Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитотоксическая активность блеомицина и его конъюгатов с адресными молекулами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Цитотоксическая активность блеомицина и его конъюгатов с адресными молекулами"

ч

РОССИЙСКАЯ АКАДЕЖЯ МЕДИЦИНСКИХ ШК ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ И МЕДИЦИНСКОЙ тш

На правах рукописи УДК 577.113

ГАЛАНОВА Илия Вюшонсвна

ШОТОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ БЛЕШЩИНА И ЕГО КОНЫГАТОВ С АДРЕСНЫМИ МОЛЕШАШ

03-СО.04 - биохимия

Автореферат-диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1992

«

Работа выполнена в Институт** иЛСЛОР^ЧЭСКОЙ И м8дицинской ХИМИИ Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

академик РДШ, профессор Арчаков АЛ.

Официальные ошоншты:

доктор Оиоюгаческшс наук Соловьева Н.И. доктор шдвдшсхих наук Терентьев А.А.

Ведущая организация:

Институт шфусолсл'яи ш.Д.И.Ивановского РАМН

Защита диссертации состоится " " 1992г. на заседании,

специализированного Ученого совета Д 001.10.01 Института биологической и кздицинской хеши РАМН по адресу: 119832, Москва, ул .Погодинская, 10.

С диссертацией можно ~ ознакомиться в библиотеке Института биологической и медацинской химии РАЩ.

Автореферат разослан " " 1992г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Павлихина Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Направленное уничтожение клеток определенного типа является одаой из важных задач атиотропной терапии различных заболеваний.

Цитотоксинн - это новый тшг фармакологических препаратов, позволяющий избирательно убивать клетки мишени. Как правило, они представляют собой гибридные молекулы состоящие из токсического и адресного фрагментов. В качества адресного фрагмента цитотоксинов успешно используют лектины, гормоны, антитала и их Раь-фрагменты. В качестве токсических фрагментов используют токсины растительного и бактериального происхокдения ( абрин, рицин, иодэцин ). Это наиболее хорошо изученный тип цитотоксинов. ■ Кроме того, широко исследуется направленная доставка к клеткам-мишеням ферментативно-активных веществ ( например, глюкозооксидазы, генерирующей перекись водорода), лекарственных прэпаратов таких как антиметаболиты (метотрексат), алкилирущие агенты (хлорамбуцил), некоторые антибиотики.

Использование низкомолекуляршгх генераторов активных форм кислорода в качества токсических фрагментов цитотоксинов - это новей подход к направленному разрушению клеток-мишеней, позволяющий сочетать точную клеточную адресацию с широким спектром возможных повреждений.

Известно, что в организме активные формы кислорода осуществляют окислительную модификацию и деградацию структурных и транспортных белков, ферментов, нуклеиновых кислот, инициируют

перекисное окисление ненасыщенных лшидов, вызывают повреадэние биомембран (Fligiel et al., 1984; Halliwell & Cutteridge, 1984; rricLovinh. 1986; Him et al., 1938; Archakov & Bachmanova, 1990 ). Довольно хорошо изучено вдтотоксктаское действие активных форм кислорода на различные вида клеток: фагоциты, эритроциты, эштелиальгше клетки, культуры опухолевых клеток и т.д. ( Badwey & Karnoveky, 1980; Nathan & Cohn, 1980; Weiss & lobuglio, 1982; Whorton et al., 1985 ).

В качестве низкомолэкулярного генератора активных форм кислорода наш был выбран. антибиотик блеомицин, относящейся к классу гликопептидов. Блеомицин, хелатируя металлы переменной валентности, генерирует активные формы кислорода в окислительно - восстановительном цикле, подобном монооксигеназнсму циклу цитохроыа Р-450 (Bargeret al., 1983; Murugesan et al, 1983). Ыолекулой-мишаньв в клетке для блеомицина является ДНК: интеркалируя в молекулу ДНК, блеомицин генерирует разрушающие ДНК активные формы кислорода (Stubbe, 1988). Помимо разрывов ДНК, блеомицин может оказывать повреждающее действие на мембранные структуры клеток за счет инициации перекисного окисления липидов, с последувдей агрегацией белков (Giri et al., 1983; Omaye and Tappel, 1984; Rosen et al., 1983).

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования являлось получение активных коныогатов блеомицина с адресными молекулами, обладающих способностью разрушать эритроциты более эффективно, чем свободный блеомицин.

В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие

задачи:

1. Исследовать повреждающее действие блеомицина на эритроциты с целью выяснения вида активных форм кислорода участвующих в этом процессе и возможности использования в нем различных доноров редокс-вквивалентов.

2. Разработать метод ковалентного связывания блеомицина с С ежом с сохранением его способности активировать молекулярный кислород.

3. Получить активные коныогаты блеомицина с конканавалином А, антиэритроцитарным о и его гаЬ-фрагментом, обладающие высоким сродством к поверхности эритроцитов.

4. Провести сравнительное исследование гемолитической активности полученных конъюгатов и свободою блеомицина.

Научная новизна и практическая значимость работы. Научная новизна предлагаемой работы состоит в том, что низкомолекулярный генератор активных форм "кислорода блэомицин предлагается использовать в качестве киллерного фрагмента при создании цитотоксинов.

В результате проведенных исследований обнаружено, что комплекс блеомицина с железом, генерируя активные формы кислорода, способен повреждать эритроцитарнне кембранн. Необходимые для этого электроны железо может получать от аскорбиновой кислоты, перекиси водорода. Кроме того, возможно ферментативное восстановление железа КАСРН-щгаогром Р-450 редуктазой.

Подобраны условия ковалентного связывания блеомицина с белками, при которых блеомицин сохраняет способность хелатировать келазо и разрушать клеточные мембраны.

Получены конъюгатн блеомицина с адресннш фрагментами

конканавалшгом А, штизритроцитарным иммуноглобулином G и Fab-фрагментом, обладавдие более высокой гемолитической активностью по сравнению со свободным блеошцшюм.

Апробация диссертаций состоялась 29.01.92 г. на совместном заседании учебно-научного комплекса кафедры биохимии юБ5 ЕГМУ и Института биологической и медицинской химии РАМН. • Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем работа. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, включая 4 таблицы а 29 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, глав, содержащих описание материалов и методов исследования, экспериментальной часта с результатами исследования и их обсуадешш, выводов и списка цитируемой литература.

ЫДТЕБШЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Суспензию эритроцитов мышей СВА готовили по методу Freimel (1987). —-----—

Для получения внтизригроцитарного Ig G кроликов иммунизировали внутрибршннным введением 1 мл 50% суспензии эритроцитов мышей СВА 5 раз через день. Для реиммунизации вводили внутрибршинно по 1 мл 10% суспензии эритроцитов 3 раза через день.

' Антиэритроцитарный иммуноглобулин G выделяли при помощи аффинной хроматографии на протеин-А-сефарозе CL-4B (Haelra et al.,1972; Goding.1976). Fab-фрагмэят антиэризроцитарного Ig G выделяли по методике Coulter & Harris (19аэ).

Содержание белка в полученных препаратах Ig G и Fab-фрагмента определяли по методу bowry et al. (1951).

Молекулярную массу и степень очистки выделенных белков (XgG к Fab-фрагмента) оценивали элактрофоретически по метолу Laemmli (1970), адаптированному для электрофореза в плотинах геля (Atwell & liarchalcnis, 1974).

Активность конканавалина А оценивали по способности агглютинировать 2% суспензию эритроцитов по методике, предложенной Вязовш О.Е. (I9S7).

HADPH-специфичный флавопротеин выделяли по модифицированному методу Dignam и Strobel (1977). Препарат фермента с удельной активностью 40 - 43 мкшль цитохрома с* мин-1* мг-1 и удельным содержанием 12-13.5 нмолей фяавопротеина на мг белка был любезно предоставлен препаративной группой лаборатории энзимолопш и биоэнергетики при кафедрэ биохимии ЫБФ РШУ".

Активность ШЕРН-щигохрои P-45Q редуктазы оценивалась -по восстановлению цитохрома с: инкубационная смесь содержала 50 мкМ цитохрома с. Реакцию запускали добавлением 100 мкМ hadph. Разница "550-600 слушала показателем, характеризующим содержание восстановленного цитохрома с ( коэффициент молярной экстинции 18,5 Mif^cM-1). Измерения проводили при 30°с.

Способность блеоиицина вызывать разрыва в ДНК оценивали по накоплэваш одного из конечных продуктов реакции - малонового даальдегида по методу Burger (1980).

Гемолитическую активность блеомицзна определяли спектрофотометркчески по методу KoJaul et al. (1986). Измерения проводили на приборе 8451A Diod Array Spectrophotometer (Hewlett

Paokard, (Ж). Изменение оптической плотности регистрировали при длине волны 600 нн. Инкубационная смесь объемом 1 мл содержала С6 эритроцитов кышей СВА. в 10. мМ фосфатном буфере, pH 7,4, содержащем 140 мМ HaCi. Предварительный подсчет клеток проводили в камере Горяева. Для получения восстановленного и окисленного комплексов блеомицина смешивали растворы блеомицина и сульфата келеза(И) или хлорида железа (XII) в эквимолярных соотношениях и инкубировали при комнатной температуре 5 мин. Добавляли в кювету до конечной концентрации 0.5 мЫ. Регистрации изменения оптической плотности проводили при 37°С.

Разрушение эритроцитов год действием блеомицина оценивали такте по выходу калия из цитоплазмы в .среду инкубации. Уточка калия из эритроцитов регистрировалась с помощью ион-селективного электрода (Orion Research, США).

Получение конъвгатов блеомицина с белками: Конъюгация блеомицина с белками проводилась го методу Horden et al. (1987)- Для коваленгаого связывания антибиотика с белками был использован бифункциональный сшивающий агент диыетиладшшмвдат, реагирующий со свободными аминогруппами молекулы белка и блеомицина с образованием ковалентной связи. Реакцию конъюгации проводили в 250 мМ триэтанолашновом буфере, pH 8,5. Блеомицин инкубировали с белком и дашгиладшшмидатом в течение 1 часа при 25°С. Реакцию останавливали добавлением равного объема 1 М трис-глицинового буфера, pH 9,0, после чего смесь инкубировали еще ю мин при 25°С.

Выделение конъвгатов блеомицина с белками из реакционной смеси проводили методом гель-фильтрации. Для выделения конъюгатов

блэомицина с альбумином (БСА) и РаЬ-фрагмонтом использовали колонку 1x20 см с сефадексом с-75, уравновешаннуи 10 мМ Иа-фосфатным буфером, рН 7,6. Наносили 0.5 мл реакционной- смеси. Элззировали тем зкэ буфером со скорость» 0,5 мл/мин. Содержание белка в элюате регистрировали при 220 нм в проточной кювете . Конъюгаты блеомицина с копканавалином А и антиэритроцитарнш С выделяли на колонке 1x20 см с сефадексом с-200, уравновешенной 10 мМ на-фосфатным буфером, рН=7,6. Наносили 0.5 мл реакционной смеси. Элвдию проводили тем т буфером со скоростью 0,5 мл/мин.

Количество молекул блэомицина, связавшихся с молекулой белка в конъюгатах, определяли с помощью меченного' 'тритием блеомицина. Удельная активность ^блеомицина составляла I мКи/ммоль. Конъюгаты ^блеомицина с белками отделяли от непрореагировавшего блеомицина методом галь-фильтрацш как было описано выше. 0.05 мл из фракции ( 2 мл) добавляли к 10 мл толуолового сциншлятора. Измерение радаактивности проводили на сцянтиляционном счэтчкко 1211 ИаоЫ^а фарш 1КВ.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ КОШВДОВАШЙ

I. Исследование механизма цитотоксической активности блеомицина.

Глихопептидный антибиотик блеошцин был выбран нами в качестве низкомолекулярного генератора акташзнх форм кислорода догя создания цитотоксинов, позволяющих направленно уничтоаать определенные виды клеток.

На первом этапе необходимо было исследовать механизм

цитотоксического действия блеомзщша на клетки с целью шяснения вида активных форм кислорода, участвующих в этом процессе, а также возможности использования при разрушении клеток различных доноров редокс-эквивалентов.

В качестве мшени были " выбраны эритроциты - клетки, повреждение которых легко контролировать спектрофотометрически и по выходу калия из цитоплазмы в среду инкубации.

Добавление комплекса блеомицин-келезо (и) к суспензии эритроцитов вызывало характерные для гемолиза спектральные изменения и сопровождалось нарастанием калия в среде инкубации, что свидетельствовало о повреждении плазматической мембраны эритроцитов. Окисленный комплекс блеомицин-келезо не вызывал гемолиза ( таблица I). Регистрируемая спектрофэтоыетрически 1фивая разрушения эритроцитов комплексом блеошцин-шлезоЦ!) имеет сигмондальную форлу, характерную для свободнорадикальных процессов (рис. I). Длительность лаг-периода гемолиза обратно пропорциональна концентрации комплекса блеомицин-келезо(II} в среде инкубации (рис. 2).

Для шяснения природа активных форм кислорода, участвующих е разрушении эритроцитов, было исследовано влияние каталазн, супероксиддисмутазн и антиоксидантов на блеомицин-зависимый гемолиз. Добавление наталазы и СОД в среду инкубации приводило к ингибированию гемолиза под действием блеомицшза при уменьшении максимальной величины гемолиза лаг-период увеличивался в 3 раза по сравнению с контролем. В отличие от этого добавление антиоксидантов в среду инкубации приводило лишь к увеличению лаг-периода .Наиболее выраженный эффект ингибирования

Таблица I.

Выход ионов калия из эритроцитов при поврезденш мембран под действием комплекса блеомящш-келезо

Состав инкубационной смеси

Выход ионов калия в среду инкубации ($ от контроля *)

Эритроциты Эритроциты Эритроциты Эритроциты

Эритроциты р-

Зритроциты Т-1

(глЮ^еток/мл) 4 Тритон N-101 (10)6) + блеомицЕШ-?е(1Н) (0.5 мМ) + ОЛЭОМЕЦИЛ-Рв(И) (0.5 мМ)

+■ гшэрн-цитохром

*

•450 редуктаза (22 вд/ил) + lIAJjpfl (ЗООмкМ) + блео;,пщин-?е(111) (0.5 мМ) + ШШРН-ЦКТОХрСМ 450 редуктаза (22 ед/мл) + NABPH (ЗООмкМ)

О 100 3 100

18

100

Инкубационная смесь объемом I мл содерхала 2*106эрятроцитов в 10 хЫ Ка-фосфатком буфере, рН 7.4, 140 :,ftf HaOl. Указанные в таблице Епградиэнты добавляли в среду инкубации и инкубировали 10 минут так 37°С перед измерением содержания калия. Контролем служила суспензия интактшх эритроцитов. За 100% прзнято содержание калия после добавления нэионпого детергента тритона N-101 (юо,<5 гемолиз).

'с I од = I )жмоль цитохрома с /мин.

Рис.I. Гемолиз эритроцитов под действием комплекса

блеошцшза-ie (IX). Инкубационная смесь объемом I мл содержала 2*Ю6 эритроцитов мыши СНА в 10 Ш Яа-фосфатнои буфере, рН 7.4, 140 ьЫ ЫаС1. Изменение оптической плотности при 600 нм регистрировали при 37°С. К суспензии эритроцитов добавляли:

комплекс блеомицин-ге(И) 0.5 ;,;Л (I); блеомицин 0.5 vU (2); сульфат железа (II) 0.5 (3).

1Л.( VMn|

Рис.2. Зависимость лаг-периода гемолиза .от концентрации блеомицша.

Длительность лаг-периода (Ь) регистрировали при различной концентрации комплекса блеошщнн-Ре(И) в среде инкубации. Состав инкубационной смеси и условия указаны в подписи к рис Л.

гемолиза наблюдался при добавлении в срэду инкубации токоферола в концентрации 100 мкМ - величина лаг-периода увеличивалась в 3.8 раза (рис.3).

Полученные результаты указывают на то, что в процессе разрушения клеточных мембран под действием комплекса блеомицин -яелозо(XI) участвует гидроксильный радикал, сутарокисный радикал и иэрекясь водорода.

-А{СООпл4

ч

Рис.3. Влияние каталазн, супэроксидцасмутаза и пнтиоксвдантов на гемолга эритроцитов, вызываемая комплексом блэоипцян-Fo (II). Состав инкубационной смэси и условия указаны з подписи к рис.1. 1С суспензия эритроцитов добавляли:

блоомицин-Ро (II) 0.5 Ш (I); блео?ящен-?е(И) 0.5 i/Л и этанол 10 иМ (2); блоокивдн-Ре(II) 0.5 мМ п мсппктол ICO мМ (3); блеомицш-Fedx) 0-5 мМ и токоферол 100 ¡яхМ (4); блеомицин-зре(11) 0.5 мМ и каталазу ( 3200 ед/нл ) (5); бязо:лэдин-ге(11) 0.5 мМ и супероксиддисмутазу ( 3000 ед/мл ) (6).

На следующем этапе исследовалось ^¿фжишяоссь различных дозоров рэдокс-экЕшзалэнтов в реакции гемолиза эритроцитов под •т гсгпхем ком иго кс а блзомшрщ-галозо (II). Срапязгоалзсь генерация

lz': :-;щх -i/jt-.i :сслсрода ккаг-г.ксэа бессгадаи- голезо(Л) при

использовании в качества доноров редокс-эквивалентов аскорбиновой кислоты, перекиси водорода и тиоловых соединений . Наиболее эффективными донорами редуцирующих эквивалентов оказались аскорбиновая кислота и перекись водорода. При использовании аскорбиновой кислоты величина лаг-периода блеомицннзависимого гемолиза уменьшалась в 3.4 раза по сравнению с контролем. Добавление _ перекиси водорода в среду инкубации приводило к уменьшению лаг-периода в 2 раза по сравнению с контролем (рис.4). Дитиотрейтол вызывал лишь незначительное уменьшение лаг-шрнода.

-А(вОО

Т(«п|

Рис.4. Влияние доноров редокс-эквивалентов на гемолиз эритроциов, вызываемый комплексом блеомицин-Ре (II).

Состав инкубационной смеси и условия указаны в подписи к рис.1. К суспензии эритроцитов добавляли:

блеомицин-Ре (II) 0.5 мМ (I); блеомицин-Ре (II) 0.5 мМ и аскорбиновую кислоту 5 мМ (2); блеомицин-Ре(II) 0.5 мМ и перекись водорода 5 мМ (3); блеомицин-Ре(II) 0.5 мМ и дитиотрейтол 5 мМ (4); аскорбиновую кислоту 5 мМ (5); перекись водорода 5 »11 (6); дитиотрейтол 5 мМ (7).

Полученные данные позволяют предположить, что в процессе разрушения клеточных мембран, также как и в реакции деградации ДНК, блеомицин может использовать в качестве доноров редокс-эквивалентов соединения, присутствующие в тканях.

Следующий вопрос, который нас заинтересовал, это возможность ферментативного восстановления комплекса Слеомицин-железо при разрушении клеточных мембран.

Комплекс блеомицин-хелезо(Ш) не вызывал разрушения эрнтроцитарных мембран. Инкубация эритроцитов с нш?н и ИАЛРН-цитохром Р-450 редуктазой также не приводила к гемолизу. Добавление маирн, МАДРВ-цитогром Р-450 редуктазы вместе с

Рис .5. Гемолиз эритроцитов вызываемый ' комплексом блеомицин-ге(ш), восстановленным 1Ш)РН-цитохром Р-450 редуктазой. Состав инкубационной смеси и условия указаны в подписи к рис.1. К суспензии эритроцитов добавляли:

блеомйцин-Ре(ХИ) 0.5 мЫ, ИАВРН-цитохром Р-450 редуктазу

(22 ед/мл) и 300 ?жМ (I); Олэомицин-Ре(111) 0.5 м?Л (2); ИАЯРН-цитохром Р-450 редуктазу (22 ед/мл) и иаирн 300 мкМ (3). * 1 ед = I мкмоль цитохрома с/шт.

комплексом блеомицин-келезо (III) вызывало разрушение плазматических мембран эритроцитов (рис. 5, таблица I), что свидетельствует о способности комплекса блеомицин-келезо(III) разрушать мембраны за счот электронов, полученных от NADPH-цитохром Р-450 редуктазы.

В целом приведенные выше экспериментальные данные указывают на то, что блеомицин, генерируя активные формы кислорода, способен оказывать цитотоксическое действие без проникновения внутрь клетки. Используя восстановительные агенты, присутствующие в среде, блзомицин моает работать в каталитическом рекиме, непрерывно вырабатывая активные формы кислорода вплоть до полного разрушения клеток-мишеней.

Все эти данные и обусловили выбор антибиотика блеомицина в качества токсического фрагмента цитотоксинов для направленного раврушиия клеток-мишеней.

2. Исследование влияния конъюгации блеомицина с альбумином на его ца*ютоксаческую активность.

При создаиш цтготоксшов, состоящих из адресного вектора к антибиотиков, одним из самых сорьозных ограничений является значительное снижение щлогоксической активности антибиотиков при конъюгации. Число работ, посвященных созданию коныогатов с антибиотиками, невелико, что сбьясыязтся небольшим количеством рзакциошгасяссобншс .групп в яолокухе антибиотика, которые могут быть вовлечены з реакцию хояьвгащги бзз из;,:знзшш его активности. При использовании Слоог.ащша только I изшогрупяа ногат быть вовлечена в рэакщга ковалентного связывания с адресным пептидом

бэз значительной потери его способности хелатировать келезо и проявлять цитотоксичность (Ghose & Blair, 1979).

В связи с этил необходимо было разработать метод связывания блеомицина с белками, сохранянций цитотоксическую активность антибиотика. Эта задача решалась с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве .молекулы белка-носителя.

В ряде работ отмечается предпочтительное использование бифункциональных сшивающих имидоэфяров в тех случаях, когда есть аминогруппы и в адресной молекуле и в молекуле вещества, используемого в качестве токсческого фрагмента. Данные реагенты позволяют проводить реакцию конъюгации в мягких условиях без потерн активности антител п активности тохсического фрагмента. Кроме того, полокатолышм качеством бифункциональных сшвакщпх реагентов является то, что различная дата углеводной цепи ямздоэфзров (6, 8, 12 атомов углерода) позволяет варьировать дистанцию мекду токсином и адресной молекулой.

Учитывая все эти условия, в качестве спивающего реагента был выбран бифункциональный янядоэфяр - даегаладишмвдат.

Paaicçsn конъюгации блзостдпна о альбумином с помощью дшлетиладншшздата проводили при полярном соотношении 50:1:300, соответственно. Такое соотношение компонентов в среде инкубации обеспечивает довольно высокий выход коньюгата блеомицин-альбумин при отсутствии коньюгата альбумин-альбумин в среде инкубации. Выделение коньюгата блеомвдин-альбумин осуществляли с помощью гвль-фиьграцив на сефадексе G-75 ( рис.6).

Количество молекул блеомицина, связанных с молекулой альбумина, оценивали, используя меченный тритием блеомяцин. Профиль радиактивпости представлен на рисунке 6. Во фракциях

н фракций

Ркс.6. Хроматографическое разделение конъюгата блеомицин-альбумин

на сефадексе 0-75 -Гель-фыьтрацшо проводили на колонке с сефадексом о-75 (1x20 см) в 10 мМ Иа-фзсфахном буфере, рН 7.6. Скорость потока 0.5 мл/мин. На колонку наносили: блеомицин-БСА ковъвгаг (I); % блеомицин-БСА конъюгат (2).

2-4, содержащих ковыогат блеомицин-альбумин радиактивность составляла 11000 срм/мл, что соответствует содерканию в коныогате 0.66 мг/мл блвомицяна при содержании 3 мг/мл альбумина в молярном соотношении-11:1.

После отделения гель-фшштрацяей ковалентного комплекса о'леоыицкн- альбумин от не связанного блеомицина проводилось исследование цятотоксичоской активности конъюгата, которая оценивалась по способности восстановленного конъюгата блеоавщин-альбушн вазнвать гемолиз эритроцитов (рис. 7). Как

ввдно, восстановленный комплекс блеомицин-альбумин сохранял способность разрушать мембраны эритроцитов. Для исключения эффекта адсорбции блеомицина на молекуле альбумина , инкубировали блеомицин с альбумином в тех не условиях, но без обработки даме тиладипимвда том. При последующем отделении белка от антибиотика гель-фильтрацией альбумин не обладал способностью разрушать мембраны эритроцитов (рис. 7).

-А1СС01

т(«г|

Рис.7. Гемолитическая активность конъюгата БСА-блеомицин после

разделения гель-фильтрацией на сефадексе с-75. Состав инкубационной смеси п условия указаны в подписи к рис.1. К суспензии эритроцитов добавлял!:

комплекс блеомицян-нелззо(П) 0.5 мМ (I); восстановленный конъюгат БСА-блеомицзш с концентрацией по блеомицину 0.5 Ш (2); БСА 0.045 мМ, проинкубированный с блеомицином и отделенный гель-фильтрацией (3).

Таким образом, мозкно сделать вывод о том, что при ковалентном связывании II молекул блеомицина с молекулой альбумина при помощи спшващего реагента диметиладишшидата цитотоксическая активность блеомицина не отличается от активности немодифицяровашгаго антибиотика.

3. Получение коныогатов блеомицина с адресными молекулами и исследование их гемолитической активности.

Для придания блеомицину сродства к определенному типу клеток необходимо было связать его с адресным фрагментом. В качестве адресного фрагмента были использованы конканавалин А, антиэритроцитарный иммуноглобулин й и его Раь-фрагмент.

Условия конъюгации блеомицина с адресными фрагментами и выделение коньюгатов описаны в разделе "Материалы и методы". Для оценки количества молекул блеомицина, связанных с адресными молекулами, также был использован меченный тритием блеомицин. Оказалось, что в конъюгате конканавалин А - блеомицин на I молекулу конканавалина А приходится 15 молекул блеомицина. В конъюгате с-блеомицин с I молекулой антиэритроцитарного о связалось 9 молекул блеомицина, тогда как ■ в конъюгате 1?аъ-фрагмент-блеомщ0н на I молекулу РаЪ-фрагмонта приходится 4 молекулы блеомицина.

Для сравнения гемолитической активности выделенных коньюгатов конканавалин А - блеомицин, о - блеомицин и РаЪ-фрагмэнт-блеомицин проводили предварительную инкубации коньюгатов с двухвалентным келезом в количестве эквимолярном концентрации блеомицина в конъюгате и добавляли восстановленные конъюгаты к суспензии эритроцитов в такой концентрации, чтобы содержание блеоьшцина в среда инкубации составляло 0.1 мМ» Величину лаг-периода гемолиза, вызываемого восстановпенныш коныогатами блэомицина с адресными молекулами сравнивали с лаг-периодом гемолиза под действием немодифицирозанпого блеомицина в концентрации 0.1 мМ.

Видно, что конъюгация блеомицина с адресными пептидами сопровождается уменьшением величины лаг-периода: для конюгата конканавалин А - блеомицин - в 2.2 раза, для конъюгата Ig в -блеомицин в 6 раз, а для коныогата РаЬ-фратент - блеомицин в 18 раз (рис.8).

-МвОО)

Рис.8. Сравнение цитотокснческой активности конъюгатов блеомицина с адресными молекулами.

Состав инкубационной смеси п условия указаны в подписи к рис.1. К суспензии эритроцитов добавляли:

комплекс блеомацин-келезо(11) 0.1 кМ (I); копъвгат конканавалин А - блео'яшин - калезо(И) 0.1 Ш (2); ксныогат 1§ б - блеомицин -железо(II) 0.1 Ш (3); конъюгат Раъ-фрагмэнт - блеомицин -'железо(И) 0.1 мМ (4).

Для каждого коныогата была установлена минимальная цитотоксическая концентрация, вызывающая полный гемолиз эритроцитов. Минимальная цитотоксическая концентрация коныогата конканавалин А - блеомицин - 0.03 >«М. Для конъвгата О -блеошцш минимальная цитотоксическая концентрация составила 0.02 мМ; для конъюгата РаЫ£рагкенг - блеомицин - 0.01 мМ. Тогда

как минимальная циготоксическая концентрация для немодафицированного блеомицина составляет - 0.1 мМ.

Учитывая минимальную цитотоксическую концентрацию конъюгагов и уменьшение величины лаг-периода вызываемого ими гемолиза, можно оценить эффективность действия данных коньюгатов в сравнении с немодифицированннм блеомицином. 'Гемолитическая активность конъюгата конканавалин А. - блеомицин в В раз превышает активность немодафицированного блеомицина. Гемолитическая активность конъюгата Ig о - блеомицин в 45 раз выше активности немодафицированного антибиотика. Гемолитическая активность конъюгата Раь-фрагменг - блеомицин в ISO раз выше активности свободного блеомицина. Таким образом, уменьшение размеров адресного фрагмента, хотя и сопровождается уменьшением количества молекул блеомицина, ковалентно связанных с молекулой переносчика, но приводит к более выраженному усилению гемолитического действия комплекса блеомицин-железо (II).

Полученные данные свидетельствуют о том, что блеомицин монет быть эффективно использован для направленного разрушения клеток-мшеней в качестве токсического фрагмента цитотокскнов.

ВЫВОДИ

1. Разрушение мембран эритроцитов под действием комплекса блеомицин-келезо (II) является свободнорадакальным процессом, в котором участвуют перекись водорода, гидроксильный и суперокисшй радикалы.

2. В процессе разрушения плазматических мембран эритроциов возможно восстановление комплекса блеомицин - железо (III) донорами редокс-эквивалентов (аскорбиновой кислотой и перекисью водорода), а также' за счет электронов, полученных от НАЕРН-цитохром Р-450 редуктазы.

3. При ковалентном связывании блеомицина с белками с помощью бифункционального имвдоэфира димегкладашмидата сохраняется способность блеомицина разрушать мембраны эритроцитов.

4. Получены цитотоксически активные конъюгаты конканавалин А -блеомицин, Ig G - блеомицин, РаЬ-фрагмент - блеомицин.

5. Конъюгация блеомицина с адресными молекулами приводит к увеличении цитогоксического эффекта: конъюгат конканавалин А -блеомицин в G раз, конъюгат иммуноглобулин G - блеомицин в 45 раз, конъюгат УаЪ-фрагмент - блеомицин в. 180 раз эффективнее немодифицироёанного блеомицина.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Вознесенский А.И., Галанова Ю.В., Арчаков А.И. Направленное разрушение мембран клеток генераторами активных форм кислорода. В тезисах Всесоюзного симпозиума "Реконструкция, стабилизация и репарация биомембран". Благовещенск, 1989, стр.35.

2. Вознесенский А.И., Галанова Ю.В. Арчаков А.И. Блеомицин, ковалентно связанный с КонА, способен генерировать активные формы " килорода для направленного разрушения эритроцитов. Тезисы Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул", Ялта, 1989, стр. 121.

3. Вознесенский А.И., Вощшаншсов Е.И., Галанова Ю.В., Арчаков А.И., Стир А. Флуорантен может использоваться при изучении моделей цитохрома Р-450. Тезисы Всесоюзной конференции " Цитохром Р-450 и модификация макромолекул", Ялта, 1989, стр. 241.

4. Vozesensky A.I., Galanova Ju.Y., Shkrob A.M., Mathanov I.E., Arohakov A.I.Conjugation of bleomycin with conoanavalin A or immunoglobulin G increases its ability to destroy oell membranes. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1990, v.283, N2, pp.519-522.

5. Voznesensky A.I., Galanova Ju.Y., Mathanov I.E., Arohakov A.I. Bleomycin Fe(II) linked to Con A or Xg G has increased ability to destruct erythrocyte membranes. Proo. Vlllth Int. Symp. Microsomes and Drug Oxidation, Stockholm, June 25-29, 1990, p. 188.

6. Voznesensky A.I., Galanova Ju.V., Arohakov A.I. Covalent binding ol bleomyoin to oonoanavalin A and Immunoglobulin G enhances the ability of the bleomyoin-Pe(II) complex to destroy the erythrocyte membrane. Biomedical Science 1991. v2, p.147-150.

7. Galanova Ju.Y., Archakov A.I. Conjugation of bleomycin with concanavalin A, antierythrocytic Ig G and Fab-fragment enhances its hemolytic activity. Abstracts of 7-th international conferenoa "Biochemistry & Biophysics of cytochrome P-450; Structure & Function , biotechnologioal & eoologioal aspects". Moscow, 1991, p. 106.

8. Galanova Yu.V., Arohakov A.I. Selective cytotoxicity of bleomycin-antibody conjugates. Proo. 7-th international conference "Biochemistry & Biophysics of cytochrome P-450; Structure & Function, bloteohnological & ecological aspects". Moscow, 1991, p. 519-521.