Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование противоопухолевой активности препаратов направленного действия на основе альфа-фетопротеина и эпидермального фактора роста в моделях in vivo

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование противоопухолевой активности препаратов направленного действия на основе альфа-фетопротеина и эпидермального фактора роста в моделях in vivo"

На правах рукописи

од

-» 1Г 33 Фельдман Наталия Борисовна

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ НА ОСНОВЕ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА И ЭПИДЕРМАЛЬНОГО , ФАКТОРА РОСТА В МОДЕЛЯХ IN VIVO

03. 00. 04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1998

Работа выполнена^ лаборатории регуляции клеточной активности Московского научно-исследовательского института медицинской

экологии.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Северин С.Е.

кандидат биологических наук Луценко C.B.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация: Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. . Ломоносова.

Защита состоится « 1998 г. на заседании

Диссертационного совета Д. 171.02.01. при Центре медико-биологических и экологических проблем РАЕН по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра медико-биологических и экологических проблем РАЕН.

Тигранян Р. А.

кандидат биологических наук Белушкина Н.Н.

Автореферат

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Актуальность проблемы. Одной из важнейших проблем практической онкологии является повышение избирательности химиотерапевтических препаратов в отношении злокачественных новообразований. Терапевтическое применение противоопухолевых препаратов часто оказывается недостаточно эффективным и сопровождается множеством побочных эффектов. Так, применение фталоцианинов вызывает нейтропению, атрофию тканей^ приобретение фоточувствительности нормальными тканями (Rousseau J. et al., 1991). К побочным эффектам, вызываемым антибиотиками антрациклинового ряда (доксорубицин, карминомипин), относятся угнетенне кроветворения, сильные иммуносупрессивные и кардиотоксические эффекты (Wang J.J. et al., 1971). Растительные алкалоиды (винбластин, винкристин) вызывают повреждение центральной нервной системы, двигательные расстройства и лейкопению. Одним из путей повышения терапевтической эффективности перечисленных выше препаратов является их избирательный рецепторопосредованный транспорт в опухолевые клетки в виде конъюгатов с белковыми векторными молекулами. Избирательность транспорта при этом достигается в результате специфичного взаимодействия вектора с его рецептором на поверхности клетки-мишени с последующей внутриклеточной интернализацией лиганд-рецепторного комплекса. Следует отметить, что белковые векторы должны отвечать ряду требований, к числу которых относятся: доступность белка в препаративных количествах, стабильность, сохранение высокого сродства к рецептору после химической модификации (конъюгирования) вектора. Этим требованиям в полной мере отвечают онкофетальный белок альфа-фетопротеин (АФП) и эпидермальный фактор роста (ЭФР). Кроме того, рецепторы АФП экспрессируются практически

всеми типами раковых клеток, но отсутствуют или присутствуют в небольших количествах на клетках нормальных тканей (Naval J. et al., 1985; Geuskens M. et al., 1991). Наличие, большого количества рецепторов ЭФР на поверхности клеток широкого спектра опухолей эпителиального происхождений также определяет возможность использования белка для избирательного транспорта противоопухолевых препаратов (Kroníng R. et-al., 1995). В связи с этим актуальной задачей является получение противоопухолевых препаратов направленного действия с использованием фталоцианинов, доксорубицина и карминомицина, а также винбластина и винкристина в качестве цитотоксических препаратов, а АФП и ЭФР в качестве векторов для их избирательного транспорта. Также представляется важным сравнительное исследование в модельных экспериментах in vitro и in vivo уровня противоопухолевой активности и возможностей терапевтического применения полученных противоопухолевых препаратов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование возможности повышения противоопухолевой активности фталоцианинов алюминия (ФЦ(А1)) и кобальта (ФЦ(Со)), антрациклиновых антибиотиков доксорубицина (Др) и карминомицина (Км) и растительных алкалоидов винбластина (Вб) и винкристина (Вк) за счет их избирательного рецептор-опосредованного транспорта в клетки-мишени с использованием АФП и ЭФР в качестве векторных молекул.

Для осуществления этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Провести сравнительное исследование цитотоксической активности противоопухолевых препаратов (ФЦ(А1), ФЦ(Со), Др,

Км, Вб, Вк) и их конъюгатов с АФП и ЭФР in vitro в отношении линий опухолевых клеток человека и мыши.

2. Оценить противоопухолевую активность исследуемых препаратов и их конъюгатов in vivo на модели перевиваемых солидных опухолей мышей, формируемых клетками линий миелолейкоза Р388 и меланомы В16.

3. Основываясь на полученных результатах, выделить из ряда исследуемых конъюгатов препараты, обладающие высокой противоопухолевой активностью, которые могли бы быть использованы для создания высокоэффективных противоопухолевых лекарственных средств направленного действия.

Научная попиэна и практическая ценность работы. Получены конъюгаты противоопухолевых антрациклиновых антибиотиков, растительных алкалоидов и фталоцианинов с АФП и ЭФР, проявляющие цитотоксическую активность, превышающую активность свободных веществ in vitro. Впервые in vivo проведено сравнительное исследование противоопухолевой активности ФЦ(А1), ФЦ(Со), Др, Км, Вб, Вк и их конъюгатов с АФП и ЭФР. Убедительно продемонстрировано, что терапевтическая активность исследуемых противоопухолевых препаратов может быть значительно увеличена за счет их избирательного рецепторопосредованного транспорта в опухолевые клетки с использованием АФП и ЭФР в качестве векторных молекул. Результаты проведенных исследований могут быть использованы для разработки на основе полученных конъюгатов высокоэффективных противоопухолевых препаратов направленного действия для клинического применения.

Структура и объем работы. Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты работы и их обсуждение, выводы , и список цитируемой литературы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на XXIV meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (California, USA, 1996); International Conferences New Anticancer Agents (Athens, Greece, 12-15. X. 1997); VIII конференции «Новые направления биотехнологии» РАН (Москва, Россия, 27-29. IV. 1997); 15th meeting European association for cancer research (EACR XV) (Stockholm, Sweden, 15-19. VIII. 1998); Fourth european congress of pharmaceutical sciences (Milan, Italy, 11-13. IX. 1998). Диссертационная работа апробирована 1 октября 1998 г. на научном семинаре МНИИМЭ.

Содержание работы Материалы и методы исследования

Клеточные линин. В работе использовали клетки карциномы молочной железы человека линии MCF-7, карциномы яичника человека линии SKOV3, Т-клеточной лимфобластомы QOS и мышиной меланомы В16. Клетки культивировали в пластиковых флаконах (Costar) в среде RPMI (Sigma), содержащей 10%

J

эмбриональной бычьей сыворотки (Sigma), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, в увлажненной атмосфере, содержащей 5% С02, при 37°С.

Определение цптотокснческой активности препаратов.

Цитотоксическую активность (ЦТА) препаратов определяли по ингибированию пролиферативной активности клеток. Количество выживших клеток определяли с использованием бромида 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) в качестве витального красителя (Mossitiann Т., 1983).

Определение противоопухолевой активности препаратов in vivo. Испытания проводили на мышах линии DBA/2 с привитыми солидными опухолями перевиваемого миелолейкоза Р388 и мышах линии С57В1/6 с привитыми солидными опухолями меланомы В16. Препараты вводились 1 раз в 4 дня, всего 3 инъекции, начиная со 2 дня после прививки опухоли. Объём опухоли вычисляли по формуле V=a2,b'Tc/6, где а - короткий, b - длинный диаметр опухоли. Относительный объем опухоли Von, вычисляли на день, предшествовавший началу гибели контрольных животных, по формуле У,,™ = Оп/К 100, где Оп - средний размер опухолей в опытной группе, К - средний размер опухолей у контрольных животных. Увеличение средней продолжительности жизни (УСПЖ) леченых животных относительно контрольных рассчитывали по формуле: УСПЖ = (Т/С-1} 100, где Т - средняя продолжительность жизни (СПЖ) леченых животных в днях, С - СПЖ для контрольных животных. Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

1. Получение конъюгатов противоопухолевых препаратов с АФП н ЭФР.

Для исследования возможностей повышения противоопухолевой терапевтической активности фталоцианинов (ФЦ(А1), ФЦ(Со)), антрациклиновых антибиотиков (Др, Км) и растительных алкалоидов (Вк, Вб), доставляемых в опухолевые клетки в результате рецепторопосредованного эндоцитоза, синтезированы конъгогаты Др, Км и Вб с АФП и ЭФР с помощью водорастворимого карбодиимида; конъюгаты ФЦ(А1), ФЦ(Со) и Вк с АФП и ЭФР получены путем прямого присоединения цитотоксических препаратов (ЦП) к белку. Молярные соотношения векторный белок:ЦП в конъюгатах АФП и ЭФР составляли 1:4 и 1:1 соответственно. Относительно высокое содержание цитотоксических препаратов в конъюгатах АФП обусловлено более высокой молекулярной массой белка (~70 кДа) по сравнению с ЭФР (6,045 кДа). Увеличение содержания ЦП в препаратах ЭФР может привести к снижению сродства векторной молекулы к рецептору и сказаться на эффективности внутриклеточной интернализации конъюгатов.

2. Цнтотокспческая активность конъюгатов АФП и ЭФР с противоопухолевыми препаратами.

Сравнительное исследование цитотоксической активности (ЦТА) свободных противоопухолевых препаратов и их конъюгатов с АФП проводили на клетках Т-клеточной лимфомы человека линии (ЗОЯ,

обладающих способностью к эффективному связыванию и внутриклеточному накоплению данного белка (Белоусова Ю.В., 1997). Опухолевые клетки рака молочной железы человека линии МСЯ-7 и меланомы мыши линии В16, несущие на поверхности рецепторы ЭФР, использовали в качестве моделей для оценки ЦТА соответствующих конъюгатов. Результаты исследования ЦТА свободных противоопухолевых препаратов и их конъюгатов с АФП и ЭФР приведены в табл.1 и 2, соответственно.

2.1. ЦТА фталоцнапннов п их конъюгатов с АФП н ЭФР.

Следует отметить, что механизм активации фталоцианинов, используемых для фотодинамической (ФЦ(А1)) и каталитической, или темновон (ФЦ(Со)) терапии может быть различным. Для

Табл. I. Цитотоксическая активность хнмиотерапевтических препаратов и их конъюгатов с АФП в отношении клеток Т-клеточной лимфомы человека линии •ЗОЯ (приведены средние значения [Сзо по трем экспериментам для каждого типа клеток).

Препарат 1С50, мкМ ПСД*

Фтялоциянинм

ФЦ(А1) 1,46

ФЦ(А!)-АФП 1,09 1,34

ФЦ(Со) 12,2

ФЦ(Со>- АФП 2,4 5,08

Антряциклиновые

янтибиотикн

Др 0,68

Др-АФП 0,29 2,34

Км , 1,25

Км- АФП 0,96 1,30

Растительные -

алкалоиды

Вб 0,022

Вб- АФП 0,0025 8,8

•Показатель соотношения доз (ПСД) представляет собой отношение значений 1Сзо в присутствии свободного цитотоксика и его ксмъгагата с АФП.

g

Табл.2. Цитотоксическая активность химиотерапевтических препаратов и их конъюгатов с ЭФР в отношении опухолевых клеток карциномы молочной железы человека линии МСР-7 и меланомы мыши линии В16 (приведены средние значения 1С50 по трем экспериментам для каждого типа клеток).

Препарат MCF-7 В16

IC50, мкМ ПСД* IC50, мкМ ПСД*

Фтялоция н ины

ФЦ(А1) 2,5 6,1

ФЦ(А1)-ЭФР 0,9. 2,78 2,5 2,44

ФЦ(Со) 40 16,2

ФЦ(Со)-ЭФР 0,3 133,33 12,1 1,34

Аптряииклиновые

антибиотики

Др 0,65 0,42

Др-ЭФР 0,57 1,14 0,18 2,33

Км 0,029 0,028

Км-ЭФР 0,007 4,14 0,027 1,04

Растительные

алкалоиды

Вб 0,0071 0,034

Вб-ЭФР 0,0017 4,18 0,00015 226,67

Вк 0,0084 0,011

Вк-ЭФР 0,002 4,20 0,0022 5,0

'Показатель соотношения доз (ПСД) представляет собой отношение значений IC50 в присутствии свободного цитотоксика и его конъюгата с ЭФР.

активации ФЦ(А1) облучали клетки светом соответствующей длины волны (Van Hillegersberg R. et al., 1994). ФЦ(Со) активировали добавлением в клеточную среду аскорбиновой кислоты (Novodarova G.N. et al., 1996). Изучение ЦТА фтапоцианинов и их конъюгатов с АФП показало, что ЦТА конъюгатов как с ФЦ(А1), так и с ФЦ(Со) заметно превышала активность свободных ФЦ, причем наибольшую ЦТА проявлял конъюгат ФЦ(Со)-АФП. Аналогичные результаты получены для конъюгатов ФЦ-ЭФР. При этом эффективность цитотоксического действия конъюгатов ЭФР с ФЦ(А1) и ФЦ(Со) в отношении клеток MCF-7 превышала эффективность их действия в отношении клеток линии В16. Следует

также отметить чрезвычайно высокую ЦТА конъюгата ФЦ(Со)-ЭФР в отношении клеток линии МСР-7. Представленные данные наглядно иллюстрируют преимущество векторной доставки фтапоцианинов в клетку, позволяющей увеличить цитотоксичность исследуемых препаратов.

2.2. ЦТА антрациклиновых антибиотиков и их конъюгатов с АФП и ЭФР.

Как видно из табл. I и 2, ЦТА конъюгата Др с АФП в отношении клеток линии В16 превышала активность свободного вещества более чем в 2 раза, в то время как ЦТА конъюгата Др-ЭФР и Др в отношении клеток линии МСР-7 характеризовались близкими значениями. Из конъюгатов Км с АФП и ЭФР лишь Км-ЭФР проявлял ЦТА, существенно превышающую активность свободного антибиотика в экспериментах с клетками линии МСР-7 (табл. 1,2).

Рис. 1. Выживаемость клеток Рис.2. Выживаемость клеток

карциномы яичника человека карциномы яичника человека

линии ЭКОУЗ при инкубации линии 5КОУЗ при инкубации

со свободным Др и его со свободным Км и его

конъюгатами Др-АФП и Др- конъюгатами Км-АФП и Км-

ЭФР в течение 72 ч. ЭФР в течение 72 ч.

Дополнительное сравнительное исследование ЦТА Др, Км и их конъюгатов проводили на чувствительных к этим антибиотикам клетках карциномы яичника человека линии SKOV3, поскольку оба вектора эффективно доставляют цитотоксические препараты в клетки данной линии (Severin S.E. et.al., 1995, Ottensmeier С. et а!., 1996). Как видно на рис. 1 и 2, конъюгат Др-АФП оказался более эффективным цитотоксическим препаратом (ЦТА Др-АФП выше активности Др в 4,13 раза), чем Км-АФП (IC50 конъюгата и свободного вещества характеризуются близкими значениями), что может быть обусловлено различиями в чувствительности и механизмах устойчивости клеток к данным антибиотикам. Конъюгат Др-ЭФР, напротив, является менее эффективным ЦП, чем Км-ЭФР. Представленные данные свидетельствуют о том, что эффективность цитотоксического действия конъюгатов определяется не только природой цитотоксических препаратов и векторных молекул, а также способом их химической "сшивки", но и правильным выбором наиболее уязвимых к действию препаратов опухолевых клеток-мишеней.

2.3. ЦТА растительных алкалоидов п их конъюгатов с АФП и ЭФР.

ЦТА всех конъюгатов Вб и Вк, представленных в табл. 1 и 2, превышала активность свободных алкалоидов в отношении клеток исследуемых линий как минимум в 4 раза. Наибольшей эффективностью цитотоксического действия отличался конъюгат Вб-ЭФР, ЦТА которого превышала активность свободного Вб более чем в 266 раз.

Таким образом, исследование векторных возможностей АФП и ЭФР показало, что оба белка могут быть успешно использованы для ренепторопосредованного транспорта в опухолевые клетки фталоцианинов, антрациклиновых антибиотиков и растительных алкалоидов. При этом ЦТА препаратов в отношении опухолевых клеток может быть значительно повышена за счет их ковалентного связывания с АФП и ЭФР (рис. 3,4). Использование АФП в качестве вектора позволяет увеличить цитотоксическую активность всех исследуемых препаратов при наиболее значительном ОУ ЦТА для конъюгатов Др и Вб (рис. 3). Как видно на рис.4, в случае ЭФР возможно значительное увеличение ЦТА практически всех исследуемых ЦП, но эффективность конъюгатов может зависеть от особенностей индивидуальной чувствительности опухолевых клеток

i

а

>>

о

б» 40 20 0

88,6

57,3

25,3 23,2 1

8,03 я

У

Ф1ЦА1) ФЦ(Со)

Др Км Вб

Рнс.З. Относительное увеличение цитотоксической активности хнмиотерапевтических препаратов (ОУ ЦТА) при их примененнн in vitro в отношении клеток Т-клеточной лимфомы человека линии QOS в составе конъюгатов с АФП. ОУ ЦТА рассчитывали по формуле

ICjo свободного препарата - ICjo конъюгата

ОУ ЦТА =--- х 100%

ICjo свободного препарата

[ClMCF-7 ПВК |

ФЦ(А1) ФЦ(Со) Др Км BG Вк

Рис.4. Относительное увеличение цитотоксической активности химиотерапевтических препаратов (ОУ ЦТА) при их применении //; vilro в отношении клеток карциномы молочной железы человека линии MCF-7 и меланомы мыши линии В16 в составе конъюгатов е ЭФР. ОУ ЦТА рассчитывали по формуле

ICso свободного препарата - IC50 конъюгата

ОУ ЦТА =-х 100%

ICío свободного препарата

к действию конъюгатов с определенными соединениями, как это имеет место с конъюгатами Км в отношении клеток меланомы мыши линии В16 (но не клеток рака молочной железы). Однако даже в таких ситуациях при использовании /я vivo конъюгатов ЦП с векторными белками можно ожидать достижения более высокой терапевтической эффективности благодаря избирательному транспорту в опухолевые клетки в организме.

2. Исследование противоопухолевой активности фталоциашшов, антрациклимовых антибиотиков, растительных алкалоидов н их конъюгатов in vivo.

Исследование противоопухолевой активности цитотоксических препаратов и их конъюгатов с АФП и ЭФР проводили на моделях

перепиваемых солидных опухолей мышей с использованием клеток мышиного лейкоза линий Р388 и L1210 и мышиной меланомы В16 соответственно. Нами были использованы разные модели опухолей для изучения векторных возможностей исследуемых белков, поскольку ранее было показано, что АФП эффективно доставляет ЦП в клетки линий Р388 и LI2I0 (Severin S.E. et al., 1996), а ЭФР в клетки линии В16 (Луценко C.B. и др., 1998).

2.1. Противоопухолевая активность ФЦ(Со) и его конъюгатов с АФП н ЭФР ш vivo.

Несмотря на то, что как конъюгаты ФЦ(А1), так и ФЦ(Со) с векторными белками обладали цитотоксической активностью, для экспериментов in vivo мы избрали ФЦ(Со), поскольку данный препарат в отличие от ФЦ(А1) может быть активирован при введении в клеточную среду и в органы аскорбиновой кислоты в отсутствии источника света (Novodarova G.N. et al, 1996). На рис. 5 представлена динамика роста опухолей у мышей, получавших внутривенно ФЦ(Со) и его коныогат с АФП по соответствующей схеме в дозах 0,2 мг/кг по фталоцианину. Через 1 ч после введения препаратов животные получали внутримышечно раствор аскорбиновой кислоты. Терапевтическое применение свободного ФЦ(Со) в указанных дозах не приводило к ингибированию роста опухолей, в то время как лечение животных конъюгатом ФЦ(Со)-АФП приводило к значительному замедлению роста опухолей. При этом величина ингибирования роста опухолей составляла 30% на' день начала гибели контроля. При применении ФЦ(Со) и ФЦ(Со)-ЭФР по такой же схеме ингибирование роста опухолей отмечалось только в случае конъюгата и составляло 44% к дню начала гибели

*о

—О—контроль 13

-0-ФЦ(С.)

—Л—ФЦ(Со)-АФП 16

14

—□—кошрлль —О—ФЦ(Сл) —А—ФЦ(Со>ЭФР

14

16

18

время,дни

20

22

Рис.5. Влияние конъюгата ФЦ(Со)-АФП и ФЦ(Со) на развитие солидных опухолей мышиного лейкоза линии Р888 у мышей ОВА/2.

время,дни

Рис.б. Влияние конъюгата ФЦ(Со)-ЭФР и ФЦ(Со) на развитие солидных опухолей мышиной меланомы В16 у мышеи С57В1/6.

контрольных животных, что свидетельствует о высокой эффективности противоопухолевого действия конъюгата ЭФР с ФЦ(Со) (рис. 6).

Следует отметить, что у мышей, получавших препарат ФЦ(Со) в виде конъюгата с ЭФР, к 15-17 дню эксперимента наблюдались некротические изменения опухолевой ткани. Однако начиная с 33 дня отмечалось резкое усиление роста опухолей в опытной группе, что свидетельствует о необходимости дополнительных поддерживающих курсов терапии препаратом ФЦ(Со)-ЭФР. Как видно на рис. 14, 15 лечение животных как конъюгатом ФЦ(Со)-АФП, так и ФЦ(Со)-ЭФР оказывало значительный позитивный эффект в отношении УСПЖ животных. Представленные данные свидетельствуют о том, что как АФП, так и ЭФР могут быть успешно использованы для направленного транспорта фтапоцианинов к опухолевым клеткам-мишеням.

2.2. Противоопухолевая активность Др, Км н их конъюгатов с ЛФП и ЭФР.

Для изучения возможностей повышения терапевтической активности Др и Км исследовали влияние свободных препаратов и их конъюгатов с ЛФП и ЭФР на развитие опухолей in vivo. При лечении животных свободным Др и его конъюгатом с АФП в дозах 140 мкг/кг по доксорубицину ингибирование роста опухолей наблюдалось в группах, получавших как свободный антибиотик, так и конъюгат. При этом конъюгат оказывал более сильное супрессивное действие в отношении опухолей, чем свободный Др * (рис. 7). Так, к 28 дню эксперимента средний размер опухолей в группе, получавшей Др-АФП, был примерно в 3 раза меньше, чем в группе, получавшей Др. Наиболее значительное УСПЖ также наблюдалось в группе животных, получавших Др-АФП (рис. 14). Таким образом, терапевтическая активность конъюгата Др-АФП была значительно выше, чем активность свободного Др. На рис. 8 приведена динамика роста опухолей в контрольной и опытной группах в процессе терапии препаратами Др и Др-ЭФР в тех же дозах. Поскольку ЭФР является митогенным фактором, стимулирующим пролиферацию нормальных и опухолевых клеток млекопитающих (Cohen S., 1974), мы исследовали его влияние на

динамику роста солидных опухолей меланомы В16. На рис. 8, 10

(

видно, что при внутривенном введении ЭФР в концентрациях эквимолярных терапевтическим концентрациям белка в составе коныбгато» ЭФР с Др и Км не оказывает стимулирующего влияния па рост опухолей. В группах животных, получавших Др и Др-ЭФР, наблюдалось заметное ингибирование опухолевого роста (рис. 8).

15 20

время, лип

25 30 35

20 25 30 35 40 время, дни

Рис.7. Влияние конъюгата Др-АФГ1 и Др на развитие солидных опухолей мышиного лейкоза линии Р888 у мышей ОВА/2.

Рис.8. Влияние конъюгата Др-ЭФР и Др на развитие солидных опухолей мышиной меланомы линии В16 у мышей С57В1/6.

При этом относительный размер опухолей у животных, получавших Др-ЭФР, к 40 дню после прививки опухоли оказался примерно в 1,7 раза меньше, чем у животных, получавших свободный Др, и в 3,4 раза меньше, чем в контроле (рис. 8). Кроме того, в отличие от свободного Др, внутривенное введение Др-ЭФР приводило к 20% УСПЖ по сравнению с контролем (рис. 15).

Исследование влияния Км и его конъюгата с АФП в дозах 20 мкг/кг по карминомицину на рост опухолей показало, что Км обладал менее выраженным ингибирующим действием по сравнению с конъюгатом. Как видно на рис. 9, к 22 дню эксперимента средний размер опухолей у животных, получавших конъюгат Км-АФП, оказался меньше примерно в 1,5 раза, чем у животных, получавших свободный Км, и в 1,9 раза меньше, чем в контрольной группе. Терапевтическое применение конъюгата Км-АФП, в отличие от свободного Км, также приводило к заметному УСПЖ животных (рис. 14).

■ 10« 10*

Л) 2

1 »»

$3.4

£

Г40

1

* .

^ ~К<М(Т|)вЛЬ Км АФП-Км

—□-"Контроль —О—Км —Л—АФП-Км

16 14 12 10 8 6 4 2

100

88.9

5 <■>->4:

3 — ч

$ 60 л«!* м «а

Г 5.-" > С^щ

3» А

* .

^ "коттрмь Км ЭФР-Км

—кяпраль —О—Км —Д— ЭФР-Км —V—ЭФР

15 20 25 время,дни

30

15 20 25 30 35 время,дни

40

Рис.9. Влияние конъюгата Км-ЛФП и Км на развитие солидных опухолей мышиного лейкоза линии Р388 у мышей ОВА/2.

Рис.10. Влияние конъюгата Км-ЭФР и Км на развитие солидных опухолей мышиной меланомы линии В16 у мышей С57В1/6.

Сравнительное исследование противоопухолевой активности Км и его конъюгата с ЭФР показало, что Км оказывал слабое ингибирующее действие в отношении роста опухолей в сравнении с контролем, тогда как ингибирующее действие Км-ЭФР оказалось значительным - к 31 дню эксперимента в группе, получавшей Км-ЭФР, относительный размер опухолей составил лишь 48,2% (рис. 10). Как видно на рис. 15, эффект Км-ЭФР в отношении УСПЖ животных также оказался существенно выше эффекта свободного Км (данные приведены на рис. 15).

Представленные результаты свидетельствуют о том, что терапевтическая активность Др и Км может быть значительно повышена за счет их адресной доставки к опухолевым клеткам-мишеням с помощью АФП и ЭФР. Следует также отметить, что используемые в работе дозы ЭФР, вводимого в составе конъюгатов, не индуцируют ускоренного развития опухолей и, таким образом, митогенная активность ЭФР не является препятствием для его

использования в качестве вектора для адресной доставки цитотоксических препаратов к опухолевым клеткам-мишеням.

2.3. Противоопухолевая активность Вб и 13к и их копъюгатов с АФ11 и ЭФР.

Исследование влияния конъюгата Вб-АФП на развитие солидных опухолей линии Ы210 показало, что как свободное вещество, так и конъюгат в дозах 0,2 мк/кг по винбластину оказывали ннгибирующее действие на рост опухолей (рис. 11). При этом относительный размер опухолей у животных, получавших Вб-АФП, к 8 дню эксперимента оказался в 3,6 раза меньше, чем у животных, получавших свободный Вб, и в 11,1 раза меньше, чем в контроле.. Терапевтическое применение конъюгата Вб-АФП приводило к наибольшему УСПЖ животных (88,6%) по сравнению со всеми

"я 1,0

1 190 10«

1»

* i 60 40 ш Э2

5 20 9 КД-1 рг У'Ч" 1

8 "контроль Вб Вб-АФ1(

-□—контроль -О—Вб -Д—Вб-АФП

б 8 10 12 время,дни

I I«

10«

77

49

ж

:

—□—кон грань —О—И) —Д— В6-ЭФР

гапръм. М В«ЭФР

20 25 30 35 время,дни

Рис.II. Влияние конъюгата Вб-АФП и Вб на развитие солидных опухолей мышиного лейкоза линии И210 у мышей ОВА/2.

Рис. 12. Влияние конъюгата Вб-ЭФР и Вб Па развитие солидных опухолей мышиной меланомы линии В16 у мышей С57В1/6.

исследуемыми конъюгатами

Рис.13. Влияние коиъюгата Вк-ЭФР и Вк на развитие солидных опухолей мышиной меланомы линии В16 у мышей С57В1/6.

15 20 25 30 35 40

время, дни

АФП и ЭФР с ЦП (рис. 14,15). Исследование влияния Вб и его конъюгата с ЭФР в тех же дозах на рост опухолей линии В16 показало, что Вб-ЭФР обладал более выраженным ингибирующим действием, чем свободный Вб (рис. 12). Относительный размер

опухолей у животных, получавших Вб-ЭФР, к 31

дню эксперимента оказался в 1,6 раза меньше, чем у

животных, получавших Вб, и более чем в 2 раза меньше, чем в контроле. При лечении животных конъюгатом Вб-ЭФР УСГ1Ж животных достигало 27%, тогда как свободный Вб в используемых дозах практически не оказывал влияния на продолжительность жизни животных (рис. 15). Аналогичным противоопухолевым действием обладал конъюгат Вк-ЭФР. При его применении в дозе 0,2 мкг/кг (по Вк) относительный размер опухолей у животных к 31 дню эксперимента оказался в 1,6 раза меньше, чем у животных, получавших свободный Вк в той же дозе, и более чем в 3 раза меньше, чем у контрольных животных. УСПЖ животных при терапии конъюгатом достигало 31%, тогда как применение свободного Вк практически не влияло на продолжительность жизни животных (рис. 15).

Представленные данные позволяют заключить, что АФП и ЭФР могут быть использованы в качестве векторов для адресной

ФЦ(Со)

Рис.14. Увеличение средней продолжительности жизни мышей с привитыми солидными опухолями мышииого лейкоза линии Р388 (в случае Вб линии 1-1210) при лечении противоопухолевыми препаратами и их конъюгатами с АФ11.

свободный препарат □копыогат

ФЦ(Со)

Рис.15. Увеличение средней продолжительности жизни мышей с привитыми солидными опухолями мышиной меланомы линии В16 при лечении противоопухолевыми препаратами и их конъюгатами с ЭФР.

доставки противоопухолевых препаратов к клеткам-мишеням. На основе данных белков могут быть созданы противоопухолевые препараты направленного действия с цитотоксическимИ веществами различных классов. Противоопухолевая активность конъюгатов векторных белков с фталоцианинами, антрациклиновыми антибиотиками и растительными алкалоидами значительно превышает активность свободных цитотоксических препаратов. По нашему мнению применение конъюгатов для лечения резистентных к химиотерапевтическим препаратам опухолей могло бы

значительно повысить эффективность терапии за счет преодоления конъюгатами резистентности опухолевых клеток и снижения терапевтических доз ЦП. Кроме того, многих побочных эффектов, вызываемых химиотерапевтическими препаратами, например высокой кардиотоксичности Др, можно было бы избежать при применении конъгагатов за счет адресной доставки ЦП к клеткам-мишеням. Для достижения максимальной терапевтической эффективности полученных препаратов направленного действия необходим подбор наиболее уязвимых к действию коныогатов опухолей и разработка оптимальных схем лечебного применения коныогатов.

И м поды

1. Получены конъюгаты противоопухолевых препаратов: ФЦ(А1), ФЦ(Со), Др, Км, Вб, Вк с АФП и ЭФР, проявляющие цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток, превышающую активность свободных веществ.

2. Наиболее высокой цнтотоксической активностью характеризуются конъюгаты АФП с ФЦ(Со) и Вб в отношении клеток линии (^ОБ, конъюгаты ЭФР с ФЦ(Со) и Км в отношении клеток линии МСР-7 и конъюгаты ЭФР с Вб и Вк в отношении клеток линий МСР-7 и В16.

3. Показано, что эффективность цитотоксического действия коныогатов Др и Км в отношении клеток линии БКОУЗ, несущих рецепторы как АФП, так и ЭФР, зависит от природы векторной молекулы.

4. Продемонстрировано, что АФП и ЭФР могут быть успешно использованы в качестве векторных молекул для рецепторопосредованного транспорта химиотерапевтических

препаратов в опухолевые клетки. При этом эффективность цитотоксического действия конъюгатов во многом определяется типом опухолевых клеток-мишеней.

5. В модельных экспериментах in vivo убедительно продемонстрировано, что терапевтическое применение конъюгатов ФЦ(Со), Др, Км, Вб и Вк как с АФП, так и с ЭФР приводит к заметному подавлению опухолевого роста и к значительному увеличению средней продолжительности жизни животных по сравнению с контролем. Применение свободных противоопухолевых веществ не сопровождается заметными терапевтическими эффектами.

6. Конъюгагы ФЦ(Со), Др, Км и Вб с АФП оказались более эффективными терапевтическими средствами, чем конъюгаты с ЭФР, в отношении соответствующих солидных опухолей.

7. АФП и ЭФР могут быть успешно использованы для избирательной доставки фталоцианинов, антрациклиновых антибиотиков и растительных алкалоидов к опухолям-мишеням. При применении противоопухолевых препаратов в составе конъюгатов наблюдается значительное увеличение их терапевтической активности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Severin S., Feldman N., Finakova G., Savitsky A., Myaghkikh I., Luzhkov Yu., Katukov V., Nakachian R., Severin E. Antitumoral effect of alpha-fetoprotein conjugates in vivo. Abstracts of XXIV meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, California, USA, 1996, p. 121.

2. Severin S.E., Moskaleva E.Yu., Posypanova G.A., Koroinyslova I.A., Shmyrev I.I., Krivonos A.V., Myagkikh I.V., Feldman N.B., Finakova G.V., Katukov V.Yu., Luzhkov Yu.M., Nakachian R., Andreani J.,

2.1

Severin E.S. In vivo antitumor activity of cytoxic drugs conjugated with human a-fetoprotein. Tumor Targeting, 1996, №2, p. 299-306.

3. Лужков Ю.М., Москалева Е.Ю., Накашьян P., Посыпанова Г.А., Родина А.В., Северин С.Е., Фельдман Н.Б., Финакова Г.В., Шмырев И.И. Конъюгаты биологически активных веществ с альфа-фетонротеином, обладающие избирательным действием по отношению к раковым опухолям, способ их получения (варианты) и фармацевтическая композиция на их основе. Патент па изобретение №2071351, 1996, с. 25.

4. Moskaleva E.Yu., Feldman N.B., Finakova G.V., Slimyrev 1.1., Posipanova G.A., Rodina A.V., Nakachian R., Katukov V.Yu. Targeted delivery of antitumor dmgs based on oncofetal protein alpha-fetoprotein. Abstracts of 5th European Winter Oncology Conference,

1997, p. 59.

5. Lutsenko S.V., Finakova G.V., Feldman N.B., Gumanov S.G., Korzhenevsky D.A., Gukasova N.V. and Severin S.E. The increase in selectivity of antitumor action of vinblastine and vincristine by targeted delivery of their EGF-conjugates to tumor cells. International Institute of anticancer research. International Conferences New Anticancer Agents, Athens, Greece, 1997, p. 56.

6. Луценко С.В., Гукасова Н.В., Посыпанова Г.А., Туманов С.Г., Фельдман Н.Б., Москалева Е.Ю., Северин Е.С., Северин С.Е., Скрябин К.Г. ЭФР как вектор для направленной доставки доксорубицина (ДР) к клеткам опухолевых линий, резистентных к ДР. VIII конференция «Новые направления биотехнологии» РАН, Москва, Россия, 1997, с. 35.

7. Луценко С.В., Туманов С.Г., Фельдман Н.Б., Посыпанова Г.А., Москалева Е.Ю., Северин С.Е., Северин Е.С., Скрябин К Г. Накопление и внутриклеточная локализация доксорубицина (ДР) при его направленном транспорте к опухолевым клеткам с помощью эпидермального фактора роста (ЭФР). VIII конференция «Новые направления биотехнологии» РАН, Москва, Россия, 1997, с. 48.

8. Lutsenko S.V., Gukasova N.V., Gumanov S.G., Posypanova G.A., Korzhenevsky D.A., Feldman N.B. and Severin S.E. Study of the cytotoxic activity of the epidermal growth factor-doxorubicin conjugate against human tumor cell cultures. 15lh meeting European association for cancer research (EACR XV), Stockholm, Sweden,

1998, p. 72.

9. Lutsenko S.V., Feldman N.B., Gukasova N.V., Posypanova G.A., Belushkina N.N., Gumanov S.G., K.G.Skryabin, Severin S.E. Toxicity of epidermal growth factor conjugate with doxorubicin against

antibiotics-resistant tumor cell cultures. . Fourth european congress of pharmaceutical sciences, Milan, Italy, 1998, p. 56.

Ю.Луценко C.B., Финакова Г.В., Фельдман H.Б., Туманов С.Г., Родина A.B., Посыпанова Г.А., Гукасова Н.В., Корженевскнй Д.А., Катуков В.Ю., Северин С.Е., Скрябин К.Г., Кирпичников М.П. Рецептороносредованный токсический эффект конъюгата эпидермального фактора роста с доксорубицином в отношении опухолевых клеток. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 1998, № 1, с. 21-25.

П.Луценко C.B., Фельдман Н.Б., Финакова Г.В., Туманов С.Г., Гукасова Н.В., Корженевскнй Д.А., Бобрускин А.И., Гельперина С.Э., Посыпанова Г.А., Катуков В.Ю., Северин С.Е., Скрябин К.Г., Кирпичников М.П., Калия О.Л., Ворожцов Г.Н. Направленная доставка к клеткам - мишеням и цитотоксическая противоопухолевая активность окта-4,5-карбоксифталоцианина (терафтал). Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 1998, № 1, с. 34-37.

12. Луценко C.B., Фельдман Н.Б., Посыпанова Г.А., Северин С.Е., Скрябин К.Г., Лукьянец Е.А., Ворожцов Г.Н., Северин Е.С. Изучение цитотоксической противоопухолевой активности конъюгатов фталоцианинов с эпидермальным фактором роста (ЭФР). Российский химический журнал (журнал Российского химического общества им. Д.И. Менделеева),1998, в печати.

1 З.Фельдман Н.Б., Луценко C.B., Финакова Г.В., Шмырев И.И., Посыпанова Г.А., Скрябин К.Г., Северин С.Е. Повышение противоопухолевой активности доксорубицина за счет его адресной доставки к клеткам-мишеням с помощью белковых векторов. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 1998, в печати.

14.Луценко C.B., Фельдман II.Б., Финакова Г.В., Посыпанова Г.А., Бобрускин А.И., Гельперина С.Э., Скрябин К.Г., Калия О.Л., Ворожцов Г.Н., Северин С.Е. Направленный транспорт ФЦ(Со) к опухолевым клеткам-мишеням с помощью альфа-фетопротешт и эпидермального фактора роста. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 1998, в печати.

15.S.V.Lutsenko, N.B.Feldman, G.V.Finakova, G.A.Posypanova, S.E.Severin, K.G.Skryabin, M.P.Kirpiclinikov, E.A.Lukyanets, G.N.Vorozhtsov. Targeting phthalocyanines to tumor cells using epidermal growth factor conjugates. Tumor biology, 1998, in press.