислород.

3. Получить активные коныогаты блеомицина с конканавалином А, инсулином и кальцитонином - белками, обладаюцими высоким сродством к поверхности тимоцитов.

4. Сравнить тимоцитолитическое действие полученных коньюгатов блеомицина с активностью свободного блеомицина. Н§11Ш52-И21Изна_и_практическая_зна5^ст

Научная новизна предлагаемой работы состоит в том, что в качестве киллерного фрагмента при создании цитотоксинов предлагается использовать низкомолекулярный генератор активных форм кислорода - блеомицин.

В результате проводенных исследований обнаружено, что комплекс блеомицина с железом, генерируя активные Формы кислорода, способен повреждать мембраны тимоцитов. Комплекс блеомицина с железом работает в каталитическом рекиме, получая необходимые для этого электроны от эндогенных и экзогенных восстановителей.

Подобраны условия ковалентного связывания блеомицина с белками, при которых блеомицин сохраняет' способность хелатировать железо и разрушать клеточные мембраны.

Получены коныогаты блеомицина с адресными фрагментами: конканавалином А, инсулином и кальцитонином, обладающие более

высокой тимоцитолитической активностью по сравнению со свободным блеомицином.

Апробация__диссертации состоялас ь 23.12.92 на совместном

заседании учебно-научного комплекса кафедра биохимии MM FIW и Института биологической и медицинской шш РАМН.

' Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работ .•

Структура___и__объем__работы. Диссертация изложена на

132 страницах машинописного текста, включая I таблицу и 27 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, глав, содержащих описание материалов и методов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Тимоциты мышей линии СВА выделяли в фосфатном солевом буфере (ФСБ) в модификации Дюльбекко по методу Фреини (198Э).

Жизнеспособные клетки тимуса определяли по прокрашивании клеток трипановым синим. Трипановый синий в концентрации 2* смешивали в равных объемах с суспензиями клеток, и далее переносили в камеру Горяева. Количество живых клеток считали на сто клеток в поле зрения. Обычно количество живых тимоцитов после их выделения составляло 80-90*.

Для определения тимоцитолитической активности блеомяцлна использовали реактив Hoeohst 33342 (бис-бензимид), который интвркалируя в ДНК клеток образует комплекс, флуоресцирует на длине волны 450 нм при длине возбуждения 350 нм (Brenan it Parish, 1988). При повреждении клеток и деспмрализации

сударскручениой ДНК реек.ив выходит из хлеток, что регистрируется по~ умепыюнап флуоресценции;-К суспензии тимоцитов в буферном раствоире ССБ в количестве 2 миллиона в I мл добавляли реактив Hoeohst 33342 до коночной концентрации I 'гаг/мл. Затем клетки инкубировала в течении I часр при температуре 37°С. Далее клетки центрифугировала при 1600 сб.Леш, и осадок ре суспендировали в »СБ. Ношкнкращэ itssxок длюдьс! до 2 )лдн/мл. Измерение пгоро«™,™ я« спвктро(Ь?1уоримвтре "Baird Novah,

Beликобритания.

При определении ТБК-актиишх продуктов в клетках к 0,5 мл суспензии клеток в ФСК, содержащих 10 № белка, добавляли 0,6 мл БОйМ TpHCHCl буфера рИ 7,4 , I мл 30« ТХУ, 0,1 мл БН раствора ног, Í мл 0,75 % расвора ТЕК. Смесь нагревали в кипящей водяной бане 20 мял. Затем раствор охлавдали и определяли оптическую плотность при БЗс кг», малярный ко»&щйент эксг»вп<цют е=1,56 (Владимиров . к Арчакоь А.К., 1072). Содержание белка определяли по методу lowry et al. (1951). В качество стандарта использовали Сычи;'. аичгрогучныД альбумин.

Коигстадая блостзццта с «fouœsi ¡ipoiWJiacb но методу, опзсакпсму Hordcn et al. (1<»Г7). Дая -повадактиого связывания ОЯЗрИЗИСТЕКа С беЛКеМГ! бил ИСПОЛЬЗОВаН СШИййкАЯ£1

¿M'"!'"" '."'í''' i!"!yi<7I!'.''\;.V,,".l - ; ■r.'-ÎOV.-'''" " , "С 777". ?ТОТ

^---iPJIj-j - ¿ - ' * -• ■ ■ ' -с îi . J ,1- .и t-Jll i'.-

цепи я блеог.яшша с образованием поперечной сенеки. Реакци» проводили а 250 r¿S •ipsoraao.-.^ixioüc::. íi'í'ií >.рН 3,5. Пгэсмтт

по.тптгпплтоалп добавлением раетл-и «.'»ва . ... ________— ..

25°G.

Выделение конъюгатов блеомицина с белками из реакционной смеси проводили методом гель-фильтрацяи. Для выделения конъюгатов блеомицина с альбумином (БСА) использовали колонку 1*20 см с сефадексом с-75. Колонку уравновяшивг ли ю мМ Na-фосфатным буфером, рН 7,6. Наносили 0.5 мл реакционной смеси. Элюировали тем же буфером со скоростью 0,5 мл/мин.Содержание белка в элюате регистрировали при 220 нм в проточной кювете детектора оптической плотности 2238 UVIC0RD фирмы 1KB.

Конъюгаты блеомицина с конканавалкном А выделяли на колонке 1x20 см с сефадексом G-200. Колонку уравновешивали ю мМ Na-фосфатным буфером, рН 7,6. Наносили 0.6 мл реакционной смеси. Элшровали тем же буфером со скоростью 0,5 мл/мин.

Реакционную смесь блеомицина с кальцитонином и инсулином предварительно обессоливали на колонке 0.9x60 см с сефадексом G 25 "Superfine", уравновешенной ю мМ Na-фосфатным буферомрН 7.5. Наносили 0.5 мл реакционной смеси. Элюировали тем же буфером со скоростью 0.2 мл/мин при регистрации оптической плотности прр длине волны 220 нм в проточной юовето.

Очистку конъюг&та блеомицина с инсулином и кальцитошшом проводили методом высокоэффективной гель-проншсакщей хроматографии на колонке TSK G2000SW (7.5x600 мм) фирмы LKB в 5Q мМ Ка-фосфатном буфере, рН 7.5, скорость потока 0.1 мл/мин. В качестве стандартов использовали цитохром с (12.5 kD), Олеомпцин (1.5 kD), феррицианид калия (0.3 kD).

'Количество блеомицина в коныогатах с белками определяла с помощью меченного тритием блеомицина. Удельная активность % блеомицина 1кю/ммоль. Конъюгаты % блеомицина с белками отделяли

-г

-о». ивпрорвап1роваввв1ч>_.»^омшша..»втодом.._гдль_С1и1.хра;йи било описано ьыае и 0.05 мл л? Транши (го 2 м_: „с'ччья.^; к ; ' мл толуолового сдщнталятора < 4 г ППО и 0.1 г ИОПОП в 1л толуола ). Измерение радноактишгостк проводи.1^ ка стпи.-.я-.щстагч СТОТШИ "1211 Гдс'.Ле+а" ТКВ.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Исследование механизма цитотоксического действия блеомицина на тимоциты.

Гликопептидний антибиотик блеомицин был выбран в качестЕв шзкомолвкулярного генератора активных <|орм кислорода для получения гибридных р-.ткул. IX

яктеьность1''.

На первом зтапе ир*лс?ч»-.-.-1Л» шт«».*с «<:'••:>• гс^т«-

Щ1ТО7ОКСИЧОСГС0 ДСЯСТП5:'1 И Я К'-Т-И Л^^.^Т^ьНГТС.

ряда. В качестве клвток-ниявней лим^с.тгагсго сяг* "иди еы^-адь ТН^СЦНТУ ^ ЛгТН}!?! > БД . Р'^р'.Т'ну^тм г;;в г:Г'СГ*' г : '-

фяуорикотраческа с есйсдью ¿».»ктивя . -¡~.~;гзг 333-11. ф.ТусрЗСгНГСУТ^Г'"! ? УУ'1Т''""га о ТОТТ, Пли ГТПППРЭГГЙТПТИ клеток и дест'ра-изыгс-и .-Г- к-мг..-;!'^ т. , ■■ , -

снижением флуоресиешгя.

Дебэвлешга комплекса б."9счкгга-?-»(II) в сг»лу «якулл'ш ■пг'-'г■ ■ ■ .. ■

ДОИ1>ТШЮ!ч пишытоп^а . ■

одного из коночных продуктов реакции - малонового дивлъдегида (ЦДЛ). Зависимость количества образующегося МДА при разрушении тимоцитов от концентрации блеомицина представлена на рисунке 2.

Для вменения природа вктшных форм кислорода, участвующие в процэссо разрупюния мэмбран и деградрцш ДНК под действием комплекса блеомиц5Ш-?в(И) было исследовало влияние на отот процосс супероксаддисмутазы, каталазы и антиокендонтов ( мигаштола, нонола, этанола ).

Ингабируюсее влияние каталези (на 80%) говорит о участки в процессе разрушении тимоцитов перекиси водорода (Рис.3). Снижение ш!тотоксического аффекта комплекса блеомицин&-Ре(П) под действием супероксидцисмутазы (на 70%) указырачт ма участие в этом процессе суперокоиданион-радикала.

Fuc.I. Зависимость падания интенсивности флуорэсцешаш реактива Roeohot 33342 при разруезнии тимоцитов о? концентрации.

Инкубационная смесь объемом I мл содержала 2x1О6 тимоцитов мышей лигам СВА в FBS буфэрэ'.рН 7,4. Тимоциты инкубировались при температуры 37°С в течении Б минут. Флуоресценция измерялась на длинна* волн Х6х-355 нм и Кеч~4Ъ0 нм. К суспензии тимоцитов добавляли:

А - комплекс блеомицин-келэзо(т1); В - feso,: С - блеомицин.

Флуоресцентен, OTII. «А.

м ю то ю

IMA. иИ____

(A-»-1-*-1--1-J--L-I-'-<-I-•-1-л-

О И

Рис.2. Накопление малонового диальдегида при разрушении

тимоцитов комплексом блеомицин-келезо (И). Инкубационная смесь объемом I ;хл содержала 5хГ06 тимоцитов мшей линии СВА в PBS буфере, рН 7,4. Время инкубации 16 минут. Оптическая плотность измерялась при Х=532 нм, е=1,56

IfW1.

! - «П.» VSi

К "Ч •:'*'■> М •

: ft;:

^ i/H^yi/iiM/H-- 1/7

Олеомлцин-келезо(II) а присутствии каталазы и супороксиддлсмутазы. Условие эксперимента указаны в подписи н рисунку I.

¡. - олеимкцик-Уеill> мх? : j* - .....: •

,. ^з,;,;,-^,, < Tt^ T«C. --------------"

" ' •• "i v. cyii'j(f:'4i''_,v.v';; " • ■ ■■ •

ект.мл)

Выраженный защитный эф$ект оказали и. ловушки наиболее реакцирннопктивного гидроксильного радикала : ктанол, ионол, диметилсульфоксид (ДМСО) и маинитол (Рис.4). Исследование концентрационной зависимости показало, что наиболее аффективен ионол, а наименее маннитол. В присутств.ш 2 мМ этанола активность блеомицина уменьшалась на 85%, в нрисутсвии 100 мкМ ионола на 90%, 25 мкМ DMSO на 58% и 50 мкМ манитола на 62*.

Полученные результаты указывают на то, что разрушение мембран тимоцитов и деградации ДНК инициируются активными формами кислорода, которые генерирует комплекс блеомицин-Fe(II). Учитывая значительное ингибирупцее действие ловушек гидроксильного радикала на процесс разрушения тимоцитов под действием комплекса блэомицин-Ре(П), можно предположить, что ведущую роль в атом процессе играет гидроксильный радикал.

Дитотокснчвскии а—акт

Рис.4. Снижение цитотаксиче скаго эффекте комплекса блеомицин-жвлезо(И) в присутствии

антиоксидантов. •• Условие эксперимента указаны в подписи к рисунку I. К суспензии тимоцитов добавляли: • „

А - комплекс блеомищш-Ре(И) БОмкМ; В - А + манитол 100 мМ; С - А + этанол 20 мМ; Б - А + ионол 100 мкМ; Е - А + ДМСО 25 мкМ.

Для проверки каталитического характера действия блеомицина тимоциты инкубировали с комплексом блеомицин-Уе (III), - Если - би вшеуквзенный комплекс работал только за счет окисления железа комплекса с Ре(1Х) до Ре(III), то при добавлении блвомицин-Ре (III) в суспензию клеток не происходило бы их разрушения. Однако добавление комплекса блеомицин-7о(Ш) лизировало клетки, также как и комплекс блеомицин-Рв(И) (Рис.5). По-видимому, железо в этом комплексе работает в каталитическом режиме, т.е. восстанавливаясь и окисляясь, получая электроны от доноров редокс-эквивалентов, присутствующих в тимоцитах (тиоловых соединений, аскорбиновой кислоты, перекиси водорода и др.).

Это подтверждено и рядом исследований (О11о,е1 а1.1981, Иигивват еЬ а! 1982, Ра(1Ьигу ег а1. 1983) установивших, что после хелатирования железа данный гликопегггидный антибиотик генерирует

Флуореоидичш. otm.hu

РИС.б.

_ Котк^ггрлии*. нЫ

Зависимость падения интенсивности флуоресценции реактива Hoechet 33342 при разрушении тимоцитов от концентрации блеомицин-железо. Условие эксперимента указаны в подписи к рисунку I.

К суспензии тимоцитов добавляли:

А>комшюкс блеомицин-железо (II);

В)комплвкс блеомицин-железо (III),

Контролем служил? флуоресценция интактных клеток - С)

активные формы кислорода в окислительно-восстановительном цикле, подобно монооксигеназному циклу цитсдрома Р-450.

То, что комапеко блеоыищш-?е(хп) обладал таким же цитотоксическим действием, как и комплеко блеомицин-?в(П), свидетельствует о возможности быстрого восстановления втого комплекса тимоцитами. Так как, ранее было показано, что способностью восстанавливать комплекс блеомицин-Рв(Ш) обладает изолированная ия>РН-цитохрсм Р-450 редуктаза (Уогпеяадвку вt а1., 1991), была измерена редуктазная активность клеток тимуса в отсутствии и в присутствии НАй(Г)Н о использованием в качестве акцептора электронов цитохрома с (табл.1). Как видно из таблицы, тимсциты обладают собственной, а так же мш- и НАСРН-зависимой редуктазной активностью. Наличие такой активности может объяснить

Таблица I.

Косубстраты 1 Цитохром с редуктазная активность

1 (нмоль*мл~**мин~*)

МАОРИ 1 20.2

КАШ ! 25.9

-------------------------т-------------

Еоз добавления косубстрата! 4.9 __________________________1_____________

функционирование комплекса блеомицин- г о (XII) в каталитическом режиме, и объясняет цитотоксический эффект его действия. Кромо '

того, комплекс блеомицнна с _ аелээон_____могвт постанавливаться

неферментним путем за счет присутствующих

Пила ."зследопана эффективность различных

:■•!,"TOo з pnrpysw!* поп

:<r«!i.;t П КПЧаОТВО

водоко-эквивалентов использовали аскорбиновую

и клетке дотюроь

доногмп лнйптвием ;;он< >роь кислоту,

иоягмюлл, пвКиОЛЬшйЫ ¡^иКГС.-.: Zl'Z'""."

эскорбшювоя кислота (увеличение иитотоксической активности в 2,5 роза), несколько меньшим - дитпотрзитол и перекись водорода, в 1,25 ц в 1,75 раза соответственно (рис.6).

Таким образом, из получегашх результатов следует, что цитотоксическгал действием обладает комплекс блеомицнна как с

с г»;:,""«« Of Г). Н".ЛИЧК? го'стполлой г-.С-и ТГОЯУ.1 riv» V ТО, ЧТО D'*,|WKT4l'HC'C'lЬ

-яню-. .-«я :ti c>>i<,Min8n»a с ¿¡¿лйоомШ) u ill J ? з^игтеь'и-

o.e.iH«K«p(t, у{/п»кво?7 :ic во^'ожкть ррботы комплекса з птnjл!т• v!pсitг-м регаше зи счет фзрг'змтпого я T*jjjw«»»tii- • го >-Г.С,.7ЛН03ЛС!Г!!Я. r.nG.T,T!V 4.fiJf)KT КЯТОЛЙЗИ, СУИОрОКСИДЛМСМутЯЗЦ it антаоксидоигои говорит о том, что шгготонсическиЛ оОДюк: сЛуп-ог""'' «вмнизмом повреждения мембран

гпаоцитов, ст'новиую роль " гсотор.ч шрает i идроксокышй

Все азло^нные выше данные и обусловили выбор антибиотика б.^о-пцина п качэстве токсического фрагмента цятотоксинов для поправленного ряор>ямтя тшк miron.

2. ;!сследоьян"л' влияния коиывганяи блпомяшна с пльбу'пглом на его иитогоас;п:;схуы «»глшиэсть.

Цитотокснчвскхя эффект

Рис.6 Цитотоксичекая активность комплекса блеомицин-Ре(II) в

присутствии доноров редокс-эквивалентов. Условие эксперимента указам в подписи к рисунку I. К суспензии тимоцитоов добавляли:

А - блеомшдан-Ре(И) 50 мкМ; В - А + перекись водорода 0,5 ыМ; С - А + датиотретол 0,5 мМ; о - А + аскорбиновая кислота 0,5 мМ.

При получении, габридной молекулы, состоящей из низкомолекулярного генератора активных форм кислорода и адресной молекулы, путем их ковалентного связывания, необходимо чтобы сохранялась цитотоксичность антибиотика и селективность адресного вектора. Количество работ, посвященных созданию конызгатов из антибиотиков невелико, что объясняется небольшим, количеством реакционноспособных групп в молекуле антибиотика, которые могут быть вовлечены в реакцию конъюгации без изменения его активности.

При использовании блоомицина в качестве токсического фрагмента цитотоксина только одна аминогруппа может быть вовлечена в реакцию ковалентного связывания с адресным пептидом без значительной потери его способностью хелатировать железо, и проявлять цитотоксичность (Ohoea & Blair, 1988). - ,

На основе вшпеизлокенного необходимо было разработать метод съязнвания блеомицина с белками, сохранящий цито-оксическую активность антибиотики. Эта задача решалась с использованием бича го сывороточного альбумина в качестве модельного белка-носителя и бифункциональных сшивающих реагентов. Данные вещества позволяют проводить реакцию конъюгации в мягких услоьалг. Соз потери активности токсического фрагменте и селективности связывания адресной молекулы (Chose & Blair, 1988).

Учитывая это, в качестЕв сшивающего реагента был выбран бифункциональный имидоэфир - диметиладипимидат. Реакция конъюгации.проводили по методике, изложенной в "Материалах и методах". Блеомицин с альбумином сшивали с помощью диметиладипимидата, в молярном соотношении 50:1:300, соответственно, Такоо соотношение компонентов в среде инкубации обеспечивает довольно высокий выход коныогата блоомишш-альбумин при отсутствии конъпгетов альбумин-альбумин.

Инкубационную смесь анализировали с помощью гель-фильтрации на сефадоксе 0-75. Для оценки количества блеомицина, связавшегося с одной молоку мой альбумина был использован мечешщй ®H блеомицин. При проведении реакции конъюгации меченый тритием блеомицин смешивали с немеченым блеомицююм в таком соотношении, чтобы радиоактивность конъйгыдаошюй июси составляла 50000 срм/'мл.

Профиль радиоактивности при разделении гель-фильтрацией инкубационной смеси после конъюгации представлен на рисунке 7. В первой фракции, содержащей кстгыогат блеомицина с альбумином, радиактивность составляла ТТ000 срм/мл, что соответствует содержанию в конъюгате 0,44 мМ блеомицина при содержании альбумина 0,045 мм, т.е. одна молекула

альбумина ковалентио связывает II молекул Слеомицина.

После отделения гель-фильтрацией ковалентного комплекса блеомицина с альбумином от несвязанного блеомицина проводили исследование цитотоксической активности коныогата, которая оценивалась по способности восстановленного конъюгата Олеомицин-альбумин вызывать разрушение клеток тимуса (ряс. 8). Как видно, восстановленный комплекс блеомицин-альбумин сохранял способность разрушать мембраны тимоцитов. Для исключения аффекта адсорбции блеомицина на молекуле альбумина , инкубировали блеомицин с альбумином в тех же условиях, но без обработки даме тил а да лимида том. При последующем отделении белка от антибиотика гель-фильтрацией альбумин ае обладал способностью разрушать клеточные мембрана.

Следовательно, действующим началом в полученном конызгате является ковалентно связанный с альбумином блеомицин, который сохраняет свою цитотоксическую активность. .

3. Получение конгюгвтов блеодацина с адресными молекулами и исследование 1а цитотоксической активности

I

Для придания блеомицину сродства к определенному типу клеток необходимо было связать его с адресным фрагментом. В качестве адресных фрагментов па тимоциты были использованы конканавалин А, инсулин и кальцатонин, рецепторы к которым имеются на различных клетках лимфоцитарного ряда ( rn.lri.oh вt а1.,1985; Ооадга а1. ,198т; Твррегтап,1987).

Условия конъюгации блеомицина с адресными фрагментами а выделение коныогатов описаны в разделе "Материалы и метода".'' Для

оценки количества молекул блеомицина, связанных с адресными молекулами, тенге был использован меченный тритием блеомицин.

Оказалось, что в конъюгате конканавалин А - блеомицин на одну молекулу конкапавалина А приходится 14 молекул блеомицина. В конъюгате инсулин-блеомицин и кальцитонин-блеомицин одна молекула блеомицина связалось с одной молекуле инсулина или калыштонина.

Для сравнения цитотоксической активности выделенных конъюгатов конканавалин А - блеомицин, инсулин - блеомицин, кальцитонин -блеомицин проводили предварительную инкубацию конъюгатов с двухвалентным железом в количестве эквимолярном концентрации блеомицина в конъюгате, и после атого добавляли к суспензии

Рис.7. Хромзтографичбское разделение конъюгата

блеомицин-БСА на еефадексе 0-75. Гель-фильтряцию проводили на колонке с сефадексом 0-75 (1x120 см) в 10 мМ Ыа-фосфятном буфере, рН=7,4. Скорость элиши 0,5 мл/миь. На колонку наносили: I) БСА; 2) блеомзцин; 3) конъкгат БСА-блеомицин ; 4) профиль радиоактивности смеси свободного ^блеомицина и конъюгата .БСА~Н?блеомкцин.

•ю-

ю ю и

ао

40

X

0 30 н м i» , мо 1ю 110 мо 17в эм

Время, оме.

Рис.8. Цитотоксическая активность конъюгата БСА-блеомицин после разделения гель-фильтрацией на сефадексе 0-75. Инкубационная смесь объемом I мл содержала 2хЮ6 клеток в рк> буфере, рН7,4. Условие эксперимента указаны в подписи к рисунку I. К суспензии тимоцитов добавляли: А - комплекс блеомицин-келезо (II) 25 мкМ; В - коньюгат БСА-блеомицин, с концентрацией по бяеомицину 25 мкМ; С - БОА, инкубированный с блеомицином, и отделенный гель-фильтрацией.

тимоцитов (рис.9). Контролем служило разрушение клеток тимуса 50 чкМ комплексом Олвомицин-Ре(И), с чем и сравнивали цитолитические аффекты конъюгатов, концентрации которых расчитаны по блеомицину. Отдельно добавленные к суспензиям клеток конканавалин А, инсулин и кальцитошш цитстоксического эффекта не оказывали. •

Оказалось, что цитотоксическая активность конъюгата блеомицина с конканавалином А превышает активность свободного антибиотика в . 4 раза. В случае сшивания блеомицина с инсулином активность их конъюгата повышается в 12,5 раза по сравнению со свободным блеомицином. Для конъюгата блеомицин-кальцитонин его активность увеличивается в 8 раз.

Флуоресценция, отн-ед.

Время, сяк.

Рис.9. Цитотоксическая активность очищенных конъюгатов

блеомицина с адресными молекулами. Условия вксперимвнта - см. рис. I. К суспензии тимоцитов добавляли:

А) комплекс блеомицин - иелезо(П) 60 мкМ; В) коньюгат конканавалпн А - блеомицин (12,5 мкМ), инсулин - блеомицин (4мкМ), кальцитонин-блеомицин (6 мкМ), С) конканавалин А

{12,5 инсулин (4мкм!, кальцитонин (О мк!,!),

¡¡роя|Я!у',:гр'<пРгНН!гй с блеомтряюм и отделенный я гчс у» уадопичт, что и коньюгат.

Таким образом, полученные лепные свидетельствуют о ток, что бле^мчцил может бить использован в качестве токсического фрзгшнта генерирующего активные форда кислородав цитотоксинах, содержащих адресный вектор, комплементарный детерминантам на

поверхности плеток.

вывода.

1. Разрушение мембран тимоцитов под действием комплекса блеомицин-железо '(II) является свободнорадикальным процессом, в котором участвуют ^0,,, и 'ОН.

2. В процессе разрушения плазматических момбран тимоцитов блеомицин функционирует в каталитическом режиме за счет ферментного и неферментного восстановления.

3. При ковалентном связывании блеомицина с БСА с помощью бифункционального имидо эфира диметиладипимидата сохраняется пособность блеомицина разрушать клеточные мембраны.

4. Цитотоксическая активность конъюгатов блеомицина превышает активность свободного антибиотика: для конъюгата блеомицин-конканавалин А в 4 раза, блеомицин-инсулин в 12,5 раза и блеомицин-кзльцитониН в 8 раз. ' '

СПИСОК ОГОБЛИКОГ)ИГО РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Матхонов Н.Э., Вознесенский А.И. и Галанова Ю.В. Направленное разрушение В-лимфоцитов генераторами активных форм кислорода. В тезизах докладов З-ей региональной конференции молодых ученых "Биологические ресурсы и проблемы экологии Сибири", г. Улан-Удэ, 1990, стр 8Г.

2. Vozneseneky A.I., Galanove. Ju.V., Shkrob Ч.М., Matkhanov 7.Я., Archnkov A.I. Conjugation of bleomycin with ooncanavalin A or immunoglobulin 0 inoreaeestts ability to destroy cell membraneeS; Arhiveo of Biochemistry and Biophyeloe, 1990, v.283,

N 2, pp. 519-522.

3. Vozneeeneky A.I., Calanova Ju.V., Matkhanov I.E., Arohakov A.I. Bleomyoin ?o(II) linked to Con A or Ig 0 has inoreaeed ability to deatrrlot erythrocyte membranes. Vroo. VTIIth Int. Symp Minrofomee and Drag Oxidation, Stookholm, June 25-29, 1990, p.188.

4. Piattownov I.E., Zhukov A.A. Conjugation of bleomycin with Insulin and oeloltonin enhaneed its ability to destroy mouse thymocytes. Proo.. ' vilth International Conference "Bioohemietry & Blophynios of Cytoohrome P-450; Struoture fr Punotion, Bioteohnologioal & Eoologioal Aepeots". Moscow, 1994, 3.117.

Заказ 33 тираж 100 экз.Ротапринт ШТГХТ им.Ломонооова М,Пироговская ул.,д,1