Использование белковых и пептидных векторов для избирательной доставки противоопухолевых препаратов и терапевтических олигонуклеотидов в опухолевые клетки

Посыпанова, Галина Ароновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование белковых и пептидных векторов для избирательной доставки противоопухолевых препаратов и терапевтических олигонуклеотидов в опухолевые клетки
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Использование белковых и пептидных векторов для избирательной доставки противоопухолевых препаратов и терапевтических олигонуклеотидов в опухолевые клетки"

На правах рукописи

ПОСЫПАНОВА ГАЛИНА АРОНОВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕЛКОВЫХ И ПЕПТИДНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ИЗБИРАТЕЛЬНОЙ ДОСТАВКИ

ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ И ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ

03.01.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 о ДПР 2013

Москва-2013

005052311

Работа выполнена в Курчатовском центре нано-, био-, информационных, когнитивных, социогуманитарных наук и технологий, с использованием рентгеновского, синхротронного и нейтронного излучений Федерального государственного бюджетного учреждения Национальный Исследовательский Центр «Курчатовский институт» и в государственном учреждении здравоохранения Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии Департамента здравоохранения г. Москвы

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, член-корр. РАМН, профессор Северин Сергей Евгеньевич

Ярыгин Константин Никитич,

доктор биологических наук, член-корр. РАМН, ФГБУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» РАМН, заведующий лабораторией

Сергеева Наталья Сергеевна,

доктор биологических наук, профессор, ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Росмедтехнологий, заведующая отделением Калинина Елена Валентиновна, доктор биологических наук, доцент, ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов», медицинский факультет, кафедра биохимии, профессор кафедры

Ведущая организация: Московский государственный университет

имени М.В. Ломоносова, биологический факультет.

Защита состоится «23» мая 2013 г. в 11.00 на заседании Диссертационного совета Д 001.010.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «ИБМХ» РАМН) по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д.Ю, стр. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ИБМХ» РАМН

Автореферат разослан » С^? 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Е.А. Карпова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Основными причинами недостаточной эффективности химиотерапевтического лечения онкозаболеваний является низкая биодоступность противоопухолевых агентов для опухоли, необходимость использовать высокие дозы препаратов и неселективный характер этих препаратов. Ограниченное проникновение лекарственных препаратов в биологически гетерогенные опухоли приводит к выживанию части опухолевых клеток, даже после длительного лечения с помощью цитотоксических агентов. Лечение высокими дозами, необходимое для полной ремиссии, является причиной тяжелейших системных побочных эффектов, что зачастую вынуждает прекратить лечение больных. Кроме того, длительное применение химиотерапевтических агентов чревато развитием множественной лекарственной устойчивости, что делает используемые препараты неэффективными. В основе феномена лекарственной устойчивости лежат различные по природе внутриклеточные механизмы, такие как снижение транспорта препаратов через плазматическую мембрану, нарушение уровня экспрессии онкогенов, повреждение систем сигнальной трансдукции и др. Для повышения эффективности терапии опухолей необходимо увеличение избирательности действия лекарственных препаратов. Здесь можно выделить 2 направления: разработка новых высокоселективных препаратов и создание новых систем регулируемого транспорта хорошо известных противоопухолевых соединений в клетки-мишени.

Избирательность действия лекарственного препарата может быть повышена за счет использования в системах доставки адресных агентов -молекул, способных связываться со специфическими детерминантами на поверхности клеток. Таким образом, использование адресного компонента определяет взаимодействие системы избирательной доставки со строго определенными клетками и тканями, в частности, опухолевыми. В качестве адресных агентов, или векторов, могут выступать физиологические лиганды рецепторов факторов роста или онкофетальных белков, т.е. сами факторы роста и онкофетальные белки. Противоопухолевый препарат может быть соединен с вектором ковалентно с образованием конъюгата, либо нековалентно, с образованием прочного комплекса. Связывание адресной молекулы со специфическим рецептором на поверхности клетки индуцирует процесс рецептор-опосредованного эндоцитоза, который обеспечивает аккумуляцию опухолевыми клетками лекарственного препарата, молекулярная мишень которого находится внутри клетки.

Необходимо отметить, что в некоторых случаях использование систем избирательной доставки является единственным способом, позволяющим использовать терапевтический потенциал некоторых высокотоксичных противоопухолевых антибиотиков, например, антибиотиков ендиинового ряда. В качестве примера можно привести препарат Милотарг, представляющий собой конъюгат калихемицина XI с гуманизированными антителами к СОЗЗ. Кроме того, применение высокоэффективных систем доставки может существенно повысить терапевтический эффект антисмысловых

олигонуклеотидов, которые, к сожалению, пока не нашли применения в клинической практике.

Успешное решение проблемы направленного транспорта лекарственных препаратов на основе рецептор-опосредованного эндоцитоза определяется, прежде всего, выбором векторной молекулы. Белковые векторы должны удовлетворять ряду основных требований, к числу которых относятся высокая афинность векторов к соответствующим рецепторам на поверхности опухолевых клеток-мишеней, высокая стабильность, возможность их химической модификации путем конъюгирования с химиопрепаратами без потери биологических свойств, доступность белков в препаративных количествах. Указанным требованиям наиболее близко соответствует онкофетальный белок альфа-фетопротеин. Важными факторами при конструировании систем избирательной доставки также являются выбор лекарственного препарата (цитостатика, фотосенсибилизатора, антисмыслового олигонуклеотида) и линкера, соединяющего адресный и цитотостатический компоненты. Скрининг созданных конструкций в системе in vitro и изучение их внутриклеточного поведения позволяет выявить наиболее оптимальные варианты систем доставки.

Целью настоящей работы являлась разработка принципов создания систем избирательной доставки противоопухолевых препаратов и терапевтических олигонуклеотидов в опухолевые клетки на основе природных и рекомбинантных белков и пептидов и выявление закономерностей, определяющих их эффективность.

Задачи исследования:

> Выбор белковых и пептидных векторных молекул для избирательной доставки противоопухолевых препаратов и антисмысловых олигонуклеотидов;

> Создание конструкций для избирательной доставки противоопухолевых препаратов в клетки-мишени на основе альфа-фетопротеина и его пептидных фрагментов,

> Исследование интернализации и внутриклеточного распределения препаратов в зависимости от типа конструкции для оптимизации систем доставки;

> Разработка подходов к преодолению множественной лекарственной устойчивости с использованием систем направленной доставки;

> Разработка конструкций на основе альфа-фетопротеина и эпидермального фактора роста для избирательной доставки антисмысловых олигонуклеотидов и оценка их эффективности.

Научная новизна и практическая значимость.

Доказано наличие рецепторов АФП как на поверхности клеток опухолевых линий человека, так и на гистологических срезах злокачественных опухолей человека (яичника, молочной железы, печени, желудка, кишечника). На срезах доброкачественных опухолей и нормальных тканей, а также на поверхности покоящихся лимфоцитов, выделенных из крови здоровых добровольцев, рецептор АФП не обнаружен. Таким образом, рецептор АФП может быть использован в качестве опухолевого маркера для широкого спектра

злокачественных опухолей, а антитела к рецептору - для диагностики опухолей.

Сформулирована и разработана концепция системы адресной доставки биологически активных соединений в клетки-мишени с использованием в качестве адресного мотива АФП и его пептидных фрагментов.

Разработаны методы, позволяющие в экспериментах in vitro в культурах клеток прогнозировать эффективность препаратов избирательного действия.

Впервые обнаружено, что рекомбинантный С-концевой фрагмент АФП (с 357 по 590 а.о.) специфически связывается с рецептором АФП, эндоцитируется опухолевыми клетками подобно АФП и аналогично АФП ингибирует эстрадиол-индуцированный рост гормонозависимых опухолевых клеток. Таким образом, данный рекомбинантный белок может быть использован в качестве векторной молекулы в системах адресной доставки.

Созданы генные конструкции для индуцированного биосинтеза С-концевых фрагментов АФП в E.coli. Разработаны высокоэффективные методы выделения рекомбинантных фрагментов АФП.

Впервые показана способность биологически активного фрагмента АФП - октапептида GIP8 (472-479 а.о.) избирательно связываться с поверхностью опухолевых клеток, с высокой эффективностью интернализоваться ими, что открывает возможность использования GIP8 в качестве вектора в системах адресной доставки.

Доказана эффективность и избирательность противоопухолевого действия конъюгатов АФП, АФП-ЗВС и GIP8 in vitro в отношении клеточных линий широкого спектра опухолей человека. Изучены закономерности их внутриклеточной транслокации, продемонстрирована зависимость эффективности действия конъюгатов от лабильности химической связи между белком и цитостатическим агентом.

При использовании систем адресной доставки на основе АФП обнаружена возможность преодоления множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток, обусловленной активностью Pgpl70

Впервые продемонстрирована высокая противоопухолевая эффективность конъюгата АФП с эсперамицином Alb in vivo.

Разработаны системы избирательной доставки терапевтических олигонуклеотидов и продемонстрирована принципиальная возможность и перспективность использования белковых векторов (АФП и эпидермального фактора роста) для их адресной доставки в опухолевые клетки.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Рецептор альфа-фетопротеина является уникальным опухолеспецифическим антигеном, который присутствует на поверхности опухолевых клеток и отсутствует у большинства нормальных клеток.

2. Рецептор альфа-фетопротеина может служить мишенью для избирательной противоопухолевой терапии. Связываясь специфически со своим рецептором, альфа-фетопротеин интернализуется опухолевыми клетками вместе с ковалентно присоединенными к нему молекулами

лекарственных соединений, обеспечивая, таким образом, избирательную доставку препаратов в опухолевые клетки.

3. Использование систем адресной доставки на основе альфа-фетопротеина позволяет преодолеть множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток, обусловленную АВС-транспортерами плазматической мембраны.

4. Рекомбинантные фрагменты альфа-фетопротеина, содержащие рецептор-связывающий мотив, могут быть использованы в системах избирательной доставки вместо полноразмерного природного белка.

5. Применение белковых векторов (АФП и эпидермального фактора роста) позволяет значительно повысить эффективность внутриклеточной доставки антисмысловых олигонуклеотидов.

Личный вклад автора.

Личный вклад автора состоит в разработке идеи, организации и проведении экспериментальных исследований, анализе, обобщении и интерпретации полученных результатов. Все эксперименты с культурами клеток выполнены непосредственно автором.

Апробация работы.

Основные результаты работы были доложены на V International Symposium on Biology and Clinical Usefulness of Tumor Markers (1995, Barcelona, Spain), XVI Intern. Congress of Clinical Chemistry, (1996, London), The interdependence of Tumor Biology and Clinical Oncology (1996, Coronado, USA) , p. 121.Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM) (1996, 1997, 1998, 1999, 2000, 2001, 2005), The European cancer conference ECCO (1997, France), Российском Национальном конгрессе "Человек и лекарство" (2000, 2005, Москва), 37th Annual Scientific Meeting of the European Society for Clinical Investigation (2003, Verona, Italy), 1st EUFEPS Conference on Optimising Drug Delivery and Formulation: New Challenges in Drug Delivery (2003, Versailles, France), The 5th ISTC/Korea workshop on biotechnology (2004, Chungbuk, Korea), World Conference on Magic Bullets (2004, Nurnberg, Germany), международной конференции Молекулярная медицина и биобезопасность (2005, Москва), III Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (2005, Москва), Московской международной конференции "Биотехнология и медицина" (2006, Москва), 19th Meeting of the European Association for Cancer Research (EACR), Budapest, Hungary, July 1-4, 2006, конференции "Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)" (2006, Ростов-на-Дону), I международной научно-практической конференции "Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине" (2010, Москва).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 34 статьи, из них 30 в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 4 патента, 42 публикации в материалах Российских и зарубежных конференций.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 256 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы, который включает 406 источников. Диссертация содержит 94 рисунка и 14 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Настоящая работа посвящена созданию препаратов избирательного действия, представляющих собой бифункциональные молекулы и комплексы. В состав таких конструкций входит адресный (целевой) домен, обеспечивающий взаимодействие с опухолевыми клетками, соединенный ковалентно или нековалентно с терапевтическим агентом - противоопухолевым препаратом.

В результате настойчивого поиска оптимальной векторной молекулы, удовлетворяющей основным требованиям, предъявляемым к адресным компонентам систем доставки, мы сосредоточили усилия на онкофетальном белке альфа-фетопротеине (АФП). Этот белок с молекулярным весом 68 кДа структурно схож с сывороточным альбумином, но по ряду свойств радикально от него отличается. АФП обладает высокой консервативностью, стабильностью в физиологических условиях. По литературным данным ряд опухолей человека (карциномы молочной железы, лимфомы, гепатомы) экспрессируют на своей поверхности специфические рецепторы АФП (АФПР). Необходимо было уточнить эти данные, определить спектр опухолей, положительных по АФПР, исследовать рецептор-опосредуемый процесс интернализации АФП и определить потенциал АФП как векторной молекулы. Следующим этапом являлось непосредственно создание описанных выше систем избирательной доставки - синтез ковалентных конъюгатов, оценка их противоопухолевой активности и выявление закономерностей, модулирующих активность терапевтических агентов. В частности, важным аспектом работы являлось изучение эффективности аккумуляции препаратов опухолевыми клетками и их внутриклеточной локализации.

ОСНОВНЫЕ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клеточные культуры. В экспериментах использовали следующие линии клеток человека: аденокарциномы молочной железы MCF7 и MCF-7AdrR, аденокарциномы яичника человека SKOV3 и SKVLB (MCF7AdrR и SKVLB -резистентные линии, экспрессирующие MDR1), гепатоцеллюлярная карцинома HepG2, карцинома шейки матки HeLa, карцинома предстательной железы Du 145, лимфомы Беркитта Raji и Namalwa, Т-клеточные лимфомы Jurkat и СЕМ, миелобластный лейкоз К562, остеосаркома Mg63, фибросаркома НТ1080, аденокарцинома прямой кишки SW837, аденокарцинома ободочной кишки Сасо-2, меланома SK-MEL-1; а также линии клеток мыши: меланома В16, лейкоз Р388, эмбриональные фибробласты ЗТЗ. Линии MCF7AdrR, SKOV3 и SKVLB были любезно предоставлены доктором В.Ю. Алаховым (Supratek Pharma, Inc. Квебек, Канада). Остальные клеточные линии были полученны из АТСС (США), РККК П (Россия) и Банка клеток МНИИМЭ. В качестве

контрольных клеток использовали лимфоциты периферической крови здоровых добровольцев.

Животные. В работе использовали гибридных мышей BDFi (C57BL/6 х DBA/2) и мышей линии DBA/2 массой 18-20 г. Противоопухолевую активность препаратов изучали на модели перевиваемой опухоли лимфоцитарного лейкоза мышей Р388. Для индукции опухолей мышам вводили клеточную суспензию подкожно (2x105 клеток в 0,1 мл физиологического раствора) в область левой лопатки. Препараты вводили, начиная с 3 дня после прививки опухолей в 0,1 мл физиологического раствора. Контрольным животным вводили физиологический раствор. Каждая опытная группа состояла из 6 мышей, контрольная - из 10 животных. Эксперименты проводились в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН (с участием З.С. Смирновой) и в МНИИМЭ (с участием Н.Б. Фельдман).

Методы исследования.

Получение белков. АФП человека выделяли из ретроплацентарной сыворотки рожениц с использованием моноклональных антител (МАт) к АФП с помощью аффинной, ионообменной и гель-фильтрационной хроматографии. Рекомбинантные С-концевые фрагменты АФП гАФП27 (аминокислотные остатки с 357 по 590) и АФП-ЗВС (аминокислотные остатки с 454 по 577) получали путем экспрессии плазмид pAFP28D3 и pAFP3BC в E.coli. Белки из биомассы штаммов-продуцентов выделяли с помощью металлохелатной, ионообменной и гель-фильтрационной хроматографии. Рефолдинг белков проводили путем медленной ренатурации. Белки были охарактеризованы с помощью ВЭЖХ (рис. 1), электрофореза в ПААГ; гАФП27 был также охарактеризован с помощью масс-спектрометрии (рис. 2) и пептидного секвенирования. Рекомбинантный белок PGEk (Protein Gen-carrier based on Epidermal Growth Factor, 64 аминокислотных остатка), содержащий природный эпидермальный фактор роста человека и олигокатионную последовательность сигнала ядерной локализации KKKKRKVEDPY на N-конце, был любезно предоставлен Г.Е. Позмоговой. Пептид GIP8 (EMTPVNPG, аминокислотные остатки 472-479 АФП человека) был синтезирован с помощью твердофазного пептидного синтеза и охарактеризован с помощью масс-спектрометрии и пептидного секвенирования.

Синтез конъюгатов. Синтез конъюгатов белков и пептида с ДОКС осуществляли с использованием коммерческих линкеров: сукцинимидного эфира 3-(2-пиридилдитио)пропионовой кислоты (SPDP), глутарового альдегида (GA), гидразида 3-малеимидобензойной кислоты (Hyd); гидразида е-малеимидокапроновой кислоты (ЕМСН), гидразида 3-(2-пропидилдитио)пропионовой кислоты (PDPH). Конъюгаты АФП с дауномицином (DM), блеомицином (ВМ), цисплатином (CisPt), карбоксифосфамидом (CPA), винбластином (Vb) метотрексатом (MTX) синтезировали с помощью 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида (EDC). Для синтеза конъюгатов АФП с дисульфохлоридами фталоцианинов алюминия (А1Фц) и кобальта (СоФц) дополнительные линкеры не использовали. Конъюгаты АФП с калихеамицином (Cal) и эсперамицином Aib

(EsA), а также конъюгат GIP8 с EsA, синтезировали с использованием SPDP. Конъюгаты альбумина (HSA), трансферрина (Tri) и полиэтиленгликоля 20000 (PEG20) с ДОКС, синтезированные с использованием Hyd были любезно предоставлены доктором F. Kratz (Tumor Biology Center, Фрайбург, Германия). Конъюгаты АФП с антисмысловыми олигонуклеотидами (ASON) синтезировали с использованием SPDP и ЕМСН. Полученные конъюгаты с указанием векторных белков, цитостатических агентов, линкеров и сокращенного названия приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Синтезированные конъюгаты с указанием векторных белков, цитостатиков и линкеров.

Векторная Цитостатик, ASON Линкер Сокращенное

молекула (белок пептид, полимер) название конъюгата

АФП Доксорубицин (ДОКС) Hyd AФП-Hyd-ДOKC, АФП-ДОКС

АФП ДОКС SPDP АФП-БРОР-ДОКС

АФП ДОКС GA АФП-ОА-ДОКС

HSA ДОКС Hyd HSA-ДОКС

Trf ДОКС Hyd Trf-ДОКС

PEG20 ДОКС Hyd РЕС20-ДОКС

АФП-ЗВС ДОКС SATA, ЕМСН АФП-ЗВС-ДОКС

GIP8 ДОКС PDPH С1Р8-ДОКС

АФП Дауномицин (ОМ) EDC АФП-DM

АФП Блеомицин (ВМ) EDC АФП-ВМ

АФП Цисплатин (ФэРО EDC АФП-CisPt

АФП Карбоксифосфамид (СРА) EDC АФП-СРА

АФП Фталоцианин алюминия (А1Фц) АФП-А1Фц

АФП Фталоцианин кобальта (СоФц) АФП-СоФц

АФП Калихеамицин (Са1) SPDP АФП-Са1

АФП Эсперамицин А1Ь (ЕБА) SPDP АФП-EsA

GIP8 ЕЭА SPDP GIP8-ESA

АФП тусА80№ SPDP, EMCH ЛФП-mycASONs

АФП Ьс1-2А80№ SPDP, EMCH A®n-bcl-2ASONs

АФП ТМОв SPDP, EMCH АФП-TMOs

АФП согиго10№ SPDP, EMCH АФП-controlONs

антитела к рецептору АФП (АФПР, клон 2В8) и биотин-стрептавидиновую систему DAKO LSAB®2 System (Peroxidase, DAB).

Внутриклеточное содержание белков с-Мус, Вс1-2 и Pgpl70 оценивали с помощью методов Western blot, проточной цитометрии и иммуноцитохимии с использованием моноклональных антител к этим белкам.

Пролиферативную активность клеток оценивали по включению [3Н]-тимидина в ДНК.

Противоопухолевую активность конъюгатов in vitro определяли, анализируя выживаемость клеток с помощью МТТ-теста и с помощью окрашивания клеток сульфородамином В. Тестируемые препараты добавляли в широком диапазоне концентраций, по результатам фотометрического измерения строили кривые выживаемости и определяли значение IC50 — концентрацию препарата, при которой выживает 50% клеток.

Исследование противоопухолевой активности препаратов in vivo. Растворы конъюгатов АФП с ДОКС в физиологическом растворе вводили мышам внутривенно на 2, 6 и 10 сут. после инокуляции опухоли в дозах 0,3, 0,6 и 1,2 мг/кг в пересчете на ДОКС. Препаратом сравнения служил свободный ДОКС, который вводили в эквимолярных конъюгатам дозах и в терапевтической дозе 2,5 мг/кг при трехкратном введении. Растворы конъюгатов АФП с EsA вводили в дозах 0,75; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 мкг/кг (по EsA) подкожно 5 дней подряд. После двухдневного интервала следовали 5 ежедневных внутривенных инъекций. Препаратом сравнения служил свободный EsA, который вводили в эквимолярных конъюгатам дозах. Эффективность терапии оценивали по ингибированию роста опухолей, используя в качестве показателей изменение объема опухолей. Объем опухоли вычисляли по формуле: У=а2*Ь»я/6, где а - короткий, Ъ - длинный диаметр опухоли. Относительный размер опухоли (ОРО) вычисляли по формуле: ОРО=Р01/РК'ЮО%, где Роп — средний размер опухолей в опытной группе, Рк — средний размер опухолей у контрольных животных. Увеличение продолжительности жизни животных в опытных группах по сравнению с контрольной рассчитывали по формуле: УПЖ=(СПЖО1/СПЖк-1)»100%, где СПЖ - средняя продолжительность жизни животных(сут), оп - опытная группа, к - контрольная группа.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием /-критерия Стьюдента. Для построения графиков и статистической обработки использовали программы OriginPro 7.5 (OriginLab Corporation) и Statistica 8 (StatSoñ).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Исследование экспрессии рецептора альфа-фетопротеина в опухолевых клетках человека.

Выбор АФП в качестве векторного белка при создании систем избирательной доставки биологически активных соединений в опухолевые клетки подразумевает, что клетки-мишени экспрессируют рецепторы к этому белку на своей поверхности. В литературе содержится информация только о

наличии рецептора на поверхности ограниченного количества опухолей человека. Поэтому мы исследовали экспрессию рецептора АФП (АФПР) на поверхности опухолевых клеток линий, которые использовались в экспериментах по испытанию биологической активности конъюгатов на основе АФП, и в некоторых опухолях человека.

Обнаружено, что как Б-АФП, так и Р-МАт к АФПР связывались со всеми опухолевыми клетками и лишь в незначительной степени с лимфоцитами периферической крови здоровых добровольцев. Количество АФПР на поверхности опухолевых клеток и Ка для АФП, рассчитанные с помощью метода обратных координат Скэтчарда представлены в таблице 2).

Таблица 2.

Количество сайтов связывания МАт к АФПР (клон 2В8) и АФП для некоторых линий опухолевых клеток человека.

Линия клеток Количество АФПР на поверхности клетки

МАт АФП

НеЬа 100 ООО 260 000 (Кй 1.2 х 10"7 М)

вКОУЗ 207 ООО 440 000 (К<) 6.4 х 10"7 М)

МСР7 300 000 ЗЮ000(КаЗх 10"6М)

175 000 580 000 (Кд 8,9 х Ю-6 М)

180 000 420 000 (Ка 4,8 х 10"7 М)

НерС2 400 000 450 000 (Ка 4,9 х 10"7 М)

Исследование экспрессии АФПР в тканях злокачественных и доброкачественных опухолей человека, а также в нормальных тканях, выявило присутствие указанного рецептора исключительно в клетках злокачественных опухолей. Наличие АФПР исследовали на гистологических срезах злокачественных и доброкачественных опухолей, а также нормальных тканей, перечисленных в таблице 3, в которой суммированы полученные результаты, (приведена степень окрашивания только для опухолевых клеток, при этом соединительная ткань, нормальные клетки стромы и инфильтрирующие лимфоциты не окрашивались).

Во всех изученных тканях АФПР был обнаружен только в злокачественных интенсивно пролиферирующих опухолевых клетках. В нормальных клетках и доброкачественных опухолях АФПР отсутствовал (рис. 3). Таким образом, экспериментальные данные подтверждают, что АФПР является универсальным опухолеспецифическим антигеном и может служить уникальной мишенью на поверхности опухолевых клеток для избирательной доставки противоопухолевых препаратов.

Таблица 3.

Экспрессия АФПР в нормальных и опухолевых тканях по данным иммуногистохимического исследования с использованием МАт к АФПР.

Орган Тип ткани и опухоли Интенсивность окрашивания

Яичник Здоровый яичник Серозная сосочковая цистаденома Папиллярная серозная цистаденома пограничной злокачественности Серозная сосочковая цистаденкарцинома 0 0 +++ +/++

Печень Нормальная печень вне зоны опухоли Гепатоцеллюлярный рак Холангиоцеллюлярный рак 0 ++/+++ +++/++

Молочная железа Аденокарцинома молочной железы мм

Желудок Молодая скиррозная аденокарцинома. мм

Толстый кишечник Аденокарцинома ++

Легкое Центральный рак Доброкачественный карциноид легкого Нормальный бифуркационный лимфоузел +++/++ 0 0

2. Исследование связывания и эндоцитоза АФП, его рекомбинантного С-концевого фрагмента и синтетического октапептнда опухолевыми и нормальными клетками in vitro.

Успех применения систем избирательной доставки лекарственных препаратов на основе белковых и пептидных векторов определяется особенностями и эффективностью связывания адресного агента со специфическими рецепторами и последующей активацией рецептор-опосредованного эндоцитоза. Поэтому мы исследовали связывание и интенсивность рецептор-опосредованного эндоцитоза выбранных векторных молекул: АФП, его рекомбинантных С-концевых фрагментов гАФП27 и АФП-ЗВС, и синтетического 8-членного фрагмента АФП GIP-8.

Флуоресцентно-меченый АФП (F-АФП) интенсивно связывался опухолевыми клетками человека и мыши при 4°С, но лишь в незначительной степени с лимфоцитами периферической крови человека (рис. 4а). Связывание носило специфический характер и ингибировалось избытком немеченого АФП. Инкубация опухолевых клеток с F-АФП при 37°С приводила к интернализации белка опухолевыми клетками (рис. 46). Аналогичными свойствами обладали рекомбинантные С-концевые фрагменты АФП гАФП27 и АФП-ЗВС (рис. 4). Избыток АФП на 80-90% снижал связывание рекомбинантных белков

Таблица 4.

Сравнение цитоетатической активности свободного EsA и его конъюгата с АФП, оцениваемой по значениям IC50.

Линия клеток 1С5о EsA, нМ 1С50 АФП-EsA, нМ

Карцинома шейки матки HeLa 0,26±0,1 5±0,2

Миелобластный лейкоз К562 0,2±0,1 2,2±0,2

Остеосаркома Mg63 1±0,2 59±1,5

Аденокарцинома простаты Dul45 0,2±0,1 5,3±0,4

Аденокарцинома прямой кишки SW 837 1±0,25 30±1,9

Аденокарцинома ободочной кишки Сасо-2 2,7±0,3 >20

Фибросаркома НТ1080 0,4±0,1 6,5±0,5

Т-клеточная лимфома Jurkat 0,04±0,02 0,2±0,1

Аденокарцинома молочной железы MCF7 0,4±0Д 2,3±0,1

Аденокарцинома молочной железы MCF7 5±0,5 8±0,5

Аденокарцинома яичника SKOV3 2±0,15 6±0,5

Аденокарцинома яичника SKVLB 1,5±0,2 з,з±о,з

Т-клеточная лимфома СЕМ 0,05±0,02 0,09±0,02

В-клеточная лимфома Raji 0,3±0,1 0,14±0,02

В-клеточная лимфома Namalva 0,4±0,04 0,35±0,1

Меланома SK-MEL-1 >5 >5

Мононуклеарные лейкоциты 0,04±0,02 4,2±0,04

20-

15-

10-

—■— контроль -о—ДФП-EsA -A- EsA

.А-

10 15 20 25 30 35 Дни после прививки опухоли

Рис. 11. Влияние конъюгата АФП-ЕвА на развитие солидных опухолей лейкоза Р388 у мышей БВА/2 при сочетании подкожного и внутривенного введения в дозе 2,5 мкг/кг (по ЕбА).

Таблица 5.

Влияние ЕбА и конъюгата АФП-ЕэА на продолжительность жизни мышей с солидными опухолями лейкоза Р388. СПЖ - средняя продолжительность жизни, УПЖ - увеличение средней продолжительности жизни.

Доза (по EsA), мкг/кг СПЖ, дни (Min-Max) УПЖ, %; СПЖ, дни (Min-Max) УПЖ, %;

EsA Конъюгат АФП-EsA

0 (физ. раствор) 25,4±1,2 0 0/6** 25,4±1,2 0 0/6**

0,75 30,0±1,7 18,1 0/6** 33,2±2,5 26,8 0/6**

1,0 32,0±2,2 26,0 0/6** 36,2±2,7 42,5 0/6**

1,5 33,8±1,9 33,1 0/6** 36,8±3,0 44,9 0/6**

2,0 36,2±2,2 42,5 0/6** 46,2±21,2* 81,9* 1/6**

2,5 39,8±1,7 56,7 0/6** 56,5±26,1* 122,4* 2/6**

3,0 51,0±19,3* 100,1* 1/6** 67,0±25,4* 163,8* 3/6**

* - вычислено на 90-й день эксперимента

** - выживших в группе к 90-му дню эксперимента

5. Исследование эффективности конъюгатов АФП с некоторыми другими противоопухолевыми препаратами in vitro.

Конъюгаты АФП с дауномицином (DM), блеомицином (ВМ), цисплатином (CisPt), карбоксифосфамидом (CPA), винбластином (Vb) метотрексатом (MTX) и калихеамицином (Cal) проявляли значительную антипролиферативную активность (рис. 12а). Ингибирование пролиферации клеток носило дозозависимый характер и значительно превышало активность свободных препаратов. Аналогичные результаты были получены при исследовании фотоцитотоксической и хемиоцитостатической активности конъюгатов АФП с фталоцианинами А1Фц и СоФц. Использование АФП для адресной доставки препаратов в опухолевые клетки позволило in vitro увеличить эффективность действия А1Фц на 3 порядка, а СоФц - в 20-75 раз.

Следует отметить избирательность действия конъюгатов цитостатиков с АФП: цитостатическая активность конъюгатов для мононуклеарных лейкоцитов периферической крови была в 10-1000 раз ниже, чем для опухолевых клеток (рис. 126).

Рис. 12. Сравнение цитотостатической активности конъюгатов и свободных препаратов через 72 ч инкубации с клетками лимфобластомы человека линии QOS. а) ингибирование пролиферации клеток, обработанных конъюгатами АФП с цитостатиками в сравнении со свободными препаратами. Концентрация препаратов составляла 0,15 нМ для Cal и АФП-Са1, 150 нМ для А1ФЦ и СоФц и 15 нМ для остальных соединений; б) сравнение цитостатической активности конъюгата АФП-СоФц для клеток линии QOS и лимфоцитов периферической крови человека.

6. Исследование эффективности применения рекомбинантного С-концевого фрагмента АФП АФП-ЗВС и октапептида С1Р8 в качестве векторных молекул.

Конъюгат АФП-ЗВС с ДОКС получали с помощью реакции конденсации гидразона ДОКС с тиолированным белком. Образовавшаяся гидразоновая связь стабильна при нейтральных рН, но при рН<6,5 ДОКС высвобождается из конъюгата в немодифицированном виде. В результате рецептор-опосредованного эндоцитоза АФП-ЗВС (как и АФП) попадает в эндолизосомальный компартмент клетки (рис. 13), кислый рН которого способствует гидролизу гидразоновой связи и высвобождению ДОКС.

При анализе локализации ДОКС в клетках (по флуоресценции ДОКС) после инкубации клеток МСР7 с конъюгатом АФП-ЗВС-ДОКС обнаружено, что после 4 ч инкубации флуоресценция наблюдается преимущественно в цитоплазме, в то время как свободный ДОКС быстро накапливается в ядрах. Это вполне ожидаемо и закономерно. Гидролиз гидразоновой связи при рН 5,0 (значение рН в лизосомах) проходит полностью через 4 ч (ВгаБкшвку, 1991). При более высоких значениях рН (5,5-6), характерных для поздних и сортирующих эндосом), процесс идет еще медленнее. Таким образом, можно ожидать, что и цитостатический эффект конъюгата будет проявляться медленней по сравнению со свободным ДОКС. Действительно, после 48 и 72 ч инкубации клеток аденокарциномы молочной железы человека линии МСР7 с

Ш ' %

Рис. 13. Внутриклеточная локализация ДОКС в клетках МСР7 после 4 ч инкубации с АФП-ЗВС-ДОКС. а) флуоресценция ДОКС, б) фазовый контраст, в) поздние эндосомы и лизосомы, окрашенные Р1ТС-мечеными антителами к ЬАМР2), г) наложение (а) и (в). Конфокальная микроскопия, срез через середину клетки по высоте.

АФП-ЗВС-ДОКС и ДОКС цитостатическая активность ДОКС, оцениваемая по значению 1С50, превышала активность конъюгата в 10 и 5 раз соответственно (данные не приведены). Увеличение времени инкубации до 96 ч привело к более выраженному проявлению цитостатической активности конъюгата (рис. 14).

Рис. 14. Выживаемость клеток аденокарциномы молочной железы человека линии МСР7 после 96 ч инкубации с конъюгатом АФП-ЗВС-ДОКС и свободным ДОКС.

0,01 0,1 1

Концентрация ДОКС, мкМ

1СЯ, мкМ I- ДОКС 0.042

»-АФП-ЗВС-ДОКС 0.08

Конъюгат GlР8-ДОКС синтезировали по той же методике, что и АФП-ЗВС-ДОКС. Конъюгат проявлял существенную избирательность действия, проявляя высокую цитостатическую активность в отношении опухолевых клеток in vitro, сравнимую с активностью свободного ДОКС (рис. 15а). В то же время, для мононуклеарных лейкоцитов цитостатическая активность GIP8-ДОКС была значительно ниже (не менее чем на порядок) активности свободного антибиотика (рис. 156). Аналогичные результаты были получены при исследовании цитостатической активности конъюгата GIP8 с EsA. В то время как активность конъюгата GIP8-EsA для клеток аденокарциномы молочной железы MCF7 была ровно такая же, как у EsA, для мононуклеарных лейкоцитов цитостатическая активность конъюгата была на порядок ниже активности свободного EsA.

Рис. 15. Выживаемость клеток аденокарциномы молочной железы линии МСЕ7 (а) и мононуклеарных лейкоцитов периферической крови (б) после 72 ч инкубации с С1Р8-ДОКС и ДОКС.

Исследование внутриклеточного распределения ДОКС через 1 ч инкубации опухолевых клеток с конъюгатом 01Р8-Д0КС выявило локализацию антибиотика в цитоплазме и частично в ядрах клеток (рис. 16в, 16г). С увеличением времени инкубации красная флуоресценция ДОКС наблюдалась преимущественно в ядрах клеток (рис. 16, д-з). По-видимому, внутриклеточный транспорт С1Р8-ДОКС отличается от такового для АФП-ДОКС или АФП-ЗВС-ДОКС.

Накопление в опухолевых клетках 01Р8-Д0КС происходило достаточно быстро. Уже через 15 мин инкубации клеток с конъюгатом при 37°С наблюдалось заметное усиление флуоресценции ДОКС в опухолевых клетках, что свидетельствует о накоплении в них конъюгата (рис. 17).

Рис. 16. Накопление ДОКС в клетках аденокарциномы яичника человека БКОУЗ через 1 ч (в, г), 4 ч (д, е) и 24 ч (ж, е) инкубации с конъюгатом в1Р8-ДОКС. а, б - контрольные клетки, а, в, д, ж - флуоресцентная микроскопия, б, г, е, з - фазово-контрастная микроскопия.

Эффективность этого процесса зависела от линии опухолевых клеток, но во всех рассмотренных случаях накопление GIPS-ДОКС превышало накопление свободного ДОКС в 2,5 - 15 раз. В отличие от опухолевых клеток, в лимфоцитах периферической крови накопление GIPS-ДОКС практически не отличалось от накопления ДОКС за это же время. Следует отметить, что результаты по накоплению GIPS-ДОКС в опухолевых клетках и лимфоцитах хорошо коррелируют с данными по накоплению F-GIP8 (рис. 6). Через 1 ч инкубации клеток с ДОКС и GIPS-ДОКС накопление как свободного ДОКС, так и ДОКС в составе конъюгата с GIP8 значительно возрастало. При этом разница средних значений интенсивности флуоресценции клеток несколько нивелировалась (в опухолевых клетках накопление конъюгата превышало накопление свободного ДОКС в 2-9 раз) (рис. 18). Несмотря на то, что накопление ДОКС и GIPS-ДОКС в нормальных лимфоцитах человека также слегка повышалась, разницы при использовании свободного антибиотика и конъюгата не наблюдалось.

Сопоставление данных по эффективности аккумуляции GIPS-ДОКС клетками и цитотостатической активности конъюгата позволяет сделать заключение о перспективности использования пептидного фрагмент АФП GIP8 в качестве вектора для избирательной доставки противоопухолевых препаратов. Заслуживает внимания избирательность действия GIPS-ДОКС: в отношении мононуклеарных лейкоцитов данный конъюгат был в 10 раз менее активен, чем свободный ДОКС.

=Г I Ф гг

о ф

о.

о >.

с;

■а

т ^

1 ф

1,5 1,0 0,5

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

ЭКОУЗ

1,5 1,0 0,5

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 НерС2

0,0

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

1,5 1,0 0,5

0,0

№та1\№а

МСР7

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

1,5 1,0 0,5

,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

0,0-1

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

1,5 1,0 0,5

Лимфоциты

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

'0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Концентрация ДОКС, мкМ

Рис. 17. Накопление доксорубицина в опухолевых клетках человека (аденокарцином яичника БКОУЗ и 8К\'ТВ. аденокарцином молочной железы МСБ7 и МСР7Дс1гК, гепатоцеллюлярной карциномы НерС2, В-лимфомы Ыата1ша, Т-лимфомы 1игка0 и лимфоцитах периферической крови человека за 15 мин инкубации при 37°С клеток с ДОКС (■) и конъюгатом с С1Р8-ДОКС (•). Данные проточной цитометрии.

Рис. 18. Накопление ДО КС в опухолевых клетках человека и лимфоцитах периферической крови за 60 мин инкубации при 37°С с ДОКС и конъюгатом С1Р8-ДОКС. Концентрация ДОКС и 01Р8-Д0КС везде 1 мкМ. Заштрихованные столбики (И) - ДОКС, закрашенные (■) - С1Р8-ДОКС. Данные проточной цитометрии.

5. Исследование внутриклеточной локализации и цитотоксической активности конъюгатов АФП-ДОКС в резистентных линиях клеток.

Резистентные линии клеток аденокарцином молочной железы и яичника человека MCF7AdrR и SKVLB были охарактеризованы по содержанию Pgpl70 с помощью Western-blot (рис. 19), иммуноцитохимии и проточной цитометрии.

12 3

Pgpl70 GADP

Рис. 19. Уровень Pgpl70 (MDR 1) в чувствительных (SKOV3, MCF7) и резистентных (SKVLB, MCF7AdrR) линиях клеток аденокарцином яичника (SKOV3, SKVLB) и молочной железы (MCF7, MCF7AdrR) человека (Western blot). 1 - MCF7AdrR, 2 -MCF7, 3 - SKVLB, 4 - SKOV3.

Накопление свободного ДОКС и его конъюгатов с АФП, НБА и "М в клетках линии МСР7дагК исследовали с помощью проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии после 15 и 60 мин инкубации клеток с препаратами при 37°С.

Накопление свободного ДОКС в клетках МСТ7Л(1г1! было значительно ниже, чем в клетках чувствительной линии МСР7 (таблица 6). ДОКС в составе конъюгатов с указанными белками интернализовался клетками гораздо интенсивней (рис. 20, таблица 6).

Рис. 20. Локализация ДОКС в клетках аденокарциномы молочной железы МСР7А1к!1 через 1 ч инкубации со свободным ДОКС (а, б) и конъюгатом АФП-ДОКС (в, г), а, в - флуоресцентная микроскопия; б, г — фазово-контрастная микроскопия. Концентрация ДОКС везде 1 мкМ.

Так накопление конъюгата НвА-ДОКС в клетках МСР7Д(1гК превышало накопление ДОКС в 2,7-6 раз, ТгЗДОКС - в 2,7-11,3 раз. Наиболее эффективно аккумуляцию ДОКС в резистентных клетках усиливал конъюгат АФП-ДОКС: накопление ДОКС в составе конъюгата превышало накопление ДОКС в 19,6-31 раза. Накопление в клетках как свободного антибиотика, так и его конъюгатов с белками возрастало с увеличением дозы препарата и времени инкубации (таблица 6).

Накопление в резистентных клетках ДОКС сопровождалось увеличением цитостатической активности конъюгатов АФП-ДОКС по сравнению со свободным антибиотиком. На рис. 21 представлены кривые выживаемости резистентных линий клеток МСР7д<1гК и 8КУЬВ, полученные после 72 ч инкубации клеток со свободным ДОКС и конъюгатом. Цитостатическая активность конъюгатов, оцененная по значениям 1С50, превышала активность ДОКС в 20 и 7,5 раз соответственно.

Уровень накопления ДОКС в конъюгатов с НБА, ТгГ и АФП в резистентной (МСР7А'|гК) линий через 15 данным проточной цитометрии.

Таблица 6.

свободном состоянии и в составе клетках чувствительной (МСР7) и мин и 1 ч инкубации с препаратами по

Концентрация ДОКС, мкМ Время инкубации Линия клеток Интенсивность флуоресценции ДОКС, усл. ед.

ДОКС Н8А-ДОКС 1>ЫОКС АФП-ДОКС

0,25 15 мин МСР7 0,07±0,02 0,21 ±0,02 0,08±0,01 0,46±0,05

мср7Дс1гК 0,03±0,01 0,08±0,02 0,08±0,01 0,59±0,04

60 мин МСР7 0,33±0,03 0,41 ±0,03 0,46±0,06 0,95±0,05

МСР7А<1гк 0,04±0,01 0,24±0,03 0,45±0,05 0,88±0,07

0,5 15 мин МСР7 0,17±0,03 0,5±0,04 0,31±0,02 1,51±0,1

мср7АйгК 0,06±0,01 0,36±0,04 0,46±0,03 1,86±0,08

60 мин МСР7 0,72±0,07 1,19±0,09 1,22±0,07 1,69±0,07

мср7Ас1гК 0,1±0,01 0,51±0,06 0,9±0,1 2,18±0,09

N10=7^

Рис 21. Выживаемость резистентных линий клеток аденокарциномы молочной железы МСР7ЛЛК (а) и аденокарциномы яичника 8КУЬВ (б) после 72 ч инкубации с ДОКС и конъюгатом АФП-ДОКС

1-ДОКС 7 Э— АФП-ДОКС 0,93 к*" АФП

................ О'

0,01 0,1 1 10 100 о,

Концентрация ДОКС, мкМ

01 0,1 1 10 100 Концентрация ДОКС, мкМ

"100

I 60

40-I

|с=о-

-■-ДОКС 20 -♦-АФП-ДОКС 1 -Ж-АФП

Полученные результаты позволяют заключить, что ДОКС в составе конъюгата с АФП способен преодолевать множественную лекарственную устойчивость, обусловленную активностью гликопротеина Рар!70 (МОЮ), и

эффективно накапливаться в резистентных клетках MCF7AdrR и SKVLB и вызывать гибель этих клеток.

6. Адресная доставка терапевтических антисмысловых олигонуклеотидов в составе конъюгатов и комплексов с белками.

Среди многочисленных исследований, посвященных разработке новых агентов избирательного действия для опухолевых клеток, особое место занимают антисмысловые олигонуклеотиды (ASON) - короткие (15-25 нуклеотидов) одноцепочечные последовательности ДНК, комплементарные специфическим последовательностям мРНК. В результате гибридизации комплементарных пар оснований ASON и мРНК образуется РНК-ДНК дуплекс и блокируется процесс синтеза целевого белка. Таким образом, применение ASON дает возможность модулировать различные стадии переноса информации от генов к белкам. В экспериментах in vitro и in vivo было убедительно продемонстрирована способность ряда ASON снижать экспрессию целевых генов. Предполагалось, что применение ASON позволит значительно повысить эффективность лечения широкого спектра опухолей. Однако до сих пор ASON не нашли применения в клинической практике. Основной причиной этого является отсутствие адекватной системы доставки ASON в клетки, так как из-за полианионной природы интернализация ASON клетками затруднена.

Мы разработали и испытали in vitro 4 системы избирательной доставки ASON. Адресными доменами, обеспечивающими интернализацию ASON клетками, в этих конструкциях служили АФП, его С-концевой фрагмент и эпидермальный фактор роста (EGF). Системы избирательной доставки представляли собой ковалентные конъюгаты АФП с ASON и нековалентные комплексы AOn-Pl*ASON, PGA*ASON и PGEk*ASON. АФП-PPASON представлял собой комплекс олигонуклеотидов с L-полилизином, ковалентно присоединенным к АФП. Рекомбинантный белок PGA (Protein Gen-carrier based on AFP) был сконструирован на основе рекомбинантного белка гАФП27 с дополнением последовательности с N-конца поликатионным фрагментом -сигналом ядерной локализации KKKKRKVEDPY Т-антигена вируса SV40. Рекомбинантный белок PGEk (Protein Gen-carrier based on Epidermal Growth Factor) был сконструирован на основе эпидермального фактора роста человека, также дополненного мотивом KKKKRKVEDPY. Выбор генов для блокирования экспрессии был обусловлен их ключевой ролью в регуляции клеточной пролиферации и апоптоза. В экспериментах использовали тиофосфатные производные ASON к мРНК с-шус (mycASONs) и bcl-2 (bcl-2ASONs), олигонуклеотиды (ON), имитирующие теломеразные повторы (TMOs), контрольные олигонуклеотиды со случайной последовательностью, соответствующие по размеру используемым ASON (controlONs), а также фосфодиэфирные ON (ТМОо).

Эффективность интернализации ASON в опухолевые клетки исследовали с помощью проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии с использованием флуоресцентно-меченых ASON (F-ASON). Экспериментально продемонстрировано, что применение каждой из трех систем доставки значительно повышало уровень накопления F-ASON в опухолевых клетках

(рис. 22). Вектор АФП-Р1 при кратковременной инкубации (1 ч) оказался неэффективным. По-видимому, это связано с определенной громоздкостью конструкции АФ1 I-Pl*F-mycASONs, что может служить препятствием при реализации рецептор-опосредованного эндоцитоза. Химическое присоединение длинной линейной заряженной молекулы полилизина к АФП может в значительной степени менять свойства белка, а также стерически влиять на доступность рецептор-связывающего участка АФП. Хотя при увеличении соотношения ASONs/белок в комплексе до 1/3 и увеличении времени инкубации до 24 ч эффективность транспорта F-ASONs в составе P1*F-mycASONs повышалась пятикратно, тем не менее, данная конструкция значительно уступала комплексам на основе PGA и PGEk и конъюгату АФП-F-mycASONs.

] F-mycASONs j АФП-PI* F-mycASONs

i ■ PGA'F-mycASONs ЩШ PGEk'F-mycASONs ■ АФП-F-mycASONs

- АФП-PI PGA PGEk АФП Вектор

Рис. 22. Накопление флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов (Р-тус-А80№) в клетках аденокарциномы яичника человека линии БКОУЗ после 1 ч инкубации с конъюгатом АФП-Р-тусАЗО№ и комплексами АФП-Р1*Р-тусА80№, РСА*Р-тусАЗО№, РОЕк*Р-тусА50№. Концентрация Р-тусАЗСЖв и белков везде 200 нМ.

Внутриклеточная локализация Р-А80№ была преимущественно цитоплазматической, но при использовании Р0Ек*Р-А80№ с соотношением белок/олигонуклеотид 4/1 в некоторых клетках наблюдалась флуоресценция в области ядра (рис. 23). При этом интенсивность флуоресценции клеток через 24 ч инкубации была приблизительно равной для Р0А*Р-А80№ и АФП-Р-А80№, но значительно выше для Р0Ек*А80№. В последнем случае интенсивность флуоресценции зависела от соотношения РОЕк/Р-АБСЖз в комплексе, чего не наблюдалось при кратковременной 1 ч инкубации (рис. 24).

Максимально эффективное соотношение РОНк/Р-ТМОя составляло 3/1. Увеличение этого соотношения не влияло на интенсивность флуоресценции (рис. 24). В то же время, для фосфодиэфирных (Ж оптимальное соотношение РОЕк/Р-ТМОо составляло 5/1 (рис. 25и). Полученные результаты хорошо коррелируют со стехиометрическими закономерностями образования комплексов РвЕк с ТМОэ и ТМОо (Бессчетнова, 2006). Таким образом, РвЕк образует стабильные комплексы с фосфодиэфирными Р-ТМОо, способствуя их эффективной интернализации, а также защищая их от деградации как вне, так и внутри клетки.

Рис. 23. Ядерная (1) и цитоплазматическая (2) локализация PGEk*F-myc-ASONs в клетках SKOV3 после 4 ч инкубации. Флуоресцентная микроскопия, увеличение 400х. Ядра клеток окрашены Hoechst 33342.

50-

а> 40

о 30-

с; -в-

10-

FTMOo FTMOs

0/1 1/1 2/1 3/1 4/1

Соотношение РСЕк/олигонукпеотцд

Рис. 24. Накопление Р-ТМОо, Р-ТМОв и комплексов РОЕк/Р-ТМОо и РОЕкЛ7-ТМОв клетками БКОУЗ за 1 ч инкубации при 37°С. Соотношения РвЕк/Р-ТМОо и РОЕк/р-ТМОз в комплексах составляло 1/1, 2/1, 3/1 и 4/1. 0/1 - свободные олигонуклеотиды Р-ТМОо и Р-ТМОэ.

Рис. 25. Распределение Р-ТМОо и Р-ТМОв в клетках 8КОУЗ после 24 ч инкубации со свободными Р-ТМОо и Р-ТМОв (а и б соответственно) и комплексами РОЕк*Р-ТМОо и РОЕк^Р-ТМОв. а, в, д - Р-ТМОо; б, г, е - Р-ТМОв. в, г -соотношение РОЕкЛ7-ТМО 3/1; д, е-5/1. Флуоресцентная микроскопия, объектив 40х.

Следует отметить избирательность накопления в клетках комплексов PGEk*ASONs: в клетках эритролейкоза линии К562, в которых рецептор эпидермального фактора роста отсутствует (Allen, 1990), интернализация комплекса PGEk*ASONs была значительно ниже интернализации F-ASONs.

Комплексы PGEk*TMOo и PGEk*TMOs проявляли выраженную антипролиферативную активность in vitro, ингибируя рост опухолевых клеток линий HeLa и MCF7 (рис. 26). Значение 1С50 для клеток карциномы шейки матки человека HeLa (2x104 рецепторов EGF/клетку, Berkers, 1991) через 5 сут инкубации составило 250 нМ, что в 10 раз ниже значения 1С5о для свободного TMOs. Для клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF7 с меньшим содержанием рецепторов EGF (3x103 рецепторов/клетку, Kroning, 1995) значение 1С50 для PGEk*TMOs составило 500 нМ. Практически таким же антипролиферативным действием обладал комплекс PGEk*TMOo (рис. 266), в то время как свободный ТМОо был неактивен в концентрациях до 20 мкМ. Полученные результаты подтверждают предположение о выполнении белком PGEk не только транспортной, но и защищающей от деградации функции и открывает перспективу использования нетоксичных природных фосфодиэфирных фрагментов ДНК как в модельных экспериментах in vitro, так, возможно, и in vivo.

Концентрация ТМОэ, нМ Концентрация ТМОо, ТМОэ, нМ

Рис. 26. Выживаемость клеток линии НеЬа (а) после инкубации с РОЕк*ТМОв (соотношение РОЕк/ТМОя = 4/1) и клеток линии МСР7 (б) после инкубации с комплексами РОЕкТМОв и РОЕк*ТМОо (соотношение РОЕк/ТМО = 5/1).

Для реализации биологической функции ТМОо или ТМОб должны не только преодолеть плазматическую мембрану, но и достичь внутриклеточной мишени. Высвободившийся из транспортного комплекса олигонуклеотид способен к пассивной диффузии в ядро. При этом неминуемо происходила бы частичная деградация фосфодиэфирного ТМОо в цитоплазме клеток, что приводило бы к снижению его цитотоксического действия вне зависимости от

соотношения PGEk/TMOo в составе комплекса, что противоречит приведенным выше экспериментальным данным. По-видимому, комплексы ТМОо и TMOs с PGEk способны к транслокации в ядро, которой способствует наличие сигнала ядерной локализации в молекуле PGEk.

Конъюгаты ЛФП-ASONs также проявляли выраженную противоопухолевую активность in vitro. На рис. 27а представлены кривые выживаемости опухолевых клеток человека 4-х линий после 96 ч инкубации с конъюгатом АФП-mycASONs. Ингибирование пролиферации носило дозозависимый характер. Чувствительность разных клеток к конъюгату различалась в зависимости от линии, значения IC50 варьировали от 16 нМ для Raji до 200 нМ для SKOV3. При этом снижалось содержание в клетках белка р65 - продукта гена с-тус (рис. 27в). Инкубация клеток MCF7, SKOV3 и Dul45 с конъюгатом АФП-mycASONs индуцировала развитие апоптоза в этих клетках (рис. 276).

> *

МЛ

fty

г бо

го

I 40

О.

-а

q о

О. С

10 100 1000 Концентрация mycASONs, нМ

Ю50, нМ — ■— Du145 50 —•— MCF7 140 -A-SKOV3 200 -▼-Raji 16

C-Nlyc

Рис. 27. Биологическая активность конъюгата АФП-mycASONs. а) Ингибирование пролиферативной активности клеток Raji, Du 145, MCF7 и _ ^^ SKOV3; б) апоптоз в клетках Raji, * ЧИР обработанных конъюгатом АФП-

mycASONs (окрашивание Hoechst 33342, p-actin ЩШ 1РШг чвш флуоресцентная микроскопия); в)

ингибирование синтеза белка с-Мус в 12 3 клетках MCF7 (Western blot): 1 - 6 ч инкубации с конъюгатом АФП-mycASONs; 2 - 24 ч, 3 - необработанный контроль.

Итак, два варианта систем направленной доставки ASON оказались высоко результативны: конъюгаты ЛФП-ASON и комплексы PGEk* ASON. Конъюгаты АФП-ASON заметно увеличивали интернализацию ASON и в значительной степени повышали противоопухолевую активность ASON. При этом активность проявляли конъюгаты АФП со всеми исследованными тиофосфатными олигонуклеотидами: mycASONs, bcl-2ASONs, TMOs. Следует отметить, что, в отличие от конъюгатов, существенным достоинством комплексов PGEk*ASON является простота их получения. Интенсивность эндоцитоза комплексов PGEk* ASON значительно превосходит все прочие варианты. Кроме того, вектор PGEk способен транспортировать олигонуклеотиды в клеточные ядра, что дает определенное преимущество, так как некоторые мишени терапевтических олигонуклеотидов локализованы именно в ядре (например, теломераза). Однако, так как PGEk сохраняет свойства исходной молекулы - эпидермального фактора роста, требуется тщательный подбор ASON для реализации противоопухолевого эффекта.

Результаты экспериментальных исследований, представленные в данной работе, свидетельствуют о высокой противоопухолевой эффективности и перспективности использования разработанных систем адресной доставки на основе альфа-фетопротеина, его фрагментов, а также белка PGEk, обусловленных, в первую очередь, избирательностью действия полученных препаратов на опухолевые клетки и особенностями их внутриклеточного распределения.

ВЫВОДЫ.

1. Разработана концепция системы адресной доставки биологически активных соединений в опухолевые клетки, в которой в качестве адресного мотива используется альфа-фетопротеин (АФП) и его фрагменты.

2. Установлено наличие рецепторов АФП как на поверхности клеток опухолевых линий человека, так и на клетках злокачественных опухолей человека (яичника, молочной железы, печени, желудка, кишечника). На срезах доброкачественных опухолей и нормальных тканей, а также на поверхности лимфоцитов здоровых добровольцев, рецептор АФП не обнаружен.

3. Показано, что не только АФП, но и его рекомбинантные С-концевые фрагменты специфически связываются с рецептором АФП и эндоцитируются опухолевыми клетками.

4. Обнаружено, что биологически активный фрагмент АФП — октапептид GIP8 избирательно связывается с неизвестным рецептором на поверхности опухолевых клеток, с высокой эффективностью интернализуется и может быть использован в качестве вектора в системах адресной доставки.

5. Установлено, что конъюгаты противоопухолевых препаратов с АФП избирательно аккумулируются клетками-мишенями, оказывают выраженное цитостатическое воздействие на опухолевые клетки и малотоксичны для нормальных клеток человека; при этом эффективность действия конъюгатов определяется лабильностью химической связи между белком и цитотоксическим агентом.

6. Использование систем адресной доставки на основе АФП позволяет преодолеть множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток, обусловленную активностью Pgpl70.

7. Эффективность транспорта доксорубицина в опухолевые клетки в составе конъюгатов с АФП значительно превосходит эффективность его транспорта в составе конъюгатов с трансферрином и сывороточным альбумином.

8. Показана высокая противоопухолевая активность конъюгата АФП с эсперамицином A]b in vivo, при использовании модели перевиваемой опухоли мышей (излечение - 30%, увеличение продолжительности жизни - 163%).

9. Конъюгат фрагмента АФП GIP8 с доксорубицином избирательно накапливается в чувствительных и резистентных линиях опухолевых клеток, оказывает выраженное цитостатическое воздействие на опухолевые клетки и малотоксичен для мононуклеарных лейкоцитов человека.

10. Продемонстрирована перспективность использования белковых векторов на основе АФП и эпидермального фактора роста для адресной доставки антисмысловых олигонуклеотидов в клетки-мишени.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи по теме диссертации.

1. Severin S.E., Moskaleva E.Yu., Shmyrev, 1.1., Posypanova G.A., Belousova Yu.V., Sologub V.K., Luzhkov Yu.M., Nakachian R., Andreani J., Severin E.S. Alpha-fetoprotein-mediated targeting of anti-cancer drugs to tumor cells in vitro. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1995. V. 37. №2. P. 385-392.

2. Moskaleva E.Yu., Posypanova G.A., Koromyslova I.A., Shmyrev I.I., Krivonos A.V., Myagkikh I.V., Feldman N.B., Finakova G.V., Katukov V.Yu., Luzhkov Yu.M., Nakachian R., Andreani J., Severin E.S., Severin S.E. In vivo antitumor activity of cytotoxic drugs conjugated with human alpha-fetoprotein. // Tumor Targeting. 1996. V. 2. P. 299-306.

3. Moskaleva E.Yu., Posypanova G.A., Shmyrev I.I., Rodina A.V., Muizhnek E.L., Severin E.S., Katukov V.Yu., Luzhkov Yu.M., Severin S.E. Alpha-fetoprotein-mediated targeting - a new strategy to overcome multidrug resistance of tumour cellsin vitro. // Cell Biology International. 1997. V. 21. №12. P. 793-799.

4. Severin S.E., Posypanova G.A., Katukov V.Y., Shmyrev I.I., Luzhkov Y.M., Severin E.S., Gerasimova G.K., Zhukova O.S., Vorozhtsov G.N., Kaliya O.L., Lukyanets E.A.. Antitumor activity of conjugates of the oncofetal protein alpha-fetoprotein and phthalocyanines in vitro. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1997. V. 4. P. 873-881.

5. Луценко C.B., Фельдман Н.Б., Финакова Г.В., Туманов С.Г., Гукасова Н.В., Корженевский Д.А., Бобрускин А.И., Гельперина С.Э., Посыпанова Г.А., Катуков В.Ю., Скрябин К.Г., Кирпичников М.П., Калия О.Л., Ворожцов Т.Н., Северин С.Е. Направленная доставка к клеткам-мишеням и цитотоксическая противоопухолевая активность окта-4,5-карбоксифталоцианина (терафтал). // Вопр. биол. мед. фарм. химии. 1998. № i.e. 34-37.

6. Родина A.B., Москалева Е.Ю., Посыпанова Г.А., Шмырев И.И., Туманов С.Г., Луценко C.B., Катуков В.Ю., Зыкова И.Е. Сравнение цитотоксической активности конъюгатов доксорубицина с а-фетопротеином и эпидермальным фактором роста в отношении чувствительных и резистентных к доксорубицину клеточных линий. // Вопр. биол. мед. фарм. химии. 1998. № 3. С. 20-25.

7. Sotnichenko A.I., Severin S.E., Posypanova G.A., Feldman N.B., Grigor'ev M.I., Severin E.S., Petrov R.V. Water-soluble 2,3,7,8-tetrachIorodibenzo-p-dioxin complex with human alpha-fetoprotein: properties, toxicity in vivo and antitumor activity in vitro. // FEBS Lett. 1999. V. 450. №1-2. P. 49-51.

8. Северин C.E., Посыпанова Г.А., Сотниченко А.И., Москалева Е.Ю., Фельдман Н.Б., Григорьев М.И., Северин Е.С., Петров Р.В. Противоопухолевая активность ковалентного конъюгата ендиинового антибиотика эсперамицина Al с а-фетопротеином человека. // Докл. Акад. Наук. 1999. Т. 366. №4. С. 561-564.

9. Луценко C.B., Фельдман Н.Б., Финакова Г.В., Туманов С.Г., Гукасова Н.В., Корженевский Д.А., Бобрускин А.И., Гельперина С.Э., Посыпанова Г.А., Катуков В.Ю., Северин С.Е., Скрябин К.Г., Кирпичников М.П., Калия О.Л., Ворожцов Г.Н.Направленный транспорт фталоцианина (Со) к опухолевым клеткам-мишеням с помощью а-фетопротеина и эпидермального фактора роста. // Вопр. биол. мед. фарм. химии. 1999. №1. С. 40-44.

10. Фельдман Н.Б., Луценко C.B., Финакова Г.В., Шмырев И.И., Посыпанова Г.А., Скрябин К.Г., Северин С.Е. Повышение противоопухолевой активности доксорубицина за счет его адресной доставки к клеткам-мишеням с помощью белковых векторов. // Вопр. биол. мед. фарм. химии. 1999. № 1.С. 44-48.

11. Петров Р.В., Сотниченко А.И., Посыпанова Г.А., Москалева Е.Ю., Фельдман Н.Б., Григорьев М.И., Северин Е.С., Северин С.Е. Разработка конструкций для направленной доставки противолейкемических средств с помощью а-фетопротеина человека. // Новости науки и техники, серия

"Медицина" (Аллергия, астма и клиническая иммунология). 1999. №3. С. 10-11.

12. Lutsenko S.V., Feldman N.B., Finakova G.V., Gukasova N.V., Petukhov S.P., Posypanova G.A., Skryabin K.G., Severin S.E. Study of antitumor activity of alpha-fetoprotein and epidermal growth factor conjugates in vitro and in vivo. // Tumor Biology. 2000. V. 21. №6. P. 367-374.

13. Фельдман Н.Б., Киселев C.M., Гукасова H.B., Посыпанова Г.А., Луценко C.B., Северин С.Е. Противоопухолевая активность коньюгата а-фетопротеина с доксорубицином in vitro и in vivo. // Биохимия. 2000. T. 65. №8. С. 1140-1145.

14. Сладкова Л.В., Москалева Е.Ю., Посыпанова Г.А., Крашенинников М.Е., Северин Е.С., Северин С.Е. Устойчивость в-клеточных линий человека с разным уровнем экспрессии bcl-2 к противоопухолевым препаратам. // Вопр. биол. мед. фарм. химии. 2000. №3. С. 25-29.

15. Василенко И.А., Северин С.Е., Хомяков Ю.Н., Луценко C.B., Посыпанова Г.А., Зыкова И.Е., Сотниченко А.И., Хомякова Т.П. Сравнительная фазовая морфометрия рецепторопосредованного эндоцитоза эпидермального фактора роста и а-фетопротеина. // Вопр. биол. мед. фарм. химии. 2000. №2. С. 22-28.

16. Луценко C.B., Гукасова Н.В., Посыпанова Г.А., Ажаев A.B., Ажаева Е.В., Фельдман Н.Б., Северин С.Е. Увеличение цитотоксической активности доксорубицина при его транспорте в опухолевые клетки с помощью белковых векторов. // Российский онкологический журнал. 2001. №3. С. 33-37.

17. Ницветов М.Б., Родина A.B., Москалева Е.Ю., Посыпанова Г.А., Попова О.Н., Сологуб В.К., Коромыслова И.А., Шмырев И.И., Сотниченко А.И., Заболотнев Д.В., Караулов A.B., Северин С.Е. Характеристика моноклональных антител к рецептору АФП в сравнении с АФП по их взаимодействию с опухолевыми клетками человека. // Вопр. биол. мед. фарм. химии. 2001. № 3. С. 19-25.

18. Северин С.Е., Родина, A.B. Ницветов М.Б., Астахов Д.В., Коваленко H.A., Москалева Е.Ю., Посыпанова Г.А., Попова О.Н., Сологуб В.К., Коромыслова H.A., Шмырев И.И., Караулов A.B. Регуляция противоопухолевой активности с помощью моноклональных антител к рецептору альфа-фетопротеина и иммунизации этим белком. // Российский иммунологический журнал. 2001. Т. 6. №3. Р. 249-257.

19. Фельдман Н.Б., Посыпанова Г.А., Гельперина С.Э., Скидан И.Н., Хомяков Ю.Н., Луценко C.B., Северин С.Е. Адресная доставка биологически активных соединений в опухолевые клетки с помощью белковых и пептидных векторов. // Вестник НИИ молекулярной медицины. 2002. №2. С. 38-54.

20. Ницветов М.Б., Москалева Е.Ю., Сладкова Л.В., Родина A.B., Посыпанова Г.А., Попова О.Н., Коромыслова И.А., Караулов A.B., Северин С.Е., Северин Е.С. Характеристика чувствительных и резистентных к

доксорубицину опухолевых клеточных линий по уровню экспрессии рецептора альфа-фетопротеина и способности к рецепторопосредованному эндоцитозу. // Молекуляр. Медицина. 2003. №2. С. 57-60.

21. Москалева Е.Ю., Сладкова JI.B., Обухова В.В., Белушкина H.H., Посыпанова Г.А., Харнас С.С., Самохвалов В.Т., Северин Е.С., Катлинский A.B., Пальцев М.А. Регуляция чувствительности опухолевых клеток с помощью антисмысловых олигонуклеотидов к гену bcl-2. // Молекуляр. Медицина. 2003. №1. С. 45-51.

22. Ницветов М.Б., Москалева Е.Ю., Посыпанова Г.А., Макарова О.В., Степанов В.А., Рогов К.А., Коромыслова И.А., Караулов A.B., Северин С.Е., Северин Е.С. Изучение экспрессии рецептора АФП в опухолевых и нормальных тканях человека с помощью иммуногистохимического метода. //Иммунология. 2005. Т. 26. №2. С. 122-125.

23. Посыпанова Г.А., Киреева H.H., Макаров В.А., Фаттахова Г.В., Попова О.Н., Позмогова Г.Е., Северин С.Е., Северин Е.С. Использование альфа-фетопротеина для адресной доставки антисмысловых олигонуклеотидов в опухолевые клетки: сравнение двух конструкций. // Вопр. биол. мед. фарм. химии. 2005. №3. С. 15-20.

24. Позмогова Г.Е., Посыпанова Г.А. Адресованные белок-нуклеиновые комплексы для генотерапии. II. Доставка чужеродной ДНК в клетки-мишени с помощью нового рекомбинантного белка PGEk. // Новые лекарственные препараты. 2005. №11. С. 72-80.

25. Посыпанова Г.А. Создание новых противоопухолевых препаратов направленного действия в сборнике Онищенко Г.Г., Пальцева М.А. и др. "Биологическая безопасность". - М. - ОАО "Издательство "Медицина". -2006.-С. 151-175.

26. Посыпанова Г.А., Чувилин А.Н., Киреева H.H., Северин Е.С., Позмогова Г.Е. Комплексы теломерных олигонуклеотидов с белковым вектором PGEk: интернализация клетками-мишенями и антипролиферативная активность. // Молекуляр. Биология. 2008. Т. 42. №> 2. С. 286-294.

27. Северин С.Е., Посыпанова Г.А., Москалева Е.Ю. Разработка новых подходов к лечению рака с помощью препаратов направленного действия и вакцин на основе белка теплового шока rHsp70. // Молекуляр. медицина. 2008. №4. С. 9-17.

28. Posypanova G.A., Gorokhovets N.V., Makarov V.A., Sawateeva L.V., Kireeva N.N., Severin S.E., Severin E.S. Recombinant alpha-fetoprotein C-terminal fragment: The new recombinant vector for targeted delivery. // J. Drug Target. 2008. V. 16. №4. P. 321-328.

29. Sharapova O.A., Pozdnykova N.V., Laurinavichyute D.K., Yurkova M.S., Posypanova G.A., Fedorov A.N., Severin S.E., Severin E.S. High-efficient expression, refolding and purification of functional recombinant C-terminal fragment of human alpha-fetoprotein. // Protein Expr Purif. 2010. V. 73. №1. P. 31-35.

30. Mizejewski G.J., Mirowski M., Garnuszek P., Maurin M., Cohen B.D., Poiesz B.J., Posypanova G.A., Makarov V.A., Severin E.S., Severin S.E. Targeted delivery of anti-cancer growth inhibitory peptides derived from human alpha-fetoprotein: review of an International Multi-Center Collaborative Study. // J. Drug Target. 2010. V. 18. №8. P. 575-588.

31. Татаринова O.H., Гороховец H.B., Макаров В.А., Посыпанова Г.А., Серебрякова М.В., Позмогова Т.Е. Новые белковые векторы на основе фрагмента альфа-фетопротеина для направленного транспорта ДНК в опухолевые клетки. // Вестник РАМН. 2010. №1, С. 3-8.

32. Шарапова O.A., Позднякова Н.В., Лауринавичюте Д.К., Юркова М.С., Посыпанова Г.А., Андронова С.М., Федоров А.Н., Северин С.Е., Северин Е. С. Выделение и характеристика рекомбинантного фрагмента альфа-фетопротеина человека, соответствующего С-концевому структурному домену. // Биоорг. химия. 2010. Т. 36. №6. С. 760-768.

33. Северин Е.С., Посыпанова Г.А. Молекулярная физиология рецептор-опосредованного эндоцитоза и его роль в преодолении множественной лекарственной устойчивости. // Физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 2011. Т. 97. №6. С. 553-565.

34. Березникова A.B., Посыпанова Г.А., Макаров В.А., Антипова О.В., Северин Е.С. Октапептид АФП - перспективный пептидный вектор для адресной доставки цитостатиков в опухолевые клетки. // Вопр. биол. мед. фарм. химии. 2012. №5. С. 15-21.

Патенты по теме диссертации.

35. Лужков Ю.М., Москалева Е.Ю., Накашьян Р., Посыпанова Г.А., Родина A.B., Северин С.Е., Фельдман Н.Б., Финакова Г.В., Шмырев И.И. Коньюгаты биологически активных веществ с альфа-фетопротеином, обладающие избирательным действием по отношению к раковым опухолям, способ их получения (варианты) и фармацевтическая композиция на их основе. Патент РФ №2071351 от 10.01.1997.

36. Позмогова Г.Е., Чувилин А.Н., Посыпанова Г.А., Шульга A.A., Эльдаров М.А., Ермолюк Я.С., Северин Е.С., Кирпичников М.П., Скрябин К.Г. Пептидный вектор, способ его получения, нуклеотидная последовательность, рекомбинантная плазмидная ДНК и штамм Escherichia coli В-8389 ВКПМ для его получения, способ генетической модификации клеток млекопитающих и человека. // Патент РФ № 2248983 от 27.03.2005.

37. Гороховец Н.В., Дигтярь A.B., Луценко Е.В., Луценко C.B., Макаров В.А., Посыпанова Г.А., Северин Е.С., Северин С.Е., Фельдман Н.Б. Противоопухолевый пептидный препарат на основе фрагмента альфа-фетопротеина, его коньюгат, фармацевтическая композиция и способ лечения гормонзависимых опухолей. Патент РФ № 2285537 от 20.10.2006.

38. Северин Е.С., Посыпанова Г.А., Макаров В.А., Киреева H.H., Северин С.Е. Пептид, являющийся аналогом фрагмента альфа-фетопротеина, конъюгат

пептида с докеорубицином и фармацевтическая композиция на его основе для лечения онкологических заболеваний. Патент РФ № 2317102 от 20.02.2008.

Публикации по теме диссертации в материалах конференций.

39. Severin E.S., Posypanova G.A., Shmyrev I.I., Andreani J., Nakachian R., Luzhkov Yu.M., Severin S.E. The application of receptor-mediated endocytosis of alpha-fetoprotein for anticancer drug delivery. // Abstracts of V International Symposium on Biology and Clinical Usefulness of Tumor Markers. Barcelona, Spain. 1995. P. 32.

40. Москалева Е.Ю., Посыпанова Г.А., Шмырев И.И., Северин Е.С., Северин С.Е. Рецепторопосредованный транспорт доксорубицина в клетки, резистентные к антрациклиновым антибиотикам. // Материалы конференции "Мембранный транспорт и функции клетки". 1995. Цитология. Т. 37. №4. С. 392-393.

41. Москалева Е.Ю., Посыпанова Г.А., Михайлова Л.И., Сологуб В.К., Шмырев И.И., Северин С.Е. Использование явления эндоцитоза альфа-фетопротеина для избирательной доставки лекарственных препаратов в раковые клетки. // Материалы международной конференции, посвященной памяти академика А.А.Баева. Москва. 1996. С. 94.

42. Посыпанова Г.А., Шмырев И.И., Катуков В.Ю., Накашьян Р., Северин С.Е. Разработка иммунощадящих методов химиотерапии онкологических заболеваний. // Материалы II Международного конгресса "Иммунореабилитация и реабилитация в медицине". Анталия, Турция. 1996. №2. С. 289.

43. Posypanova G.A., Moskaleva E.Yu, Rodina A.V., Severin E.S., Nakachian R., Severin S.E. Mechanism of targeted transport of AFP-Doxorubicin conjugates to the tumor cells. // Abstracts of 24th FEBS Meeting. Barcelona, Spain. 1996. P. 73.

44. Sologub V.K., Posypanova G.A., Kanevsky V.Yu., Severina M.E., Severin S.E. Human alpha-fetoprotein receptor (AFPR) and antibodies to AFPR as a tool for tumor screening. // Proceedings of the XVI Intern. Congress of Clinical Chemistry. London, Great Britain. 1996.

45. Moskaleva E.Yu., Posypanova G.A., Shmyrev I.I., Luzhkov Yu.M., Katukov V.Yu., Nakachian R., Severin E.S., Severin S.E. Alpha-fetoprotein-mediated targeting of anti-cancer drugs - the new strategy to overcome multidrug resistance of tumor cells. // Abstracts of Conference "The interdependence of Tumor Biology and Clinical Oncology". Coronado, California, USA. 1996. P. 121.

46. Mikhailova L.I., Moskaleva E.Yu., Posypanova G.A., Sologub V.K., Shmyrev I.I., Severin S.E. Delivery of drugs to the tumor cells by alpha-fetoprotein. // Abstracts of XIII National Biochemistry congress. Ankara, Turkey. 1996. P. C-676.

47. Moskaleva E.Yu., Feldman N.B., Finakova G.V., Shmyrev I.I., Posypanova G.A., Rodina A.V., Nakachian R., Katukov V.Yu., Severin S.E. Targeted delivery of antitumor drugs based on oncofetal protein alpha-fetoprotein. // Abstracts of 5th European Winter Oncology Conference. France. 1997. P. 59.

48. Lutsenko S.V., Savitsky A.A., Gelperina S.E., Gumanov S.G., Korzhenevsky

D.A., Katukov V.Yu., Posypanova G.A., Lebedeva V.S., Mironov A.F., Severin S.E. Study of possibility of targeted delivery of photofrine and chlorines e6 and p6 to tumor cells. // Abstracts of the 25th anniversary meeting of the ISOBM. Montreux, Switzerland. 1997. P. 126.

49. Severin S.E., Posypanova G.A., Sotnichenko A.I., Shmyrev 1.1., Moskaleva,

E.Yu. Feldman N.B., Finakova G.V., Katukov V.Yu., Luzhkov Yu.M., Severin, E.S., Nakachian R., Andreani J. Targeted delivery of esperamicine Al by using oncofetal protein a-fetoprotein. // Abstracts of the European cancer conference ECCO 9. Hamburg, Germany. European Journal of Cancer. 1997. V. 33. №S8. P. S89.

50. Sotnichenko A.I., Posypanova G.A., Moskaleva E.Yu., Kulakov V.N., Severin E.S., Severin S.E. AFP as an instrument for tumor diagnostics and vehicle for targeted delivery: from cell to mice. // Abstracts of the 26th Meeting of the ISOBM "From Tumor Biology to Clinical Oncology". 1998. Umea, Sweden. Tumor Biol. V. 19. Suppl. 2. P. 45.

51. Gelperina S.E., Posypanova G.A., Bobruskin A.I., Severin S.E. Cytotoxic effects of AFP-doxorubicin conjugate in multidrug-resistant cells. // Abstracts of the 26th Meeting of the ISOBM "From Tumor Biology to Clinical Oncology". 1998. Umea, Sweden. Tumor Biol. V. 19. Suppl. 2. P. 80.

52. Khomaykov Yu.N., Vasilenko I.A., Posypanova G.A., Severin E.S., Zykova I.E. Study of receptor-mediated endocytosis of basic ligands for drug delivery. // Proc. of Seventh European Congress of Biopharmaceutics and Pharmacokinetics. 1999. Jerusalem. P. 153.

53. Sladkova L.V., Moskaleva E.Yu., Posypanova G.A., Popova O.N., Belousova Yu.V., Severin S.E., Severin E.S. BCL-2: supression of apoptosis and possible role in cellular proliferation. // Abstracts of the 28th Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM). 2000. P. 100.

54. Северин E.C., Сотниченко А.И., Посыпанова Г.А., Зотова Е.Е. Новые подходы к терапии рака - защита и противоопухолевая активация иммунной системы. // Материалы III съезда иммунологов и аллергологов СНГ. 2000. Сочи-Дагомыс. Аллергология и иммунология. Т. 1. № 2. С. 7.

55. Posypanova G.A., Sotnichenko A.I., Zabolotnev D.V., Kireeva N.N., Lutcenko S.V., Gukasova N.V., Popova O.N., Severin S.E. Influence of a type of a chemical bond on cytotoxicity and endocytosis of conjugates AFP with doxorubicin. // Abstracts of the 28th Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM). 2000. P. 109.

56. Pozmogova G.E., Chuvilin A.N., Posypanova G.A. Oligodeoxyribonucleotide-recombinant human epidermal growth factor (rEGFh) conjugates. // Abstracts of

International Conference "Trends in nucleic acid chemistry". 2000. Moscow. P. 13.

57. Фельдман Н.Б., Киселев C.M., Гукасова H.B., Посыпанова Г.А., Хомяков Ю.Н., Луценко С.В., Северин С.Е. Цитотоксическая и противоопухолевая активность коньюгата а-фетопротеина с доксорубицином. // Материалы VII Российского национального конгресса "Человек и лекарство". 2000. Москва. С. 556.

58. Луценко С.В., Фельдман Н.Б., Гукасова Н.В., Посыпанова Г.А., Киселев С.М., Северин С.Е. Использование белковых векторов для направленного транспорта доксорубицина в опухолевые клетки-мишени. // Материалы VII Российского национального конгресса "Человек и лекарство". 2000. Москва. С. 518.

59. Позмогова Г.Е., Чувилин А.Н., Посыпанова Г.А., Шульга А.А., Ермолюк Я.С., Киреева Н.Н., Глухов А.И., Кирпичников М.П., Скрябин К.Г. Новый пептидный вектор EGF-NLS для доставки антисенс-олигонуклеотидов и плазмидной ДНК в опухолевые клетки. // Материалы конференции "Биотехнология -2001". 2001. Пущино. С. 215.

60. Посыпанова Г.А., Сладкова Л.В., Москалева Е.Ю., Сотниченко А.И., Заболотнев Д.В., Киреева Н.Н., Северин Е.С. Использование белковых векторов для направленной доставки антисмысловых олигонуклеотидов в опухолевые клетки. // Материалы Всероссийской конференции "Клеточная биология на пороге XXI века". 2001. Цитология. Т. 43. № 4. С. 886.

61. Pozmogova G.E., Chuvilin A.N., Posypanova G.A., Shulga A.A., Ermolyuk Ya.S., Kireeva N.N., Kirpichnikov M.P., Skryabin K.G. New EGF-based peptide vectors for antisense oligonucleotides and plasmid DNA target delivery into actively proliferating cells. // Abstracts of International Conference "RNA as Terapeutic and Genomics Target". 2001. Novosibirsk. P. 83.

62. Nitsvetov M.B., Rodina A.V., Moskaleva E.Yu., Posypanova G.A., Popova O.N., Sologub V.K., Koromyslova I.A., Severin S.E., Sotnichenko A.I., Belousova Yu.V., Severin E.S. Monoclonal antibodies to the AFP receptor and their antitumoral activity. // Abstracts of 3-rd Central European Conference on Human Tumor Markers. 2001. Praga, Czech Republic. Biomarkers and Environment. V. 4. №1,2. P. 51.

63. Ницветов М.Б., Москалева Е.Ю., Сладкова Л.В., Родина А.В., Посыпанова Г.А., Попова О.Н., Сологуб В.К., Коромыслова И.А., Караулов А.В., Северин Е.С. Анализ количества и активности рецепторов АФП на чувствительных и резистентных опухолевых клетках и преодоление множественной лекарственнойустойчивости с помощью направленного транспорта доксорубицина через рецептор АФП. // Материалы I Всероссийской научно-практической конференции "Биотерапия рака". 2002. С. 73-74.

64. Посыпанова Г.А., Сладкова Л.В., Москалева Е.Ю., Фаттахова Г.В., Макаров В.А., Северин Е.С. Адресная доставка антисмысловых олигонуклеотидов в опухолевые клетки. // Материалы 14 Всероссийского

симпозиума "Структура и функции клеточного ядра". 2002. С.-Петербург. Цитология. Т. 44. №9. С. 900-901.

65. Severin S., Nitsvetov М., Moskaleva Е., Rodina A., Makarova О., Stepanov V., Belousova Yu., Posypanova G., Karaulov A., Severin E. AFP-receptor - the universal target for targeted drug delivery. // Abstracts of 37th Annual Scientific Meeting of the European Society for Clinical Investigation. 2003. Verona, Italy. P. 161.

66. Ницветов М.Б., Москалева Е.Ю., Посыпанова Г.А., Макарова О.В., Степанов В.А., Рогов К.А., Попова О.Н., Сологуб В.К., Коромыслова И.А., Караулов A.B., Северин С.Е., Северин Е.С. Экспрессия РеАФП в опухолевых и нормальных тканях человека. // Материалы 3-ей научной конференции и школы-семинара. Астрахань-Москва. 2003. С. 14-19.

67. Posypanova G., Kireeva N., Fattakhova G., Makarov V., Pozmogova G., Severin S. Targeted delivery of doxorubicin and antisenses into tumour cells. // Abstracts of 1st EUFEPS Conference on Optimising Drug Delivery and Formulation: New Challenges in Drug Delivery. Versailles, France. 2003. P.94.

68. Posypanova G A. New Approaches for Biotherapy of Cancer-related Diseases. // Proceedings of the 5th ISTC/Korea Workshop On Biotechnology. 2004. Chungbuk, Korea. P. 81-92.

69. Posypanova G.A., Nitsvetov M.B., Moskaleva E.Yu., Kireeva N.N., Rodina A.V., Popova O.N., Severin S.E., Severin E.S. Alpha-fetoprotein-vehicled targeted delivery of doxorubicin and antisenses to tumor cells. // Abstracts of World Conference on Magic Bullets. 2004. Nürnberg, Germany. P. A-109.

70. Sawateeva L., Gorokhavets N., Makarov V., Posypanova G., Severin S. Recombinant third domain of human alpha-fetoprotein: selectivity and antitumor activity of conjugate with Taxol. // Abstracts of the XXXIII Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM). 2005. Rhodes, Greece. P. 84.

71. Москалева Е.Ю., Хомякова A.B., Родина A.B., Посыпанова Г.А., Гороховец Н.В., Макаров В.А., Северин С.Е., Северин Е.С. Исследование иммуномодулирующей активности АФП в отношении дендритных клеток человека и его антипролиферативной активности в отношении опухолевых клеток. // Материалы II международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность". Москва. 2005. С. 194.

72. Дигтярь A.B., Посыпанова Г.А., Попова О.Н., Макаров В.А., Фельдман Н.Б., Луценко С.В., Швец В.И. Исследование возможности применения пептидных векторов для адресной доставки биологически активных соединений в опухолевые клетки эпителиального происхождения. // Материалы XII Российского национального конгресса "Человек и Лекарство". 2005. Москва. С. 658.

73. Северин Е.С., Посыпанова Г.А. Проблемы создания новых лекарственных форм с использованием рецепторопосредованного эндоцитоза. // Материалы международной конференции "Биотехнология и медицина". Москва. 2006. С. 314.

74. Savvateeva L., Gorokhovets N., Posypanova G., Makarov V. Recombinant domain III of human alpha-fetoprotein - new vector for antitumor drug delivery. // Abstracts of the 19th Meeting of the European Association for Cancer Research (EACR). 2006. Budapest, Hungaiy. P. 86.

75. Позмогова Г.Е., Чувилин A.H., Посыпанова Г.А., Бессчетнова И.А., Борисова О.Ф. Структура и свойства адресованных комплексов рекомбинантного белка PGEk с теломерным олигонуклеотидом d(TTAGGG)4 и его фосфотиоатным аналогом. // Материалы Международной конференции, посвященной 80-летию со дня рождения академика Д.Г. Кнорре. 2006. Новосибирск. С. 203.

76. Северин Е.С., Посыпанова Г.А. Разработка белковых и пептидных систем адресной доставки лекарственных соединений в опухолевые клетки. // Материалы научно-практической конференции "Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)". 2006. Ростов-на-Дону. С. 113.

77. Татаринова О.Н., Гороховец Н.В., Макаров В.А., Посыпанова Г.А., Позмогова Г.Е. Направленный транспорт олигонуклеотидов в опухолевые клетки с помощью белковых векторов на основе фрагмента альфа-фетопротеина. // Материалы 1-й международной научной школы Нано-2009. 2009. Москва. С. 345-346.

78. Северин Е.С., Посыпанова Г.А., Кондрашева И.Г., Гукасова Н.В., Москалева Е.Ю. Молекулярные механизмы преодоления резистентности лекарственных препаратов. // Материалы I международной научно-практической конференции Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине. 2010. Москва. С. 112.

79. Gukasova G., Godovanniy A., Naidenova A., Posypanova G., Pozdniakova N., Yabbarov N., Vasilenko E., Moskaleva E., Severin S., Severin E. Targeted delivery of anti-cancer drugs using rhafpfr-linked plga-nanoparticles by receptor-mediated endocytosis. // Abstracts of the 4th International Congress of Molecular Medicine. 2011. Istanbul, Turkey. In Vivo. V. 25. №3. P. 467-576

80. Северин E.C., Посыпанова Г.А. Новые подходы к избирательной доставке противоопухолевых препаратов: клеточная физиология и нанотехнологии. // Материалы III Съезда физиологов СНГ. 2011. Ялта, Украина. С. 24.

Заказ № 115-а/03/2013 Подписано в печать 27.03.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:zak@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Посыпанова, Галина Ароновна, Москва

О5Г2013£О882

На правах рукописи

ПОСЫПАНОВА ГАЛИНА АРОНОВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕЛКОВЫХ И ПЕПТИДНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ИЗБИРАТЕЛЬНОЙ ДОСТАВКИ

ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ И ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ

03.01.04. - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант

Член-корр. РАМН, профессор С.Е. Северин

Москва 2013 г.

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. 5

ВВЕДЕНИЕ 10

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 15

1.1. Основные идеи и пути создания противоопухолевых препаратов

направленного действия 15 1.1.1. Препараты направленного действия в онкологии: лекарственные препараты на основе моноклональных антител и антисмысловых

олигонуклеотидов. 16

1.2. Рецептор-опосредованный эндоцитоз и его роль в доставке биологически-

активных соединений в клетки-мишени 31

1.3. Альтернативные системы адресной доставки противоопухолевых

препаратов для повышения эффективности терапии рака. 39

1.4. Опухолево-специфические антигены как мишени адресной доставки противоопухолевых препаратов 41

1.5. Адресная доставка лекарственных препаратов в составе конъюгатов с

белковыми и пептидными векторными молекулами. 43

1.6. Химерные Белки 52

1.7. Альфа-фетопротеин и его рецепторы в качестве мишени избирательной

доставки биологически активных веществ в опухолевые клетки. 55

1.7.1. Структура и функции альфа-фетопротеина 55

1.7.2. Рецепторы альфа-фетопротеина. 62

1.7.3. Биологически активные фрагменты альфа-фетопротеина 65

1.8. Адресная доставка противоопухолевых препаратов как основной подход к преодолению множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) 69

1.8.1. Феномен множественной лекарственной устойчивости опухолевых

клеток. 69

1.8.2. Современные подходы к преодолению множественной лекарственной устойчивости. 79 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 84

2.1. Выделение природного альфа-фетопротеина человека и получение рекомбинантных белков-фрагментов АФП. 84

2.1.1. Выделение АФП человека 84

2.1.2. Получение рекомбинантного С-концевого фрагмента АФП (гАФП27) 85

2.1.3. Получение рекомбинантного белка PGA 87

2.1.4. Получение рекомбинантного фрагмента АФП AFP-3BC 88

2.2. Синтез конъюгатов белков и пептидов с FITC, цитостатиками и

олигонуклеотидами. 89

2.2.1. Синтез FITC-меченых АФП, МАт и С-концевого фрагментов АФП -

гАФП27 и AFP-3BC. 89

2.2.2. Синтез FITC-меченого октапептида АФП GIP8. 89

2.2.3. Синтез конъюгатов АФП, гАФП27, AFP-3BC и октапептида

EMTPVNPG (GIP8) с доксорубицином. 89

2.2.4. Синтез конъюгатов АФП с винбластином. 96

2.2.5. Синтез конъюгатов АФП с фталоцианинами 96

2.2.6. Синтез конъюгатов АФП и GIP8 с эсперамицином Aib (EsA). 96

2.2.9. Синтез конъюгатов АФП с олигонуклеотидами. 99

2.2.10. Получение комплексов ON с белками. 102

2.3. Культуры клеток и условия культивирования. 102

2.4. Оценка связывания с рецептором и эндоцитоза флуоресцентно меченых

белков, пептидов и конъюгатов с помощью метода проточной цитометрии. 103

2.4.1. Оценка связывания АФП и МАт с рецептором АФП. 103

2.4.2. Оценка эндоцитоза флуоресцентно меченных АФП, С-концевого

фрагмента АФП, октапептида АФП GIP8. 105

2.5. Оценка эндоцитоза конъюгатов белков и пептидов с ДОКС с помощью

метода проточной цитометрии. 105

2.6. Иммуноцитохимические и иммуногистохимические исследования. 105

2.6.1. Исследование экспрессии рецепторов АФП на поверхности клеток. 105

2.6.2. Исследование экспрессии белков с-Мус, Вс1-2 и Pgpl70. 106

2.6.3. Иммунохимическое окрашивание гистологических срезов. 106

2.7. Исследование экспрессии с-Мус, Вс1-2 и Pgpl70 в опухолевых клетках. 107

2.7.1. Исследование экспрессии с-Мус, Вс1-2 и Pgpl70 с помощью Western

blot. 107

2.7.2. Исследование экспрессии с-Мус, Вс1-2 и Pgpl70 в опухолевых клетках с

помощью проточной цитометрии. 108

2.8. Флуоресцентная микроскопия. 109

2.9. Определение цитостатической активности препаратов in vitro. 109

2.9.1. Определение выживаемости клеток. 109

2.9.2. Определение ингибирования пролиферативной активности клеток. 110

2.9.3. Анализ уровня апоптоза с помощью флуоресцентной микроскопии. 110

2.8.4. Определение фотоцитостатической и хемиоцитостатической активности конъюгатов АФП с фталоцианинами алюминия (А1Фц) и кобальта (СоФц). 110

2.9. Исследование пролиферативной активности клеток. 111

2.10. Анализ клеточного цикла с помощью проточной цитометрии. 111

2.11. Исследование противоопухолевой активности препаратов in vivo. 112

2.12. Статистическая обработка результатов. 113 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. 114

3.1. Исследование экспрессии рецептора альфа-фетопротеина на клетках

опухолевых линий человека. 114

3.1.1. Исследование специфичности клонов МАт к АФПР 115

3.1.2. Оценка количества АФПР на культивируемых in vitro опухолевых

клетках человека. 116

3.2. Иммунохимическое выявление АФПР на клетках и срезах тканей 118

3.2.1. Исследование экспрессии рецепторов АФП на поверхности опухолевых

клеток с помощью иммуноцитохимии. 119

3.2.2. Иммуногистохимическое окрашивание срезов опухолевых тканей 119

3.3. Исследование связывания и эндоцитоза флуоресцентно меченного АФП опухолевыми клетками in vitro. 123

3.3.1. Исследование связывания АФП с рецептором на поверхности опухолевых клеток и нормальных лимфоцитов периферической крови

человека с помощью проточной цитометрии. 123

3.3.2. Исследование эндоцитоза АФП in vitro с помощью проточной

цитометрии и флуоресцентной микроскопии. 126

3.4. Использование рецептор-опосредованного эндоцитоза для адресной доставки противоопухолевых препаратов - доксорубицина, винбластина, эсперамицина, фталоцианинов. 129

3.4.1. Анализ интернализации опухолевыми клетками in vitro конъюгатов

АФП с антибиотиками/цитостатиками на примере доксорубицина. 129

3.4.2. Исследование цитостатической активности конъюгатов белков с доксорубицином in vitro. 134

3.4.3. Исследование противоопухолевой активности конъюгатов АФП с ДОКС

in vivo. 137

3.4.4. Исследование фотоцитостатической и хемиоцитостатической активности конъюгатов АФП с фталоцианинами алюминия (А1Фц) и кобальта

(СоФц). 139

3.4.5. Исследование цитостатической активности конъюгатов АФП с

некоторыми другими противоопухолевыми антибиотиками (цитостатиками). 145

3.4.6. Исследование цитостатической активности конъюгатов АФП с

эсперамицином Ajb (EsA) in vitro. 146

3.4.7. Исследование противоопухолевой активности конъюгатов АФП с эсперамицином Aib (EsA) in vivo. 150

3.5. Преодоление множественной лекарственной устойчивости, обусловленной экспрессией гена MDR 1 с помощью конъюгатов АФП с противоопухолевыми препаратами in vitro. 154

3.5.1. Характеристика резистентных линий клеток. 154

3.5.2. Анализ интернализации ДОКС и его конъюгатов с белками в

резистентных линиях клеток. 156

3.5.3. Исследование цитостатической активности конъюгатов ДОКС с АФП в отношении резистентных линий клеток. 158

3.6. Биологически активные фрагменты АФП. 160

3.6.1. Рекомбинантный С-концевой фрагмент АФП (гАФП27). 160

3.6.2. Рекомбинантный С-концевой фрагмент АФП АФП-ЗВС. 166

3.6.3. Биологически активный октапептид - фрагмент АФП 173

3.7. Адресная доставка антисмысловых олигонуклеотидов в опухолевые

клетки. 182

3.7.1. Адресная доставка антисмысловых олигонуклеотидов в опухолевые

клетки в виде их конъюгатов с АФП. 182

3.7.2. Исследование эффективности доставки ASON с помощью

нековалентных комплексов с АФП. 198

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. ВЫВОДЫ.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

214 221 223

Список сокращений.

ABC-транспортеры ATP binding cassette, АТФ-связывающие (зависимые) транспортеры

Akt протеинкиназа Akt

А1Фц фталоцианин алюминия

Arp Actin-related protein, актиноподобный белок

ASON антисмысловые олигонуклеотиды

Au NPs наночастицы золота

ВСА бицинхониновая кислота

BCRP breast cancer resistance protein, белок, ассоциированный с

резистентностью рака молочной железы, ABCG2

ВМ блеомицин

Са1 калихеамицин

СЕА раково-эмбриональный антиген

CisPt цисплатин

controlONs контрольные олигонуклеотиды

СоФц фталоцианин кобальта

CPA циклофосфана карбоксифосфамид

CURL Compartment of Uncoupling of Receptor and Ligand, компартмент,

содержащий несвязанные рецептор и лиганд

DE дифтерийный токсин

DM дауномицин

EDC водорастворимый карбодиимид

ЕЕА1 Early Endosome Associated Protein 1, белок, ассоциированный с

ранними эндосомами 1

EGF эпидермальный фактор роста

EGFR рецептор эпидермального фактора роста

EMC epsilon-maleimidocaproic acid, s-малеимидокапроновая кислота

ЕМСН гидразид е-малеимидокапроновой кислоты

ERK1/2 протеинкиназы, индуцируемые внеклеточными сигналами 1/2

EsA эсперамицин Aib

FasL Fas-лиганд

F- флуоресцентно меченный

F-ASON флуоресцентно меченные антисмысловые олигонуклеотиды

FAOIT флуоресцентно меченный АФП

FBS эмбриональная бычья сыворока

FMAt флуоресцентно меченные моноклональные антитела

GA глутаровый альдегид

GILT гамма-интерферон индуцибельная лизосомальная тиолредуктаза

GIP34 growth inhibitory peptide 34 а.о., рост-ингибирующий пептид из 34

аминокислотных остатков (фрагмент АФП)

GIP8 growth inhibitory peptide 8 а.о., рост-ингибирующий пептид из 8

аминокислотных остатков (концевой фрагмент GIP34)

GN нитрат галлия

GnRH gonadotropin releasing hormone - гонадолиберин

GSH глутатион

GSH-GST глутатион - глутатион S-трансфераза

HLA главный комплекс гистосовместимости

HNF гепатоцитарный ядерный фактор

HSA сывороточный альбумин человека

Hsc70 конститутивный белок теплового шока

HUVEC эндотелиальные клетки пуповинной вены человека

Hyd гидразид 3-малеимидобензойной кислоты

IFNy интерферон-гамма

IGF-1 инсулиноподобный фактор роста I

IL интерлейкин

LAMP Lysosomal-Associated Membrane Protein, белок, ассоциированный с

мембраной лизосом

LMA-1 фактор стабилизации t-SNARE

Ipf липофектин

МАРК митоген-активируемая протеинкиназа

MDR, МЛУ множественная лекарственная устойчивость

МНС главный комплекс гистосовместимости

MRP multidrug resistance-associated protein - белок, ассоциированный с

множественной лекарственной устойчивостью, АВСС

МТХ метотрексат

mycASON антисмысловой олигонуклеотид к мРНК с-тус

NBD нуклеотид-связывающие домены

NBS сыворотка новорожденных телят

NLS сигнал ядерной сигнализации

NSF N-этилмалеимид-чувствительный фактор, NEM-Sensitive Factor

OFA олигофектамин

ON олигонуклеотиды

ONs модифицированные тиофосфатные олигонуклеотиды

PBS фосфатно-солевой буфер

PBSD фосфатно-солевой буфер в модификации Далбекко

PDPH гидразид 3-(2-пропидилдитио)пропионовой кислоты

РЕ псевдомонадный экзотоксин

PGA Protein Gen-carrier based on AFP, белковый переносчик генов на

основе альфа-фетопротеина PGEk Protein Gen-carrier based on Epidermal Growth Factor, белковый

переносчик генов на основе эпидермального фактора роста Pgp гликопротеин Р170, MDR1, АВСВ1

PI3K/AKT PI3K/AKT протеинкиназа

PIP3 фосфотидилинозитол-3,4,5-трифосфат

РКС протеинкиназа С

PL полилизин

PMSF бензилсульфонилфторид (phenylmethylsulfonyl fluoride), ингибитор

сериновых протеиназ PRD богатый пролином домен

PTEN phosphatase and tensin homolog, фосфатаза с двойной субстратной

специфичностью, продукт гена PTEN, опухолевый супрессор Rab5 малый G-белок

гАФП27 рекомбинантный С-концевой фрагмент АФП

SATA Ы-сукцйНймидил-8-ацетилтиоацетат

siRNA малые интерферирующие РНК

SNAP, Soluble NSF Attachment Protein, белки, участвующие в

SNARE Soluble NSF Attachment Protein REceptor кавеолин-зависимом

v-SNARE (vesicle), t-SNARE (target) эндоцитозе

SPDP N-оксисукцинимидный эфир 3-(2-дитиопиридил) пропионовой

кислоты

TERT telomerase reverse transcriptase - теломеразная обратная

транскриптаза

TGFp трансформирующий фактор роста Р

TMDs

TMO

TRAIL

Trf TfR Vb

VEGF VIP21

A.o.

АФК

АФП

АФПР

БАВ

ГЦР

ДМСО

ДНР

ДОКС, DOXO

ДТНБ

ДТТ

ИФА

MAt

МЛУ

OCA

ПААГ

ПЭГ, PEG

РОЭ

РЭС

САД

Т-ПЛЛ

TPO

трансмембранные домены

олигонуклеотид, имитирующий теломерные повторы РНК-субъединица теломеразы

tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, цитокин

семейства факторов некроза опухоли, лиганд, вызывающий апоптоз

трансферрин

рецептор трансферрина

винбластин

эндотелиальный сосудистый фактор роста

Vesicular Integral-membrane Protein, везикулярный интегральный

мембранный белок 21 кДа, локализован в неокаймленных везикулах

аскорбиновая кислота

аминокислотные остатки

активные формы кислорода

альфа-фетопротеин

рецептор альфа-фетопротеина

биологически-активные вещества

гепатоцеллюлярный рак

диметилсульфоксид

даунорубицин

доксорубицин

5,5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота) дитиотреитол

иммуноферментный анализ моноклональные антитела множественная лекарственная устойчивость опухолеспецифические антигены полиакриламидный гель полиэтиленгликоль рецептор-опосредованный эндоцитоз ретикуло-эндотелиальная система сывороточный альбумин

система адресной доставки лекарственных препаратов Т-пролимфоцитарный лейкоз торможение роста опухоли

Тф терафтал

УСПЖ увеличение средней продолжительности жизни

ФГА фитогемагглютинин

ФДТ фото динамическая терапия

ФИТЦ флуоресцеинизотиоционат

ФС фотосенсибилизаторы

ФЦ фталоцианины

хлл хронический лимфолейкоз

Введение

Избирательность действия лекарственного препарата может быть повышена за счет использования в системах доставки адресных агентов - молекул, способных связываться со специфическими детерминантами на поверхности клеток. Таким образом, использование адресного компонента определяет взаимодействие системы избирательной доставки со строго определенными клетками и тканями, в частности, опухолевыми. В качестве адресных агентов, или векторов, могут выступать физиологические лиганды рецепторов факторов роста или онкофетальных белков, т.е. сами факторы роста и онкофетальные белки. Противоопухолевый препарат может быть соединен с вектором ковалентно с образованием конъюгата, либо нековалентно, с образованием прочного комплекса. Связывание адресной молекулы со специфическим рецептором на поверхности клетки индуцирует процесс рецептор-опосредованного эндоцитоза, который обеспечивает аккумуляцию опухолевыми клетками лекарственного препарата, молекулярная мишень которого находится внутри клетки.

Необходимо отметить, что в некоторых случаях использование систем избирательной доставки является единственным способом, позволяющим использовать

терапевтический потенциал некоторых высокотоксичных противоопухолевых антибиотиков, например, антибиотиков ендиинового ряда. В качестве примера можно привести препарат Милотарг, представляющий собой конъюгат калихемицина Xi с гуманизированными антителами к CD33. Кроме того, применение высокоэффективных систем доставки может существенно повысить терапевтический эффект антисмысловых олигонуклеотидов, которые, к сожалению, пока не нашли применения в клинической практике.

Информация о работе

Посыпанова, Галина Ароновна
доктора биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.04

Диссертация

Использование белковых и пептидных векторов для избирательной доставки противоопухолевых препаратов и терапевтических олигонуклеотидов в опухолевые клетки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы