Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитотоксическая активность блеомицина и его конъюгатов с адресными молекулами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Цитотоксическая активность блеомицина и его конъюгатов с адресными молекулами"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЕ И МЕЦЩЩШСКОЙ химии

На правах рукописи УДК 577.113

ГАЛАНОВА Илия Вилиамовна

ЩСТОТОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ВЛЕОМШЩНА И ЕГО КОЕЫЗГАТОВ С АДРЕСНЫМИ МОЛЕКШШ

СЗЗ.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1992

Работа выполнена в Институте биологической и медицинской химии Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

академик РАШ, профессор Арчаков А.И.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Соловьева Н.И. доктор медицинских наук Терентьев A.A.

Ведущая организация:

Институт вирусолога им.Д.И.Ивановского РАМН

Защита диссертации состоится 1992г. на заседании

специализированного Ученого совета Д 001.10.01 Института биологической и медицинской химии РАМН по адресу: II9832, Москва, ул.Погодинская, 10.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Института биологической и медацинской химии РАМН.

Автореферат разослан " <.-L*J2-P 1992г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Павлнхина Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Направленное уничтожение клеток определенного типа является одной из важных задач этиотройной терапии различных заболеваний.

Цнтотоксинн - это новый тип фармакологических препаратов, позволяющий избирательно убивать клетки мишени. Как правило, они представляют собой гибридные молекулы состоящие из токсического и адресного фрагментов. В качестве адресного фрагмента цитотоксинов успешно используют лектины, гормоны, антитела и их Уаь-фрагменты. В качестве токсических фрагментов используют токсины растительного и бактериального происхоадения ( абрин, рицин, модецин ). Это наиболее хорошо изученный тип цитотоксинов. ■ Кроме того, широко исследуется направленная доставка к клеткам-мишеням ферментативно-активных веществ ( например, глюкозооксидазы, генерирующей перекись водорода), лекарственных препаратов таких как антиметаболиты (метотрексат), алкилирукщие агенты (хлорамбуцил), некоторые антибиотики.

Использование низкомолекулярных генераторов активных форм кислорода в качестве токсических фрагментов цитотоксинов - это новый подход к направленному разрушению клеток-мишеней, позволяющий сочетать точную клеточную адресацию с широким спектром возможных повревдений.

Известно, что в организме активные формы кислорода осуществляют окислительную модификацию и деградацию структурных и транспортных белков, ферментов, нуклеиновых кислот, инициируют

перекисное окисление ненасыщенных лшшдов, вызывают повреждение биомембран (Fligiel et al., 1984; Halliwell & GuttericLge, 1984; Fridovioh, 1986; Him et al., 1988; Archakov & Bachraanova, 1990 ). Довольно хорошо изучено цитотоксическое действие активных форм кислорода на различные виды клеток: фагоциты, эритроциты, эпителиальные клетки, культуры опухолевых клеток и т.д. ( Badwey & Karnovsky, 1980; Nathan & Cohn, 1980; Weiss & Lobuglio, 1982; Whorton et al., 1985 ). -

В качестве низкомолекулярного генератора активных форм кислорода нами был выбран антибиотик блеомицин, относящийся к классу гликопептидов. Блеомицин, хелатируя металлы переменной валентности, генерирует активные формы кислорода в окислительно - восстановительном цикле, подобном монооксигеназному циклу цитохрома Р-450 (Burger et al., 1983; Murugesan et al, 1983). Молекулой-мишенью в клетке для блеомицина является ДНК: интеркалируя в молекулу ДНК, блеомицин генерирует разрушающие ДНК активные формы кислорода (stubbe, 1988). Помимо разрывов ДНК, блеомицин может оказывать повреждающее действие на мембранные структуры клеток за счет инициации перекисного окисления липидов, с последующей агрегацией белков (Giri et al., 1983; Omaye and Tappel, 1984; Rosen et al., 1983).

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования являлось получение активных коныогатов блеомицина с адресными молекулами, обладающих способностью разрушать эритроциты более эффективно, чем свободный блеомицин.

В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие

задачи:

1. Исследовать повреждающее действие блеомицина на эритроциты с целью выяснения вида активных форм кислорода участвующих в этом процессе и возможности использования в нем различных доноров ре докс-эквивалентов.

2. Разработать метод ковалентного связывания блеомицина с белком с сохранением его способности активировать молекулярный кислород.

3. Получить активные конъюгаты блеомицина с конканавалином А, антиэритроцитарным о и его Раь-фрагментом, обладающие высоким сродством к поверхности эритроцитов.

4. Провести сравнительное исследование гемолитической активности полученных коныогатов и свободого блеомицина.

Научная новизна и практическая значимость работы. Научная новизна предлагаемой работы состоит в том, что низкомолекулярный генератор активных форм кислорода блеомицин предлагается использовать в качестве киллерного фрагмента при создании цитотоксинов.

В результате проведенных исследований обнаружено, что комплекс блеомицина с железом, генерируя активные формы кислорода, способен повреждать эритроцитарные мембраны. Необходимые для этого электроны железо может получать от аскорбиновой кислоты, перекиси водорода. Кроме того, возможно ферментативное восстановление железа ИАИРН-цитохром Р-450 редуктазой.

Подобраны условия ковалентного связывания блеомицина с белками, при которых блеомицин сохраняет способность хелатировать железо и разрушать клеточные мембраны.

Получены- конъюгаты блеомицина с адресными фрагментами

конканавалином А, антиэритроцитарным иммуноглобулином с и Fab-фрагментом, обладающие более высокой гемолитической активностью по сравнению со свободным блеомицином.

Апробация диссертации состоялась 29.01.92 г. на совместном заседании учебно-научного комплекса кафедры биохимии МВФ РГМУ и Института биологической и медицинской химии РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 130 станицах машинописного текста, включая 4 таблицы л 29 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, глав, содержащих описание материалов и методов исследования, экспериментальной части с результатами исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Суспензию эритроцитов мышей СВА готовили по методу Freimel

(1987). • * —----—

Для получения антиэритроцитарного Ig G кроликов иммунизировали внутрибршинным введением 1 мл 50% суспензии эритроцитов мышей СВА 5 раз через день. Для реиммунизации вводили внутрибршинно по 1 мл юЖ суспензии эритроцитов 3 раза через день.

' Антиэритроцитарный иммуноглобулин G выделяли при помощи аффинной хроматографии на протеин-А-сефарозе CL-4B (Hjelm et al.,1972; Goding,l976). Pab-фрагмент антиэритроцитарного Ig G выделяли по методике Coulter & Harris (1983).

б

Содержание белка в полученных препаратах Ig G и Pab-фрагмента определяли по методу Lowry et al. (1951).

Молекулярную массу и степень очистки выделенных белков (igG и РаЬ-фрагмента) оценивали электрофорвтически по метол Laemmli (1970), адаптированному для электрофореза в пластинах геля (Atwell & Marchalonis, 1974).

Активность конканавалина А оценивали, по способности агглютинировать 2% суспензию эритроцитов по методике, предложенной Вязовым О.Е. (1967).

nadph-егоцкфичный флавопротеин выделяли по модифицированному методу Dignam и strobel (1977). Препарат фермента с удельной активностью 40 - 43 мкмоль цитохрома с* мин-1* мг-1 и удельным содержанием 12-13.5 нмолей флавопротеина на мг белка был любезно предоставлен препаративной группой лаборатории энзимологии и биоэнергетики при кафедре биохимии ЫБФ РГМУ.

Активность NADPH—цитохром Р-450 редуктазы оценивалась -по восстановлению цитохрома с: инкубационная смесь содержала 50 мкМ цитохрома с. Реакцию запускали добавлением 100 мкМ ЫАБРН. Разница ^550-600 служила показателем, характеризующим содержание восстановленного цитохрома с ( коэффициент молярной экстинции 18,5 мМ-1см-1). Измерения проводили при 30°С.

Способность блеомицина вызывать разрывы в ДНК оценивали по накоплению одного из конечных продуктов реакции - малонового диальдегида по методу Burger (1980).

Гемолитическую активность блеомицина определяли спектрофотомэтричэски по методу MoPaul et al. (1986). Измерения проводили на приборе 8451A Diod Array Spectrophotometer (Hewlett

Paokard, QUA). Изменение оптической плотности регистрировали при длине волны 600 ны. Инкубационная смесь объемом 1 мл содержала 2x1 о6 эритроцитов мышей СВА в ю. мМ фосфатном буфере, pH 7,4, содержащем 140 мМ HaCl. Предварительный подсчет клеток проводили в камере Горяева. Для получения восстановленного и окисленного комплексов блеомицина смешивали растворы блеомицина и сульфата железа(II) или хлорида железа (III) в эквимолярных соотношениях и инкубировали при комнатной температуре 5 мин. Добавляли в кювету до конечной концентрации 0.5 мМ. Регистрацию изменения оптической плотности проводили при 37°С.

Разрушение эритроцитов под действием блеомицина оценивали также по выходу калия из цитоплазмы в среду инкубации. Уточка калия из эритроцитов регистрировалась с помощью ион-селективного электрода (Orion Research, США).

Получение коньюгатов блеомицина с белками:

Конъюгация блеомицина с белками проводилась по методу Horden et al. (1987). Для ковалентного связывания антибиотика с белками был использован бифункциональный сшивающий агент диыетиладипимидат, реагирующий со свободными аминогруппами молекулы белка и блеомицина с образованием ковалентной связи. Реакцию конъюгации проводили в 250 мМ триэтаноламиновом буфере, pH 8,5. Блеомицин инкубировали с белком и диметиладипимидатом в течение 1 часа при 25°С. Реакцию останавливали добавлением равного объема 1 Ы трис-глицинового буфера, pH 9,0, после чего смесь инкубировали еще ю мин при 25°С.

Выделение коньюгатов блеомицина с белками из реакционной смеси проводили методом гель-фильтрации. Для выделения коньюгатов

блеомицина с альбумином (БСА) и РаЬ-фрагмонтом использовали колонку 1x20 см с сефадексом с-75, уравновешенную 10 мМ Иа-фосфатным буфером, рН 7,6. Наносили 0.5 ил реакционной смеси. Элвировали тем же буфером со скоростью 0,5 мл/мин. Содержание белка в элюате регистрировали при 220 нм в проточной кювете . Конъюгаты блеомицина с конканавалином А и антиэритроцитарным в выделяли на колонке 1x20 см с сефадексом а-200, уравновешенной 10 мМ На-фосфатным буфером, рН=7,6. Наносили 0.5 мл реакционной смеси. Элюцию проводили тем же буфером со скоростью 0,5 мл/мин.

Количество молекул блеомицина, связавшихся с молекулой белка в коныогатах, определяли с помощью меченного' ' тритием блеомицина. Удельная активность %блеомицина составляла I мКи/ммоль. Конъюгаты ^блеомицина с белками отделяли от непрореагировавшего блеомицина методом гэль-фильтрации как было описано выше. 0.05 мл из фракции ( 2 мл) добавляли к 10 мл толуолового сцинтилятора. Измерение радаактивности проводили на сцинтшшционном счетчике 1211 ИасИ^а фармы ЬКВ.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Исследование механизма цитотоксической активности блеомицина.

Гликопептидный антибиотик блеошцин был выбран наш в качестве низкомолекулярного генератора активных форм кислорода для создания цитотоксинов, позволяющих направленно ункчтогать определенные виды клеток.

На первом этапе необходимо было исследовать механизм

цитотоксического действия блеомицина на клетки с целью выяснения вида активных форм кислорода, участвующих в этом процессе, а также возможности использования при разрушении клеток различных доноров редокс-экнивалентов.

В качестве мишени были выбраны эритроциты - клетки, повреждение которых легко контролировать спектрофотометрически и по выходу калия из цитоплазмы в среду инкубации.

Добавление комплекса блеомицин-железо(И) к суспензии эритроцитов вызывало характерные для гемолиза спектральные изменения и сопровождалось нарастанием калия в среде инкубации, что свидетельствовало о повреждении плазматической мембраны эритроцитов. Окисленный комплекс блеомицин-келезо не вызывал гемолиза ( таблица I). Регистрируемая спектрофотометрически кривая разрушения эритроцитов комплексом Олеомицин-келезо(И) имеет сигмоидальную форму, характерную для свободнораданалышх процессов (рис. I). Длительность лаг-периода гемолиза обратно пропорциональна концентрации комплекса блеомицин-келезо(И) в среде инкубации (рис. 2).

Для выяснения природы активных форм кислорода, участвующих е разрушении эритроцитов, было исследовано влияние каталазы, супероксиддисмутазы и антиоксидантов на блеомицин-зависиыый гемолиз. Добавление каталазы и СОД в среду инкубации приводило к ингибированию гемолиза под действием Олеомицина при уменьшении максимальной величины гемолиза лаг-период увеличивался в 3 раза по сравнению с контролем. В отличие от этого добавление антиоксидантов в среду инкубации приводило лишь к увеличению лаг-периода.Наиболее выраженный эффект ингибирования

«

Таблица I.

Выход ионов калия из эритроцитов при повреждении мембран под действием комплекса блеомнцин-келезо

Состав инкубационной смеси

Выход ионов калия в среду инкубации (% от контроля *)

Эритроциты (глЮ^еток/мл) Эритроциты + Тритон N-101 (10$) Эритроциты + блеомицин-г,е(Ш) (0.5 мГЛ) Эритроциты + блвомицин-Fe (и) (0.5 мМ) Эритроциты + MAJDPH-Цитохром

*

Р-450 редуктаза (22 ед/мл) + HADPH (ЗООмкМ) Эритроциты + блвомицин-Fe(III) (0.5 Ш) -:- ЩБРН-цитохром Р-450 редуктаза (22 ед/мл) + NABPH (ЗООмкМ)

О 100 3 100

18

100

Инкубационная смесь объемом I мл содержала 2-10 эритроцитов в 10 мМ на-фосфатном буфере, рН 7.4, 140 :лМ NaCl. Указанные в таблице ВЕградиенты добавляли в среду инкубации и инкубировали 10 минут при 37°С перед измерением содержания калия. Контролем служила суспензия интактвых эритроцитов. За 1002 принято содержание калия после добавления нэконного детергента тритона N-1C1 (юой гемолиз).

I эд = I икмоль цитохрома с /мин.

/чеюх

Рис.1. Гемолиз эритроцитов под действием комплекса

блеомщина-Уе (II). Инкубационная смесь объемом I мл содержала 2*10® эритроцитов мыши СНА в 10 мМ Ка-фосфатном буфере, рН 7.4, 140 кМ Най. Из;,мнение оптической плотности при 600 нм регистрировали при 37°С. К суспензии эритроцитов добавляли:

комплекс блеомицин-£е(11) О.Б }М (I); блоажцш 0.5 мМ (2); сульфат железа (II) 0.5 ыЫ (3).

1Л.1 №**>)

Рис.2. Зависимость лаг-периода гемолиза .от концентрации блеомицина.

Длительность лаг-париода (Ь) регистрировали при различной концентрации комплекса блеомицин-Ре(И) в среде инкубации. Состав инкубационной смеси и условия указаны в подписи к рис.1.

гемолиза наблюдался при добавлении в среду инкубации токоферола в концентрации 100 мкМ - величина лаг-периода увеличивалась в 3.8 раза (рис.3).

Полученные результаты указывают на то, что в процессе разрушения клеточных мембран под действием комплекса блеомицин -келезо(и) участвуют гадроксильный радикал, суперокисный радикал и перекись водорода.

-AiOOOrarl

Рис.3. Влияние каталазн, сугороксвддисмутазн и антиоксидантов на гемолиз эритроцитов, Еыэивпвш'Я комплексом блеошцш-Ре (IX). Состав инкубационной смэси и условия указана в подписи к рис.1. К суспензии эритроцитов добавляли:

блоомицин-?е(II) 0.5 rM (I); блео:,ицкн-?е(П) 0.5 мМ и этанол 10 мМ (2); блеожщин-:еа(11) 0.5 м!.! н мслштол 100 мМ (3); блесыицин-Ре(II) 0.5 мМ и токсфэрол 100 ;иМ (4); блеомящип-Уе(Н) 0.5 и'.! и каталазу ( 3200 ед/мл ) (5); блеог.тщин-РеШ) 0.5 мМ и супороксидцисмутазу ( 3000 ед/мл ) (6).

На слодукцом этапе исследовалось иф£экгевность различных доноров родокс-зкЕИвалентов в реакции гемолиза эритроцитов под комплекса блоомзцин-тюлозо (II). Сраташиалась генерация форл хг^слорола кетяшжсок блссащиа- голезо(П) при

использовании в качестве доноров редокс-эквивалентов аскорбиновой кислоты, перекиси водорода и тиоловых соединений . Наиболее эффективными донорами редуцирующих эквивалентов оказались аскорбиновая кислота и перекись водорода. При использовании аскорбиновой кислоты величина лаг-периода блеомициязависимого гемолиза уменьшалась в 3.4 раза по сравнению с контролем. Добавление. перекиси водорода в среду инкубации приводило к уменьшению лаг-периода в 2 раза по сравнению с контролем (рис.4). Дитиотрейтол вызывал лишь незначительное уменьшение лаг-периода.

-А(000)

Рис.4. Влияние доноров редокс-эквивалентов на гемолиз эритроциов, вызываемый комплексом блеомицин-Ре(II).

Состав инкубационной.смеси и условия указаны в подписи к рис.1. К суспензии эритроцитов добавляли:

блеомицин-Ре(II) 0.5 ыМ (I); блеомицин-Ре(II) 0.5 мМ и аскорбиновую кислоту 5 мМ (2); блеомицин-Ре(II) 0.5 Ш и перекись водорода 5 ыЫ'(З); блеомицин-Ре (II) 0.5 мМ и дитиотрейтол 5 мМ (4); аскорбиновую кислоту 5 мМ (5); перекись водорода 5 мМ (6); дитиотрейтол 5 мМ (7).

Полученные данные позволяют предположить, что в процессе разрушения клеточных мембран, также как и в реакции деградации ДНК, блеомицин может использовать в качестве доноров редокс-эквивалентов соединения, присутствующие в тканях.

Следующий вопрос, который нас заинтересовал, это возможность ферментативного восстановления комплекса блеомицин-келезо . при разрушении клеточных мембран.

Комплекс блеомицин-железо(Ш) не вызывал разрушения эритроцитарных мембран. Инкубация эритроцитов с ыабрн и ИАБРН-цитохром Р-450 редуктазой также не приводила к гемолизу. Добавление наври, НАЛРН-цитохром Р-450 редуктазы вместе с

Рис.5. Гемолиз эритроцитов вызываемый " комплексом блеомицин-7е(Ш), восстановленным ЭДШРН-цитохром Р-450 редуктазой. Состав инкубационной смеси и условия указаны в подписи к рис.1. К суспензии эритроцитов добавляли:

блеомицин-Ре(Ш) 0.5 мМ, КАБРН-цитохром Р-450 редуктазу *

(22 ед/мл) и 1Ш)РН 300 мкМ (I): блеомицин-Ре(III) 0.5 мМ (2); ИАДРН-цитохром Р-450 редуктазу (22 ед/мл) и НАБРН 300 мкМ (3). * I ед = I мкмоль цитохрома с/мин.

комплексом блеомицин-железо (ill) вызывало разрушение плазматических мембран эритроцитов (рис. 5, таблица I), что свидетельствует о способности комплекса блеомицин-железо(III) разрушать мембраны за счет электронов, полученных от NADPH-цитохром Р-450 редуктазы.

В целом приведенные выше экспериментальные данные указывают на то, что блеомицин, генерируя активные формы кислорода, способен оказывать цитотоксическое действие без проникновения внутрь клетки. Используя восстановительные агенты, присутствующие в среде, блеомицин может работать в каталитическом режиме, непрерывно вырабатывая активные формы кислорода вплоть до полного разрушения клеток-мишеней.

Все эти данные и обусловили выбор антибиотика блеомицина в качестве токсического фрагмента цитотоксинов для нацравлепного разрушения клеток-мишеней.

2. Исследование влияния конъюгации блеомицина с альбумином на его ци'хотоксическую активность.

При еоодг1:к1 хсгготсксшюв, состоетдих из адресного вектора и антибиотиков, одолм из сакых серьезных ограничений является значительное снижение цитохокскческой активности антибиотиков при конъюгации. Число работ, посвяноиднх созданию коныогатов с актЕбкотшиш, навалико, что объясняется небольшим количеством рзакционноспоссбных групп в молекуле антибиотика, которые могут быть вовлечены в реакцию кокьагацяи баз пзкзпзния его активности. При использовании блеомицина только I аминогруппа могсет быть вовлечена в реакцию ковалентного связывания с адресным пептидом

без значительной потери его способности хелатировать железо и проявлять цитотоксичность (Ghose & Blair, 1979).

В связи с этим необходимо было разработать метод связывания блеомицина с белками, сохраняющий цитотоксическую активность антибиотика. Эта задача решалась с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве .молекулы бежа-носите ля.

В ряде работ отмечается _ предпочтительное использование бифункциональных сшивающих имидоэфиров в тех случаях, когда есть аминогруппы и в адресной молекуле и в молекуле вещества, используемого в качестве токсческого фрагмента. Данные реагенты позволяют проводить реакцию конъюгации в мягких условиях без потери активности антител и активности токсического фрагмента. Кроме того, положительным качеством бифункциональных сшивающих реагентов является то, что различная длина углеводной цепи вмядоЕффОв (Б, 8, 12 атомов углерода) позволяет варьировать дистанции между токсином и адресной молекулой.

Учитывая все эти условия, в качества спшващего реагента был выбран бифуша^олальЕый пмвдоэфар - даметиладашивдат.

Гэакцшо конъюгации блэокпцина с альбумином с помощью диметиладапимидата проводили при молярном соотношении 50:1:300, соответственно. Такое соотношение компонентов в среде инкубации обеспечивает довольно высокий выход конъюгата блеомицин-альбумин при отсутствии конъюгата альбумин-альбумин в среде инкубации. Выделение конъвгата блеомицин-альбумин осуществляли с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-75 ( рис.6).

Количество молекул блеомицина, связанных с молекулой альбумина, оценивали, используя меченный тритием блеомицин. Профиль радиактивности представлен на рисунке 6. Во фракциях

Н фракций

Рис.6. Хроматографическое разделение конъюгата блеомицин-альбумин

на сефадексе 6-75. Гель-фильтрацию проводили на колонке с сефадексом 0-75 (1x20 см) в 10 мМ Иа-фосфатном буфере, рН 7.6. Скорость потока 0.5 мл/мин. На колонку наносили: блеомицин-БСА конъюгат (I); % блеомицин-БСА конъюгат (2).

2-4, содержащих конъюгат блеомицин-альбумин радиактивность составляла 11000 сры/мл, что соответствует содержанию в конъюгате 0.66 кг/мл блеомицяна при содерданак 3 мг/мл альбумина в молярном соотношении 11:1.

После отделения гель-фильтрацией ковалентного комплекса олзсшщин- альбугжк от несвязанного блэсжщина проводилось исследование цитотоксической активности конъюгата, которая оценивалась ' по способности восстановленного конъюгата блаомйцпн-альбушш вызывать геколиз эритроцитов (рис. 7). Как

видно, восстановленный комплекс блеомицин-альбумин сохранял способность разрушать мембраны эритроцитов. Для исключения эффекта адсорбции блеомицина на молекуле альбумина , инкубировали блеомицин с альбумином в тех же условиях, но без обработки диметиладипимидатом. При последующем отделении белка от антибиотика гель-фильтрацией альбумин не обладал способностью разрушать мембраны эритроцитов (рис. 7).

Рис.7. Гемолитическая активность конъюгата БСА-блеомицин после

разделения гель-фильтрацией на сефадексе 0-75. Состав инкубационной смеси и условия указаны в подписи к рис.1. К суспензии эритроцитов добавляли:

комплекс блеомицин-келезо(II) 0.5 мМ (I); восстановленный конъюгат БСА-блеомицин с концентрацией по блеомицину 0.5 мМ (2); БСА 0.045 мМ, проинкубированный с блеомицином и • отделенный гель-фильтрацией (3).

Таким образом, можно сделать вывод о том, что при ковалентном связывании II молекул блеомицина с молекулой альбумина при помощи сшивающего реагента диметиладипимидата цитотоксическая активность блеомицина не отличается от активности немодифяцирозанного антибиотика.

-Н<хх* ав|—

о

О 5 ТО 20 26 00 бб 40

ЦтИ

3. Получение конъюгатов блеомицина с адресными молекулами и исследование их гемолитической активности.

Для придания блеомицину сродства к определенному типу клеток необходимо было связать его с адресным фрагментом. В качестве адресного фрагмента были использованы конканавалин А, антиэритроцитарный иммуноглобулин с и его Раь-фрагмэнт.

Условия конъюгации блеомицина с адресными фрагментами и выделение конъюгатов описаны в разделе "Материалы и методы". Для оценки' количества молекул блеомицина, связанных с адресными молекулами, также был использован меченный тритием блеомицин. Оказалось, что в коныогате конканавалин А - блеомицин на I молекулу конканавалина А приходится 15 молекул блеомицина. В конъюгате й-блеомицин с I молекулой антиэритроцитарного с связалось 9 молекул блеомицина, тогда как в конъюгате гаъ-фрагмент-блеомицин на I молекулу Рай-фрагмента приходится 4 молекулы блеомицина.

Для сравнения гемолитической активности выделенных конъюгатов конканавалин А - блеомицин, I® б - блеомицин и гаЪ-фрагмент-блеомицин проводили предварительную инкубацию конъюгатов с двухвалентным железом в количестве эквимолярном концентрации блеомицина в конъюгате и добавляли восстановленные конъюгаты к суспензии эритроцитов в такой концентрации, чтобы содержание блеомицина в среде инкубации составляло 0.1 мМ. Величину лаг-пэриода гемолиза, вызываемого восстановленными конъюгатами блеомицина с адресными молекулами сравнивали с лаг-периодом гемолиза под действием немодифацированного блеомицина в концентрации 0.1 мМ.

Видно, что конъюгация блеомицина с адресными пептидами сопровождается уменьшением величины лаг-периода: для конюгата конканавалин А - блестящий - в 2.2 раза, для конъюгата в -блеомицин в 6 раз, а для конъюгата Раь-фрагмент - блеомицин в 18 раз (рис.8).

-А10О0)

Еис.8. Сравнение цитотоксической активности коныогатов блеомицина с адресными молекулами.

Состав инкубационной смеси и условия указаны в подписи к рис.1. К суспензии эритроцитов добавляли:

комплекс блеомицин-железо (II) 0.1 ыМ (I); конъюгат конканавалин А - блеомицин - железо(П) 0.1 мМ (2); конъюгат й - блеомицин -железо(II) 0.1 мМ (3); конъюгат Раь-фрагмент - блеомицин -железо(П) 0.1 мМ (4).

Для каждого конъюгата была установлена минимальная цитотоксическая концентрация, вызывающая полный гемолиз эритроцитов. Минимальная цитотоксическая концентрация конъюгата конканавалин А - блеомицин - 0.03 мМ. Для конъюгата о -блеомицин минимальная цитотоксическая концентрация составила 0.02 мМ; для конъюгата РаЬ-фрагмент - блеомицин - 0.01 мМ. Тогда

как минимальная цитотоксическая концентрация для немодифнцированного блеомицина составляет - 0.1 мМ.

Учитывая минимальную цитотоксическую концентрацию конъюгатов и уменьшение величины лаг-периода вызываемого ими гемолиза, можно оценить эффективность действия данных конъюгатов в сравнении с немодифицированным блеомицином. "Гемолитическая- активность конъюгата конканавалин А - блеомицин в 6 раз превышает активность немодифицированного блеомицина. Гемолитическая активность конъюгата Ig G - блеомицин в 45 раз выше активности немодифицированного антибиотика. Гемолитическая активность конъюгата РаЬ-фрагмент - блеомицин в 180 раз выше активности свободного блеомицина. Таким образом, уменьшение размеров адресного фрагмента, хотя и сопровождается уменьшением количества молекул блеомицина, ковалентно связанных с молекулой переносчика, но приводит к более выраженному усилению гемолитического действия комплекса блеомицин-железо (II).

Полученные данные свидетельствуют о том, что блеомицин может быть эффективно использован для направленного разрушения клеток-мишеней в качества токсического фрагмента цктотоксинов.

выводы

1. Разрушение мембран эритроцитов под действием комплекса блеомицин-нелезо (II) является свободнорадакальным процессом, в котором участвуют перекись водорода, гидроксильный и суперокисный радикалы.

2. В процессе разрушения плазматических мембран эритроциов возможно восстановление комплекса блеомицин - железо (XII) донорами редокс-эквивалентов (аскорбиновой кислотой и перекисью водорода), а также за счет электронов, полученных от ИАБРН-цитохром Р-450 редуктазы.

3. При ковалентном связывании блеомицина с белками с помощью бифункционального имидоэфира диметаладипимидата сохраняется способность блеомицина разрушать мембраны эритроцитов.

4. Получены цитотоксически активные конъюгаты конканавалин А -блеомицин, lg G - блеомицин, РаЬ-фрагмент - блеомицин.

5. Конъюгация блеомицина с адресными молекулами приводит к увеличению цитотоксического эффекта: конъюгат конканавалин А -блеомицин в 6 раз, конъюгат иммуноглобулин G - блеомицин в 45 раз, конъюгат РаЪ-фрагмент - блеомицин в, 180 раз эффективнее немодифициробанного блеомицина.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Вознесенский А.И., Галанова Ю.В., Арчаков А.И. Направленное разрушение мембран клеток генераторами активных форм кислорода. В тезисах Всесоюзного симпозиума "Реконструкция, стабилизация и репарация биомембран". Благовещенск, 1989, стр.35.

2. Вознесенский А.И., Галанова D.B. Арчаков А.И. Елеомицин, ковалентно связанный с КонА, способен генерировать активные формы ' килорода для направленного разрушения эритроцитов. Тезисы Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул", Ялта, 1989, стр. 121.

3. Вознесенский А.И., Вощинников Е.И., Галанова Ю.В., Арчаков А.И., Стар А. Флуорантен может использоваться при изучении моделей цитохрома Р-450. Тезисы Всесоюзной конференции " Цитохром Р-450 и модификация макромолекул", Ялта, 1989, стр. 241.

4. Vozeeensby A.I., Calanova Ju.V., Shkrob A.M., Mathanov I.E., Arohakov A.I.Conjugation ol bleomyoin with, conoanavalin A or Immunoglobulin G inoreases its ability to destroy oell membranes. Archives of Biochemistry and. Biophysics, 1990, v.283, N2, pp.519-522.

5. Voznesensky A.I., Galanova Ju.V., Mathanov I.E., Archakov A.I. Bleomyoin Fe(II) linked to Con A or Ig G has increased ability to destruot erythrocyte membranee. Proc. VIIIth Int. Symp. Microsomes and Drug Oxidation, Stockholm, June 25-29, 1990, p. 188.

6. Voznesensky A.I., Galanova Ju.V., Archalcov A.I. Covalent binding of bleomyoin to oonoanavalin A and Immunoglobulin G enhanoes the ability of the bleomyoin-Fe(II) complex to destroy the erythrocyte membrane. Biomedical Science 1991. v2, p.147-150.

7. Galanova Ju.V., Archakov A.I. Conjugation of bleomycin with concanavalin A, antierythrocytic Ig G and Fab-fragment enhances its hemolytic activity. Abstracts of 7-th international conference "Biochemistry & Biophysics of cytochrome P-450; Strycture & Function , biotechnologioal & eoological aspects". Moscow, 1991, Р- 106.

8. Galanova Yu.V., Arohakov A.I. Selective cytotoxicity of bleomycin-antibody conjugates. Proc. 7-th international conference "Biochemistry & Biophysics of cytochrome P-450; Structure & Function, bioteohnological & eoological aspects". Moscow, 1991, p. 519-521.