Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание металлорганических магнитных наночастиц как потенциальных агентов адресной доставки противоопухолевых средств и исследование их физико-химических свойств

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Создание металлорганических магнитных наночастиц как потенциальных агентов адресной доставки противоопухолевых средств и исследование их физико-химических свойств"

На правах рукописи

005050120

Кондрашина Ольга Владимировна

СОЗДАНИЕ МЕТАЛЛОРГА1ШЧЕСКИХ МАГНИТНЫХ НАНОЧАСТИЦ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ АГЕНТОВ АДРЕСНОЙ ДОСТАВКИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СРЕДСТВ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

Специальность 03.01.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 ФЕВ 2013

Воронеж 2013

005050120

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» (ФБГОУ ВПО «ВГУ»),

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Артюхов Валерий Григорьевич

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Максимов Георгий Владимирович

доктор биологических наук, профессор, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, профессор кафедры биофизики биологического факультета,

Федорин Дмитрий Николаевич

кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет», доцент кафедры биохимии и физиологии клетки.

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н. И. Пирогова

Защита диссертации состоится «/¿|>> марта 2013 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д.212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006 г. Воронеж, Университетская пл. 1., комната 59.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и на сайте Воронежского государственного университета www.vsu.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан «/^>> февраля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Грабович М.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Важнейшей задачей молекулярной биофизики и фармации является поиск новых эффективных лекарственных препаратов комбинированного действия, содержащих в своем составе фрагменты с различными видами терапевтической и биологической активности. В настоящее время особую значимость приобретают исследования молекулярных механизмов адресной доставки лекарств, позволяющих добиться повышения эффективности лечения с использованием уже существующих средств в клинической терапии. Одним из наиболее используемых методов лечения опухоли является лучевая терапия, вызывающая дегенерацию опухолевой ткани или подавление роста злокачественных клеток. Однако применение ионизирующих излучений может привести к негативным побочным воздействиям на здоровые ткани и системы органов человека в виде локальных и отдаленных последствий. Есть основания полагать, что применение нейтрон-захватывающей терапии (НЗТ) позволит решить многие проблемы клинической радиотерапии и повысит процент выживаемости онкологических больных.

Гадолиний-157 обладает высоким градиентом накопления вещества в опухоли и максимальным сечением захвата тепловых нейтронов — 255 ООО барн. Но непосредственное применение гадолинийсодержащих фармацевтических препаратов в НЗТ затруднено из-за высокой токсичности ионов гадолиния и значительности воздействия вторичного у-излучения на здоровые ткани, окружающие опухоль.

Идеи применения магнитных наночастиц для повышения клинической эффективности лекарств основаны на том, что вещества, созданные с помощью нанотехнологических подходов, отличаются по своим физико-химическим свойствам от соединений, полученных в традиционной лекарственной форме. Магнитные наночастицы можно позиционировать с помощью магнитного поля, а также бесконтактно управлять их перемещением в органах и тканях за счет воздействия внешнего магнитного поля. Клетки транспортируют магнитные наночастицы в «мишени», а

магнитное поле дополнительно фокусирует и . локализует зону терапевтического воздействия.

До настоящего времени остаются недостаточно изученными модельные системы, имитирующие адресную доставку ионов гадолиния в очаг поражения при злокачественных новообразованиях. Не исследованы особенности процесса формирования комплексов гадолиния с холестерической жидкокристаллической дисперсией (ХЖКД) ДНК и возможности адресной транспортировки ионов гадолиния с помощью магнитных наночастиц и макрофагов в злокачественные опухоли.

Цель настоящей работы состояла в создании методов получения и исследования свойств наночастиц - носителей ионов Ос13+ как агентов адресной доставки противоопухолевых средств.

Задачи исследования:

1. Разработать модельные системы, имитирующие адресную доставку гадолиния в составе частиц ХЖКД комплекса [ДНК-Оё] к клеткам мишени.

2. Показать принципиальную возможность использования частиц ХЖКД [ДНК-Ос1] для НЗТ в качестве системы адресной доставки 157Оё в опухоль.

3. Разработать способ получения стандартного образца частиц ХЖКД [ДНК-Ос1] и обосновать методы оценки качества получаемой системы.

4. Предложить и обосновать возможный механизм появления новых свойств полученных частиц ХЖКД [ДИК-вс!].

Научная новизна. Разработан способ получения ХЖКД ДНК с заданными характеристиками. Впервые получены наноскопические частицы ХЖКД ДНК, содержащие ионы редкоземельных элементов. Стратегия данного подхода принципиально отличается от классических способов создания подобных препаратов (на основе гадопентетовой кислоты и наночастиц на основе хитозана и др.). Частицы ХЖКД комплекса [ДИК-вс!] сохраняют свои свойства в течение длительного времени (более 200 суток).

В результате выполнения данной работы был разработан новый стабильный биоматериал. Комбинация размера наночастиц при максимально

известной на сегодняшний день локальной концентрации гадолиния в частицах (400 мг/мл) и их стабильности открывает путь к практическому применению этого нового биоматериала в качестве основы для Ос1-НЗТ.

Научная и практическая значимость работы. Получен достаточно стабильный, не обладающий цитотоксичностыо, комплекс [ДНК-Оё] с максимальной локальной концентрацией гадолиния. Свойства этого комплекса заметно отличаются от свойств классических холестериков ДНК. Локальная концентрация гадолиния в частице может достигать 400 мг/мл (т.е. до 30% от массы частицы), что делает ее уникальной по сравнению с существующими на сегодняшний день препаратами. Жидкокристаллические свойства наночастиц комплекса дают возможность доставлять гадолиний в ткань опухоли, а их магнитные свойства позволяют осуществлять активную диффузию С<1 и удерживать его необходимое время с помощью сильного магнитного поля. Вследствие высокой локальной концентрации гадолиния его воздействие происходит точечно (радиус воздействия —100 мкм вокруг частицы), что максимально сохраняет здоровые ткани организма.

Концентрация гадолиния легко контролируется простыми оптическими методами. Эффективность применения данной наносистемы адресной доставки лекарственного вещества заметно превосходит эффективность

Ют-»

препаратов с В и других препаратов на основе гадолиния.

Положения, выносимые на защиту:

1. Способ получения наночастиц ХЖКД комплекса [ДНК-Ос1] на основе молекул нуклеиновых кислот и ионов гадолиния вс13+, связанного в составе частиц с заданными стабильными физико-химическими свойствами.

2. Стандартизация и контроль качества комплекса ХЖКД [ДНК-0(1] с помощью оптических методов.

3. Обоснование возможности использования комплекса ХЖКД [ДНК-Ос1] в качестве инструмента для НЗТ как системы адресной доставки гадолиния в ткань опухоли.

4. Возможность адресной доставки комплекса ХЖКД [ДНК-Gd], используя магнитное поле или клетки-переносчики.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на Международной Путинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2005); И-ом Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2005» (Москва, 2005); 4-ой Всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармобразование - 2010. Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых физиологически активных веществ» (Воронеж, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе в журналах, входящих в список ВАК РФ, - 7.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из Перечня использованных сокращений, Введения, трех глав (Обзора литературы, Экспериментальной части и Обсуждения результатов), Заключения, Выводов, Списка литературы (244 источника). Иллюстрационный материал включает 20 рисунков, 6 таблиц и одну блок-схему.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Дана характеристика методов молекулярной биофизики, направленных на создание систем адресной доставки лекарственных веществ в ткани опухолей. Описаны различные подходы по применению НЗТ для лечения злокачественных заболеваний, способов фокусировки и удержания гадолиния в тканях опухоли на период облучения с помощью нанотехнологических методов.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служил препарат ДНК тимуса теленка («Sigma», США), а также полиэтиленгликоль (ПЭГ) («Sigma», США) с молекулярной массой 4000 Да и метакрилатный макромономер

полиэтиленоксида (М = 4000 Да), препараты хлоридов солей редкоземельных элементов - гадолиния, лантана, неодима, празеодима, самария, тербия и иттербия (чистота 99,99%). Эксперименты по исследованию токсичности наночастиц ХЖКД [ДНК-Gd] проводили на белых мышах линии Vistar массой 18-20 г, содержавшихся в условиях вивария.

Изучение ДНК и ее фрагментов проводили в камере вертикального электрофореза VE-2M (Россия) при температуре 0-4 "С и напряжении 100 В в течение 60 мин. Визуализацию молекул ДНК осуществляли посредством ультрафиолетового облучения геля с треками ДНК при длине волны 312 нм, используя краситель SYBR Green I.

Образование ХЖКД двухцепочечной ДНК осуществляли по методу Ю.М. Евдокимова (1989) и контролировали путем определения оптической плотности раствора ДНК при 350-600 нм.

Сканирование образцов проводили на атомно-силовом микроскопе «P47-SPM-MDT» (Зеленоград) в полуконтактном режиме с использованием стандартного кантилевера из нитрида кремния (жесткость 5,5 Н/м, резонансная частота 150 кГц, радиус кривизны иглы 10 нм).

Рентгенографический анализ ХЖКД [ДНК-Gd] провели при помощи малоуглового дифрактометра с линейным позиционно-чувствительным детектором «Амур-K» (Институт кристаллографии РАН, Москва). Положения максимумов на кривых рассеяния рентгеновских лучей рассчитывали, пользуясь формулой Брэгга: ПБрхг = ( )/l)sirt( 2в/2), где X -длина волны рентгеновского излучения (1,54 нм), 20- угол рассеяния.

Для активации образцов, содержащих комплекс ХЖКД [ДНК-Gd], использовали нейтронный генератор НГ-400 при энергии быстрых нейтронов 14,8 МэВ. Для получения быстрых нейтронов применяли титан-тритиевую мишень. Плотность потока быстрых нейтронов с энергией 14,8 МэВ на образцы составляла 2109 нейтрон/см2с. Для нормировки использовали фольгу (0,11 мм) из чистого гадолиния. Интенсивность у-излучения измеряли коаксиальным Ge-детектором IGG-45 со следующими параметрами: объем Ge - 200 см3 , эффективность излучения- 45%, разрешение - 2,2 кэВ (для энергии 1,33 МэВ).

Измерение магнитного момента намагниченных образцов осуществляли на сквид-магнитометре. Однородное магнитное поле создавали ниобий-титановой трубкой, находящейся в гелиевой ванне. Магнитное поле измеряли датчиком Холла с погрешностью 2%, а температуру - с помощью Cu-CuFe-термопары со статистической ошибкой 0,1 К.

При атомно-змиссионном анализе ХЖКД комплексов [ДНК-Gd] образцы подвергали озолению при температуре ~400°С и растворяли в 5 М HCI. Концентрацию гадолиния в полученном растворе определяли на плазменном атомно-эмиссионном спектрометре JY-38P.

Спектры кругового дихроизма регистрировали при помощи портативного дихрометра СКД-2 (кварцевые кюветы с длиной оптического пути в 1 см).

Макрофаги выделяли введением внутрибрюшинно 5 мл раствора Хэнска из предварительно декапитированной и обескровленной мыши линии Vistar. Полученную жидкость центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин. Подсчет клеток производили в камере Горяева и доводили до 106 кл/мл. Жизнеспособность клеток изучали путем окрашивания их водным раствором трипанового синего (0,5%) в камере Горяева через 40 мин, 24 часа и 72 часа.

При исследовании макрофагов с помощью флуоресцентной наноскопии в питательную среду, содержащую макрофаги, добавляли липофильные красители на основе аминостирилов - FM1-43 (Synaptogreen СЗ), FM4-64 (SynaptoRed С2), концентрации - 10"'2 М. Они обеспечивали окрашивание и флуоресценцию цитоплазматических мембран клеток. Затем клетки подвергали воздействию монохроматического света с длиной волны от 300 до 780 нм. Облучение проводили последовательно с шагом 1 нм. Запись сигнала регистрировали автоматически с помощью компьютера, затем изображения последовательно накладывали друг на друга с помощью программного обеспечения, разработанного Д.А. Климовым (2005) из ООО «Стерионик».

Метакрилатный гидрогель получали радикальной полимеризацией гидрофильных мономеров полиэтиленоксида с помощью сшивающего метилен-2-метакрилата. Для этого в кювету с 2 мл раствора полиэтиленоксида добавляли 0,1 мл мстилен-2-мстакрилата. Смесь аккуратно размешивали и инкубировали в течение суток для установления равновесия в анализируемой системе.

Все экспериментальные исследования осуществлялись в 4-5-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась на персональном компьютере с помощью программы статистической обработки данных Origin-98 традиционным способом с использованием /-критерия Стыодента при 95% уровне значимости.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Формирование комплексов ХЖКД двухценочечной ДНК.

Проведены исследования процесса формирования жидкокристаллических комплексов ДНК с применением ПЭГ. Показано, что эта система представляет собой частицы жидкокристаллической дисперсии, распределенные в растворе ПЭГ. В спектре кругового дихроизма жидкокристаллической дисперсии ДНК имеет место амплификация, сопровождающаяся появлением аномальной полосы при 270 нм. Ее интенсивность зависит от степени спирализации холестерика, т.е. ДНК.

3.2. Формирование комплекса ХЖКД с гадолинием. К сформированной ХЖКД ДНК добавляли раствор хлорида гадолиния в различных концентрациях и наблюдали вторичную амплификацию спектра кругового дихроизма. На рис.1 представлены спектры кругового дихроизма ХЖКД ДНК в отсутствие (кривая /) и в присутствии Ос1С1з (кривые 2-6). Здесь АЛ = (Л[.— Ая) представляет собой разность коэффициентов поглощения света соответственно с левой и правой круговой поляризацией. Амплитуда аномальной отрицательной полосы, характерной для ХЖКД ДНК, увеличивается приблизительно в 2,5 раза при концентрации С(1С1з 2,92-10"3 М. Для жидкокристаллической дисперсии зарегистрирован сдвиг

Рис. 1. Спектры кругового дихроизма ХЖКД ДНК в отсутствие (кривая /) и в присутствии (кривые 2-6) Сс1С1з: А А = (А^-Ая); ААом, = [ААмат. -ДА-,]/\АЛ макс ]> Где ААмакс ЦАА++АА"]. Концентрация Ос1С1], М: 2- 2,49-ю-4; 3 - 4,97 - Ю-4; 4 - 9,80 -10"4 ;

0

1макс

-ю-

г4 •

240 260 280 300 320 340 360 Длина волны, нм

5 - 1,48 • 10 ; 6 -2,92-10 .

г3 • Л - 7 ч? - 1П"3

отрицательной полосы спектра кругового дихроизма в длинноволновую область.

3.3. Исследование взаимодействия двухцепочечной линейной ДНК с ионами С(13\ При инкубировании нагивной ДНК с С<ЗС13 раличных концен-фаций установлено, что спектр кругового дихроизма, характерный для исходной В-формы ДНК (кривая 1 на рис.1), искажается. Положительная полоса при X - 280 нм изменяет свой знак при концентрации ОсЮЬ 3-Ю"5 М, а амплитуда отрицательной полосы увеличивается, причем ее максимум смещается в красную область спектра (рис.2). Аналогичные изменения формы спектров наблюдали при взаимодействии ионов других редкоземельных металлов (Ьа, ИЬ, Бт, ТЬ, Ей, УЬ) с молекулами ДНК.

Показано, что при формировании ХЖКД из ДНК, уже обработанной гадолинием, образуются частицы, лишенные холестерической структуры (рис.3), однако имеет место поглощение в области Я > 350 нм, где ни ДНК, ни ПЭГ не поглощают. Сохранение «кажущейся оптической плотности» свидетельствует о том, что частицы комплексов [ДНК-Оё] присутствуют в растворе в аморфном состоянии. Возникновение комплексов Ос!3 с парами оснований ДНК не влияет на способность молекул ДНК к образованию частиц дисперсии, но нарушает характер узнавания соседних комплексов [ДНК-Ос1] при их пространственном сближении в результате фазового

Рис. 2. Спектры кругового дихроизма линейных двухцепочечных молекул ДНК в отсутствие (кривая /) и в присутствии (кривые 2-7) ОёСЬ: ЛА={А1- А,0; ¿Л„„,„ = - АА-, ] / [ ААМШС ],

где ААЛ,„КС= ЦАА*+АА']. Концентрации всЗСЬ, М:

2-110"5; 4- 3 105; 6-610"5;

3-2-10'5; 5-4-10"5; 7 - 7 -10"5

Длина волны, нм

Рис. 3. Спектры кругового дихроизма ХЖКД, сформированной из молекул ДНК, предварительно обработанных разными концентрациями всЮз; АА = (Ли -Ац). Кривая 1 -ХЖКД в отсутствие Сс1С13; 2- 0,6105 М вёСЬ; 3-11()-5М

оась

исключения. Образуется частица, которая лишена упорядоченности, свойственной жидким кристаллам. Положительный заряд на поверхности комплекса [ДНК-Gd] обусловлен связыванием мультизарядных ионов, что препятствует слипанию частиц, т.е. переходу в единую фазу.

3.4. Визуализация наночастиц ХЖКД комплексов [ДНК-Gd]. Данные атомно-силовой микроскопии (АСМ) свидетельствуют (рис. 4) о том, что средний размер частиц ~ (4-5)-102 нм. Это практически совпадает с размером частиц ХЖКД, полученных из исходной ДНК. При обработке ХЖКД ДНК хлоридом гадолиния «жидкий» характер упаковки молекул исчезает, и они приобретают жесткую пространственную структуру. Из рис.5 следует, что размер частиц колеблется от 100 до 700 нм. Наибольшее число частиц комплексов [ДНК-Gd] имеет диаметр ~ 500 нм.

200

■ ■ * ' .. • • «" .....1 ■ =Т 180 -

í г » • »• ж ч* • < \ . *' > s 6 го з- 160 -

Ш* * " »* ¿ ••• зіниі 0 1 140 '

. * • ' ■ 1» / - ** .Ib. ■ я ИИНИННН"ЯЙН№* 1КI VA, ж J- 120 -100 -ао -

60 •

4 « ■ . 1« * • ;./ к* і' * 40 20 -

щт # щ^. » s • * . . 5 t 0 -

0

Рис.4. АСМ-изображение частиц ХЖКД ДНК, обработанных ОсІСЬ и иммобилизованных на поверхности ядерного мембранного фильтра (размер поля — 10x10 мкм2).

100 200 300 400 500 600 700 Диаметр частиц, км

Рис. 5. Распределение частиц ХЖКД комплекса [ДНК- Осі] по размеру

3.5. Рентгенографические спектры фаз ХЖКД комплекса [ДНК-

Сс1]. Регистрацию кривых малоуглового рассеяния рентгеновских лучей проводили в области углов от 0,2 до 10°. Рис. 6 представляет собой зависимость величины брэгговского максимума 1 на кривых малоуглового рассеяния рентгеновских лучей фазами комплексов ХЖКД [ДНК-ОсЦ от обратного расстояния 5, которое проходят рентгеновские лучи в кристалле

(А-1). При анализе результатов рентгенографического исследования обнаружено, что для ХЖКД комплекса [ДНК-С<1] характерен малоугловой

рентгеновский рефлекс, лежащий в пределах от 31 до 53 А. При концентрации гадолиния 3-10 5 - 5-10 5 М характеристический брэгговский пик, определяющий степень упорядоченности структуры ХЖКД, исчезает (рис. 6, кривая 2). Трансляционный порядок в расположении соседних молекул ДНК нарушается вплоть до его полного исчезновения при концентрации Ос1С1з ~ 3 10"5 М. Показано, что амплитуда аномальной полосы

л

0,1 ■

0.2 . I \

I

\

Рис.6. Кривые малоуглового рассеяния рентгеновских лучей холестерической жидкокристаллической фазой ДНК в отсутствие (кривая /) и в присутствии вёСЬ (кривая 2). По оси абсцисс отложено обратное расстояние которое проходят рентгеновские лучи в кристалле, по оси ординат -оптическая плотность А

0

0.1

0,2

0.3

5. ГАГ

в спектре кругового дихроизма ХЖКД комплексов [ДНК-ОсЦ резко увеличивается. Вероятнее всего, такая структура состоит из чередующихся нерегулярных фрагментов, имеющих конформацию типа правоспиральной Ви левоспиралыюй 2-формы ДНК.

3.6. Определение концентрации гадолиния в ХЖКД комплекса [ДНК-вс!] с помощью магнитометрического метода. Магнитный момент Р,„ образца определяли как Р,„ = 4,419-10"9 Ык„, где Ыка - отсчет квантового магнитометра. Удельную намагниченность образца получали делением Рт на массу образца. Удельную магнитную восприимчивость худ рассчитывали по формуле Хул = М/и/ В, где В - магнитная индукция; - удельная намагниченность (А м2/кг); М - магнитная постоянная (4л-10"7 Гн/м). Установлено, что число молекул ДНК в таблетке равно 3.00-1015. Соответственно, на каждую молекулу ДНК приходится Ы*с,УЫдНК = 2600 ионов Ос13н. Число витков спирали в ДНК равно (8-106)/(6,6- 103) ~ 120, то есть на каждом витке спирали расположено Сс13+-ионов 2600/120 = 21,7.

3.7 Определение концентрации гадолиния в ХЖКД [ДНК-Сф методом нейтрон-активационного анализа. Массу гадолиния в образцах определяли по формуле: та = тнАыТнТ) / ТаАн , где ты, Ааа, Тва~ масса, активность и время измерения образцов ХЖКД комплекса [ДНК-Ос!]; тн, Ан, Тн ~ масса, активность и время измерения нормировочных образцов; г/ -

поправка на распад 159С(1 в образцах за время измерения и время выдержки. Последнюю можно рассчитать по закону радиоактивного распада: т] — ехр(0,693ЛТ /Т1/2); ЛТ - разность времён выдержки исследуемых ХЖКД и нормировочных образцов, Т,,2 - период полураспада радионуклида 159Сё исследуемых ХЖКД и нормировочных образцов. Во всех наших опытах ЛТ мало, т.е. поправка 77 близка к 1. В контрольном образце при точности анализа 210"3 гадолиний не обнаружен. Установлено, что в насыщающих условиях на 1 нуклеозид ДНК в составе комплекса [ДНК-Ос1] приходится 1,5 атома гадолиния, то есть локальная концентрация гадолиния в частицах может достигать 400 мг/мл (-30% от массы частицы).

3.8 Определение стабильности наночастиц ХЖКД [ДНК-Сс1].

Установлено, что в процессе хранения амплитуда аномальной оптической полосы увеличилась примерно на 5%, что может свидетельствовать об упорядочивании молекул кристалла и уменьшении свободной энергии системы ХЖКД [ДНК-ОсЦ. Рентгенографические исследования ХЖКД [ДНК-йс!], проведенные после 200 дней хранения в лабораторных условиях, не выявили существенных различий в свойствах кристалла.

Наличие в составе ХЖКД [ДНК-Ос1] жесткоцепных молекул ДНК, содержащих фосфатные группы, с которыми ионы редкоземельных металлов образуют малорастворимые соединения (произведение растворимости ~ 10"12), обусловливает получение стабилизированного, не изменяющего во времени своих свойств материала с расширенным интервалом условий его существования. Полученные данные позволяют заключить, что стабильность наночастиц ХЖКД [ДНК-Ос!] не изменяется при хранении в условиях лаборатории в течение 6 месяцев.

3.9,Оценка цитотоксичности наночастиц ХЖКД [ДНК-Сй].

Внесение раствора Ос1С1з (100 мкл, концентрация 6-Ю"5 М) в питательную среду к макрофагам белых мышей приводило через 40 мин инкубации к гибели 40% клеток. Через 24 и 72 часа все клетки при воздействии ионов гадолиния погибали. Введение ХЖКД ДНК в питательную среду, в которой находятся макрофаги (100 мкл, концентрация ДНК - 2-10"7 М),

сопровождается достоверным уменьшением числа выживших клеток. Результаты экспериментов показали, что включение ионов гадолиния в наночастицы ХЖКД ДНК значительно снижает его токсическое воздействие на макрофаги. Очевидно, что этот редкоземельный элемент прочно удерживается внутри ианочастиц и не вымывается питательной средой. Наночастицы, полученные на основе ХЖКД [ДНК-СсГ], сохраняют свою стабильность в биологических тканях и могут быть использованы в медицине.

3.10. Моделирование диффузии магнитных ианочастиц ХЖКД [ДНК-Сс1] в капиллярах опухоли. Учитывая специфические магнитные свойства ионов гадолиния, было проведено исследование магнитной восприимчивости и возможности управления наночастицами с помощью магнитного поля внутри системы, моделирующей просветы капилляров.

В кювету размером 0,5x1x3 см3 наливали 0,5 мл смсси, содержащей наночастицы, и осуществляли процесс радикальной полимеризации с помощью метил-2-метакрилата. Затем аккуратно наслаивали еще 1 мл смеси гидрогеля без гадолиния. Гидрогель помещали в сквид-магнитометр и подвергали действию магнитного поля в течение 2 час при температуре 25°С. Регистрация спектра кругового дихроизма показала, что под действием магнитного поля происходит диффузия ианочастиц внутри полимерной сетки.

3.11. Иммобилизация ианочастиц на мембранах макрофагов.

Клетки инкубировали в течение 40 мин с наночастицами, содержащими ионы Еи3+, затем дважды отмывали раствором Хенкса с последующим центрифугированием и осуществляли окрашивание цитоплазматических мембран красителями РМ1-43 и РМ4-64 (концентрация - 10"12 М). Процесс иммобилизации ианочастиц на макрофагах контролировали методом флуоресцентной наноскопии и получали трехмерное изображение клеток с наночастицами, иммобилизированными на мембранах. Так как макрофаги имеют свойство концентрироваться в районе опухоли, можно ожидать, что иммобилизация ианочастиц на их мембранах приведет к лучевой гибели

клеток очага опухоли, т.е. локально, что позволит снизить возможную дозу гадолиния и интенсивность нейтронного потока.

3.12. Моделирование ІІЗТ с помощью наночастиц, иммобилизованных на макрофагах. Суспензию клеток культивировали в пластиковых флаконах по 1 мл в питательной среде 11РМ1-40 (МО6 кл/мл) при 5%-ном содержании С02 и температуре 37°С. Образцы 1-4 подвергли облучению нейтронами (таблица). Можно отметить, что тепловые нейтроны не оказывают радиационного воздействия на метаболизм макрофагов, так как не обладают достаточной энергией для лучевого поражения на клеточном уровне. Например, при однократном облучении тепловыми нейтронами в контрольных образцах через 40 мин оказалось 95% жизнеспособных клеток, а через 72 часа после облучения - 86%.

Таблица. Выживаемость макрофагов после нейтронного облучения

Номер образца % выживших клеток после облучения через

40 мин 24 час 72 час

1- контрольный образец 95 ±5 84 ±4 86 ±4

2 - клетки + ХЖКД ДНК 95 ±5 84 ±4 72 ±3

3 - клетки + наночастицы 0 0 0

4 - наночастицы - - -

5 - макрофаги, культивируемые в термостате 100 ±5 98 ±5 93 ±5

3.13. Разработка методики стандартизации и контроля качества ХЖКД комплекса [ДИК-вс!] с помощью оптических методов. Для

контроля качества, концентрации препарата ДНК и его чистоты необходима регистрация спектров поглощения (;.тах = 258 нм), т.е. зависимость оптической плотности от длины волны света, падающего на объект: И = е1С, где £> - оптическая плотность, е - молярный коэффициент экстинкции, / -длина оптического пути, С - концентрация (М). При исследовании аналитической полосы поглощения ДНК измеряют ее максимум.

3.14. Разработка технологии получения наночастиц на основе ХЖКД ДНК и гадолиния. Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать способ изготовления наночастиц на ХЖКД, сформированной в водно-солевом растворе ПЭГ из молекул двухцепочечной ДНК и связанных в комплексе с ионами гадолиния (схема). Процесс приготовления ХЖКД [ДНК-Gd] имеет 5 этапов.

1. Приготовление исходного водного раствора GdCl3 (чистота 99,9 %) концентрации 0,1 М.

2. Приготовление водно-солевого раствора ДНК (2-10"7 М). Для получения раствора двухцепочечной ДНК рекомендуется использовать низкомолекулярную ДНК (Sigma, США) и водно-солевые растворы NaCl (0,3 М).

3. Перемешивание растворов двухцепочечной ДНК и ПЭГ (8,5-10~5 М) с помощью миксера «Vortex» в течение 5 мин и последующая инкубация в течение 1 час при температуре 25°С.

4. Контроль образования ХЖКД ДНК путем помещения 2 мл исходного материала в кювету и регистрации спектра кругового дихроизма. Появление интенсивной отрицательной полосы поглощения при Я = 270 нм свидетельствует об образовании ХЖКД двухцепочечной ДНК.

5. Для образования комплекса ХЖКД ДНК с ионами гадолиния необходимо добавить водный раствор хлорида гадолиния (3 ■ 10"3 М) к уже сформированной дисперсии двухцепочечной ДНК, содержащей ПЭГ. Далее следует их перемешивание в течение 1 мин при комнатной температуре. Затем определяют амплитуду отрицательной полосы поглощения на спектре кругового дихроизма, при X = 270 нм. Ее двукратный прирост по сравнению с исходным спектром и смещение в область с большей длиной волны свидетельствует о том, что ионы гадолиния образуют наночастицы ХЖКД [ДНК-Gd].

Образованные наночастицы на основе двухцепочечных ДНК низкой молекулярной массы и ионов гадолиния могут быть иммобилизованы на поверхности макрофагов, применяющихся для адресной доставки наночастиц с лекарственными веществами непосредственно в объем

Схема получения напочастиц ХЖКД[ДНК-С(1]

опухоли. Локальная концентрация гадолиния в наночастице может достигать 400 мг/мл.Частицы ХЖКД комплекса [ДИК-всТ] сохраняют свои свойства в течение 200 суток и остаются стабильными в температурном интервале от 0 до 50°С.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время проводятся многочисленные исследования, направленные на изучение возможности применения гадолиния в качестве нейтрон-захватывающего нуклида. Одной из главных причин, сдерживающих применение гадолиния как перспективного вещества для НЗТ, является токсичность свободного гадолиния. Необходимость получения лекарственного соединения, обеспечивающего высокую концентрацию гадолиния в опухоли и значительное время локализации его после введения в очаг поражения, а также безопасность его применения предполагает ряд подходов к решению этой задачи.

В диссертационной работе предлагается метод получения наночастиц на основе ХЖКД комплекса [ДНК-Gd], основанный на обработке частиц ХЖКД исходной двухцепочечной ДНК водным раствором GdClj. Показано, что гадолиний взаимодействует с двухцепочечной ДНК, связываясь как с ее фосфатными группами, так и с азотистыми основаниями. При этом происходят структурные изменения В-формы ДНК, о чем свидетельствуют изменения в спектрах кругового дихроизма исходной низкомолекулярной ДНК и наночастиц, полученных на основе комплекса ХЖКД ДНК и редкоземельного элемента гадолиния.

Существование независимых частиц подтверждает гипотезу о появлении некомпенсированного положительного заряда на частицах ХЖКД [ДНК-Gd]. Такая стабилизация пространственной структуры наночастиц ХЖКД, в свою очередь, препятствует агрегации и образованию однородной фазы комплекса [ДНК-Gd].

АСМ-изображение единичных наночастиц свидетельствует о том, что при обработке GdCl3 растворимость двухцепочечных ДНК значительно уменьшается, и возникает жесткая пространственная структура. Методом АСМ показано, что данная структура имеет форму, близкую к сферической, а найденный с помощью атомно-силового микроскопа диаметр близок к 500 нм. Наночастицы состоят из ~103 молекул ДНК, и на одну молекулу в среднем приходится 1,5 атома гадолиния. Наночастицы содержат 80% воды и 20% нуклеозидов комплекса [ДНК-Gd]. Они сохраняют в течение 200 суток значительную концентрацию гадолиния (-400 мг/мл) и могут быть иммобилизованы на макрофагах, выделенных из тканей человека с целью адресной доставки в очаги поражения.

При изучении процесса транспорта наночастиц в локальные очаги поражения нами была предпринята попытка использовать парамагнитные свойства наночастиц и контролировать адресную доставку этого нейтрон-захватывающего нуклеотида с помощью сильного магнитного поля. Измерения магнитного момента наночастиц, содержащих ион гадолиния, показывают, что этот редкоземельный элемент прочно связан с молекулами ДНК.

Адсорбционная иммобилизация наночастиц на макрофагах белых мышей приводит к увеличению стабильности наночастиц и связана, в первую очередь, с принудительным замедлением движения в водной фазе и последующим направленным взаимодействием наночастиц с очагами поражения тканей.

Наши экспериментальные данные, результаты расчетов и анализ данных литературы позволяют рекомендовать наночастицы, созданные на основе ХЖКД комплекса [ДНК-Ос1], в качестве агента для нейтрон-захватывающей терапии.

ВЫВОДЫ

1. Методами атомно-эмиссионного спектрального анализа, атомно-силовой микроскопии, рентгенографического анализа, нейтронно-активационного анализа и флуоресцентной наноскопии проведены систематические исследования процессов взаимодействия водных растворов С5с1С1з с линейными двухцепочечными ДНК и ХЖКД ДНК.

2. Разработан способ получения наночастиц на основе ХЖКД [ДНК-С<1] с высоким содержанием ионов гадолиния (до 400 мг/мл). Препарат способен храниться в условиях лаборатории в течение 200 суток без изменения физико-химических свойств.

3. Показано, что при образовании наночастиц ионы гадолиния связываются с молекулами ДНК путем взаимодействия как с фосфатными группами, так и с азотистыми основаниями, нарушая регулярный характер вторичной структуры ДНК.

4. Обнаружено, что при образовании наночастиц значительно уменьшается растворимость двухцепочечных ДНК и появляется нескомпенсированный положительный заряд на поверхности комплекса, препятствующий его агрегации.

5. Предложена методика получения наночастиц на основе комплекса ХЖКД [ДНК-С<1], включающая обработку частиц ХЖКД исходной двухцепочечной ДНК водным раствором Сс1С13.

6. Изучены магнитные свойства наночастиц, позволяющие осуществлять активную диффузию нейтрон-захватывающего нуклида гадолиния непосредственно в очаге злокачественной опухоли.

7. Осуществлена иммобилизация наночастиц путем адсорбции на макрофагах, определяющих активную адресную доставку ионов гадолиния в очаги поражения.

8. Обосновано применение наночастиц с локальной концентрацией гадолиния -400 мг/мл в качестве носителя для нейтрон-захватывающей терапии злокачественных новообразований.

Благодарность. Автор выражает особую благодарность доктору химических наук Ю.М. Евдокимову за предоставленную возможность проведения исследований на базе ИМБ РАН им. В.А. Энгельгардта и ценные советы при выполнении и обсуждении диссертационной работы.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих работах:

1. Particles of liquid-crystalline dispersious formed by (nucleic acid - rare earth element) coumplexes as a potential platform for neutron capture therapy / Y.M. Yevdokimov, V.l. Salyanov, O.V. Kondrashina, V.l. Borshevsky, S.V. Semenov, A.A. Gasanov, I.V. Reshetov, V.D. Kuznetsov, V.N. Nikiforov, S.V. Abulinichev, M.V. Mordovskoi, S.I. Potashev, V. M. Skorkin // Int. J. Biol. Macromol. - 2005. - Vol. 37. - P. 165-173.

2. Жидкокристаллические дисперсии комплексов ДНК с гадолинием -потенциальная платформа для нейтрон-захватывающей терапии / Ю.М. Евдокимов, В.И. Салянов, О.В. Кондрашина, М.А. Лагутина, A.A. Гасанов, В.Н. Никифоров, В.И. Борщевский, К.А. Дсмбо, И.В. Решетов // Доклады РАН. - 2005. - Т. 402, № 5. - С. 693-696.

3. Некоторые характеристики комплексов гадолиния с линейной и жидкокристаллическими формами ДНК / В.И. Салянов, А.И. Евсеев, В.И. Попенко, A.A. Гасанов, К.А. Дембо, О.В. Кондрашина, Э.В. Штыкова, Ю. М. Евдокимов // Биофизика. - 2007. - Т. 52, вып. 3. - С. 452-459.

4. Индуцированное изменение холестеричеекой закрутки нуклеиновых кислот катионами РЗЭ / Ю.М. Евдокимов, В.И. Салянов, О.В. Копдрашина, Э.В. Штыкова, К.А. Дембо // Письма в ЖЭТФ. - 2007. - Т. 131, вып. 3. - С. 556-566.

5. Новый биоматериал на основе комплекса (ДНК-Gd). 1 .Определение концентрации гадолиния в частицах / C.B. Акулиничев, В.М. Скоркин, В.Н. Никифоров, В.И. Салянов, А.И. Евсеев, О.В. Копдрашина, Ю.М. Евдокимов // Медицинская физика. - 2006. - № 3. - С. 64-69.

6. Копдрашина О.В. Оценка эффективности использования гибридного жидкокристаллического металлорганического наносоединения адресной доставки лекарственного вещества на основе ДНК для поражения клеток методом ,57Ос1-нейтрон-захватной терапии / О.В. Копдрашина, В.А. Быков, А.И. Сливкин // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2010. - № 10. - С. 17-23.

7. Копдрашина О.В. Жидкокристаллические дисперсии комплексов нуклеиновых кислот с редкоземельными элементами / О.В. Копдрашина, Ю.М. Евдокимов // 9-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, 18-22 апреля 2005г. - Пущино, 2005. - С. 31.

8. Магнитные свойства G(13+-hohob в молекулах ДНК, упорядоченных в частицах жидкокристаллической дисперсии. Медицинские аспекты применения / В.Н. Никифоров, A.B. Ручкин, О.В. Копдрашина, И.В. Решетов, Ю.М. Евдокимов // Медицинская физика - 2005: тез. докл. 11-го Евразийского конгресса по мед. физике и инженерии, Москва, 21-24 июня. -М., 2005.-С. 58.

9. Копдрашина О.В. Магнитные свойства гибридного жидкокристаллического металлорганического наносоединения адресной доставки лекарственного вещества как возможность управления его диффузией в тканях опухолей / О.В. Кондрашина, В.А. Быков, А.И. Сливкин // Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых физиологически активных веществ: материалы 4-й всерос. с междунар. участием науч.-метод. конф. "Фармобразование-2010", 20-22 апр.

2010 г., Воронеж. - Воронеж, 2010. - Ч. 2 : Научные основы создания новых лекарственных средств. — С. 197-199.

10. Кондрашина О.В. Физико-химические свойства жидкокристаллической дисперсии комплексов нуклеиновых кислот с редкоземельными элементами / О.В. Кондрашина, В.А. Быков, А.И. Сливкин // Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых физиологически активных веществ: материалы 4-й всерос. с междунар. участием науч.-метод, конф. "Фармобразование-2010", 20-22 апр. 2010 г., Воронеж. - Воронеж, 2010. - Ч. 2 : Научные основы создания новых лекарственных средств. - С. 195-196.

11. Кондрашина О.В. Некоторые физико-химические свойства холестерической жидкокристаллической дисперсии, влияющие на ее способность к образованию металлорганических наночастиц / О.В. Кондрашина, В.Г. Артюхов, А.И. Сливкин // Вестник Воронеж, гос. ун-та. Серия: Химия. Биология. Фармация, 2012. - №1. - С. 146-148.

Статьи № 1-6 и 11 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Подписано в печать 14.02.13. Формат 60x84 '/,„. Усл. псч. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 156.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательско-полшрафического центра Воронежскою государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кондрашина, Ольга Владимировна, Воронеж

Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет»

На правах рукописи

Кондрашина Ольга Владимировна

СОЗДАНИЕ МЕТАЛЛОРГАНИЧЕСКИХ МАГНИТНЫХ НАНОЧАСТИЦ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ АГЕНТОВ АДРЕСНОЙ ДОСТАВКИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СРЕДСТВ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

(Специальность: 03.01.02 - биофизика)

Научный руководитель: Доктор биологических наук Артюхов В.Г.

Воронеж 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Перечень использованных сокращений 5

Введение 6

Глава 1. Обзор литературы 11

1.1. Молекулярная биофизика и ДНК-нанотехнология 11

1.2. Нанотехнология и конструирование новых фармацевтических препаратов для адресной доставки лекарств 21

1.3. Воздействие магнитного поля на живые организмы и его

применение в медицине 28

1.4. Макрофаги как носители в адресной доставке фармацевтических препаратов 33

1.5. Действие ионизирующей радиации на злокачественную опухоль 36

1.6. Нейтрон-захватывающая терапия и ее применение в медицине 42

52

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Объекты исследования 52

2.2. Методы исследования 53

2.2.1. Изучение ДНК и ее фрагментов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле 53

2.2.2. Образование ХЖКД двуцепочечной ДНК по методу

Ю.М. Евдокимова 55

2.2.3. Метод атомно-силовой микроскопии 55

2.2.4. Рентгенографический анализ ХЖКД [ДНК-Оё] 57

2.2.5. Нейтронно-активационный анализ образцов ХЖКД [ДНК-Оё] 58

2.2.6. Измерение магнитных свойств гадолиния в составе комплексов

ХЖКД [ДНК-Оа] 59

2.2.7. Атомно-эмиссионный анализ ХЖКД комплексов [ДНК-Оё] 60

2.2.8. Метод оптического кругового дихроизма 61

2.2.9. Методика выделения макрофагов 63

2.2.10. Исследование макрофагов с помощью флуоресцентной

наноскопии 63

2.2.11. Радикальная полимеризация метакрилатного гидрогеля 67

2.2.12. Статистическая обработка результатов экспериментов 67

/ГО

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Формирование комплексов ХЖКД двуцепочечной ДНК 68

3.2. Формирование комплекса ХЖКД с гадолинием 73

3.3. Исследование взаимодействия двухцепочечной линейной ДНК с

ионами Оё3+ 75

3.4. Визуализация наночастиц ХЖКД комплексов [ДИК-вс!] 81

3.5. Рентгенографические спектры фаз ХЖКД комплекса [ДНК-Оё] 88

3.6. Определение концентрации гадолиния в ХЖКД комплекса

[ДНК- вё] с помощью магнитометрического метода 92

3.7. Определение концентрации гадолиния в ХЖКД [ДНК-Оё] методом

нейтрон-активационного анализа 98

3.8. Определение стабильности наночастиц ХЖКД [ДИК-вс!] 103

3.9. Оценка цитотоксичности наночастиц ХЖКД [ДИК-вё] 105

3.10. Моделирование диффузии магнитных наночастиц ХЖКД

[ДНК-Оё] в капиллярах опухоли 106

3.11. Иммобилизация наночастиц на мембранах макрофагов 110

3.12. Моделирование НЗТ с помощью наночастиц, иммобилизованных

на макрофагах 113

3.13. Разработка методики стандартизации и контроля качества

комплекса ХЖКД [ДНК-Gd] с помощью оптических методов 116

3.14. Разработка способа получения наночастиц на основе

ДНК и гадолиния 118

3.15.Методика определения пространственной упаковки комплекса

ХЖКД [ДНК-Gd] методом КД 120

Заключение 122

Выводы 124

Список литературы 126

ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АСМ - атомно-силовая микроскопия; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

[ДНК-Gd] - комплексное соединение, образованное при взаимодействии молекул ДНК и ионов гадолиния;

Gd-НЗТ - нейтрон-захватывающая терапия при помощи атомов гадолиния;

КД - круговой дихроизм;

МРТ - магнитно-резонансная томография;

НЗТ - нейтрон-захватывающая терапия;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТАЕ - буфер трис-ацетат-ЭДТА;

ТЕ - буфер трис-ЭДТА ;

трис - трис(гидроксиметил)аминометан;

ХЖКД - холестерическая жидкокристаллическая дисперсия;

ХЖКД ДНК - холестерическая жидкокристаллическая дисперсия, состоящая из молекул ДНК;

ХЖКД [ДНК-Gd] - холестерическая жидкокристаллическая дисперсия, состоящая из молекул ДНК, образовавших комплексное соединение с ионами гадолиния;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Важнейшей задачей молекулярной биофизики и фармакологии является поиск новых эффективных лекарственных препаратов комбинированного действия, содержащих в своей структуре фрагменты с различными видами терапевтической и биологической активности. В настоящее время исследование молекулярных механизмов взаимодействия комплексных лекарственных препаратов с клетками патологического очага в организме человека, адресная доставка лекарств, позволяющая добиться повышения эффективности лечения с использованием уже существующих средств в клинической терапии, приобретают особую значимость в связи с широким распространением онкологических заболеваний [1].

Одним из наиболее используемых методов лечения опухоли является лучевая терапия, вызывающая дегенерацию опухолевой ткани или подавление роста злокачественных клеток. Однако применение ионизирующих излучений в онкологии может привести к негативным побочным воздействиям на здоровые ткани и системы органов человека в виде локальных и отдаленных последствий. Поэтому разрабатываются новые направления и модификации лучевой терапии. Они позволяют снизить риск облучения здоровых тканей, окружающих опухоль (строму), и увеличивать радиочувствительность опухолевых клеток. Есть основания полагать, что применение нейтрон-захватывающей терапии (НЗТ) позволит решить многие проблемы клинической радиотерапии и повысит процент выживаемости онкологических больных. НЗТ способна обеспечивать адресное воздействие ионизирующего излучения на злокачественное новообразование и определенный диапазон безопасности стромы [2].

НЗТ пока не применяется для лечения людей, но прошла успешные клинические испытания за рубежом и привлекает все больше внимания исследователей разных специальностей. Среди элементов, используемых в НЗТ, первое место занимает изотоп бора 10В. Однако возникает множество проблем, связанных с его транспортировкой в достаточной концентрации и стабильной локализации в течение определенного времени [3]. Кроме того, получаемые терапевтические эффекты при применении 10В не достаточны для полного уничтожения опухоли. Поэтому необходимо изучить возможности применения других элементов (в частности, редкоземельных) в качестве нейтрон-захватывающих нуклидов в НЗТ.

Известно, что гадолиний-157 обладает высоким градиентом накопления вещества в опухоли и максимальным сечением захвата тепловых нейтронов - 255 ООО барн (сечение захвата 10В - 3869 барн). Непосредственное же применение гадолиний-содержащих фармацевтических препаратов в НЗТ затруднено из-за высокой токсичности ионов гадолиния и значительности воздействия вторичного у-излучения на здоровые ткани, окружающие опухоль [4].

Идеи применения магнитных наночастиц для повышения клинической эффективности лекарств основаны на том, что вещества, созданные с помощью нанотехнологических подходов, отличаются по своим физико-химическим свойствам от соединений, полученных в традиционной лекарственной форме. Магнитные наночастицы можно позиционировать с помощью магнитного поля, а также бесконтактно управлять их перемещением в органах и тканях за счет воздействия внешнего магнитного поля. Магнитные наночастицы, используемые в терапевтических целях, могут состоять из ферро-, ферри- или супермагнитных металлов [5].

Магнитные наночастицы, покрытые иммуноспецифическими агентами, могут связываться с эритроцитами, бактериями или злокачественными клетками. Технология адресной доставки состоит в добавлении суспензии магнитных наночастиц с иммобилизованными антителами к клеткам-

7

переносчикам, например, макрофагам, выделенным из организма in vitro с последующим введением их в организм человека. Клетки транспортируют магнитные наночастицы в «мишени», а магнитное поле дополнительно фокусирует и локализует зону терапевтического воздействия [6].

До настоящего времени остаются недостаточно изученными модельные системы, имитирующие адресную доставку ионов гадолиния в очаг поражения при злокачественных новообразованиях. Не исследованы особенности процесса формирования комплексов гадолиния с холестерической жидкокристаллической дисперсией (ХЖКД) ДНК и возможности адресной транспортировки ионов гадолиния с помощью магнитных наночастиц и макрофагов в злокачественные опухоли.

Цель настоящей работы состояла в создании методов получения и исследования свойств наночастиц - носителей ионов Gd3+ как агентов адресной доставки противоопухолевых средств.

Задачи исследования:

1. Разработать модельные системы, имитирующие адресную доставку гадолиния в составе частиц ХЖКД комплекса [ДНК-Gd] к клеткам мишени.

2. Показать принципиальную возможность использования частиц

1

ХЖКД [ДНК-Gd] для НЗТ в качестве системы адресной доставки Gd в опухоль.

3. Разработать способ получения стандартного образца частиц ХЖКД [ДНК-Gd] и обосновать методы оценки качества получаемой системы.

4. Предложить и обосновать возможный механизм появления свойств полученных частиц ХЖКД [ДНК-Gd].

Научная новизна. Разработан способ получения ХЖКД ДНК с заданными характеристиками. Впервые получены наноскопические частицы ХЖКД ДНК, содержащие ионы редкоземельных элементов. Стратегия данного подхода принципиально отличается от классических способов создания подобных препаратов (на основе гадопентетовой кислоты и наночастиц на основе хитозана и др.). Частицы ХЖКД комплекса [ДНК-Ос!] сохраняют свои свойства в течение длительного времени (более 200 суток).

В результате выполнения данной работы был разработан новый стабильный биоматериал. Комбинация размера наночастиц при максимально известной на сегодняшний день локальной концентрации гадолиния в частицах (400 мг/мл) и их стабильности открывают путь к практическому применению этого нового биоматериала в качестве основы для Оё-НЗТ.

Научная и практическая значимость работы. Получен достаточно стабильный, не обладающий цитотоксичностью, комплекс [ДНК-Оё] с максимальной локальной концентрацией гадолиния. Свойства этого комплекса заметно отличаются от свойств классических холестериков ДНК. Локальная концентрация гадолиния в частице может достигать 400 мг/мл (т.е. до 30% от массы частицы), что делает ее уникальной по сравнению с существующими на сегодняшний день препаратами. Жидкокристаллические свойства наночастиц комплекса дают возможность доставлять гадолиний в ткань опухоли, а их магнитные свойства позволяют осуществлять активную диффузию Оё и удерживать его необходимое время с помощью сильного магнитного поля. Вследствие высокой локальной концентрации гадолиния его воздействие происходит точечно (радиус воздействия -100 мкм вокруг частицы), что максимально сохраняет здоровые ткани организма.

Концентрация гадолиния легко контролируется простыми оптическими методами. Эффективность применения данной наносистемы адресной доставки лекарственного вещества заметно превосходит эффективность препаратов с 10В и других препаратов на основе гадолиния.

Положения, выносимые на защиту:

1. Способ получения наночастиц ХЖКД комплекса [ДИК-вё] на основе молекул нуклеиновых кислот и ионов гадолиния Ос13+, связанного в составе частиц с заданными стабильными физико-химическими свойствами.

2. Стандартизация и контроль качества комплекса ХЖКД [ДНК-Оё] с помощью оптических методов.

3. Обоснование возможности использования комплекса ХЖКД [ДНК-Ос!] в качестве инструмента для НЗТ как системы адресной доставки гадолиния в ткань опухоли.

4. Возможность адресной доставки комплекса ХЖКД [ДНК-Оё], используя магнитное поле или клетки-переносчики.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пугцино, 2005); П-ом Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2005» (Москва, 2005); 4-ой Всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармобразование - 2010. Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых физиологически активных веществ» (Воронеж, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе в журналах, входящих в список ВАК РФ, - 7.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молекулярная биофизика и ДНК-нанотехнология

В последнее время внимание исследователей направлено на поиск таких агентов, которые, связываясь со строго определенными участками нуклеиновых кислот, позволяли бы управлять функциональной активностью определенных генов, контролировать их экспрессию, влиять на синтез тех или иных белков. Конечной целью подобных проектов является создание диагностических и генно-инженерных фармацевтических препаратов, которые можно применять в клинической практике при лечении бактериальных и вирусных инфекций, наследственных болезней и онкологических заболеваний [7].

Одной из основных проблем медикаментозного лечения злокачественных новообразований являются побочные эффекты химиотерапии, вызываемые противоопухолевыми препаратами (цитостатиками). В результате их системного введения лишь менее 1 % лекарственного соединения достигает цели - раковых клеток, тогда как основная его часть поражает здоровые ткани организма [8]. Существенное отличие новых типов лекарственных форм от стандартных состоит в возможности реализации на их основе технологий более точной адресной доставки к определенным тканям, клеткам и даже к внутриклеточным органеллам. Идея применения наночастиц для повышения эффективности воздействия фармакологических средств основана на том факте, что вещества, созданные с помощью нанотехнологии, имеют свойства, отличающиеся по физико-химическим параметрам и клиническим

характеристикам от фармацевтических препаратов, полученных в макродисперсной форме [9].

Адресная (целевая) доставка лекарств - особый процесс введения фармацевтического препарата для достижения терапевтического эффекта, при котором лекарство концентрируется в определенной области организма -мишени. Направленный транспорт фармацевтических препаратов в очаг развития патологического процесса позволяет добиться повышения эффективности лечения с использованием уже существующих средств лекарственной терапии [10].

Концепция адресной доставки включает в себя наличие лекарственного вещества, имеющего единственную «мишень» в организме (например, злокачественную опухоль), и избирательное высвобождение его в этой «мишени» за контролируемый отрезок времени [11]. Такие лекарственные вещества в составе наночастиц, в том числе и магнитных, липосом, наносом и др., изготавливают и применяют для улучшения фармакокинетических и фармакодинамических свойств. Например, магнитные наночастицы, транспортирующие лекарства, можно позиционировать в организме пациента с помощью магнитного поля. Основное их достоинство — это возможность бесконтактного управления их перемещением в организме с применением внешнего магнитного поля [12]. Магнитные наночастицы, покрытые иммуноспецифическими агентами, могут быстро связываться с эритроцитами, бактериями или злокачественными клетками. Технология адресной доставки состоит в добавлении суспензии магнитных наночастиц с иммобилизованными антителами к клеткам-переносчикам (например, макрофагам, выделенным из организма) in vitro с последующим возвращением этих клеток в собственный организм. Клетки приносят эти частицы к «мишени», а магнитное поле дополнительно фокусирует и локализует зону терапевтического воздействия [13] .

В настоящее время особую значимость приобретают исследования комплексов молекул ДНК с различными интеркаляторами природного и синтетического происхождения, например, с ионами редкоземельных элементов. Комплексы между белками и нуклеиновыми кислотами отличаются по структурной организации и выполняют in vivo очень важные биологические функции (эухроматин, рибосомы, структура вирусов). В нуклеопротеидных комплексах нуклеиновые кислоты находятся в различных состояниях. Нуклеосома эухроматина содержит 45% белка, причем одна молекула ДНК взаимодействует с 3 молекулами полипептидов. Белки, входящие в состав нуклеопротеидных комплексов, связываются с определенными участками нуклеиновых кислот, что приводит к изменениям физико-химических характеристик и белков и нуклеиновых кислот [14, 15].

В лаборатории датского профессора P.E.Nielsen (1991) была синтезирована пептидно-нуклеиновая кислота (ПНК) как аналог олигонуклеотидов, способных связываться с двойной спиралью ДНК [16]. Мономером ее основной цепи является Ы-(2-аминоэтил)-глициновое звено, соединенное с тем или иным азотистым основанием через метилен-карбонильные связи. ПНК имеет о