Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка противоопухолевых препаратов направленного действия на основе фотосенсибилизаторов и антибиотиков антрациклинового ряда с использованием белковых векторов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Разработка противоопухолевых препаратов направленного действия на основе фотосенсибилизаторов и антибиотиков антрациклинового ряда с использованием белковых векторов"

На правах рукописи

РГб од

Гукасова Надежда Вадимовна

1 з ДЕК 2000

РАЗРАБОТКА ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ НА ОСНОВЕ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ И АНТИБИОТИКОВ АНТРАЦИКЛИНОВОГО РЯДА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БЕЛКОВЫХ ВЕКТОРОВ

03. 00. 04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2000 г.

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте медицинской экологии Комитета здравоохранения Правительства г. Москвы.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Северин С.Е.

доктор биологических наук ЛуценкоС.В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Глухов А.И.

кандидат химических наук Хомутов А.Р.

Ведущая организация: Московская государственная академия

Диссертационного совета Д. 171.02.01. при Центре медико-биологических и экологических проблем РАЕН по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра медико-биологических и экологических проблем РАЕН.

Автореферат разослан 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

тонкой химической технологии им.

М.В. Ломоносова.

Защита состоится

на заседании

кандидат биологических наук

Актуальность проблемы. Несмотря на высокие возможности основных методов лечения злокачественных новообразований результаты терапии онкологических больных до сих пор далеки от желаемых. В течение долгого времени в клинике доминировали хирургическое и лучевое лечение онкологических заболеваний, однако сфера применения этих методов весьма ограничена. Применение химиотерапии позволило добиться значительных успехов в лечении ряда злокачественных опухолей, хотя проблема повышения эффективности действия химиопрепаратов, по-прежнему остается крайне актуальной. Известно, что для классических противоопухолевых химиопрепаратов, в том числе и для широко используемых в клинике антрациклиновых антибиотиков, повышение дозовой интенсивности является главной детерминантой эффективности лечения, однако увеличению терапевтических доз препятствуют серьезные побочные эффекты, а также феномен множественной лекарственной устойчивости опухолей. В связи с этим представляется актуальным поиск новых эффективных подходов и методов противоопухолевых воздействий.

Среди таких подходов, интенсивно разрабатываемых в последние годы, наиболее перспективными являются фотодинамическая терапия (ФДТ), биотерапия, а также применение технологии направленного транспорта различных противоопухолевых агентов к тканям-мишеням. ФДТ онкологических заболеваний основана на использовании фотосенсибилизаторов, активируемых при облучении светом соответствующей длины волны. Будущее ФДТ связывают с применением хлоринов и фталоцианинов, а также с появлением метода темновой (каталитической) терапии, в которой используется терафтал - противоопухолевый препарат фталоцианинового ряда, не требующий для своей активации светового облучения. Терапевтические свойства противоопухолевых химиопрепаратов, а также фотосенсибилизаторов могут быть в значительной мере улучшены за счет их адресного транспорта к опухолевым клеткам с

помощью векторных молекул. Одними из наиболее перспективных векторов являются альфа-фетопротеин (АФП) и эпидерм&тьный фактор роста (ЭФР), которые характеризуются высоким сродством к соответствующим рецепторам, гиперэкспрессированным на поверхности клеток широкого спектра опухолей. Важной особенностью АФП и ЭФР является возможность их химической модификации путем связывания с цитотоксическими препаратами без потери биологических свойств. Эффективным вектором может оказаться также рецепторсвязывающий фрагмент молекулы ЭФР (ЭФРфр) в силу его высокой стабильности и доступности в препаративных количествах. В связи с этим актуальной задачей является разработка подходов к осуществлению синтеза биологически активных конъюгатов антрациклиновых антибиотиков, фотосенсибилизаторов и терафтала с ЭФР, АФП и ЭФРфр, а также исследование цитотоксической противоопухолевой активности полученных конъюгатов в экспериментах in vitro и in vivo.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в получении циготоксических конъюгатов фотосенсибилизаторов, терафтала, доксорубицина с АФП, ЭФР и ЭФРфр, а также исследовании их противоопухолевой активности. Для осуществления этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать оптимальные методические подходы для синтеза и очистки в необходимых для экспериментов количествах конъюгатов фотосенсибилизаторов, терафтала и доксорубицина с векторными молекулами.

2. Провести сравнительное исследование цитотоксической активности исследуемых свободных препаратов и их конъюгатов in vitro в отношении культур опухолевых клеток.

3. Изучить влияние способа химического связывания компонентов конъюгата на его цитотоксическую активность.

4. Оценить эффективность цитотоксического действия конъюгатов векторных молекул с доксорубицином в отношении резистентных к антибиотику линий опухолевых клеток.

5. Исследовать цитотоксическую и противоопухолевую активность конъюгатов на основе рецепторсвязывающего фрагмента молекулы ЭФР.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработаны схемы синтеза и очистки конъюгатов противоопухолевых препаратов различных классов с АФП, ЭФР и ЭФРфр. Получены цитотоксические конъюгаты, противоопухолевая активность которых была сравнима или превышала активность свободных веществ. Показана возможность использования векторных белков (АФП и ЭФР) для значительного увеличения цитотоксичности фотосенсибилизаторов - хлоринов и дисульфохлорид фталоцианин алюминия, а также для повышения противоопухолевой активности терафтала - препарата для темновой (каталитической) терапии. Использование цитотоксических конъюгатов направленного действия на основе доксорубицина позволяет существенно повысить чувствительность резистентных к антибиотику опухолевых клеток. Впервые показана возможность применения рецепторсвязывающего фрагмента ЭФР в качестве векторной молекулы. Убедительно продемонстрировано, что терапевтическое применение конъюгата ЭФРфр с доксорубицином приводит к заметному подавлению опухолевого роста и увеличению продолжительности жизни экспериментальных животных, что позволяет рассматривать данный конъюгат в качестве перспективного противоопухолевого препарата.

Структура н объем работы. Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты работы и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на Втором съезде биохимического общества РАН, Москва, Пущино, Россия, 1997; VIII конференции "Новые направления биотехнологии" РАН, Москва, Россия, 1997; 15th meeting European association for cancer research (EACR XV), Stockholm, Sweden, 1998; Fourth European congress of pharmaceutical sciences, Milan, Italy, 1998; Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 2000; The Symposium of American Association of clinical chemistry, San Francisco, USA, 2000; 28th meeting of the International society for oncodevelopmental biology and medicine, Munich, Germany, 2000. Диссертационная работа апробирована 4 сентября 2000 г. на научном семинаре МНИИМЭ.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

В работе использовались следующие фотосенсибилизирующие агенты и химиопрепараты: фотогем (ФГ), З-дезвинил-З-формилхлорин ре (фХЛрб), хлорин еб (ХЛев) (Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова), дисульфохлорид фталоцианин алюминия (ФЦ(А1)), окта-4,5-карбоксифталоцианин кобальта (терафтал, ТФ) (ГНЦ РФ Научно-исследовательский институт органических полупродуктов и красителей, Москва), доксорубицина гидрохлорид (ДР, "Брынцалов А", Россия), а также водорастворимые карбодиимиды: 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид (КД), дициклогексил-карбодиимид (ДЦКД) и бифункциональный сшивающий реагент -глутаровый альдегид (ГА) ("Sigma", США).

Для синтеза конъюгатов использовали высокоочищенные АФП человека и ЭФР мыши. Выделение АФП проводили из ретроплацентарной сыворотки рожениц по методу (Severin S.E. et al., 1996), а ЭФР - из подчелюстных желез самцов мыши по методу (Луценко С.В. и др., 1998). Чистота белков составляла >98% по

данным ДСН-электрофореза в 12%-ном ПААГ (Laemmli U.K., 1970). Пептид ЭФРфр был получен с использованием метода твердофазного пептидного синтеза (Atherton Е. et al., 1989) и очищен с помощью ОФ ВЭЖХ.

В работе использовали клетки карциномы молочной железы человека линий MCF-7Wt и MCF-7AdrR, В-клеточной лимфомы человека линии Rají, эпидермальной карциномы человека, линии А431, карциномы яичников человека линий SKV03 и SKVLB, меланомы мыши линии В16 и фибробластов мыши линии ЖН ЗТЗ. Клетки культивировали в пластиковых флаконах ("Costar", США) в среде RPMI 1640 ("Sigma", США), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки ("Sigma1', США), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СОг, при 37°С. Пролиферативную активность ЭФР и ЭФРфр оценивали по включению [3Н]-тимидина в ДНК клеток фибробластов (O'Brien J. et al., 1979).

Для определения цитотоксической активности (ЦТА) клетки инкубировали с соответствующими препаратами в стандартных условиях. Количественную оценку жизнеспособности клеток проводили с использованием МТТ-теста (Mossmann Т., 1983). ЦТА препаратов оценивали по показателю IC50 (концентрация препарата, вызывающая снижение выживаемости клеток на 50%). Определение противоопухолевой активности препаратов in vivo проводили на мышах линии С57В1/6 с привитыми солидными опухолями меланомы мыши линии В16. Препараты вводились внутривенно один раз в 4 дня, всего три инъекции, начиная с 3-го дня после прививки опухоли. Объем опухоли вычисляли по формуле V^bd6, где а - короткий, b - длинный диаметр опухоли. ОРО (относительный размер опухоли) определяли по формуле: ОРО = Оп/КхЮО, где Оп - средний размер опухолей в опытной группе, К -средний размер опухолей у контрольных животных. Увеличение СПЖ леченых животных по сравнению с контролем определяли по

б

формуле: УСПЖ = (Т/С-1)х100%, где Т - СПЖ леченых животных, дни, С - СПЖ контрольных животных, дни. Статистическую обработку результатов проводили с использованием /-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез и очистка конъюгатов фотогема, хлоринов, фталоцианинов и доксорубицина с АФП, ЭФР и ЭФРфр

Конъюгаты АФП и ЭФР с ФГ и хлоринами (АФП-, ЭФР-ФГ; АФП-, ЭФР-фХЛрб; АФП-, ЭФР-ХЛеб) получали с использованием водорастворимого карбодиимида. Синтез проводили при +4°С в темноте в 0.01 М пиридиновом буфере, рН 5.0, с молярными соотношениями белокгцитотоксический препарат:КД в реакционной смеси, равными 1:10:100 в случае АФП и 1:10:10 в случае ЭФР. Конъюгаты АФП и ЭФР с ФЦ(А1) (АФП-, ЭФР-ФЩА1)) получали методом прямого синтеза в 0.1 М карбонатном буфере, рН 8.7, смешивая реагенты в молярном соотношении 1:9 и инкубируя реакционную смесь 2 ч при +20°С. Конъюгаты АФП и ЭФР с ТФ (АФП-, ЭФР-ТФ) синтезировали в два этапа: стадия активации СООН-групп ТФ (получение пентафторфенилового эфира) путем смешивания ТФ, ДЦКД и пентафторфенола в соотношении 1:3:3 и стадия непосредственного синтеза конъюгата, включающая инкубацию полученного эфира ТФ с раствором белка в течение 2 ч при +20°С. Очистку конъюгатов проводили с помощью гель-фильтрации на колонке с сефадексом С-25 и ОФ ВЭЖХ на колонке ц-Вопс!орак С18. Использованные схемы синтеза позволили получить стабильные конъюгаты, в которых белок и препарат (ФГ, фХЛрб, ХЛей) ТФ) связаны амидной связью между СООН-группами препаратов и N112-группами белков, а в случае конъюгатов с ФЦ(А]) сульфамидной связью между сульфохлоридными группами ФЦ(А1) и КНггруппами

белков. Молярное соотношение АФП:препарат в конъюгатах АФП-ФГ, АФП-ХЛе6, АФП-фХЛрб и АФП-ФЦ(А1) составляло 1:4, а в коныогате АФП-ТФ - 1:10. Конъюгаты на основе ЭФР характеризовались молярным соотношением равным 1:1. Синтезированные конъюгаты на основе АФП отличались более высоким содержанием цитотоксического препарата, что обусловлено различиями в молекулярной массе АФП (Мг» 70 кДа) и ЭФР (Мг« б кДа) и содержанием лизиновых ЭДЦ-групп.

Конъюгаты ЭФР с ДР получали с использованием водорастворимого карбодиимида (ЭФР-ДРкд) и глутарового альдегида в качестве бифункционального сшивающего реагента (ЭФР-ДРгд). Синтез ЭФР-ДРкд проводили при тех же условиях, что и в случае синтеза конъюгатов с фотосенсибилизаторами (молярное соотношение ЭФР:ДР:КД в инкубационной смеси составило 1:20:1000). Конъюгат ЭФР-ДРгд, а также конъюгат ЭФРфр с ДР (ЭФРфр-ДР) получали путем смешивания ЭФР (или ЭФРфр) с ДР в соотношении 1:8.5 в 0.1 М бикарбонатном буфере, рН 8.5, последующего добавления раствора ГА и инкубации реакционной смеси в течение 30 мин при +20°С. Соединение компонентов в коныогате ЭФР-ДРкд осуществлялось через амидную связь между ИНг-группой ДР и СООН-группой белка, а в случае конъюгатов ЭФР-ДРгд и ЭФРфр-ДР - через шиффовы основания с участием ИНг-групп ДР и ЭФР (или ЭФРфр). Очистку конъюгатов проводили с использованием гель-фильтрации и ОФ ВЭЖХ. Молярное соотношение ЭФР.ДР в конъюгатах составляло 1:1.

Цитотокснческая активность конъюгатов фотогема, хлоринов и фталоцианинов с АФП и ЭФР

ЦТА синтезированных конъюгатов исследовали в отношении линий клеток, высокоэкспрессирующих рецепторы АФП (линия Пар, 2x105 -7x103 рецепторов на клетку) и ЭФР (линия МСР-7, 3x105 рецепторов на клетку) (ЬаЬогс1а I & а1., 1987; Ойепзптаег С. й а!., 1996).

s

Активацию фотосенсибилизирующих препаратов проводили облучением светом соответствующей длины волны (Van Hillegersberg R. et al., 1994), а ТФ активировали добавлением в клеточную среду аскорбиновой кислоты (Novodarova G.N. et al., 1996). Было показано, что все полученные как с АФП, так и с ЭФР конъюгаты проявляли дозозависимую ЦТА в отношении опухолевых клеток. Результаты исследования ЦТА свободных препаратов и их конъюгатов представлены в табл. 1-3.

Исследование темновой цитотоксичности свободных ФГ, XJIes, фХЛр6 и ФЦ(А1) и соответствующих конъюгатов на основе АФП и ЭФР показало, что конъюгаты проявляли более высокую активность, чем свободные препараты (табл. 1). Сравнение темновой токсичности и фототоксичности препаратов в отношении опухолевых клеток показало существенное возрастание их ЦТА при облучении светом (табл. 1, 2), . 4TQ обусловлено запуском фотохимических свободнорадикальных реакций, приводящих к повреждению биомолекул и гибели клеток. Так, из исследованных конъюгатов наибольшее отличие в уровне световой и темновой ЦТА наблюдалось в случае АФП-фХЛрб (фототоксичность препарата в 180 раз превышала его темновую токсичность).

Исследование фототоксичности конъюгатов на основе АФП показало, что наиболее высокой ЦТА характеризовался АФП-фХЛрв (IC50 = 0.12

Табл. 1. Темновая токсичность химиотерапевтических препаратов и их конъюгатов с АФП и ЭФР в отношении опухолевых клеток В-клеточной лимфомы человека Raji и карциномы молочной железы человека MCF-7

Препарат Raji MCF-7

1С50 свободного препарата, мкМ ICso конъюгата препарата с АФП, мкМ ICso свободного препарата, мкМ IC50 конъюгата препарата с ЭФР, мкМ

ФГ 8.5 60 >50 6.1

фХЛ р6 137 21 4 >50 5.5

ХЛе6 78 27 >50 5.7

ФЦ(А1) - - >20 п >20

мкМ) (табл. 2). Сравнение ЦТА конъюгатов и свободных веществ в данной группе показало, что наиболее токсичными в отношении клеток оказались конъюгаты АФП-ФЦ(А1) и АФП-фХЛр6. Их ЦТА превысила на 80% и 78.2%, соответственно, активность свободных препаратов (рис. 1). Конъюгаты АФП-ФГ и АФП-ХЛеб, напротив, оказались менее эффективными, чем свободные ФГ и ХЛеб, что может быть обусловлено низким уровнем накопления данных конъюгатов в клетках. Из конъюгатов с ЭФР наиболее высокой ЦТА характеризовался ЭФР-ФЦ(А1) (относительное увеличение ЦТА составило 64%, рис. 1), причем активность конъюгатов в данной группе снижалась в следующем порядке: ЭФР-ФЦ(А1) > ЭФР-фХЛрб,ЭФР-ХЛеб > ЭФР-ФГ (табл. 2). Таким образом, из иследованных фотоактивных конъюгатов наиболее эффективными оказались конъюгаты ФЦ(А1), как с АФП, так и с ЭФР, а также конъюгат АФП-фХЛрб (рис. 1). Повышение ЦТА конъюгатов по сравнению со свободными фотосенсибилизирующими агентами может объясняться тем, что связывание с векторными белками приводит к изменению механизма проникновения препаратов в клетку и их распределения во внутриклеточных компартментах, способствуя более эффективной реализации цитотоксического действия. В отличие от фотоактивных препаратов фталоцианинового ряда ТФ не требует для активации источника света, что делает этот препарат

Табл. 2. Фототоксичность химиотерапевтических препаратов и их конъюгатов с АФП и ЭФР в отношении опухолевых клеток В-клеточной лимфомы человека Яа^ и карциномы молочной железы человека \lCF-7

Препарат Нам МСК-7

1С50 свободного препарата, мкМ Ю50 конъюгата препарата с АФП, мкМ 1С50 свободного препарата, мкМ 1С50 конъюгата препарата с ЭФР, мкМ

ФГ 3.2 5.0 3.9 3.4

фХЛ ре 0.55 0.12 1.65 1.5

ХЛ е6 0.12 0.19 1.6 1.5

ФЦ(А1) 1.5 0.3 2.5 0.9

привлекательным для изучения его противоопухолевой ЦТА (Сыркин А.Б. и др., 1998). Результаты исследования ЦТА ТФ и его конъюгатов с АФП и ЭФР приведены в табл. 3. ЦТА как ТФ, так и его конъюгатов была сравнительно низкой в отсутствие активации, однако при добавлении в клеточную среду аскорбиновой кислоты токсичность препаратов значительно повышалась, что связано с запуском свободнорадикальных механизмов повреждения клеток. ЦТА конъюгатов с АФП и ЭФР (в присутствии аскорбиновой кислоты) превышала активность свободного ТФ. Так, относительное увеличение ЦТА для АФП-ТФ составило 19%, а для ЭФР-ТФ -61.1% (рис. 1). Сравнение ЦТА фотоактивных конъюгатов и конъюгатов на основе ТФ показывает, что активность последних заметно ниже (табл. 2 и 3). Так, значения 1С50 конъюгатов АФП и ЭФР с фХЛр6, ХЛеб и ФЦ(А1) колеблются в диапазоне от 0.12 до 1.5 мкМ, тогда как показатель 1С50 для АФП-ТФ и ЭФР-ТФ был равен 9.8 и 7.0 мкМ, соответственно. Несмотря на меньшую ЦТА конъюгатов с ТФ в сравнении с фотоактивными конъюгатами, решающим условием при возможном терапевтическом использовании ТФ может оказаться отсутствие необходимости применения светового облучения для активирования препарата, что позволяет воздействовать на опухоли различной локализации.

Приведенные данные исследования ЦТА показывают, что

Табл. 3. Цитотоксическая активность ТФ и его конъюгатов с АФП и ЭФР в отношении опухолевых клеток В-клеточной лимф омы человека Яа^ и карциномы молочной железы человека МСР-7 без активации и с активацией аскорбиновой кислотой

Препарат Нал МСЕ-7

1СМ свободного препарата, мкМ 1С50 конъюгата препарата с АФП, мкМ 1С«о свободного препарата, мкМ 1С5о конъюгата препарата с ЭФР, мкМ

ТФ 300.3 170.5 >80 >80

ТФ + АК 12.1 9.8 18 7.0

Рис.1 Относительное увеличение цитотоксической активности (ОУ ЦТА) конъгогатов АФП и ЭФР с ФГ, ХЛ ре, ХЛ еб, ФЦ(А1) при световой активации и с ТФ при активации аскорбиновой кислотой (для оценки ЦТА конъюгатов АФП использовали клетки Raji, а конъюгатов ЭФР - MCF-7). ОУ ЦТА расчитывали по формуле:

ОУ ЦТА=(1 - ICso конъюгата/1С5о свободного препарата)х100'%.

использованные методы синтеза конъюгатов не приводят к потере токсичности фотосенсибилизаторов и ТФ - ЦТА конъюгатов либо превышала, либо была близка к активности свободных препаратов (за исключением конъюгатов АФН-ХЛе^ и АФП-ФГ) (рис. 1). По-видимому, повышение ЦТА связано с тем, что основным механизмом поступления конъюгатов в клетку является рецептор-опосредованный эндоцитоз, инициируемый взаимодействием ЭФР и АФП с соответствующими рецепторами на поверхности опухолевых клеток. Последующая компартментализация, вероятнто, способствует проявлению высокой ЦТА конъюгатов, обусловленной протеканием свободнорадикальных реакций, лежащих в основе механизма токсического действия как фотосенсибилизирующих агентов, так и ТФ (Pass H.I. et al., 1993; Сыркин А.Б. и др., 1998). В целом, представленные данные позволяют говорить о перспективности

дальнейших исследований в области использования препаратов направленного действия для проведения фотодинамической и темновой (каталитической) терапии онкологических заболеваний.

Сравнительный анализ ЦТА конъюгатов ЭФР-ДРкди ЭФР-ДРга-

Конъюгаты ЭФР с ДР были синтезированы с использованием водорастворимого карбодиимида (ЭФР-ДРкд) и глутарового альдегида (ЭФР-ДРга)- Исследование ЦТА полученных конъюгатов проводили на различных линиях опухолевых клеток человека, экспрессирующих в большей или меньшей степени рецепторы ЭФР (РЭФР): А431, МСБ-7™, МСР-7а<1гК, БКЛЮЗ и БКУЬВ. Как видно из табл. 4, ЦТА свободного ДР и исследуемых конъюгатов заметно отличались. Также, существенные различия отмечались в ЦТА конъюгатов ЭФР-ДРга и ЭФР-ДРвд.

Чувствительность клеток А431 к конъюгатам, особенно к ЭФР-ДРга (1С50 = 0.001 мкМ), превышала чувствительность клеток остальных исследуемых линий (табл. 4). Это может быть обусловлено тем, что линия А431, часто используемая для изучения РЭФР, характеризуется высоким уровнем экспрессии РЭФР (~ ЗхЮ6 рецепторов на клетку) и высокой скоростью рецептор-опосредованного эндоцитоза (Лппо Н. е1 а!., 1996), что, по-видимому, создает благоприятные условия для поступления конъюгата в клетку. Следует также отметить, что конъюгат ЭФР-ДРга оказался в 20 раз более активным в отношении клеток А431, чем свободный ДР, в то время как 1С50 конъюгата ЭФР-ДРкд и ДР характеризовались близкими значениями. На рис. 2 приведены результаты сравнительного исследования ЦТА свободного ДР и конъюгатов в отношении чувствительных (МСР-7УЛ, рис. 2 А) и резистентных (МСР-7А!№, рис. 2 Б) к ДР линий опухолевых клеток. Как видно на рис. 2, свободный ДР и конъюгаты проявляли дозозависимую ЦТА в отношении клеток исследуемых линий. При

Таол. 4 Цитотоксическая активность ДР и его конъюгатов с ЭФР

Линия клеток 1С50 свободного ДР, мкМ Конъюгат 1См конъюгата, мкМ ПСД'

А431 0.02 ЭФР-ДРкд 0.04 0.5

: ЭФР-ДРГА : о.оо! ; . .. 20.

0.17 ЭФР-ДРкд 0.045 3.78

ЭФР-ДРга ' 0.С22 : - 7.73 .

МСЕ-7л"гК 12.5 ЭФР-ДРкд 12 1.04

ЭФР-ДРга 0.7 ' 17.86

вКОУЗ 0.08 ЭФР-ДРкд 0.1 0.8

ЭФР-ДРга' . . 0.042 : - 1.9

БКУЬВ 12.2 ЭФР-ДРкд 9.3 1.31

■ ЭФР-ДРга : ■ 0.38 . . .: 32Л;.

♦Показатель соотношения доз (ПСД) представляет собой отношение значений ГС50 свободного ДР и конъюгата.

этом ЦТА конъюгатов ЭФР-ДРга и ЭФР-ДРвд в отношении клеток линии МСР-?1*4 заметно превышала активность свободного антибиотика (примерно в 7.7 и 3.8 раз, соответственно) (табл. 4). Следует отметить, что ЦТА исследуемых препаратов в отношении резистентных к ДР клеток линии МСР-7АА-а, была ниже их активности в отношении чувствительных клеток (рис. 2 А, Б). Очевидно, что высокая устойчивость клеток линии МСР-7ЛйгК к ДР связана с экспрессией мембранного транспортного белка Р170, обеспечивающего выведение ДР из клетки (Логилзоп 1.В., 1991). Сравнение ЦТА свободного ДР и конъюгатов в отношении клеток МСР-7ЛшИ- показало, что конъюгат ЭФР-ДРга оказался примерно в 18 раз токсичнее для клеток, чем свободный ДР, а ЦТА конъюгата ЭФР-ДРкд была близка к активности ДР (табл. 4).

Анализ данных ЦТА препаратов в отношении опухолевых клеток линий БКУОЗ и БКУЬВ также указывает на высокую эффективность действия конъюгата ЭФР-ДРга (табл.4). Так, ЦТА этого конъюгата

А Б

Рис. 2. Циго токсическая активность ДР и его конъюгатов с ЭФР в отношении клеток карциномы молочной железы человека линий МСР-7Л' (А) и MCF-7MrR (Б).

оказалась выше активности свободного ДР в 1.9 (чувствительные клетки - SKV03) и в 32.1 раза (резистентные клетки - SKVLB). Кроме того, конъюгат ЭФР-ДРга проявлял более высокую ЦТА, чем ЭФР-ДРкд- Таким образом, конъюгат ЭФР-ДРгд успешно снижал резистентность опухолевых клеток двух разных линий (MCF-7AdrR и SKVLB). Существенное повышение чувствительности резистентных опухолевых клеток к действию конъюгата, по-видимому, объясняется тем, что конъюгат, в отличие от свободного ДР, поступает в клетку путем рецептор-опосредованного эндоцитоза, и в процессе его компартментализации антибиотик в меньшей степени подвержен действию насоса Р170. Полученные результаты свидетельствуют о том, что использование векторных молекул, селективно доставляющих цитотоксические препараты в опухолевые клетки-мишени, является одним из перспективных путей решения проблемы лекарственной устойчивости опухолей к химиопрепаратам.

Представленные данные свидетельствуют о том, что в отношении всех

исследуемых клеточных линий ЦТА конъюгата ЭФР-ДРга заметно превышала активность конъюгата ЭФР-ДРкд. Очевидно, что наблюдаемые различия в уровнях ЦТА конъюгатов являются следствием различий в методах их синтеза и типе химической связи антибиотика с белком. В случае конъюгата ЭФР-ДРкд компоненты соединены амидной связью, которая, как известно, плохо подвергается лизосомальному ферментативному гидролизу и, следовательно, высвобождение ДР из конъюгата затруднено (Тгоие! А. е1 а1., 1984). Также возможна частичная потеря фармакологической активности ДР в ходе реакции синтеза конъюгата (Нигл'кг Е. е( а1., 1975). Снижение аффинности ЭФР к его рецептору, обусловленное конформационными изменениями в молекуле белка, вызванными его химической модификацией, представляется также вполне вероятным. Как показано во многих исследованиях, использование ГА в качестве бифункционального сшивающего реагента позволяет сохранить фармакологическую активность ДР и биологическую активность векторной молекулы (Егпопс! 1Р. е1 а]., 1982). По-видимому, связывание белка с антибиотиком в конъюгате ЭФР-ДРга через шиффовы основания, нестабильные в кислых рН, способствует высвобождению ДР в лизосомах (рН = 4-5) (Кга1г Б. е1 а1., 1998). Представленные результаты позволяют заключить, что эффективность реализации цитотоксического действия конъюгатов во многом определяется количеством РЭФР на поверхности опухолевых клеток, скоростью рецептор-опосредованного эндоцитоза, проявлением механизмов лекарственной резистентности, а также способом связывания химиопрепарата и векторного белка в составе конъюгата. Применение конъюгата ЭФР с ДР, полученного с помощью глутарового альдегида, позволяет существенно снизить резистентность опухолевых клеток, которая является одним из главных препятствий в проведении эффективной терапии злокачественных новообразований.

Использование ЭФРфр в качестве векторной молекулы

В последние годы наблюдается повышение интереса к использованию различных пептидов в качестве векторов для направленного транспорта противоопухолевых препаратов, что обусловлено высокой стабильностью, доступностью подобных пептидов, а также их способностью связываться с соответствующими сайтами на поверхности клеткок-мищеней (Ыа§у А. е1 а1., 1996; Агар XV. (Л а1., 1998). Для изучения возможности применения рецепторсвязывающего фрагмента молекулы ЭФР в качестве векторной компоненты конъюгатов с химиопрепаратами мы исследовали его биологическую активность.

Биологическая активность ЭФРфр

Структура ЭФРфр представляет собой следующую последовательность аминокислот: Н-МУШАЬБКУАС-ОН, которая

соответствует рецепторсвязываю-щему участку ЭФР (район молекулы с 21 по 31 аминокислоту) (Котопуа А. й а1., 1984). Биологическая активность ЭФРфр оценивалась по

уровню его

пролиферативной активности, косвенно свидетельствующей об эффективном взаимодействии

ЭФРфр с РЭФР и последующем запуске им митогенных процессов. Как видно на рис. 3, ЭФРфр, также как и ЭФР, проявлял

0,01 ОД 1 10 100 1000

концентрация, нМ

Рис. 3. Влияние ЭФР и его пептидного фрагмента ЭФРфр на пролиферацию фибробластов мыши линии МНЗТЗ.

дозозависимый пролиферативный эффект в отношении фибробластов мыши линии NIH ЗТЗ. Хотя уровень стимуляции пролиферации фибробластов ЭФРфр был несколько ниже, чем стимулирующий эффект ЭФР, полученный результат свидетельствует о выраженной биологической активности исследуемого пептида. Цитотоксическая активность конъюгата ЭФРфр-ДР Для оценки эффективности противоопухолевого действия препарата, полученного с использованием ЭФРфр в качестве вектора, мы синтезировали конъюгат ЭФРфр-ДР с помощью ГА в качестве сшивающего реагента. Применение ГА для синтеза конъюгата обусловлено тем, что в экспериментах in vitro конъюгат ЭФР-ДРга показа,! более высокую ЦТА в сравнении с ЭФР-ДРкд- Результаты исследования ЦТА ЭФРфр-ДР представлены на рис. 4, 5. Анализ данных ЦТА свободного ДР и конъюгата ЭФРфр-ДР в отношении чувствительных (MCF-7wt и SKV03) и резистентных к ДР (MCF-7AdrR и SKVLB) линий опухолевых клеток показывает, что ЦТА конъюгата была существенно выше активности свободного антибиотика. Как видно на рис. 4 А и Б, ЦТА конъюгата в отношении

А

Б

—..........

0,01 0,1 1

1С,, мкМ —о—др 3,7

1

0,1

1

10

100

[ДР}, мкМ

[ДР], мкМ

Рис. 4. Цитотоксическая активность ДР и его конъюгата с ЭФРфр в отношении клеток карциномы молочной железы человека линий MCF-7*' (А) и MCF-7AdrR (Б).

А

Б

1СХ, мкМ 0,209 10°'

1СХ, мкМ

0,01

0,1

1

0,1

1

10

[ДР], мкМ

[ДР], мкМ

Рис. 5. Цигсггоксическая активность ДР и его конъюгата с ЭФРфр в отношении клеток карциномы яичника человека линий БКОУЗ (А) и ЭКУШ (Б).

клеток линии МСР-?^" превышала активность ДР в 23.4 раза, а в отношении резистентных клеток линии МСР-7А<1гЯ- в 12.3 раза. ЦТ А конъюгата в отношении клеточных линий БКУОЗ и БКУЬВ также была заметно выше ЦТА свободного ДР (в 6 и 10.2 раза, соответственно) (рис. 5 А, Б). По-видимому, высокий уровень ЦТА конъюгата ЭФРфр-ДР в сравнении со свободным антибиотиком определяется эффективностью его интернализации и спецификой внутриклеточного распределения. Таким образом, высокя ЦТА в отношении опухолевых клеток и способность к значительному снижению уровня их резистентности к ДР позволяют рассматривать препарат ЭФРфр-ДР в качестве перспективного терапевтического средства.

Следует также отметить, что конъюгаты, синтезированные на основе ЭФРфр и ЭФР, проявляли близкую ЦТА в отношении исследуемых клеточных линий (табл. 4, рис.' 4, 5). Однако применение ЭФРфр в качестве векторной молекулы для осуществления направленного транспорта химиопрепаратов к опухолевым клеткам имеет ряд

преимуществ по сравнению с ЭФР, к числу которых относятся высокая стабильность пептида, доступность в препаративных количествах и относительно низкая стоимость. Представленные данные свидетельствуют о больших потенциальных возможностях применения ЭФРфр в качестве эффективной векторной молекулы для доставки химиопрепаратов к опухолевым клеткам. В связи с этим, мы исследовали терапевтический потенциал конъюгата ЭФРфр-ДР в экспериментах in vivo.

Противоопухолевая активность конъюгата ЭФРфр-ДР in vivo Исследование противоопухолевой активности конъюгата ЭФРфр-ДР in vivo проводили на модели перевиваемой солидной меланомы В16, традиционно используемой для тестирования химиопрепаратов. Выбор данной модели также обусловлен тем, что ранее была показана высокая противоопухолевая активность конъюгатов ЭФР с винкристином, винбластином и карминомицином в отношении меланомы В16 (Lutsenko S.V. et al., 1997). На первом этапе исследования определяли ЦТА ЭФРфр-ДР в отношении клеток меланомы линии В16 in vitro (рис. 6). Как видно на рис. 6, ЦТА

конъюгата в 23.3

раза превышала активность

свободного ДР, что свидетельствует о высокой

чувствительности клеток

злокачественной

U jjj Q j m^jiaxivjmxjj

[ДР], мкМ действию

меланомы

к

Рис б. Цитотоксическая активность ДР и его конъюгата с ЭФРфр в отношении клеток мышином меланомы линии В 16.

конъюгата.

Для сравнительного

исследования

противоопухолевой активности конъюгата ЭФРфр-ДР и свободного ДР in vivo, препараты вводили животным внутривенно в дозах 0.2 мг/кг (по ДР) согласно терапевтической схеме. Результаты наблюдения динамики развитая опухолей, а также показатели ОРО и СПЖ приведены на рис. 7 и в табл. 5. Как видно на рис. 7, до 21 дня динамика' роста опухолей в опытных группах отличалась незначительно. Так, средний размер опухолей в группах животных, получавших свободный ДР и ЭФРфр-ДР, отличался в 1.78 раза (табл. 5). Однако начиная с 24 дня в группе животных, которым вводили свободный ДР, наблюдалось резкое прогрессирование роста опухолей (ОРО = 162.7%). В отличие от свободного ДР, введение животным конъюгата ЭФРфр-ДР приводило к значительному торможению развития опухолей в течение всего периода наблюдения (рис. 7), причем к 34 дню эксперимента ОРО составлял лишь 41.9% (табл. 5). Кроме того, применение конъюгата приводило к 48.5% увеличению продолжительности жизни экспериментальных животных, чего не

6000-

—□— контроль

г

S 2000 ñ

э 1000

5000

S 2

£ 4000 §

зооо

£

i—i

о

о-

Ф-цг-ц/ ~

10

15

20

25

30

35

дни после прививки опухоли

Рис. 7. Влияние свободного ДР и конъюгата ЭФРфр-ДР на развитие солидных опухолей мышиной меланомы В16 у мышей С57В1/6.

Табл. 5. Эффективность противоопухолевого действия ДР и его конъюгатов с ЭФР и ЭФРфр при внутривенном введении мышам линии С57В1/6 с привитыми солидными опухолями меланомы В16

группа животных ОРО, % от контроля СГОК, дни УСПЖ, %

12-21 день 24-34 день

контроль 100 100 31,4+4,8 -

ДР 66,3+20,8 162,7+40,2 23,6+4,0 -24,8

ЭФРфр-ДР 37,3+12,0 41,9+4,0 46,6+5,7* 48,5

*р < 0.05

наблюдалось в случае свободного ДР (табл. 5). Таким образом, конъюгат ЭФРфр-ДР проявлял значительно более высокую терапевтическую активность, чем свободный препарат. Повышение противоопухолевой активности конъюгата может объясняться как избирательностью его действия в отношении опухолевой ткани, обусловленной векторным транспортом химиопрепарата, так и низкой скоростью выведения ДР из организма животного. Представленные результаты проведенных экспериментов in vitro и in vivo наглядно иллюстрируют высокую эффективность противоопухолевого действия конъюгата ЭФРфр-ДР, свидетельствующую о возможности успешного использования ЭФРфр в качестве векторной молекулы. Дальнейшие модельные эксперименты могли бы позволить определить наиболее чувствительные к терапии виды опухолей, а также совершенствовать схемы введения препарата для достижения максимального терапевтического эффекта.

Выводы

1. На основе разработанных схем синтезированы и очищены конъюгаты фотосенсибилизаторов, терафтала и доксорубицяна с векторными молекулами - АФГ1, ЭФР и ЭФРфр, проявляющие противоопухолевую' ЦТА либо близкую, либо превышающую активность свободных препаратов.

2. Показано, что рецепторсвязывающий фрагмент молекулы ЭФР может быть использован в качестве эффективного вектора для доставки цитотоксических агентов в опухолевые клетки.

3. Продемонстрирована высокая противоопухолевая цитотоксическая активность конъюгатов фталоцианинов с АФП и ЭФР. При этом данные конъюгаты могут быть использованы для проведения как фотодинамической, так и темновой (каталитической) терапии.

4. Показано, что ЦТА конъюгата ЭФР с ДР, синтезированного с применением глутарового альдегида, заметно превышала активность конъюгата, полученного с помощью карбодиимида. Обнаружено, что использование конъюгатов на основе ЭФР и ЭФРфр с ДР, синтезированных с помощью глутарового альдегида, позволяет значительно снизить резистентность опухолевых клеток различных линий к действию антибиотика.

5. Продемонстрировано, что терапевтическое применение конъюгата ЭФРфр с ДР в модельных экспериментах in vivo приводит к ингибированию опухолевого роста и значительному увеличению средней продолжительности жизни животных по сравнению с контролем. Применение свободного доксорубицина в тех же дозах не оказывало существенного терапевтического эффекта.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Луценко C.B., Туманов С.Г., Гукасова Н.В., Родина А.В, Северин С.Е. Использование эпидермального фактора роста для направленной доставки доксорубицина к клеткам-мишеням. Второй съезд биохимического общества РАН, Москва, Пущино, Россия, 1997, с. 450.

2. Луценко C.B., Гукасова Н.В., Посыпанова Г.А., Туманов С.Г., Фельдман Н.Б., Москалева Е.Ю., Северин Е.С., Северин С.Е., Скрябин К.Г. ЭФР как вектор для направленной доставки доксорубицина (ДР) к клеткам опухолевых линий, резистентных к ДР.

VIII конференция "Новые направления биотехнологии" РАН, Москва, Россия, 1997, с. 81.

3. Lutsenko S.V., Gukasova N.V., Gumanov S.G., Posypanova G.A., Korzhenevsky D.A., Feldman N.B., Severin S.E. Study of the cytotoxic activity of the epidermal growth factor-doxorubicin conjugate against human tumor cell cultures. 15th meeting European association for cancer research (EACR XV), Stockholm, Sweden, 1998, p. 127.

4. Lutsenko S.V., Feldman N.B., Gukasova N.V., Posypanova G.A., Gumanov S.G., Skryabin K.G., Severin S.E. Toxicity of epidermal growth factor conjugate with doxorubicin against antibiotics-resistant tumor cell cultures. Fourth European congress of pharmaceutical sciences, Milan, Italy, 1998, p. 56.

5. Луценко C.B., Финакова Г.В., Фельдман Н.Б., Туманов С.Г., Родина '

A.В., Посыпанова Г.А., Гукасова Н.В., Корженевский Д.А., Катуков

B.Ю., Северин С.Е., Скрябин К.Г., Кирпичников М.П. Рецепторопосредованный токсический эффект конъгогата эпидермального фактора роста с доксорубицином в отношении опухолевых клеток. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 1998, № 1, с. 21-25.

6. Луценко С.В., Фельдман Н.Б., Финакова Г.В., Туманов С.Г., Гукасова Н.В., Корженевский Д.А., Бобрускин А.И., Гельперина С.Э., Посыпанова Г.А., Катуков В.Ю., Северин С.Е., Скрябин К.Г., Кирпичников М.П., Калия О.Л., Ворожцов Т.Н. Направленная доставка к клеткам - мишеням и цитотоксическая противоопухолевая активность окта-4,5-карбоксифталоцианина (терафтал). Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 1998, № 1, с. 34-37.

7. Савицкий А.А., Гукасова Н.В., Туманов С.Г., Фельдман Н.Б., Лукьянец Е.А., Миронов А.Ф., Якубовская Р.И., Луценко С.В., Северин С.Е. Цитотоксическое действие конъюгатов альфа-фетопротеина и эпидермального фактора роста с фотогемом, хлоринами и фталоцианинами. Биохимия, 2000, т. 65, № 6, с. 859-864.

8. Луценко С.В., Киселев С.М., Гукасова Н.В., Посыпанова Г.А., Фельдман Н.Б., Северин С.Е. Эпидермальный фактор роста и его рецептор-связывающий фрагмент как векторы для направленной доставки доксорубицина в опухолевые клетки. Биомедицинские технологии, 2000, № 13, с. 23-27.

9. Луценко С.В., Фельдман Н.Б., Гукасова Н.В., Посыпанова Г.А., Киселев С.М., Северин С.Е. Использование белковых векторов для направленного транспорта доксорубицина в опухолевые клетки-мишени. Тезисы докладов Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 2000, с. 518.

10.Lutsenko S.V., Gukasova N.V., Posypanova G.A., Kiselev S.M., Belousova Y.V. Targeted delivery of doxorubicin to tumor cells by alpha-fetoprotein, the epidermal growth factor and its receptor-binding fragment. Clinical chemistry, 2000, Vol.46, № 6, supplement, Abstract of the Symposium of American Association of clinical chemistry, San Francisco, USA, p. 153.

11.Kiselev S.M., Gukasova N.V., Feldman N.B., Lutsenko S.V., Severn: S.E. Cytotoxic activity of the conjugate of the epidermal growth factor with doxorubicin against human cells. Tumor biology, 2000, Vol. 21, № 1, Abstracts of 28th meeting of the International Society for oncodevelopmental biology and medicine, Munich, Germany, p. 137.

12.Lutsenko S.V., Feldman N.B., Finakova G.V., Gukasova N.V., Petukhov S.P., Posypanova G.A., Skiyabin K.G., Severin S.E. Antitumor activity of alpha-fetoprotein and epidermal growth factor conjugates in vitro and in vivo. Tumor Biology, 2000, Vol. 21, № 6, p. 367-374.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гукасова, Надежда Вадимовна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Фотодинамическая терапия - новое направление в лечении онкологических заболеваний

1.1.1 История становления метода

1.1.2 Агенты для фотодинамической терапии: фотосенсибилизаторы первого и второго поколений

1.1.3 Механизмы действия фото динамической терапии

1.1.4 Опыт клинического применения фотодинамической терапии и возможные пути повышения ее эффективности

1.2 Химиотерапия онкологических заболеваний с использованием антрациклиновых антибиотиков

1.2.1 Основные свойства антрациклиновых антибиотиков

1.2.2 Проблемы в области химиотерапии злокачественных новообразований

1.2.3 Применение полимерных носителей и векторных молекул для повышения селективности действия антрациклиновых антибиотиков в отношении опухоли

1.3 Возможности использования альфа-фетопротеина (АФП), эпидермального фактора роста (ЭФР) и его рецепторсвязывающего фрагмента (ЭФРфр) в качестве векторных молекул

1.3.1 Рецепторы АФП и ЭФР как мишени для химиотерапевтических воздействий

1.3.2 Основные свойства АФП, ЭФР и ЭФРфр

1.3.3 Возможные подходы для создания конструкций векторпротивоопухолевый агент

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Выделение и очистка АФП

2.2 Выделение и очистка ЭФР

2.3 Синтез и очистка ЭФРфр

2.4 Оценка ростстимулирующей активности ЭФР и ЭФРфр в отношении культуры клеток фибробластов

2.5 Синтез и очистка конъюгатов

2.5.1 Синтез и очистка конъюгатов АФП и ЭФР с фотогемом и хлоринами

2.5.2 Синтез и очистка конъюгатов АФП и ЭФР с фталоцианинами

2.5.3 Синтез и очистка конъюгатов ЭФР и ЭФРфр с доксорубицином

2.6 Культивирование клеток

2.7 Определение цитотоксической активности препаратов in vitro

2.8 Определение противоопухолевой активности препаратов in vivo

2.9 Статистическая обработка результатов

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1 Получение конъюгатов фотогема, хлоринов, фталоцианинов и доксорубицина с АФП, ЭФР и ЭФРфр

3.2 Цитотоксическая активность конъюгатов фотогема, хлоринов и фталоцианинов с АФП и ЭФР

3.3 Сравнительный анализ цитотоксической активности конъюгатов ЭФР-ДРкд и ЭФР-ДРГА

3.4 Использование ЭФРфр в качестве векторной молекулы

3.4.1 Биологическая активность ЭФРфр

3.4.2 Цитотоксическая активность конъюгата ЭФРфр-ДР

3.4.3 Противоопухолевая активность конъюгата ЭФРфр-ДР in vivo 86 Выводы 89 Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФП - альфа-фетопротеин

ЭФР - эпидермальный фактор роста

ЭФРфр - рецепторсвязывающий фрагмент молекулы ЭФР

ФДТ - фотодинамическая терапия

ПГП - производное гематопорфирина

ФС - фотосенсибилизатор

ФГ - фотогем

ХЛеб - хлорин еб

ХЛрб - хлорин рб фХЛрб - З-дезвинил-З-формилхлорин рб аХЛрб - 3 -дезвинил-3 -ацетилхлорин р

ФЦ(А1) - дисульфохлорид фталоцианин алюминия

ФЦ(Со) - дисульфохлорид фталоцианин кобальта

ТФ - окта-4, 5-карбоксифталоцианин кобальта (терафтал) т-ТНРС - мета-тетра(гидроксифенил)-хлорин

ПР - полная регрессия опухоли

АА - антрациклиновый антибиотик

ДР - доксорубицин

ДМ - дауномицин

КМ - карминомицин топо II - ДНК-топоизомераза II

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость

МАТ - моноклональные антитела

РАФП - рецептор альфа-фетопротеина

РЭФР - рецептор эпидермального фактора роста

ПКС - протеинкиназа С

МАПК - митогенактивируемая протеинкиназа ФЛС - фосфолипаза С Р1 - фосфатидилинозитол ДАГ - диацилглицерол

ОФ ВЭЖХ - обратнофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография

ЦТА - цитотоксическая активность

ОУ ЦТА - относительное увеличение ЦТА

ОРО - относительный размер опухоли

СПЖ - средняя продолжительность жизни животных

УСПЖ - увеличение СПЖ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка противоопухолевых препаратов направленного действия на основе фотосенсибилизаторов и антибиотиков антрациклинового ряда с использованием белковых векторов"

Несмотря на высокие возможности основных методов лечения злокачественных новообразований результаты терапии онкологических больных до сих пор далеки от желаемых. В течение долгого времени в клинике доминировали хирургическое и лучевое лечение онкологических заболеваний, однако сфера применения этих методов весьма ограничена. Применение химиотерапии позволило добиться значительных успехов в лечении ряда злокачественных опухолей, хотя проблема повышения эффективности действия химиопрепаратов, по-прежнему остается крайне актуальной. Известно, что для классических противоопухолевых химиопрепаратов, в том числе и для широко используемых в клинике антрациклиновых антибиотиков, повышение дозовой интенсивности является главной детерминантой эффективности лечения, однако увеличению терапевтических доз препятствуют серьезные побочные эффекты, а также феномен множественной лекарственной устойчивости опухолей. В связи с этим представляется актуальным поиск новых эффективных подходов и методов противоопухолевых воздействий.

Среди таких подходов, интенсивно разрабатываемых в последние годы, наиболее перспективными являются фотодинамическая терапия (ФДТ), биотерапия, а также применение технологии направленного транспорта различных противоопухолевых агентов к тканям-мишеням. ФДТ онкологических заболеваний основана на использовании фотосенсибилизаторов, активируемых при облучении светом соответствующей длины волны. Будущее ФДТ связывают с применением хлоринов и фталоцианинов, а также с появлением метода темновой (каталитической) терапии, в которой используется терафтал - противоопухолевый препарат фталоцианинового ряда, не требующий для своей активации светового облучения.

Терапевтические свойства противоопухолевых химиопрепаратов, а также фотосенсибилизаторов могут быть в значительной мере улучшены за счет их адресного транспорта к опухолевым клеткам с помощью векторных молекул. Одними из наиболее перспективных векторов являются альфа-фетопротеин (АФП) и эпидермальный фактор роста (ЭФР), которые характеризуются высоким сродством к соответствующим рецепторам, гиперэкспрессированным на поверхности клеток широкого спектра опухолей. Важной особенностью АФП и ЭФР является возможность их химической модификации путем связывания с цитотоксическими препаратами без потери биологических свойств. Эффективным вектором может оказаться также рецепторсвязывающий фрагмент молекулы ЭФР (ЭФРфр) в силу его высокой стабильности и доступности в препаративных количествах. В связи с этим актуальной задачей является разработка подходов к осуществлению синтеза биологически активных конъюгатов антрациклиновых антибиотиков, фотосенсибилизаторов и терафтала с ЭФР, АФП и ЭФРфр, а также исследование цитотоксической противоопухолевой активности полученных конъюгатов в экспериментах in vitro и in vivo.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Гукасова, Надежда Вадимовна

Выводы

1. На основе разработанных схем синтезированы и очищены конъюгаты фотосенсибилизаторов, терафтала и доксорубицина с векторными молекулами - АФП, ЭФР и ЭФРфр, проявляющие противоопухолевую ЦТА либо близкую, либо превышающую активность свободных препаратов.

2. Показано, что рецепторсвязывающий фрагмент молекулы ЭФР может быть использован в качестве эффективного вектора для доставки цитотоксических агентов в опухолевые клетки.

3. Продемонстрирована высокая противоопухолевая цитотоксическая активность конъюгатов фталоцианинов с АФП и ЭФР. При этом данные конъюгаты могут быть использованы для проведения как фотодинамической, так и темновой (каталитической) терапии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гукасова, Надежда Вадимовна, Москва

1. Kessel D. Photodynamic therapy and neoplastic disease // Oncology Research. -1992. 4. - P. 219-225.

2. Pass. H.I. Photodynamic therapy in oncology: mechanisms and clinical use // J. Natl. Cancer Inst.- 1993,- 6,- P. 443-456.

3. Raab O. Uber die wirkung fluoreszierenden stoffen // Infuzoria Z Biol.-1900,-Vol. 39,-P. 524-529.

4. Hausman W. Die sensibilisierende wikung des hematoporphyrins // Biocem. Z.- 1911.- Vol. 30,-P. 276-280.

5. Lipson R.L., Baldes E.J. The use of a derivative of hematoporphyrin in tumor detection // J. Natl. Cancer Inst.- 1961,- Vol. 26,- P. 1-8.

6. Lipson R.L., Grey M.J., Baldes E.J. Hematoporphyrin derivative for detection and management of cancer // Proc. 9th International Cancer Congress, Tokyo, Japan.- 1966.- P. 393.

7. Dougherty T.J., Kaufman J.E., Goldfarb A, et al. Photoradiation therapy for the treatment of malignant tumors // Cancer Res.- 1978,- Vol. 38 P. 2628-2635.

8. Spikes J.D., Jori G. Photodynamic therapy of tumors and others disease using porphyrins // Lasers Med. Sci.- 1986,- 2,- P. 3-15.

9. Лукьянец E.A. Новые сенсибилизаторы для фото динамической терапии // Российский химический журнал,- 1998,- 5,- С. 9-16.

10. Ю.Миронов А.Ф. Фотосенсибилизаторы на основе порфиринов и родственных соединений для проведения фотодинамической терапии рака // Итоги науки и техники: Современные проблемы лазерной физики.- 1990,- Т. 3.- С. 5-62.

11. Moan J. Properties for optimal photodynamic therapy sensitizers // Journal of Photochem. And Photobiol.- 1990,- 5,- P. 521-524.

12. Филоненко Е.В. Эндоскопическая фото динамическая терапия начальных форм рака бронхов, пищевода и желудеа с использованием фотосенсибилизатора фотогем: Дисс. . канд. мед. наук. -М.- 1997.

13. Лукьянец Е.А. Разработка сенсибилизаторов второго поколения на основе природных хлорофиллов // Российский химический журнал,- 1998.- 5.- С. 9-16.

14. Чиссов В.И., Казачкина Н.И., Фомина Г.И., Шитова JI.A. и др. Хлорин рб и его производные как новые фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии рака // Российский онкологический журнал,- 1999.- 5.- С. 22-25.

15. Rosental I. Phtalocianines as photodinamic sensitizers. Photochem. Photobiol.- 1991,- 53,- P. 859-870.

16. Novodarova G.N., Belkov V.M., Volpin M.E., Shaharova Z.A. The activation of dioxygen and homogeneous catalytic oxidation // 6th Intern. Symposium 1996,-Noordwijkerhout.-P. 215-216.

17. Peng Q., Moan J., Farrants G.W. et al. Location of P-II and A1PC34 in human tumor LOX in vitro and in vivo by means of computerencanced video fluorescence microscopy // Cancer lett.- 1991.- 58,- P. 37-47.

18. Berns M.V., Dahlman A., Johnsen F.M. et al. In vitro cellular effects of heamatoporphyrin derivative // Cancer Res.- 1982,- 42,- P. 2325-2329.

19. Peng Q., Farrants G.W., Madslien K. et al. Subcellular localisation, redistribution and photobleaching of sulfonated aiuminium phtalocyanines in a human melanoma cells line // Int. J. Cancer.- 1991.49.- P. 290-295.

20. Якубовская P.И., Казачкина Н.И., Кармакова Т.А. и др. Скрининг и медико-биологическое изучение отечественныхфотосенсибилизаторов // Российский химический журнал.- 1998.5,- С. 17-23.

21. Bellnier D.A., Но Y-K, Pandey R.K. et al. Distribution and elimination of photophrin II in mice // Photochem. Photobiol- 1989,- '50.- P. 221228.

22. Peng Q., Moan J., Farrants G.W. et al. Localization of patent photosentizers in human tumors LOX by means of laser sanning microscope // Cancer lett.- 1991.- 58,- P. 17-27.

23. Сыркин А.Б., Жукова О.С., Кикоть Б.С. и др. Терафтал новый препарат для бинарной каталитической терапии злокачественных опухолей // Российский химический журнал.- 1998.- 5,- С. 140-146.

24. Barel A., Jori G., Perin A. et al. Role of high-, low- and very lowdensity lipoproteins in the transport and tumor-delivery of hematoporphyrin in vivo // Cancer lett.- 1986.- 32,- P. 145-150.

25. Henderson B.W., Dougherty T.J. How does photodynamic therapy work? // Photochem. Photobiol.- 1992,- 55,- P. 145-157.

26. Foote C.S., Mechanisms of photooxigenation. In porphyrin localisation and teatment of tumors (Doiron D.R., Gomer С ,J. eds). New York: Alan R. Liss.- 1984.- P. 4.

27. Van Hillegersberg R., Kort W.J., Wilson J.M. Current status of photodynamic therapy in oncology // Drugs.- 1994,- 48,- P. 510-527.

28. Moan J., Berg K. Photochemotherapy of cancer: experimental reasearch. //Photochem. Photobiol.- 1992,- 55,-P. 931-948.

29. ЗО.Зенькевич Э.И., Сагун Е.И., Кнюкшто В.Н. и др. Дезактивация S1-и Т1-состояний порфиринов и хлоринов при их взаимодействии с молеулярным кислородом в растворах // Журнал прикладной спектроскопии.- 1996.-4.-С. 599-612.

30. Pass H.I., Evans S., Matthews W.A. et al. Photodynamic therapy of oncogene-transformed cells // J. Thorac. Cardiovasc. Surg.- 1991.- 101.-P. 795-799.

31. Фотокаталитическая генерация активных форм кислорода в биологических средах в методе фотодинамической терапии // Российский химический журнал.- 1998,- 5,- С. 36-49.

32. Коган Е.А., Невольских А.А., Жаркова Н.Н., Лощенов В.Б. Морфо-и патогенез повреждений злокачественных опухолей при фотодинамической терапии // Архив патологии.- 1993.- 6,- С. 73-76.

33. Valenzeno D. Photomodification of biological membranes with emphasis on singlet oxygen mechanisms // Photochem. Photobiol.- 1987.- 46,- P. 146-160.

34. Hilf R., Murant R.S., Narayanan U. Et al. Relationsip of mitochondrial function and cellular adenosinetriphosphate levels to hematoporphyrin derivative-induced photosensitization in R3230AC mammary tumors // Cancer Res.- 1986,- 46,- P. 211-217.

35. Jin H., Whitacre C.M., Xue L. et al. Protease activation and cleavage of Poly(ADP-ribose) polymerase: an integral part of apoptosis in response to photodynamic treatment // Cancer Res.- 1998.- 58 P. 940-946.

36. Кард Т.И., Пятибрат Л.В., Календо Г.С. Фотосенсибилизированная инактивация опухолевых клеток HeLa фталоцианинами // Радиобиология,- 1989,- Т. 29,- 3,- С. 353-358.

37. Gomer C.J. Preclinical examination of first and second generation photosensitizers used in photodynamic therapy // Photochem. Photobiol.-1991,-54,-P. 1093-1107.

38. Вольпин M.E., Крайнова Н.Ю., Левитин И.Я. и др. Механизмы окисления аскорбиновой кислоты и проблемы каталитической (темновой) терапии рака // Российский химический журнал.- 1998.-5,-С. 111-115.

39. Dougherty T.J. Photoradiation therapy // Urol. Suppl.- 1984,- 23.- P. 6171.

40. Соколов B.B., Странадако Е.Ф., Жаркова H.H. и др. Фотодинамическая терапия злокачественных опухолей основных локализаций с препаратами фотогем и фотосенс (результаты 3-летних наблюдений) // Вопросы онкологии,- 1995.- 2,- С. 134-138.

41. Ris Н.В., Altermatt H.J., Stewart С.М. et al. Photodynamic therapy with m-tetra-hydroxyphenylchlorin in vivo: optimization of the therapeutic index// Intern. Journal of cancer.- 1993,- 55.- P. 245-249.

42. Блознелите JI., Пономарев И.В. Эффективность фотодинамической терапии опухолей разной гистологической структуры // Российский онкологический журнал.- 1997.- 4.- С. 18-21.

43. Чиссов В.И., Соколов В.В., Филоненко Е.В. Фото динамическая терапия злокачественных опухолей // Российский химический журнал,- 1998.- 5,- С. 5-9.

44. Jiang F., Lilg L., Grenier J. et al. Photodynamic therapy of U87 human glioma in nude rat using liposome-delivered photofiin // Lasers in surgery and medicine.- 1998,- 22.- P. 74-80.

45. Ris H., Hof V., Stewart C. et al. Endobronchial photodynamic therapy: comparison of mTHPC and polyethylene glycol-derived mTHPC onhuman tumor xenografts and tumor-free bronchi of minipigs // Lasers in surgery and medicine.- 1998,- 23,- P. 25-32.

46. Блохин H.H., Переводчикова Н.И. Химиотерапия опухолевых заболеваний // М.: Медицина, 1984.

47. Гаузе Г.Ф., Дудник Ю.В. Противоопухолевые антибиотики // М.: Медицина, 1987.

48. Arcamone F. Doxorubicin, Anticancer antibiotics // New York: Acad. Press.- 1981 -369 p.

49. De Vita, Hellman S., Rosenberg S. // in Principles and practice of oncology, Eds. Lippincott J.B.- Philadelphia, PA, 1985.

50. Schwartz H. S. Mechanism of selective cytotoxisity of adriamycin, daunomycin, and related antracyclines // In: Molecular aspects of anticancer drug action, Eds. S. Neidle, M. J. Waring. London: Mac MillanPress.- 1983,-P. 93-125.

51. Potmesil M., Israel M., Silber R. Two mechanisms of adriamycin-DNA interaction in L1210 cells // Biochem. Pharmacol.- 1984,- Vol. 33.-20.-P. 3137-3142.

52. Kanter P.M., Schwartz H. S. Effects of N-trifluoroacetyladriamycin-14-valerat and related agents on DNA strand damage and thymidine incorporation in CCRF-CEM cells // Cancer Res.- 1979.- Vol. 39.-2,- P. 448-451.

53. Liu L. F. DNA-topoisomerase poison as antitumor drugs // Ann Rev. Biochem.- 1989,- 58,- P. 351-375.

54. Tewey К. M., Rowe T. C, Yang L. at all. Adriamycin-induced DNA damage mediated by mammalian topoisomerase II. // Scence.- 1984,-Vol. 226.- P. 466-469.

55. Pommier Y. DNA topoisomerases and their inhibition by anthraciclines // In: Antracicline antibiotics, American Chemical Society.- 1994,- P. 182199.

56. Capranico G., Jaxel C., Roberge M. et al. Nucleosome positioning as a critical determinant DNA topoisomerase II in reconstituted simian virus 40 chromatin. //Nucleic Acid Res.-1990,- Vol. 18,- P. 4553-4559.

57. Miyashita Т., Reed J.C. Bcl-2 oncoprotein blocks chemotherapy induced apoptosis ina human leukemia cell line // Blood.- 1995,- 8,- P. 151-157.

58. Эммануэль H.M., Богданов Г.Н., Орлов B.C. Свободнорадикальные механизмы в цитотоксическом действии противоопухолевых антибиотиков // Успехи химии,- 1984,- Т. 53,- №12,- С. 1929-1958.

59. Bachur N.R., Gordon S.L., Gee M.V. et al. NADFH cytochrome P-450 reductase activation of quinone anticancer agents to free radicals // PNAS USA.- 1979,- Vol. 76(2).- P. 954-957.

60. Тараховский A.M., Жмарева E.H., Ромоданов C.A. Роль системы образования и детоксикации супероксидных радикалов в механизме противоопухолевого эффекта адриамицина // Бюллетень, экспер. биол.- 1983,- Т. 96.- №11,- С. 86-88.

61. Eliot Н., Gianni L., Myers С. Oxidative destrruction of DNA by the adriamycin-iron complex // Biochemistry.- 1984.- Vol. 23.-5,- P. 928936.

62. Myers C.E., Gianni L., Simone C.B. et al. Oxidative destruction of erythrocyte ghost membranes cataiyzed by the doxorubicine-iron complex // Biochemistry.- 1982.- Vol. 21.-8,- P. 1707-1713.

63. Tritton T. R. Cell surface actions of adriamycin. // Pharmac.Ther.- 1991.-Vol. 49.- P. 293-309.

64. Tritton T. R., Yee G. The anticancer agent adriamycin can be actively cytotoxic without entering cells // Science.- 1982,- Vol. 217.- P. 248250.

65. Mehta R., Burke T.G. Membrane biophisical parametrs influencing anthracycline action // In: Antracicline antibiotics, American Chemical Society.- 1994,- P. 223-240.

66. Богуш T.A., Шубина И.Ж., Смирнова Г.Б., Сыркин А.Б., Богуш Е.А. Прижизненная количественная оценка внутриклеточного распределения доксорубицина в опухолевых клетках. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,- 1995,- №11.- С. 518521.

67. Ferrans V. Overview of cardiac pathology in relation ro anthracycline cardiotoxity // Cancer Treat. Rep.- 1978.- Vol. 62,- P. 995-961.

68. Doroshow J. H. Effect of anthracycline antibiotics on oxygen radical formation in rat heart // Cancer Res.- 1983,- Vol. 43.-2.- P. 460-472.

69. Семиглазов В.Ф. Предупреждение кардиотосического действия антрациклинов с помощью кардиоскана // Вопросы онкологии,-1997,- Т. 43,-6,-С. 569-574.

70. Roninson I.B. Molecular and cellular biology of multidrug resistance in tumor cells. 1991,- New York, Plenum Press.

71. Сергеева H.C., Стороженко И.В., Маршутина H.B. Множественная лекарственная устойчивость как один из возможных механизмов клинической химиорезистентности опухолей человека // Российский онкологический журнал,- 1996,- 3,- С. 51-55.

72. Ставровская A.A. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток // Биохимия,-2000,- Т. 65,- 1,- С. 112-126.

73. Dalton W.S., Miller Т.Р. // In: Principles and practice of oncology, Ed. Lippincott J.B.- Philadelphia, PA.-1991,- Vol. 5,- P. 1-13.

74. Cole S.P., Bhardwaj G., Gerlach J.H. et al. Overexspression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line // Science.- 1992,- Vol. 258,-P. 1650-1654.

75. Beck W.T., Danks MX, Wolverton J.S., Kirn R., Chen M. Drug resistance associated with altered DNA topoisomerase II // Adv. Enzyme Regul.- 1993,-33,-P. 113-127.

76. De Jong S., Zilstra J. Mulder N. Reduced DNA-topoisomerase II activity and drug-induced DNA cleavage activity in adriamycin resistant human small cell lung carcinoma cell line // Cancer Res.- 1990,- 50,- P. 304309.

77. Schneider E., Horton S., Yang C. et al. Multidrug-resistance associated protein and reduced drug sensivity of topoisomerase II in human breast carcinoma MCF-7 cells // Cancer Res.- 1994,- 54.-P. 158-165.

78. Danks M.K., Yalowich J.C., Beck W.T. Atypical multipal drug resistance in human leukemic cell line selected for resistance to teniposide // Cancer Res.- 1987,- 47.- P. 1297-1301.

79. Владимирская Е.Б., Кисляк H.C., Румянцев А.Г. Причины и пути преодоления лекарственной резистентности при лейкозах и лимфомах у детей // Гематол. и трансфузиол.- 1998,- Т. 43,- 6,- С. 37.

80. Lowe S.W., Ruley Н.Е., Jacks Т., Housman D.E. p53 Dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents // Cell.- 1993,-74.-P. 957-967.

81. Hickman J.A., Potten C., Merritt J., Fisherr T. Apoptosis and cancer chemotherapy // Phil. Trans. R. Soc.- 1994.- 345,- P. 319-325.

82. Zijistra J.G., De Vries E.G.E., Mulder N.H. Multifactorial drug resistance in an Adriamycin-resistant human small cell lung carcinoma cell line // Cancer Res.- 1987,- 47,- P. 1780-1784.

83. Perez-Soler R., Sugarman S., Zou Y., Priebe W. // In: Antracicline antibiotics, American Chemical Society.- 1994,- P. 300-319.

84. Duncan R., Seymour L.W., O Hare K.B. et al. Preclinical evaluation of polymer-bound doxorubicin // J. Controlled Release.- 1992,- Vol. 19,- P. 331-346.

85. Danhauser-Reidl S., Hausmann E., Schick H.D. et al. Phase I clinical and pharmacokinetic trial of dextrane conjugated doxorubicin // Investigational New Drugs.- 1993,- 11.-P. 187-195.

86. Todorova N., Krysteva M., Maneva K., Todorov D. Carminomycin-chitosan: a conjugated antitumor antibiotic // J. Bioactive and compatible polymers.- 1999,- Vol. 14,-P. 178-184.

87. Goldberg J.A., Wïllmott N., Kerr D.J. et al. An in vivo assessment of adriamycin-loaded albumin microspheres // Br. J. Cancer.- 1992,- Vol. 65.-P. 393-395.

88. Gupta P.K., Hung C.T., Rao N.S. Ultrastructural disposition of adriamycin-associated magnetic albumin microspheres in rats // J. Pharm. Sci.- 1989,- Vol. 78,- P. 290-294.

89. Kattan J., Droz J.-P., Couvreur P. et al. Phase I clinical trial and pharmacokinetic evaluation of doxorubicin carried by polyisohexylcyanoacrylate nanoparticles // Investigational New Drugs.-1992,- 10,-P. 191-199.

90. Mayer L.D., Tai L.C., Ko D.S.K. et al. Influence of vesicle size, lipid composition, and drug-tolipid ratio on the biological activity of liposomal doxorubicin in mice // Cancer Res.- 1989,- Vol. 49,- P. 5922-5930.

91. Rahman A., Treat J., Roh J.-K. et al. A phase I clinical trial and pharmacokinetic evaluation of liposome-encapsulated doxorubicin // J. Clin. Oncol.- 1990,- Vol. 8,- P. 1093-1100.

92. Gabison A.A. Selective tumor localization and impruved therapeutic index of anthracyclines encapsulated in long-circulating liposomes // Cancer Res.- Vol. 52.-P. 891-896.

93. Vasey P.A., Kaye S.B., Morrison R. et al. Phase I clinical and pharmacokinetic study of Pkl first member of a new class of chemotherapeutic agents drug-polymer conjugates // Clin. Cancer Res.-1999,-Vol. 5,-P. 83-94.

94. Ю7.Гуляев A.E., Ермекбаева Б.А., Кивман Г.Я. и др. Наночастицы как вектор направленного транспорта антибиотиков // Химико-фармацевтический журнал,- 1998,- 2 С. 3-6.

95. Schwartz G. К., Casper E.S. A phase II trial doxorubicin HC1 liposome injection in patients with advanced pancreatic adenocarcinoma // Investigational New Drugs.- 1995,- 13,-P. 77-82.

96. Kawano K. Tissue distribution of adriamicin-encapsulated liposomes conjugated with monoclonal antibody // Drug Delivery System.- 1992.-Vol. 7.-P. 23-29.

97. Ю.Северин C.E., Катуков В.Ю., Муйжнек Е.Л., Северин Е.С. Проблемы избирательной регуляции клеточной активности: от фундаментальных основ к практическим результатам // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии,- 2,- С. 312.

98. Arnon R., Sela М. In vitro and in vivo efficacy of conjugates of daunomycin with antitumor antibodies. // Immunol. Rev.- 1982.- Vol. 62.- P. 5-27.

99. Belles-Isles M., Page M. In vitro activity of daunomicin-anti-alpha-fetoprotein conjugate on mouse hepatomas cells // Br. J. Cancer.- 1980,41.- P. 841-845.

100. Page M., Delorme F., Lafontaine F., Dumas L. Chemotherapy with daunorubicin-anti-CEA conjugates in human colon adenocarcinoma grafted in nude mice // Seminars in Oncology.- 1984.- Vol. 11.- 4,- P. 5658.

101. Stan A.C., Radu D.L., Casares S. et al. Antineoplastic efficacy of doxorubicin enzymatically assembled on galactose residues of a monoclonal-antibody specific for the carcinoembryonic antigen // Cancer Res.- 1999,-Vol. 59,-P. 115-121.

102. Thibeault D., Page M. Coupling daunorubicin to monoclonal antialphafoetoprotein with a new activated derivative // Int. J. Immunopharmac.- 1990,- Vol. 12,- 5,- P. 503-507.

103. Trail P.A., Willner D., Lasch S.J. Cure of xenografted human carcinomas by BR96-doxorubicin immunoconjugates // Science.- 1993.-Vol. 261.-P. 212-215.

104. Shih L.B., Goldenberg D.M., Xuan H. et al. Antracycline immunoconjugates prepared by a site-spesific linkage via an amino-dextran intermediate carrier // Cancer Res.- 1991,- Vol. 51.- P. 41924198.

105. Takahashi H., Adachi K., Yamaguchi F. et al. Experimental treatment of malignant gliomas with human monoclonal antibody-drug conjugates // Anticancer Res.- 1999,- Vol. 19,- P. 4151-4155.

106. Gallego J., Price M. R., Baldwin R. W. Preparation of four daunomycin monoclonal antibody 791T/36 conjugates with antitumor activity // Int. J. Cancer.- 1984,- Vol. 33.- P. 737-744.

107. Hatano T., Ohkawa K., Matsuda M. Cytotoxic effect of the protein-doxorubicin conjugates on the multidrug-resistant human myelogenous leukemia cell line, K562, in vitro // Tumor biol.- 1993,- 14,- P. 288-294.

108. Lemieux P., Page M. Sensitivity of multydrug-resistant MCF-7 cells to a transferrin-doxorubicin conjugate // Anticancer Res.- 1993,- 13.- P. 397-404.

109. Kratz F., Beyer U., Roth T. et al. Transferrin conjugates of doxorubicin // J. Pharm. Sei.- 1998.- Vol. 87.- 3,- P. 338-346.

110. Varga J.M., Asato N., Lande S., Lerner A.B. Melanotropin-daunomycin conjugates shows receptor-mediated cytotoxity in cultured murin melanoma cells // Nature.- 1997.- Vol. 261.- P. 56-58.

111. Schally A.V., Nagy A. Cancer chemotherapy based on targeting of cytotoxic peptide conjugates to their receptors on tumors // European Journal of endocrinology.- 1999,- Vol. 141.- l.-P. 1-14.

112. Himmelweit F. // The collection Paper of Paul Ehrlich.- New York.-1960,-Vol. 3,-P. 46.

113. Авдеев Г. Иммунотерапия опухолей // Итоги науки и техники. Серия онкология.- 1985,- С. 135-140.

114. Trouet A., Jolles G. Targeting of daunorubicin by association with DNA or proteins: a review // Seminars in oncology.- 1984,- Vol. 11.- 4, P. 6472.

115. Lai B.T., Gao J.P., Lanks K.W. Mechanism of action and spectrum of cell-lines sensitive to a doxorubicin-transferrin conjugate // Cancer chemotherapy and pharmacology.- 1998.- Vol. 41.- 2.- P. 155-160.

116. Mizejewski G.J. Alpha-fetoprotein binding proteins: implication for transmembrane passage and subcellular localization // Life Sciences.-1995,-Vol. 56,-l.-P. 1-9.

117. Villacampa M.J., Moro R., Naval J. et al. AFP receptor in a human breast cancer cell line // Bioch. Bioph. Res. Comm.- 1984,- 122.- P. 1322-1327.

118. TorresJ.M., Geuskens M., Uriel J. Receptor-mediated endocytosis and recycling of alpha-fetoprotein in human B-lymphoma and T-leukemia cells // Int. J. Cancer 1991,- 47 - P. 110-117.

119. Uriel J., Villacampa M.J., Moro R., Naval J., Failly-Crepin Ch. Uptake of radiolabeled alpha-fetoprotein by mouse mammary carcinoma's and itsusefulness in tumor scintigraphy // Cancer Res.- 1984,- 44.- P. 53145319.

120. Villcampa M.J., Lapreave F., Calvo M., Naval J., Pineiro A., Uriel J. Incorporation of radiolabeled AFP in the brain and other tissues of the developing rat // Dev. Brain Res.- 1984,- 12,- P. 77-82.

121. Moro R., Tamaoki Т., Wegmann T.G., Longenecker B.M., Laderoute M.P. Monoclonal antibodies directed against a widespread oncofetal antigen: the alpha-fetoprotein receptor // Tumor Biol.- 1993.- 14,- P. 116-130.

122. Modjtahedi H., Dean Ch. The receptor for EGF and its ligands: expression, prognostic value and target for therapy in cancer // Int. J. Oncol.- 1993,- 4,- P. 277-296.

123. Ennis B.W., Lippman М.Е., Dickson R.B. The EGF receptor system as a target for antitumor therapy // Cancer Investigation.-1991,- Vol. 9,- 5,-P. 553-562.

124. Wells A. EGF receptor // IJBCB.-1999.- 31.- P. 637-643.

125. Никольский Н.Н., Соркин А.Д., Сорокин А.Б. Эпидермальный фактор роста //- JI.: Наука.- 1987,- 200 с.

126. Neelam B., Richter A., Chamberlin S.G. et al. Structure-function studies of ligand-induced epidermal growth factor receptor dimerization // Biochemistry.- 1998.- Vol. 37,-14.- P. 4884-4891.

127. Cochet C., Filhol O., Payrastre B. et al. Interaction between the epidermal growth factor receptor and phosphoinositide kinase // J. biol. Chem.-1991,- Vol. 266.-P. 637-644.

128. Whitman M., Cantley L. Phosphoinositide metabolism and control of cell proliferation // Biochim. biophys. Acta.- 1988.- Vol. 948,- P. 327344.

129. Sasaoka N., Langlois W.J., Draznin B. et al. The signalling pathway coupling epidermal growth factor recepror to activation of p21ras // J. biol. Chem.- 1994.- Vol. 269,- P. 32621-32625.

130. Marais R., Marshall C.J. Control of the ERC MAP kinase cascade by Ras andRaf// Cancer Surv.- 1996,- Vol. 27,- P. 101-125.

131. Das R., Vouderhaar B.K. Tamoxifen inhibits prolactin signal transduction in ER-NOG-8 mammary epithelial cells // Cancer Lett.-1997,- Vol. 116,-P. 41-46.

132. Cotter F.E., Pocock C.F. In vivo modelling and antisense therapy in malignancy //UCLMol. Path. Ser.- 1996.- Vol. 3.-P. 161-189.

133. Gutowski M. C., Briggs S. L., Johnson D. A. Epidermal Growhth factor receptor-reactiv monoclonal antibodies: Xenograft antitumor activity alone and as drug immunoconjugates // Cancer Res.- 1991.- Vol. 51.- P.5471-5475.

134. Wei H., Barnes S., Wang Y. Inhibitory effect of genistein on a tumor promoterinduced c-fos and c-jun expression in mouse scin // Oncol. Rep.- 1996.- Vol. 3.-P. 125-128.

135. Liao C.W., Hseu T.H., Hwang J. A target-specific chimeric toxin composed of epidermal growth factor and Psedomonas exotoxin A with adeletion in its toxin-bindihg domain // Appl. Microbiol. Biotechnol.-1995.-Vol. 43.-P. 498-507.

136. Кушлинский H.E., Герштейн E.C. Клинические перспективы исследования рецептора эпидермального фактора роста в опухолях человека//Клин.лаб.д-ка.- 1996,-1,- С. 9-12.

137. Carpentier J.-L., White М. F., Orel L., Kahn R. С. Direct visualization of the phosphorylated epidermal growth factor receptor during its internalization in A431 cells // J. Cell Biol.- 1987.- Vol. 105,- P. 27512762.

138. Miller K., Beardmore J. et al. Localization of the epidermal growth factor (EGF) receptor within the endosome of EGF-stimulated epidermoid carcinoma (A 431) cells // J. Cell Biol.- 1986.- Vol. 102,- P. 500-509.

139. Bellet D.H., Wands J.R., Isselbacher K.J., Bohuon С. Serum alpha fetoprotein levels in human disease: perspective from a highly specific monoclonal radioimmunoassay // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1985,81,- P. 3869-3873.

140. Deutch H.F. Chemistry and biology of alpha-fetoprotein // Cancer Res.-1991.- 56,-P. 252-267.

141. Mizejewski G.J. a-Fetoprotein as a biologic response modifier: relevance to domain and subdomain structure // J. Exp. Biol. Med.-1997.- 14.-P. 333-362.

142. Mizejewski G.J., Jacobson H.I. Alpha-fetoprotein is a dual regulator of growth in estrogen-responsive tissues // CRS Press, Boca Raton.- 1985.-Florida.-l.-P. 71-82.

143. Fedi P., Tronick S.R., Aaronson S.A. Growth factors // Cancer Medicine, 4-th Ed.- Eds J. Holland et al.- 1997,- P. 41-64.

144. Savage C. R., Cohen S. Epidermal growth factor and a new derivative: rapid isolation procedures and biological and chemical characterization // J. Biol. Chem.- 1972,- Vol. 247.- P. 7609-7611.

145. Hollenberg M. D., Gregory H. Epidermal growth factor-urogastrone: biological activity and receptor binding of derivatives // Mol. Pharmacol.-1980.- Vol. 17,-P. 314-320.

146. Иващенко Ю.Д, Быкорез А.И. Полипептидные факторы роста и канцерогенез // Киев, Наукова думка, 1990.- 191с.

147. Taylor J.M. et al. Epidermal growth factor. Physical and chemical properties // J. Biol. Chem.- 1972,- Vol. 247,- P. 5928-5934.

148. Mayo К. H. Epidermal growth factor from the mouse. Structural characterization by proton nuclear magnetic resonance and nuclear Overhauser experiments at 500 MHz // Biochemistry.- 1984,- Vol. 23,-P. 3960-3973.

149. Komoriya A., Hortsch M., Meyers C., Smith M., Kanety H., Schlessinger . Biologically active synthetic fragments of epidermal growth factor: localization of a major receptor-binding region // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1984.- Vol. 81.- P. 1351-1355.

150. Matrisian L. M., Larsen B. R., Finch J. S., Magun В. E. Further purification of epidermal growth factor by HPLC 7/ Anal. Biochem.-1982,-Vol. 125,-P. 339-351.

151. Лобанова В.В. Возможность получения эпидермального фактора роста в различных системах экспрессии генов // Биотехнология,-1997,-5.-С. 3-9.

152. Cawley D.B., Herschman H.R., Gilliand D.G., Collier R.G. Epidermal growth factor-toxin A chain conjugates // Cell.- 1980,- Vol. 22,- P. 563570.

153. Haigler И. Т., Wiley H. S., Moehring H., Moehring J. M. Altered degradation of epidermal growth factor in a diphtheria toxin-resistant clone of KB cells // J. Cell. Physiol.- 1985.- Vol. 124.- P. 322-330.

154. Hurwitz E., Levy, R., Mavon R. et al. The covalent binding of daunomycin and adriamycin to antibodies with retention of both drug and antibody activities // Cancer Res.- 1975,- Vol. 35.- P. 1175-1181.

155. Shen W. G., Ryser J. P. cis-Aconityl spacer between daunomycin and macromolecular carriers: A model of pH sensitive linkage releasing drug from a lisosomotropic conjugate // Biochem. Biophys. Res. Commun-1981,-Vol. 102.-P. 1048-1054.

156. Mueller В. M., Wrazidlo W. A., Reisfeld R. A. Antibody cojugates with morfolynodoxorubicin and acid cleavable linkers // Bioconj. Chem.-1990,-Vol. 1,-P. 325-330.

157. Severin S.E., Moskaleva E.Yu., Posypanova G.A. et al. In vivo antitumor activity of cytotoxic drugs conjugated with human a-fetoprotein // Tumor targeting.- 1996,- 2,- P. 299-306.

158. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem.- 1951,- 193- P. 265-275

159. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature.- 1970,- 221.- P. 680-685.

160. Atherton Е.Е., Sheppard R.S. Solid phase peptide synthesis. A practical approach // IRL Press at Oxford University Press.- 1989.

161. Hash J.H. Liquid scintillation counting in micribiology // In: Methods in microbiology, 6B, J.R. Norris, D.W. Ribbons (eds.).- Academic Press, New York.- 1972,- Chap. 5.

162. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assays // J. Immunol. Meth.-1983,- 65,-P. 55-63.

163. Jinno H., Masakazu U., Ozawa S. et al. Epidermal growth factor receptor-dependent cytotoxic effect by an EGF-ribonuclease conjugate on human cancer cell lines // Cancer Chemother. Pharmacol.- 1996,- Vol. 38,- P. 303-308.

164. Arap W., Pasqualini R., Ruoslahti E. Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse model // Science.-1998,- Vol. 279.- 16,-P. 377-380.112