Экспериментальное исследование золотых наносфер, нанозвезд и композитов на основе нанозвезд в качестве оптических зондов и носителей проспидина

Бибикова, Ольга Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспериментальное исследование золотых наносфер, нанозвезд и композитов на основе нанозвезд в качестве оптических зондов и носителей проспидина
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальное исследование золотых наносфер, нанозвезд и композитов на основе нанозвезд в качестве оптических зондов и носителей проспидина"

На правах рукописи

Бибикова Ольга Александровна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЗОЛОТЫХ НАНОСФЕР, НАНОЗВЕЗД И КОМПОЗИТОВ НА ОСНОВЕ НАНОЗВЕЗД В КАЧЕСТВЕ ОПТИЧЕСКИХ ЗОНДОВ И НОСИТЕЛЕЙ ПРОСПИДИНА

Специальность 03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

ОКТ 2013

005534409

Саратов-2013

005534409

Работа выполнена на базовой кафедре биофизики Саратовского государственного университета имени Н. Г. Чернышевского и в лаборатории нанобиотехнологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

Богатырев Владимир Александрович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор

кафедры оптики и биофотоники Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского Синичкин Юрий Петрович

кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник Института проблем точной механики и управления РАН Акчурин Георгий Гарифович

Ведущая организация: Саратовский государственный медицинский

университет им. В. И. Разумовского Минздрава России

Защита состоится «11» декабря 2013 диссертационного совета Д212.243.05 университета имени Н.Г.Чернышевского 83, корпус 3, аудитория 34.

года в 15 часов 30 минут на заседании на базе Саратовского государственного по адресу: 410012, г. Саратов, Астраханская,

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной Научной библиотеке имени В.А.Артисевич Саратовского государственного университета имени Н.Г.Чернышевского.

Автореферат разослан «)Т-» 13 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук, профессор

Дербов В.Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Использование плазмонно-резонансных частиц (ПРЧ), в частности золотых наночастиц (ЗНЧ), в диагностике и терапии онкологических заболеваний является альтернативой традиционным методам обнаружения и лечения опухолей [Л1, Л2]. В последнее время разработаны новые методы детектирования онкозаболеваний с помощью ЗНЧ. Новым направлением биомедицины является конструирование композитных наночастиц, состоящих из материалов с различными физическими и химическими свойствами, для проведения исследований в области одновременной диагностики и терапии опухолевых заболеваний (тераностики) [Л1]. Благодаря высокой эффективности светорассеяния и сильно развитой поверхности, золотые нанозвезды (ЗНЗв) могут использоваться в качестве оптических зондов, для доставки целевых веществ к биомишеням или в качестве плазмонного ядра в составе многофункциональных нанокомпозитов. Одним из перспективных направлений в терапии онкозаболеваний с использованием ЗНЧ является адресная (направленная) доставка лекарственных веществ непосредственно в опухолевую ткань или перерожденную клетку. Несмотря на болыцое количество проведенных исследований, некоторые аспекты направленной доставки продолжают оставаться актуальными. В частности, механизмы взаимодействия лекарственного вещества с поверхностью наночастиц и собственной токсичности носителей не являются универсальными и требуют специального изучения для каждой конкретной системы. Зачастую, используемые комплексы, включающие в себя наночастицы и лекарственные препараты, имеют сложный состав и их синтез трудновоспроизводим.

Для успешной диагностики и терапии опухолей необходимо определение локализации ЗНЧ в тканях и клетках. Среди способов одновременной визуализации ЗНЧ и клеточных структур следует выделить конфокальную микроскопию и оптическую когерентную томографию (ОКТ), которые позволяют определить локализацию ЗНЧ на клеточном уровне и на уровне тканей. В конфокальной микроскопии визуализация ЗНЧ возможна в режиме мультифотонной флуоресценции, в то время как конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ) требует использования флуоресцентных зондов. Однако большинство стандартных методов флуориметрических исследований не предполагают использования ЗНЧ в силу принципиальных особенностей системы освещения и регистрации сигнала. Кроме того, экспериментальные данные по оптическим спектрам поглощения и рассеяния нанокомпозитов на основе золотых нанозвезд отсутствовали в литературе. К тому же, не были исследованы возможности доставки распространенного противоопухолевого лекарственного средства проспидина в нормальные и опухолевые клетки с использованием золотых наночастиц. Этим определяется актуальность и научная значимость темы диссертации.

Целью диссертационной работы было сравнительное экспериментальное исследование золотых наносфер, нанонанозвезд и композитов (нанозвезды с оболочкой из двуокиси кремния) в качестве оптических зондов для цитологических исследований и носителей противоопухолевого препарата проспидина при взаимодействии с нормальными и опухолевыми клетками.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи исследования:

1. Синтезировать золотые наносферы и нанозвезды с повышенной эффективностью светорассеяния. Разработать микроскопические методики одновременной регистрации рассеянного и флуоресцентного излучения для исследования проникновения полученных частиц в живые клетки в присутствии различных красителей и для оценки цитотоксичности исследованных наносистем.

2. Получить конъюгаты золотых наночастиц с противоопухолевым препаратом проспидином и изучить влияние конъюгатов на клетки нормальных и опухолевых линий.

3. Получить и охарактеризовать эффективности поглощения и рассеяния нанокомпозитных частиц, состоящих из золотых нанозвезд, покрытых оболочкой из двуокиси кремния.

4. Экспериментально оценить варианты использования композитных нанозвезд в цитологических исследованиях и в оптической когерентной томографии на моделях фантомов тканей.

Научная новизна полученных результатов заключается в следующем:

1. Обнаружено усиление светимости золотых наночастиц и их агрегатов в результате взаимодействия с катионным флуоресцентным красителем акридиновым оранжевым. На этой основе предложен оригинальный метод использования смешанных меток (наночастицы+флуорсцентные красители) в режимах темнопольной и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

2. С использованием комбинирования дифференциально-интерференционного контраста и темного поля впервые показана внутренняя или наружная локализация ЗНЧ в клетках, подтвержденная конфокальной лазерной сканирующей микроскопией в режиме регистрации светорассеяния.

3. Впервые показано синергетическое действие противоракового препарата проспидина в комплексе с ЗНЧ на опухолевые клетки в культуре.

4. Экспериментально получены плазмонные нанопорошки золотых нанозвезд в смеси с проспидином в качестве препарата длительного хранения и использования.

5. Золотые нанозвезды, покрытые оболочкой из двуокиси кремния, впервые использованы в оптической когерентной томографии на моделях фантомов тканей.

Научно-практическая значимость работы. Разработанные методы использования смешанных меток и системы освещения стандартных микроскопов не требуют уникального оборудования и могут использоваться во многих лабораториях для наблюдения проникновения ПРЧ в живые клетки и влияния этого процесса на жизнеспособность клеточных культур. В частности, эти методы уже нашли применение в таких учреждениях, как ИБФРМ РАН (г. Саратов, Россия), СГУ (г. Саратов, Россия), Университет Оулу и Биоцентр Оулу (г. Оулу, Финляндия). Полученный комплекс проспидин+ЗНЧ является перспективным потенциальным противоопухолевым препаратом. Золотые нанозвезды, покрытые оболочкой из диоксида кремния, используются в Университете Оулу для контрастирования фантомов тканей в OKT.

На защиту выносятся следующие основные положения и результаты:

1. Катионные флуоресцентные красители, сорбируясь на частицах золота и/или вызывая их агрегацию, увеличивают светимость золотых частиц (агрегатов), позволяют исследовать локализацию золота и жизнеспособность клеток методами КЛСМ и световой микроскопии в режиме темного поля и в комбинированных режимах.

2. Комплекс золотых наночастиц с проспидином при малых концентрациях проспидина (8 мМ) эффективно подавляет жизнеспособность опухолевых клеток в сравнении с чистым проспидином и не оказывает токсического действия на нормальные животные клетки.

3. Усиление сигнала флуоресценции от препарата клеток, инкубированных с золотыми наночастицами, зависит от поверхностных свойств наночастиц. В отличие от ЦТАБ-покрытых золотых нанозвезд, золотые нанозвезды, покрытые ХЕПЕС, не увеличивают интенсивность светорассеяния от клеточных структур и флуоресценции красителей. Механизм увеличения сигнала флуоресценции можно объяснить изменением проницаемости цитоплазматических мембран.

4. Золотые нанозвезды, покрытые оболочкой из диоксида кремния, обладают настраиваемым плазмонным резонансом в диапазоне длин волн 750-900 нм. Подобные нанокомпозиты нетоксичны в концентрациях золота до 28 мкг/мл и являются перспективными контрастирующими агентами для оптической когерентной томографии.

Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с другими исследователями. Экспериментальные результаты получены лично автором в сотрудничестве с д.б.н. В.А. Богатыревым, д.б.н. JI.A. Дыкманом, д.б.н. С.А. Староверовым, д.б.н. О.И. Соколовым, к.б.н. М.К. Соколовой, к.б.н. Т.Е. Пылаевым, аспирантом А.Ю. Прилепским. Общее планирование экспериментов, их обсуждение и подготовка результатов к публикации проводились совместно с д.ф.-м.н. проф. Н.Г. Хлебцовым и д.б.н. В.А. Богатыревым. Эксперименты по синтезу нанокомпозитов и исследование их токсичности и оптических свойств выполнены совместно с к.ф.-м.н. А.П. Поповым, к.ф.-м.н. A.B. Быковым, к.б.н. И.Н. Сковородкиным, к.т.н. М. Киннунен, проф. С. Вайнио и проф. К. Кордаш в университете Оулу (Финляндия) и на базе Биоцентра Оулу (Финляндия). Работа выполнена на базовой кафедре биофизики факультета нелинейных процессов Саратовского госуниверситета и в лаборатории нанобиотехнологии ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках госбюджетных тем: «Нанобиотехнология частиц с настраиваемым плазмонным резонансом: синтез, функционализация, оптические свойства, применения в биологии и медицине», № гос. регистрации 01200904392 и «Многофункциональные наноматериалы на основе металлических и композитных наночастиц: синтез, характеристика и биомедицинские применения», № гос. регистрации 01201359050 (рук. д.ф.-м.н. профессор Хлебцов Н.Г). На защиту вынесены только те положения и результаты, в получении которых роль автора была определяющей.

Государственные контракты и гранты. Работа поддержана программой УМНИК, проект № 16910 «Разработка метода использования золотых наночастиц в качестве носителей противоопухолевых препаратов и средств диагностики» государственный контракт № 10497р/16910 от 08.06.2012 г. (рук. асп. Бибикова O.A.). Стипендией CIMO Fellowships (Финляндия) «Nanocomposites containing drug-loaded hollow mesoporous silica and gold nanoparticles: multifunctional capability of fluorescence diagnostic, photothermolysis and drug delivery» проект № 24301281, TM-12-8278 от 23.04.2012 (рук. асп. Бибикова O.A.).

Диссертационные исследования были также частично поддержаны грантами РФФИ (08-02-0399а, 09-02-00496а, 11-02-00128а); программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине»; Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования (научн. рук. член.-корр. РАН Никитов С.А., научн. рук. направления от ИБФРМ РАН д.ф.-м.н. проф. Хлебцов Н.Г.); госконтрактом № 02.513.11.3043 в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (рук. д.х.н. Горин Д. А.); контрактом № 24.439.11.0/ИБФРМ в рамках ФЦП

«Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 гг.)» (рук. д.б.н. Дыкман J1.A.).

Апробация результатов

Основные результаты диссертации представлялись автором на следующих научных конференциях:

1. Saratov Fall Meeting - International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophysics, Saratov, Russia, 2009, 2010, 2012 (два стендовых доклада и один устный доклад).

2. Открытый урок по нанотехнологиям в биологии в гимназии № 87, Саратов, Россия, 2010 (устный доклад).

3. Всероссийский Форум «Селигер 2010», Тверская область, Россия, 2010 (заочное участие).

4. Конкурс молодежных инновационных проектов на получение национальной премии в области инноваций - Зворыкинская премия, Саратов, Россия, 2010 (устный доклад).

5. Вторая и третья Международная конференции «Наноонкология», Тюмень, Саратов, Россия, 2010, 2011 (заочное участие).

6. Вторая и третья Всероссийские конференции для молодых ученых «Проблемы медицины третьего тысячелетия», Санкт-Петербург, Россия, 2010, 2012 (заочное участие).

7. Workshop of Local Cluster Saratov (Рабочее совещание в рамках Европейского проекта Photonics4Life FP-7, Саратов, Россия, 2011 (стендовый доклад).

8. Четвертый Всероссийский конгресс «Симбиоз-Россия», Воронеж, Россия, 2011, (устный доклад).

9. II Международная конференция «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий», Казань, Россия, 2011 (устный доклад).

10. XXV зимняя школа для молодых ученых «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, Россия, 2012 (стендовый доклад).

11. Международная летняя школа «NANOTECHNOLOGY: from fundamental research to innovations», при под держке «FP7 Nanotwinning Project of European Commission», Буковель, Украина, 2012 (устный доклад).

12. Международная конференция «Development, Regeneration and Aging», Оулу, Финляндия, 2012 (стендовый доклад).

13. Oulu Biolmaging (OBI) Network Workshop, Оулу, Финляндия, 2013 (стендовый доклад).

14. Международная конференция Optics Days, Хельсинки, Финляндия, 2013 (стендовый доклад).

15. Международная конференция European Conference on Biomedical Optics, Мюнхен, Германия, 2013 (устный доклад).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 22 работы, в том числе 4 статьи в журналах из списка, рекомендованного ВАК.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, основной части, содержащей 5 глав, заключения и списка использованных литературных источников (216 наименований). Работа изложена на 174 страницах, иллюстрирована 42 рисунками и 4 таблицами.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обоснована актуальность темы работы и её научно-практическое значение, представлены объекты и задачи исследования.

В Главе 1 приведен аналитический обзор литературы по теме диссертации. Рассмотрены основные характеристики ЗНЧ, показана перспективность использования ЗНЧ в диагностике и терапии онкологических заболеваний. Подробно обсуждаются способы визуализации ЗНЧ на уровнях клеток и тканей. Рассмотрены пути проникновения ЗНЧ в клетку и их локализация в клеточных органеллах и влияние на жизнеспособность клеточных культур. В заключительной части главы формулируются нерешенные проблемы, цель и задачи исследований.

В Главе 2 перечислены реактивы, оборудование и клеточные культуры, используемые в работе. Приведены методики получения суспензий золотых наносфер (ЗНСф), наностержней (ЗНСт) и нанозвезд (ЗНЗв), а также композитных нанозвезд (кНЗв). Описаны методы визуализации смешанных меток в комбинированном режиме регистрации рассеянного и флуоресцентного излучения. Описан способ функционализации золотых наночастиц противоопухолевым препаратом проспидином и варианты использования кНЗв в OKT.

Глава 3 посвящена вопросам взаимодействия ЗНЧ различных размеров и форм с флуоресцентными красителями, а также определению локализации золотых наночастиц методами световой и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Применение KJICM требует использования флуоресцентных меток, в то время как ЗНЧ обладают люминесценцией с очень низким квантовым выходом. В диссертационной работе проведено исследование возможности использования смешанных меток, состоящих из ЗНЧ и одного или нескольких флуоресцентных красителей, для определения колокализации ЗНЧ с клеточными органеллами и жизнеспособности клеток. Для визуализации клеток и ЗНЧ мы модифицировали системы освещения микроскопов и использовали комбинирование нескольких микроскопических режимов физического контрастирования. Размеры ЗНЧ значительно меньше предела разрешения светового микроскопа, поэтому их нельзя зарегистрировать в режиме проходящего света.

Для оптического детектирования ЗНЧ наиболее популярным методом является микроскопия темного поля. Хорошо известно, что частицы с характерными размерами меньше 30 нм обладают недостаточно яркой светимостью для получения четкой и контрастной картины в этом режиме. Тем не менее, при исследовании образцов клеток, инкубированных с золотыми наносферами диаметром 15 нм (ЗНСф-15) и окрашенных флуоресцентным катионным красителем акридиновым оранжевым (АО), мы обнаружили значительное усиление светимости частиц в темнопольном режиме (рис. 1).

На рис. 1

приведены изображения клеток почек эмбриона свиньи (8РЕУ-2),

инкубированных с ЗНСф-15 и окрашенных акридиновым оранжевым, сделанные в режимах флуоресцентной и темнопольной микроскопии. Частицы хорошо различимы в виде ярких точек в режиме темного поля и практически не видны в режиме флуоресценции (указано стрелкой). Этот пример иллюстрирует влияние режимов обработки клеток и микроскопического контрастирования на возможность визуализации плазмонных наночастиц. Мы предполагаем, что способность АО увеличивать

интенсивность рассеяния ЗНЧ связана с адсорбцией флуорофора на поверхности

Рис, 1. Изображения клеток SPEV-2, инкубированных с ЗНСф-15 и окрашенных АО в концентрации 6 мкМ, полученные на микроскопе Leica DM-2500 в темном поле (а) и в режиме флуоресценции (б) (фильтр 13 при возбуждении в интервале длин волн 450-490 нм).

частиц и их агрегацией. Агрегаты частиц и дают интенсивное рассеяние. Кроме того, при адсорбции красителя на частицах золота флуоресценция акридинового оранжевого полностью тушится.

Внутренняя или наружная локализация ЗНЧ в клетке (наряду с КЛСМ) исследовалась способом комбинирования режимов физического контрастирования: темного поля и дифференциального интерференционного контраста (ДИК). Рассеяние от ЗНЧ в режиме ДИК микроскопии регистрировали путем настройки призм для получения максимального темного поля с применением дополнительного бокового освещения. На

рис. 2 приведены изображения клеток линии 8РЕУ-2 до (а) и после (б) инкубации ЗНСф-50, полученные в комбинированном режиме ДИК и темного поля. Золотые наночастицы отчетливо видны в виде желтых точек.

Известно, что форма и поверхностные свойства частиц играют ключевую роль в механизме и степени их проникновения в клетку. Наши исследования с некоторыми типами частиц (см. Таблицу 1) подтвердили имеющиеся литературные данные. Мы также исследовали взаимодействие ЗНЧ различных типов с клешами в присутствии флуоресцентных красителей. В качестве золотых наночастиц использовали нанозвезды, покрытые цетилтриметиламмоний бромидом (ЗНЗв-ЦТАБ), нанозвезды, покрытые натриевой солью 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-этансульфоновой кислоты (ЗНЗв-ХЕПЕС), ЗНСф-15, ЗНСф-50 и золотые наностержни (ЗНСт). В таблице 1 приведены параметры синтезированных нами частиц, которые использовались в качестве зондов и носителей проспидина.

Таблица 1. Параметры наночастиц, исследованных в работе.

Образец d (ТЭМ)*, нм d (ДРС)**, нм ^Чпгх, НМ N, ЗНЧ/мл

ЗНСф-15 15.8±1.4 15.3±2,3 519 1.6х1012

ЗНСф-50 48.8±2.1 53.1±3,1 535 4.5x10'°

ЗНЗв-ЦТАБ 105.5±15.8 - 690 2.7хЮ10

ЗНЗ-ХЕПЕС 32.0±6.8 - 658 5x10й

ЗНСт Длина 43.2±8.2 Диаметр 10.6±2.2 - 830*** 1 X1012

* ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия.

** ДРС - динамическое рассеяние света, измерения выполнены на приборе Zeta sizer Nano ZS

(Malvern, UK).

*** Приведено значение основного длинноволнового продольного резонанса; минорный поперечный коротковолновый резонанс регистрировался около 510 нм.

^^ИИ п и i

Рис. 2. Изображения клеток SPEV-2, полученные на микроскопе Leica LMD 7000 в комбинированном режиме ДИК и темного поля для контрольных клеток (а) и клеток, инкубированных с ЗНСф-50.

ШЗв-ЦТАБЦ

Для иллюстрации влияния морфологии частиц и режима регистрации на информативность оптической микроскопии на рис. 3 приведены изображения монослоя клеток SPEV-2 после инкубации с ЗНСф-50 и ЗНЗв-ЦТАБ. В режиме фазового контраста (рис. За) образцы клеток, инкубированных с ЗНЗв-ЦТАБ, выглядят более контрастно по сравнению с ЗНСф-50. Во многих клетках отчетливо различимы ядра, что, вероятно, связано с диффузным распределением наночастиц и отсутствием заметной агрегации. Сильное фоновое диффузное рассеяние без ярких желто-оранжевых точек, соответствующих резонансному рассеянию ЗНЗв-ЦТАБ в режиме темного поля (рис. Зв), свидетельствует, по всей видимости, о локализации большей доли ЗНЗв-ЦТАБ на поверхности клеток и в инкубационной среде. Мы полагаем, что ЗНСф-50 обладают сильной светимостью в темном поле за счет агрегации частиц.

Об увеличении проницаемости мембраны в препаратах с ЗНСф свидетельствуют результаты окрашивания ядерным красителем пропидием йодистым (PI). PI легко проникает только в клетки с поврежденными плазматическими мембранами и поэтому широко используется для дифференцировки живых и мертвых клеток. В отличие от клеток, инкубированных с ЗНСф-50, практически не окрашенных PI, клетки, инкубированные с ЗНЗв-ЦТАБ, обладали яркой флуоресценцией. При этом ярко окрашенного ядра, характерного для мертвых клеток с нарушенной барьерной функцией мембран, не наблюдалось. Лишь несколько округлых неадгезированных клеток имели ярко светящиеся ядра, при этом количество таких клеток было примерно одинаковым для обоих образцов. На рис. Зг представлены изображения клеток, сделанные в комбинированном режиме темного поля и флуоресценции. Для регистрации флуоресцентного сигнала использовали фильтр 13 (полоса возбуждения 450-490 нм, дихроичное зеркало 510 нм, подавляющий фильтр 515 нм). В результате окрашивания АО клетки, инкубированные с ЗНЗв-ЦТАБ, выглядят значительнее желтее, чем инкубированные с ЗНСф-50. Кроме того, на препаратах с ЗНЗв-ЦТАБ не визуализируются оранжевые точки, характерные для комплексов АО с однонитевыми нуклеиновыми кислотами (выделены красным кругом на рис. Зг). Усиленная светимость образцов клеток, инкубированных с ЗНЗв-ЦТАБ, не позволяет проводить визуализацию частиц и клеток в комбинированном режиме флуоресценции и темного поля из-за слишком яркого паразитного свечения, исходящего от клеток. Напротив, золотые частицы на препарате с ЗНСф-50 отчетливо видны в виде ярко-желтых точек.

б * * и* • * % % • ï à ^ •

... . . v • i ■ • ; * ' < в t* 4" '• "V- -fi ' V:

Щ щш

Рис. 3. Изображения клеток 8РЕУ-2, инкубированных с ЗНСф-50 (слева) и ЗНЗв-ЦТАБ (справа), окрашенных АО (6.8 цМ), БАР1 (0.14 рМ) и Р1 (6 цМ). Режимы фазового контраста (а), флуоресценции (фильтр N21, при возбуждении на 515-560 нм) (б), темного поля (в), и - комбинированный режим темного поля и флуоресценции (фильтр 13, при возбуждении на 450490 нм) (г).

Рис. 4. Изображения клеток SPEV-2, окрашенных DAPI, в контроле (а) и инкубированных с ЗНЗв-ЦТАБ (б), ЗНЗ-ХЕПЕС (в), ЗНСт (г), полученные на микроскопе Leica DMI 3000 в комбинированном режиме темного поля и флуоресценции (фильтр А, при возбуждении на 340-380 нм). Концентрация добавляемых частиц равна ~104 ЗНЧ/кл.

Для уточнения механизма усиления светимости образцов клеток, инкубированных с ЗНЗв-ЦТАБ, в режимах флуоресценции и темного поля, проводили инкубацию клеток с двумя типами частиц, покрытыми ЦТАБ: золотыми нанозвездами и наностержнями, и с нанозвездами, покрытыми ХЕПЕС (рис. 4). Следует отметить, что используемый здесь термин «усиление флуоресценции» обозначает не физический эффект, связанный с изменением квантового выхода, а только усиление флуоресцентного сигнала от образцов клеток. Из рис. 4 видно, что в отличие от ЗНЗв-ЦТАБ, инкубация клеток с ЗНЗв-ХЕПЕС, не дает увеличения контрастности и усиления сигнала флуоресценции красителя DAPI. В препарате клеток, инкубированных с ЗНСт, наблюдали эффект усиления светимости, аналогичный зарегистрированному эффекту в случае инкубации клеток с ЦТАБ-покрытыми нанозвездами. Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что усиление светорассеяния и флуоресцентного сигнала от препарата клеток, инкубированных с золотыми наночастицами, зависит от поверхностных свойств наночастиц. с десорбцией ЦТАБ с поверхности наночастиц, и увеличение проницаемости

Механизм усиления можно связать способной вызывать преципитацию биополимеров биологических мембран. За счет этого флуоресцентные красители легче проникают в клеточные структуры. Полученный результат свидетельствует о том, что стандартные протоколы окрашивания и интерпретация результатов микроскопических и цитофлуориметрических исследований должны критически анализироваться в случае использования металлических плазмонных наночастиц.

Комбинирование ЗНСф с флуорофорами позволяет исследовать локализацию частиц методом КЛСМ в режиме регистрации светорассеяния и флуоресценции. Для регистрации светорассеяния мы совмещали полосу приема с длиной волны возбуждающего лазера, равной 633 нм (6/.=0), снижая мощность лазера и напряжение регистрирующего ФЭУ таким образом, чтобы не выявлять никакого сигнала светорассеяния от клеточных органелл контрольных образцов. На рис. 5 приведен пример анализа методом КЛСМ живых клеток линии 8РЕУ-2, инкубированных с ЗНСф-50 и окрашенных АО.

z—6,3 мкм /=-4,4 мкм

t б ' * . Л. л

Рис. 5. Изображения оптических срезов клеток SPEV-2, инкубированных с ЗНСф-50 и окрашенных АО, полученные в проекции XY методом KJICM на микроскопе Leica TCS SP5. (а) - зеленая флуоресценция, (б) - зеленая флуоресценция и светорассеяние (8Х=0, Х=663 нм).

Благодаря чрезвычайно сильному рассеянию ЗНЗв-ЦТАБ, мы смогли использовать KJ1CM в смешанном режиме регистрации светорассеяния и флуоресценции для визуализации наночастиц (рис. 6) Настройку напряжения фотоэлектронного усилителя канала регистрации светорассеяния (/.=633 нм, 5Л.=0) проводили таким образом, чтобы в контрольных образцах сигнал отсутствовал. При этом в образцах, инкубированных с ЗНЗв-ЦТАБ, сигнал светорассеяния регистрировали в виде ярких точек и пятен. На рис. 6 представлены ортогональные проекции изображения опухолевых клеток HeLa, инкубированных с ЗНЗв-ЦТАБ, по осям XYZ в режиме S/.--0. Наличие частиц в клетках на всех трех срединных проекциях доказывает внутриклеточную локализацию ЗНЗв-ЦТАБ. На рисунке слева приведена XY проекция, справа - все три ортогональные проекции, белыми линиями показаны положения оптических сечений. На XY проекции хорошо видно, что светящиеся точки локализованы в цитоплазме в виде окаймленных везикул, либо в виде крупных агрегатов ближе к периферии клеток. Для более детального изучения распределения частиц внутри клетки мы окрашивали препараты клеток, инкубированных с ЗНЗв-ЦТАБ и ЗНСт, флуоресцентными красителями родамин 123 и PI. Была обнаружена локализация ЗНЧ в цитоплазме, преимущественно в вакуолярных областях, но не в ядре.

Таким образом, применение дифференциального окрашивания флуоресцентными красителями, выявляющими жизнеспособность клеток по признакам проницаемости клеточных мембран и активности клеточных ферментов, вместе с комбинированными схемами освещения световых микроскопов, позволяют оценивать микропопуляции клеток по физиологической активности и способности накапливать ЗНЧ [J13, J14],

В главе 4 приведены результаты исследования воздействие комплекса, состоящего из золотых наносфер диаметром 50 нм и проспидина, на животные клетки трансформированных и нормальной линий. Проспидин - известный противоопухолевый препарат. Определённое структурное сходство проспидина с АО позволило нам предположить аналогию во взаимодействии этих препаратов с золотыми наночастицами с учетом того, что для АО с более планарной молекулой более свойственны гидрофобные взаимодействия. Отсутствие в оптическом диапазоне спектра характерных полос поглощения у проспидина не позволяло нам проводить оперативный контроль его содержания спектроскопическими методами, поэтому свои предположения мы выстраивали, основываясь на аналогии с АО.

Для доказательства адсорбции препарата на ЗНСф-50 исследовали изменение электрокинетического потенциала частиц при их связывании с проспидином с помощью системы для измерения электрофоретической подвижности наночастиц Zetasizer Nano-ZS (Malvern, UK). Используя раствор ЗНСф-50 с концентрацией частиц 109 ЗНСф/мл, изменяли концентрацию проспидина в растворе от 8000 мкМ до 0.08 мкМ методом десятикратных разведений. В таблице 2 представлено изменение электрокинетического потенциала ЗНСф-50 в зависимости от концентрации проспидина. Изменение заряда частиц при изменении концентрации проспидина указывает на связывание молекул проспидина с ЗНСф-50.

jKj

Рис. 6. Ортогональные проекции по осям XYZ изображения клеток HeLa (справа), инкубированных с ЗНЗв-ЦТАБ, полученные на конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 в режиме 8Я.=0. Слева приведена XY проекция.

Таблица 2. Изменение ^-потенциала золотых сферических наночастиц при их

конъюгации с п роспидином

Концентрация проспидина, мкМ ^-потенциал, мВ

8000 31.0±2

800 23.Ш

80 22.5±1

8 22.0±1

0.8 -1.0±0.5

0.08 -24.6±2

0 (контроль) -34.0±2

Жизнеспособность клеток определяли либо колориметрическим МТТ-тестом, либо окрашиванием красителем Р1. МТТ-тест основан на определении степени метаболической активности клеток за счет способности митохондриальных дегидрогеназ конвертировать водорастворимый реагент МТТ в окрашенный продукт -диформазан, который кристаллизуется внутри клетки и среде культивирования. Изменение оптической плотности формазана, образовавшегося в клетках, инкубированных с исследуемым веществом, коррелирует с изменением количества жизнеспособных клеток. Следует учесть, что сами золотые наночастицы, входящие в состав исследуемых комплексов, при проведении МТТ-теста дают ощутимый вклад в оптическую плотность раствора. Чтобы исключить влияние ЗНЧ на результат эксперимента, мы дополнительно центрифугировали суспензии для осаждения частиц. В этом случае проводили анализ супернатантов образцов, содержащих только формазан, полученный из клеток [Л5]. Микроскопическими методами жизнеспособность клеток определяли по степени проницаемости поврежденной клеточной мембраны с использованием Р1. Для количественной оценки находили процентное соотношение количества поврежденных клеток, окрашенных Р1, по флуоресцентным изображениям, и общего количества клеток, определяемого по изображениям препаратов, полученных в режиме фазового контраста.

Во всех экспериментах проспидин разводили в полной ЯРМ1 среде (с содержанием питательной сыворотки и антибиотиков), в качестве контрольного образца использовали чистую культуру клеток и клетки, инкубированные с ЗНСф-50. За показатель 100% дыхательной активности клеток брали среднюю величину оптической плотности диформазана из образцов чистой культуры клеток при измерении на микропланшетном спектрофотометре на длине волны 492 нм (МТТ-тест). Концентрация ЗНСф-50 составляла около 104 ЗНЧ/кл. На первом этапе был определен диапазон эффективно действующих концентраций проспидина. Учитывая, что 48-часовая экспозиция является одной из стандартных при токсилогических исследованиях, мы сочли это время оптимальным для последующих экспериментов. В качестве основной концентрации для экспериментов выбрали величину половинного эффективного действия, 12.5 мМ. Было выявлено, что различные концентрации ЗНСф-50 в целом не снижали цитостатического действия проспидина с концентрацией 12.5 мМ. В качестве отрицательного контроля проводили титрование раствора золота в полной ЯРМ1 среде.

Далее мы провели

исследование влияния комплекса ЗНСф-50+проспидин на линии опухолевых клеток карциномы шейки матки человека НеЬа; клеток почек эмбрионов свиньи, несущих онковирус, 8РЕУ-2; нормальных клеток почек макаки-резус Ма-104 (рис. 7). Клетки выращивали до 70% монослоя в шестилуночном планшете и разделяли на 4 группы: контроль (чистая культура), клетки, инкубированные с ЗНСф-50, клетки, инкубированные с проспидином (8 мМ), и клетки, инкубированные с комплексом ЗНСф-50+проспидин (8 мМ), по четыре лунки для каждого образца. Инкубировали клетки с веществами в течение 48 ч, проводили МТТ-тест, не снимая клетки с планшета. Анализ полученных результатов показал, что для клеток линии Ма-104 метаболическая активность

клеток в образце, инкубированном с комплексом, составляет 105%, в то время как в образце с чистым проспидином отношение равно 93%, а в клетках с золотыми наночастицами более 115%. Разница в угнетении дыхания для контрольного и опытных образцов незначительна, что означает, что и проспидин, и комплекс ЗНСф-50 не оказывают цитотоксического действия на линию Ма-104. Данный результат можно объяснить тем, что проспидин не оказывает влияния на нормальную культуру, поэтому комплекс ЗНСф-50+проспидин, проникая внутрь клеток за счет транспортной функции золота, не влияет на дыхательную активность клеток, так как золотые наносферы не обладают собственной токсичностью. Напротив, для клеток линий НеЬа и 8РЕУ-2 количество живых клеток в опытных образцах, обработанных проспидином, было в несколько раз меньше, чем в образцах, обработанных комплексом ЗНСф-50+проспидин. Разница в угнетении дыхания чистого проспидина и лекарственного комплекса составляет около 40-50%. При этом разница жизнеспособности контрольных клеток и клеток, инкубированных только с ЗНСф-50, незначительна и находится в пределах погрешности. В данном случае, при комбинировании проспидина с ЗНСф-50, его терапевтическое действие усиливается благодаря проникновению комплекса внутрь клетки путем эндоцитоза за счет более эффективной доставки, осуществляемой золотыми наночастицами. Следует отметить, что клетки линии НеЬа оказались более чувствительны к действию проспидина, чем клетки линии 8РЕУ-2.

Кроме того, нами было исследовано влияние комплекса на клетки линий НеЬа и 8РЕУ-2 с помощью алгоритма подсчета живых и мертвых клеток в образцах, окрашенных Р1. Для клеток линии 8РЕУ-2 процентное отношение живых клеток к общему числу клеток в образце, инкубированном с комплексом, составляло около 53%, в образце с проспидином аналогичное отношение было равно 73%, а в клетках с ЗНСф-

Рис. 7. Диаграмма изменений метаболической активности для клеток линий НеЬа, 5РЕУ-2, Ма-104 при инкубировании с ЗНСф-50, проспидином и комплексом ЗНСф-50+проспидин. Концентрация проспидина равна 8 мМ, концентрация ЗНСф-50 примерно равна 104 ЗНС/кл. Указанные погрешности соответствуют величине стандартного отклонения.

50 - более 90%. Для клеток линии HeLa процентное отношение живых клеток к общему числу клеток в образце, инкубированном с комплексом, составляло 63%, в образце с чистым проспидином отношение равно 84%, в клетках с ЗНСа-50 - 95%. Полученные расхождения в данных определения жизнеспособности МТТ и PI методами можно объяснить тем, что при микросокопическом анализе в поле зрения попадают только клетки монослоя, в то время как методом МТТ определяется активность всей микропопуляции. На начальных этапах апоптоза клетки округляются и десорбируются от субстрата, уходя из фокальной плоскости объектива.

В качестве заключительного этапа исследований была изучена возможность высушивания и стерилизации коллоидного раствора комплекса ЗНСф-50 для последующего конъюгирования с проспидином. Для этого функционализовали частицы карбокси-ПЭГ-тиолом по стандартной методике [JI3]. Для определения стабильности раствор проводили через серию замораживаний. Было определено, что многократное замораживание не влияет на агрегационную стабильность соединения золотых частиц с карбокси-ПЭГ-тиолом. Тест на солевую агрегацию также показал стабильность соединения.

После удаления несвязавшихся молекул карбокси-ПЭГ-тиола центрифугированием, осадок высушивали при комнатной температуре потоком азота до образования золотистой пленки. Полученный осадок легко растворялся в воде без дополнительного ультразвукового воздействия. Конъюгацию с проспидином проводили, растворяя порошок золотых частиц в воде с добавлением проспидина до финальной концентрации 100 мМ.

В таблице 3 представлены изменения электрокинетического потенциала исходных золотых сферических наночастиц, частиц, функционализованных карбокси-ПЭГ-тиолом, и частиц, конъюгированных с проспидином.

Таблица 3. Изменение ¡¡-потенциала ЗНСф-50 при их конъюгации с проспидином

Тип частиц Ç-потенциал, мВ

ЗНСф -31 ±2

ЗНСф-S-PEG-COOH -33±2

ЗНСф-S -PEG-COOH-проспидин +11±1

Изменение заряда частиц при изменении концентрации проспидина показывает связывание молекул проспидина с ЗНСф-50.

На рис. 8 представлены спектры экстинкции исходных ЗНСф-50, частиц, функционализованных карбокси-ПЭГ-тиолом после центрифугирования, и частиц, перерастворенных из порошка. По данным спектрометрии оптическая плотность на длине волны плазмонного резонанса - 525 нм равна 0.1, полуширина спектра равна 55 нм; после центрифугирования оптическая плотность на длине волны плазмонного резонанса - 525 нм равна 0.1, полуширина спектра - 50 нм, после перерастворения оптическая плотность на длине волны плазмонного резонанса - 527 нм равна 0.093, полуширина спектра - 50 нм. Сохранение основных оптических характеристик частиц свидетельствует об образовании поверхностной оболочки на ЗНСф-50 и их стабильности. Для стерилизации комплекса высушенный аналогичным образом коллоидный раствор ЗНСф-50, функционализованных PEG-COOH, перерастворяли в 70% растворе этилового спирта. После центрифугирования осадок высушивали при комнатной температуре потоком азота до образования золотистой пленки. Конъюгацию

свежеприготовленные частицы

частицы, полученные и $ порошка частицы, покрытые ПЭГ-тиолом

б5о ' 55о

Длина волны,нм

1000

Рис. 8. Спектры экстинкции свежеприготовленных золотых сферических наночастиц, частиц, покрытых РЕС-СООН, и частиц, перерастворенных из порошка.

Л 0.12

0.08"

свежепрнтотовлеыные частицы част ицы, полученные из порошка частицы, цокрытые ПЭГ-тиолом

с проспидином проводили в стерильных условиях, растворяя порошок золотых частиц в воде с добавлением проспидина до финальной концентрации 100 мМ.

На рис. 9 представлены спектры экстинкции свежеприготовленных золотых сферических наночастиц; частиц, покрытых карбокси-ПЭГ-тиолом, после центрифугирования; частиц, полученных из порошка после обработки этанолом. По данным спектрометрии оптическая плотность на длине волны плазмонного резонанса - 525 нм равна 0.1, полуширина спектра равна 55 нм; после центрифугирования оптическая плотность на длине волны плазмонного резонанса - 525 нм равна 0.1, полуширина спектра -50 нм, после перерастворения оптическая плотность на длине волны плазмонного резонанса - 526 нм равна 0.11, полуширина спектра -50 нм. Незначительный батохромный сдвиг, сохранение добротности спектра и абсолютной величины поглощения свидетельствуют о стабильности наночастиц и отсутствии их агрегации после обработки спиртом, что позволяет говорить о возможности стерилизации золотых наночастиц с их последующим конъюгированием с проспидином в стерильных условиях.

В главе 5 описан синтез композитных наночастиц, состоящих из золотых нанозвезд, покрытых оболочкой из диоксида кремния, приведены характеристики частиц и некоторые возможности их применения. Для получения нанокомпозитов синтезированы золотые наночастицы двух типов: нанозвезды, покрытые ЦТАБ, синтезированные по методу, предложенному группой Татсумы [Л4], и нанозвезды, полученные по методике, разработанной группой Во-Динха [Л6], без использования ЦТАБ (рис. 10, 11). При синтезе композитных нанозвезд на основе ЗНЗв-ЦТАБ, нанозвезды покрывали ПЭГ-тиолом, путем наращивания на поверхности частиц промежуточного слоя молекул ПЭГ, обеспечивающего эффективную стерическую стабилизацию во время реакции замещения лигандов тиольными группировками.

0.04

400

1000

600 800 Длина волны, нм Рис. 9. Спектры экстинкции свежеприготовленных золотых сферических наночастиц, частиц, покрытых РЕС-СООН, и частиц, перерастворенных из порошка после обработки 70% этанолом.

¡'-Я

кНЗв-ЦТАБ -ЗНЗв-ЦТАБ

♦

Рис. 10. Спектры эксгинкции ЗНЗв-ЦТАБ и кНЗв-ЦТАБ (а), ТЭМ изображения ЗНЗв-ЦТАБ, покрытых ПЭГ-тиолом (б), и ТЭМ изображения кНЗв-ЦТАБ (в, г).

■=0.8. "а

На рис. 10 представлены спектры экстинкции ЗНЗв-ЦТАБ, покрытых ПЭГ-тиолом, и ЗНЗв-ЦТАБ с оболочкой из диоксида кремния (кНЗв-ЦТАБ) (рис. 10а), а также ТЭМ изображения частиц, полученные на двух этапах синтеза, первый из которых заключается в синтезе ядра композитной наночастицы (рис. 106). ЗНЗв-ЦТАБ имеют размер около 100 нм и обладают несколькими крупными лучами. На втором этапе синтеза, на поверхность ПЭГелированных ЗНЗв-ЦТАБ был нанесен слой из диоксида кремния толщиной около 20 нм (рис. 10в, г). Согласно ТЭМ изображениям, силикатная оболочка не обладала мезопористой структурой. Слой из диоксида кремния приводит к сдвигу спектра экстинкции частиц в красную область на 30 нм за счет увеличения локального показателя преломления около ЗНЧ. Максимум экстинкции также несколько увеличивается, в зависимости от толщины оболочки (рис. 10, 11). По нашим наблюдениям, ЗНЗв-ЦТАБ являются наиболее стабильным и устойчивым к агрегации типом нанозвезд, однако, синтез этих частиц занимает длительное время, их оптические и плазмонные свойства достаточно трудно контролировать. ЗНЗв-ЦТАБ обладают небольшим числом достаточно крупных пологих лучей, в то время как тонкие лучи нанозвезд других типов, определяющие их оптические свойства, более интенсивно взаимодействуют с лазерным излучением в ближней инфракрасной области. Поэтому использование биосовместимых ЗНЗв, предложенных группой Во-Динха, представляется нам более перспективным для некоторых биомедицинских приложений и оптической визуализации. Привлекательные оптические свойства этих частиц обусловлены наличием у них множества тонких острых лучей (рис. 11). Синтез ЗНЗв относительно прост и занимает около одной минуты, однако при экспериментальной реализации синтеза мы столкнулись с плохой воспроизводимостью результатов и крайне низкой агрегационной устойчивостью частиц, даже после создания стабилизирующей оболочки из ПЭГ-тиола по методике, предложенной для этого типа

* кЗ

Длина волны, им

В 50пм

Рис. 11. Спектры экстинкции ЗНЗв и кНЗв (а), ТЭМ изображения ЗНЗв, покрытых ПВП (б), и ТЭМ изображения кНЗв (в, г).

частиц Фалесом и др. [JI7]. Для предотвращения агрегации частиц в качестве стабилизатора вместо ПЭГ-тиола мы предлагаем использовать поливинилпирролидон (ПВП), что обеспечивает стабильность в течение, как минимум, 3 месяцев. На рис. 11 показаны спектры поглощения ЗНЗв, покрытых ПВП, композитных наночастиц (рис. 11а), и ТЭМ изображения наночастиц, полученных на этапах синтеза ЗНЗв (рис. 116) и синтеза кНЗв (рис. 11в,г). ЗНЗв имеют размер около 60 нм и характеризуются наличием множества тонких лучей. Полученный слой из диоксида кремния имеет толщину около 60 нм. Использовали метод наращивания оболочки, основанный на гидролизе тетраэтилортосиликата (ТЭОС), катализируемом основаниями. Толщина оболочки из диоксида кремния может варьироваться в зависимости от времени реакции и концентрации ТЭОС. В нашем случае наращивание оболочки занимало около 30 мин, а общее время синтеза кЗНЗв составило 45 мин.

Анализ оптических свойств полученных частиц был проведен с помощью спектрофотометра, оборудованного интегрирующими сферами, позволяющими определить соотношение поглощения и рассеяния суспензии изготовленных наночастиц. Использование спектрофогомегрической установки, обладающей режимами для определения коллимированного пропускания и диффузного отражения/пропускания (рис. 12г), позволяет выделить вклады рассеяния (рис. 126) и поглощения (рис. 12в) в спектре экстинкции ЗНЗв и кНЗв на их основе (рис. 12а). Экспериментальное определение спектров поглощения и рассеяния плазмонных частиц представляет большой интерес в связи с оценкой возможностей их применений в биомедицине. Так, фототермальные эффекты определяются спектром поглощения, а спектр рассеяния определяет эффективность частиц как меток в световой микроскопии и оптической когерентной томографии (в последнем случае важен также и спектр рассеяния).

Ослабление параллельного монохроматического пучка света при распространении его в поглощающей и рассеивающей среде описывается законом Бугера-Ламберта-Бера:

(1)

где /0 и I суть интенсивности входящего и выходящего пучка, I есть толщина слоя вещества, через которое проходит свет, д есть коэффициент экстинкции, равный сумме коэффициентов рассеяния jus и поглощения ц.а,

~Ms +Ма- (2)

Для определения вкладов рассеяния и поглощения были измерены значения пропускания R (вперед) и отражения Т (назад) для ЗНЗв и кНЗв. Коэффициент поглощения был найден из формулы, описывающей истинное поглощение А за вычетом отраженного и прошедшего света:

A = R + T = e~^1. (3)

Далее были измерены значения коллимированного пропускания для этих частиц Тс :

= (4)

Откуда, с учетом найденного ранее коэффициента поглощения, можно вычислить коэффициент рассеяния jUs.

Из рис. поглощения экстинкцию соответствии

12 видно, что вклады и рассеяния в общую примерно одинаковы. В с известными свойствами

Длина волны, нм

Рис. 12. Спектры экстинкции (а), рассеяния (б) и поглощения (в) ЗНЗв и кНЗв. На панели (г) показан общий вид спектрофотометрической установки, которая содержит источник света (1), монохроматор (2) и интегрирующую сферу (3).

ПРЧ, увеличение толщины оболочки приводит к смещению пиков поглощения и рассеяния примерно на 30 нм в длинноволновую область. С нашей точки зрения, композитные наночастицы, покрытые оболочкой, более

перспективны для терапии

онкозаболеваний в сравнении с исходными золотыми нанозвездами, благодаря наличию оболочки, которая может быть нагружена веществами с использованием современных методов создания нанокомпозитов.

Отсутствие цитотоксичности

композитных нанозвезд при концентрациях по золоту до 28 мг/мл было показано на клетках линии HeLa методами МТТ-теста и окрашиванием образцов PI. Взаимодействие нанокомпозитов в максимальной используемой концентрации было исследовано с помощью конфокального микроскопа Zeiss LSM 780 в трансмиссионном режиме (данные в автореферате не приведены). На КЛСМ изображениях было отчетливо видно, что большее число частиц локализовано внутри, либо на поверхности клеток. При этом большинство клеток сохраняли веретенообразную форму, что свидетельствовало о хорошем прикреплении к подложке и высокой жизнеспособности.

Для исследования возможности применения золотых нанозвезд и нанокомпозитов на их основе в качестве усилителей сигнала в оптической когерентной томографии (ОКТ) проводили визуализацию частиц в модельной жидкости (интралипиде). Измерения проводились на спектральном оптическом когерентном томографе Thorlabs Hyperion OCT System в лаборатории оптоэлектроники и измерительной техники университета Оулу. Источником излучения служил суперлюминесцентный диод с центральной длиной волны 930 нм, шириной спектра 65 нм, мощностью 6 мВт, осевым разрешением (вдоль

оси Z), равным 5.8 мкм, и горизонтальным разрешением 8 мкм. Прибор основан на интерферометре Майкельсона, в котором опорное зеркало является неподвижным, а сигнал с разных глубин восстанавливается путем преобразования Фурье сигнала, разложенного в спектр диспергирующим элементом (дифранционной решеткой). ЗНЗв, покрытые ПВП, использовали для визуализации жидкости в стеклянных капиллярах, заполненных

tтек. 10 г текло

?ТПп 1 Н111р:1.1П1ШД4° о

пекло с сек. to

501) МКМ 500 мкм

пек. ю пек. ю

шпра.шпнд 4°о стекло ингрнлипнл 20%** с секло

500 мкм 500 мкм

Рис. 13. Визуализация стеклянных капилляров методом ОКТ. Поперечное сечение капилляров толщиной 200 мкм, заполненных: ЗНЗв (00=10) (а), смесью ЗНЗв и интралипида-4% (б), чистым итралипидом-4%, чистым интралипидом-20% (г).

либо суспензией золотых нанозвезд, либо смесью водного раствора интралипида и суспензией ЗНЗв, либо водным раствором интралипида. По своим оптическим свойствам (сечения рассеяния и поглощения, индикатриса рассеяния) интралипид имитирует кожу в ближнем ИК-диапазоне и используется в качестве свегорассеивающей модельной суспензии.

Стеклянные капилляры заполняли суспензией ЗНЗв с 00=10 и длиной волны плазмонного резонанса 930 нм (рис. 13а), смесью интралипида-4% и ЗНЗв (рис. 136), чистым интралипидом-4% (рис. 13в) и чистым интралипидом-20% (рис. 13г). На рис. 13 более яркий цвет соответствует более сильному рассеянию на длине волны 930 нм. Внутренняя толщина капилляров равна 200 мкм.

Очевидно, что композиты на основе золотых нанозвезд не дают такого же сильного сигнала, как интралипид-4%, и, тем более, интралипид-20%. Это можно объяснить различием концентраций ЗНЗв и интралипида в исследованных системах. Весовая процентная концентрация нанозвезд, соответствующая 00=10. составляет около 0.05%, следовательно, концентрации сравниваемых веществ различаются примерно в 80 раз. Однако, даже при столь различных количествах вещества, рассеяние от нанозвезд надежно регистрируется и качественно сравнимо с рассеянием раствора интралипида. Кроме того, использование ЗНЗв оправдано при исследовании жидкостей, обладающих сильно анизотропным рассеянием вперед, таких как кровь. В этом случае ЗНЗв позволяют увеличить обратно отраженный свет, делая возможным не только статическую визуализацию кровеносных капилляров, но и определение профиля скорости крови, что необходимо для диагностики некоторых заболеваний.

Для визуализации кНЗв методом ОКТ в суспензии эритроцитов мы использовали композитные нанозвезды с плазмонным резонансом на длине волны 930 нм и 00=10. Использовали суспензии отмытых эритроцитов с разными гематокритами (50%, 6.25%), с добавлением и без нанокомпозитов (4 мл суспензии с указанным гематокритом + 0.025 мл нанозвезд, покрытых диоксидом кремния). Суспензии прокачивалась через стеклянный прямоугольный капилляр с внутренней толщиной 100 мкм со скоростью 10 мл/ч. С помощью ОКТ-томографа регистрировались 20 изображения капилляра, из которых потом с помощью программы МаЙаЬ получали распределения интенсивности сигнала и сдвига фаз, пропорциональному скорости потока, по глубине капилляра. Сравнение проводилось с суспензией интралипида-2%.

На рис. 14 представлено распределение сигнала ОКТ по глубине капилляра для различных сред. При добавлении нанозвезд сигнал растет, что говорит об отражении излучения

нанозвездами. Пик слева для суспензии с гематокритом 6.25% возникает из-за седиментации эритроцитов в поле тяжести (капилляр ориентирован горизонтально).

На рис. 15 представлена разность фаз интерференционных сигналов при последовательном сканировании в потоке крови через поперечное сечение капилляра. Полученный профиль можно условно принять за профиль скорости потока крови через поперечное сечение капилляра в связи с тем, что скорость потока пропорциональна фазе с точностью до константы. Незначительное увеличение

- 50% Гемат

- 50% Гемат + кНЗв

- 6.25% Гемат

- 6.25% Гемат + кНЗв

160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 Глубина (оптическая), мкм

Рис. 14. Распределение сигнала ОКТ по глубине капилляра для различных сред.

-50% Гемат

Глубина (оптическая), мкм

Рис. 15. Профиль сдвига фаз в радианах, пропорциональный скорости потока крови через поперечное сечение капилляра.

скорости (розовая кривая выше синей), возможно, связано с уменьшением вязкости суспензии в присутствии кНЗв.

В целом, в случае использования композитных наночастиц, мы наблюдали некоторое усиление сигнала от образцов, однако профили скорости не меняются и остаются искаженными. Можно предположить, что более крупные частицы, обладающие большим сечением рассеяния, определяют спектр сигнала. В обсуждении этих результатов отмечается, что они представляют несомненный интерес и требуют проведения дальнейших более детальных исследований.

В заключении отмечается возможность использования смешанных меток и модифицированной системы освещения микроскопов для определения локализации ЗНЧ и их влияния на клетки в широком круге неспециализированных лабораторий. Обсуждаются возможности создания лекарственного препарата проспидин+ЗНСф с последующей перспективой внедрения в медицинскую практику. Отмечена перспективность применения композитных частиц для исследований фантомов ткани. В конце работы формулируются результаты и выводы.

Основные результаты и выводы:

1. Золотые наносферы с диаметром около 50 нм, золотые нанозвезды с характерными размерами 60-100 нм и нанокомпозиты на их основе могут эффективно использоваться как оптические зонды в цитологических исследованиях, в оптической когерентной томографии и как носители для доставки целевых веществ к биомишеням. Полученные нанозвезды и нанокомпозиты имеют примерно одинаковые сечения поглощения и рассеяния, а их плазмонный резонанс может настраиваться от 650 до 950 нм. При инкубации клеток с ЗНЧ и флуоресцентными диагностическими красителями, локализация ЗНЧ и жизнеспособность клеток может быть исследована методами КЛСМ и комбинированной световой и флуоресцентной микроскопией.

2. Для эффективной визуализации золотых наночастиц в структуре живых клеток с помощью стандартных прямых или инвертированных микроскопов необходимо использовать систему бокового освещения, которая позволяет комбинировать режимы физического контрастирования (темное поле и дифференциальный интерференционный контраст) с флуоресцентным возбуждением.

3. Использование акридинового оранжевого как витального красителя увеличивает интенсивность рассеяния от золотых сферических наночастиц и позволяет надежно идентифицировать наночастицы как внутри, так и снаружи живых клеток и одновременно дифференцировать клеточные микропопуляции по состоянию ядерного аппарата.

4. Комплекс золотых наночастиц с проспидином в концентрации 8 мМ угнетает жизнеспособность опухолевых клеток линий НеЬа и 8РЕУ-2 как минимум в 2 раза более эффективно, чем чистый проспидин, но не оказывает токсического действия на нормальные клетки линии Ма-104.

5. Контролируемое наращивание оболочки из диоксида кремния путем окисления тетраэтилортосиликата на поверхности золотых нанозвезд, покрытых поливинилпирролидоном, является эффективным и воспроизводимым методом получения нанокомпозитов, которые нетоксичны для клеток HeLa вплоть до концентраций золота 28 мкг/мл. Эти композитные частицы могут использоваться как эффективные контрастирующие агенты в ОКТ биотканей.

Цитированные работы:

Л1. Dykman L., Khlebtsov N. // Chem. Soc. Rev. 41, 2256 (2012).

Л2. Dreaden C., Alkilany A.M., Huang X., Murphy C.J., El-Sayed M.A. // Chem. Soc. Rev. 41, 2740 (2012).

ЛЗ. Liao H., Hafner J.H. Chem. Mater, 17, 4636 (2005).

Л4. Yu K.F., Kelly K.L., Sakai N„ Tatsuma T. // Langmuir 24, 5849 (2008).

Л5. Zhao T.T., Wu H., Yao S.Q., Xu Q.-H., Xu G.Q. // Langmuir, 26, 14937 (2011).

Л6. Yuan H„ Khoury C.G., Hwang H., Wilson C.M., Grant G.A., Vo-Dinh T. // Nanotechnology 23, 075102 (2012).

Л7. Fales A.M., Yuan H., Vo-Dinh T. // Langmuir 27, 12186 (2011).

Статьи Бибиковой (Гасиной) в реферируемых изданиях и журналах:

1 Гасина (Бибикова), О.А. Воздействие комплекса проспидин-коллоидное золото на опухолевые клетки [Текст] / О.А. Гасина (Бибикова), С.А. Староверов, В.А. Богатырев // Медицинский академический журнал. - 2010. - Т. 10, № 5. — С. 47-48.

2. Khlebtsov, В. Nanocomposites containing silica-coated gold-silver nanocages and Yb-2,4-dimethoxyhematoporphyrin: Multifunctional capability of IR-luminescence detection, photosensitization, and photothermolysis [Text] / B. Khlebtsov, E. Panfilova, V. Khanadeev, O. Bibikova, G. Terentyuk, A. Ivanov, V. Rumyantseva, I. Shilov, A. Ryabova, V. Loshchenov, N. Khlebtsov // ACS NANO. - 2011. - V. 5, No. 9. - P. 70777089.

3. Бибикова, O.A. Плазмонно-резонансные золотые частицы как носители лекарственных веществ и оптические метки в цитологических исследованиях [Текст] / О.А. Бибикова, С.А. Староверов, О.И. Соколов, Л.А. Дыкман, В.А. Богатырев // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Физика. - 2011. - Т. 11, Вып. 2.-С. 58-61.

4. Хлебцов, Б.Н. Новые типы наноматериалов: порошки золотых наносфер, наностержней, нанозвезд и золотосеребряных наноклеток [Текст] / Б.Н. Хлебцов, В.А. Ханадеев, Е.В. Панфилова, Т.Е. Пылаев, О.А. Бибикова, С.А. Староверов, В.А. Богатырев, Л.А. Дыкман, Н.Г. Хлебцов. // Российские нанотехнологии. - 2012. - Т. 7, №. 11-12.-С. 87-94.

Статьи Бибиковой (Гасиной) в материалах международных и российских конференций:

1. Gasina, О.А. The use of plasmon resonant nanoparticles and fluorescent dyes for light microscopic investigations of animal cells [Text] / O.A. Gasina, B.A. Bogatyrev, S.A. Staroverov, O.I. Sokolov // Материалы международной школы для студентов и молодых ученых по оптике, лазерной физике и биофизике «Saratov Fall Meeting», Саратов. - 2009. - URL: www.optics.sgu.ru.

2. Гасина, O.A. Использование плазмонно-резонансных частиц и флуоресцентных красителей для светомикроскопических исследований животных клеток [Текст] / O.A. Гасина, В.А. Богатырев, С.А. Староверов, О.И. Соколов // Материалы всероссийской школы-конференции «Нелинейные дни в Саратове для молодых - 2009», Издательство «Наука», - 2010. - С. 136-139.

3. Богатырев, В.А. Плазмонно-резонансные частицы как инструмент генетико-цитологических исследований [Текст] / В.А. Богатырев, С.А. Староверов, JI.A. Дыкман, O.A. Гасина, Н.Г. Хлебцов // Сборник тезисов международной научной конференции «Биотехнология начала III тысячелетия», Издательство «Коллектив авторов», Санкт-Петербург - 2010. - С. 25-29.

4. Gasina, O.A. Influence of prospidin - colloidal gold complex on tumor cells culture [Text] / O.A. Gasina, B.A. Bogatyrev, S.A. Staroverov // Материалы международной школы для студентов и молодых ученых по оптике, лазерной физике и биофизике «Saratov Fall Meeting», Саратов. - 2010. - URL: www.optics.sgu.ru.

5. Хлебцов, Н.Г. Золотые и композитные наночастицы для применений в качестве трмосенсибилизаторов, биомаркеров и адъювантов [Текст] / Н.Г. Хлебцов, В.А. Ханадеев, Т.Е. Пылаев И.В. Видяшева, Е.В. Панфилова, O.A. Гасина, Б.Н. Хлебцов,

B.А. Богатырев, Л.А. Дыкман, С.А. Староверов, И.Л. Максимова, Г.С. Терентюк, В.В. Тучин // Тезисы докладов конференций и семинаров по научным направлениям Программы фундамертальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине», Издательство «Слово», Москва-2010. - С. 104-105.

6. Бибикова, О. А. Использование золотых частиц как носителей лекарственных веществ и оптических зондов в цитофлуоресцентных исследованиях [Текст] / O.A. Бибикова,

C.А. Староверов, В.А. Богатырев // Материалы IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов Симбиоз Россия, Воронеж. — Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета, Воронеж.-2011.-Т. 1,С. 105-108.

7. Khlebtsov, N. Novel multifunctional nanocomposites for theranostics [Текст] / N. Khlebtsov, B. Khlebtsov, E. Panfilova, V. Khanadeev, O. Bibikova, S. Staroverov, G. Terentyuk, V. Rumyantseva, A. Ivanov // SPIE Newsroom. - 2011. doi: 10.1117/2.1201109.003832.

8. Хлебцов, Н.Г. Композитные плазмонно-резонансные наночастицы для применений в тераностике [Текст] / Н.Г. Хлебцов, Б.Н. Хлебцов, Е.В. Панфилова, В.А. Ханадеев, O.A. Бибикова, С.А. Староверов, A.A. Широков, Л.Ю. Матора, Л.А. Дыкман, В.А. Богатырев, Г.С. Терентюк, И.Л. Максимова, Е.С. Тучина, В.В. Тучин, В.Д. Румянцева, A.B. Иванов, И.П. Шилов, A.B. Рябова, В.Б. Лощенов // Тезисы докладов конференций и семинаров по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине», Издательство «Слово», Москва - 2011. - С. 122-123.

9. Бибикова, O.A. Использование золотых наночастиц и красителя акридинового оранжевого в цитологических исследованиях [Текст] / O.A. Бибикова, С.А. Староверов, В.А. Богатырев // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXIV Зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Издательство Учебно-научного центра Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова, Москва,- 2012. - С. 59.

10. Староверов, С.А. Использование плазмонно-резонансных частиц в качестве флуоресцентных меток и носителей лекарственных веществ в цитологических исследованиях [Текст] / С.А. Староверов, O.A. Бибикова, В.А. Богатырев // Сборник трудов II Международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии

и бионанотехнологии Казань», Издательство «Казанский университет», Казань.-

2012.-С. 310-312.

11. Bibikova, О.A. Plasmon-resonance gold nanoparticles as drug carriers and optical labels for cytological investigations [Text] / O.A. Bibikova, S.A. Staroverov, A.Yu. Prilepskiy, V.A. Bogatyrev // Материалы международной школы-конференции «NANOTECHNOLOGY: from fundamental research to innovations», Издательство «Евросвет», Львов. - 2012. - С. 59-60.

12. Bibikova, О. A. Gold nanoparticles with variable morphology and surface functionalization penetrate into animal cells [Text] / O.A. Bibikova, S.A. Staroverov, A.Yu. Prilepskiy, V.A. Bogatyrev // Материалы международной школы для студентов и молодых ученых по оптике, лазерной физике и биофизике «Saratov Fall Meeting», Саратов. - 2012 - URL: www.optics.sgu.ru.

13. Хлебцов, Н.Г. Новые типы функционализованных золотых и композитных наночастиц для медицинской тераностики [Текст] / Н.Г. Хлебцов, Б.Н. Хлебцов, Е.В. Панфилова, Т.Е. Пылаев, В.А. Ханадеев, О.А. Бибикова, С.А. Староверов, А.А. Широков, Л.Ю. Матора, Л.А. Дыкман, В.А. Богатырев, Г.С. Терентюк, Е.С. Тучина, В.В. Тучин // Программа фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине». Тезисы докладов. Конференции и семинары, проведенные в рамках научных подпрограмм в 2012 г. Издательство «Слово», Москва-2012.-С. 164-165.

14. Bibikova, О. A. Plasmon-resonant gold nanoparticles as an attractive platform for drug delivery and cytological investigations. Publishing house of the University of Oulu [Text] / O.A. Bibikova, S.A. Staroverov, A.Yu. Prilepskiy, V.A. Bogatyrev // Abstract book of international conference «Development, Regeneration and Aging», Publ. «Biocenter Oulu», Oulu.-2012.-P. 36.

15. Bibikova, O. Gold nanostars with silica shells for optical imaging [Text] / O. Bibikova, I. Skovorodkin, A. Popov, A. Prilepskyi, T. Pylaev, A. Bykov, S. Staroverov, S. Vainio, V. Tuchin, K. Kordas, M. Kinnunen, V. Bogatyrev, N. Khlebtsov // Abstract book of international conference «Optics Days, Book of abstracts» Publ. «Helsinki University», Helsinki.-2013.-P. 50.

16. Богатырёв, В.А. Микроводоросль Dunaliella salina Teod. как тест-объект определения токсичности наноматериалов [Текст] / В.А. Богатырёв, А.А. Голубев, А.Ю. Прилепский, Т.Е. Пылаев, О.А. Бибикова, Б.Н. Хлебцов, Л.А. Дыкман, Н.Г. Хлебцов // Материалы Международной междисциплинарной научной конферецнии «Биологически активные вещества и материалы: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения», Новый Свет. Издатель B.C. Мартынюк, Киев,-

2013.-С. 373.

17. Popov, А.Р. High-resolution deep-tissue optical imaging using anti-Stokes phosphors [Text] / A.P. Popov, A.V. Karmenyan, A.V. Bykov, E.V. Khaydukov, A.V. Nechaev, O.A. Bibikova, V.Y. Panchenko, V.A. Semchishen, V.N. Seminogov, A.S. Akhmanov, V.I. Sokolov, M.T. Kinnunen, V.V. Tuchin, A.V. Zvyagin // Proc. SPIE. - 2013. - V. 8801. -art. 88010C.

18. Bibikova, O. Plasmon-resonant gold nanoparticles with variable morphology as optical labels and drug carriers for cytological research [Text] / O. Bibikova, A. Popov, I. Skovorodkin, A. Prilepskyi, T. Pylaev, A. Bykov, S. Staroverov, V. Bogatyrev, V. Tuchin, M. Kinnunen, S. Vainio, K. Kordas, N. Khlebtsov // Proc. SPIE. - 2013. - V. 8801. - art. 880102.

Формат 60x84 1/16. Гарнитура Times New Roman 10, _Объем 1 п. л. Тираж 100. Заказ 57._

Отпечатано в ИБФРМ РАН Саратов, пр. Энтузиастов 13.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Бибикова, Ольга Александровна, Саратов

Министерство образования и науки Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ САРАТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н. Г. ЧЕРНЫШЕВСКОГО

На правах рукописи

0«0Н52530

БИБИКОВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

03.01.02 - биофизика

диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель: д.б.н. В. А. Богатырев

Саратов -2013

СОДЕРЖАНИЕ

Введение........................................................................................................................4

1.1. Использование золотых частиц в диагностике и терапии опухолевых заболеваний.................................................................................................................14

1.2. Определение локализации золотых наночастиц в живой клетке и организме, токсичность золотых наночастиц.............................................................................37

1.3. Постановка задач исследования........................................................................59

Глава 2. Материалы и методы...................................................................................62

2.1. Реактивы и материалы........................................................................................62

2.2. Оборудование......................................................................................................63

2.3 Система дополнительного бокового освещения...............................................64

2.4. Клеточные культуры, использованные в работе.............................................64

2.5. Получение золотых наночастиц........................................................................64

2.6. Культивирование животных клеток..................................................................68

2.7. Исследование взаимодействия акридинового оранжевого со сферическими наночастицами диаметрами 15 и 50 нм...................................................................70

2.8. Комбинированное использование золотых наносфер и флуоресцентных красителей...................................................................................................................70

2.9. Определение жизнеспособности клеток методом МТТ-теста.......................72

2.10. Определение жизнеспособности клеток с помощью флуоресцентного красителя йодистого пропидия.................................................................................72

2.11. Культивирование животных клеток с комплексом, состоящим из проспидина и золотых наносфер диаметром 50 нм................................................73

2.12. Получение сухого препарата, состоящего из проспидина и золотых наносфер......................................................................................................................74

2.13. Визуализация нанозвезд методом оптической когерентной томографии .. 75 Глава 3. Влияние наночастиц на жизнеспособность клеток.................................77

3.1. Взаимодействие золотых наночастиц с флуоресцентными красителями.....78

3.2. Определение локализации наночастиц в животных клетках методами темного поля и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.................98

3.3. Жизнеспособность клеток, инкубированных с золотыми наночастицами. 102

Глава 4. Воздействие комплекса, состоящего из золотых наночастиц и противоопухолевого препарата проспидина, на животные клетки....................107

4.1. Определение оптимального состава лекарственного комплекса.................107

4.2. Исследование возможности высушивания и стерилизации коллоидного раствора комплекса золотых наночастиц с проспидином...................................120

Глава 5. Синтез и применение композитных наночастиц, состоящих из золотых нанозвезд, покрытых оболочкой из двуокиси кремния.......................................126

5.1 Синтез и характеристика композитных наночастиц, состоящих из золотых нанозвезд, покрытых оболочкой из двуокиси кремния.......................................126

5.2. Оценка токсичности композитных наночастиц.............................................133

5.3. Применение золотых нанозвезд в оптической когерентной томографии... 135

Заключение и выводы..............................................................................................142

Список сокращений и условных обозначений......................................................146

Список использованных источников.....................................................................148

л- !

Введение

Золотые наночастицы (ЗНЧ) - обширный класс современных наноматериалов, охватывающий область размеров от единиц до сотен нанометров и форм от сферической до сложной многоразмерной. Состав наночастиц также может изменяться, как по композиции металлов, так и комбинации ядро -оболочка. Характерным оптическим свойством ЗНЧ, как и других драгоценных и монетных металлов, является плазмонный резонанс (ПР), в связи с чем наночастицы этого типа носят название плазмонно-резонансных частиц (ПРЧ). Химическая инертность золота, сочетающаяся с высоким сродством к некоторым нуклеофилам (тиолам и аминам), делает ЗНЧ практически нетоксичными, и в то же время позволяет функционализировать поверхность различными физиологически активными соединениями или гетеробифункциональными реагентами.

Благодаря свойству ПР, химической стабильности и биосовместимости ЗНЧ находят все большее применение в различных отраслях медико-биологических исследований: геномике, биосенсорике, иммунологическом анализе, оптической когерентной томографии, мультифотонной люминесцентной и фотоакустической спектроскопии, методах световой микроскопии в качестве оптических зондов (маркеров). Одним из наиболее перспективных направлений в использовании золотых наночастиц является диагностика и терапия онкологических заболеваний, включающая в себя фотодинамическую и фототермическую терапию, а также адресную (направленную) доставку лекарственных веществ непосредственно в опухолевую ткань или перерожденную клетку. При адресной доставке терапевтическое действие противоопухолевых препаратов усиливается благодаря непосредственному проникновению лекарственного средства в опухоль за счет транспортной функции наночастиц, а также вследствие повышения локальной концентрации активного вещества в области мишени. Несмотря на большое количество опубликованных экспериментальных работ и обзоров, некоторые аспекты направленной доставки продолжают оставаться актуальными.

В частности, недостаточно исследованы вопросы взаимодействия лекарственного вещества с поверхностью наночастиц и собственной токсичности носителей.

Зачастую используемые комплексы, включающие в себя наночастицы и лекарственные препараты, имеют сложный состав, и их синтез трудновоспроизводим. В качестве лекарственной составляющей используются дорогостоящие противоопухолевые препараты. В данной работе мы исследовали возможность создания лекарственного комплекса, состоящего из доступного отечественного противоопухолевого препарата проспидина и золотых сферических наночастиц, синтезируемых по классическому широко известному методу с доказанным отсутствием токсичности.

Для успешной диагностики и терапии опухолей необходимо точное определение локализации золотых наночастиц и опухолевых клеток. Не менее важно изучение жизнеспособности клеток как для фундаментальных исследований цитотоксичности ПРЧ, так и для определения эффективности противоопухолевой терапии.

Локализацию золотых наночастиц определяют методами световой микроскопии темного поля, двухфотонной люминесцентной или электронной микроскопии. Применение конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ) требует использования флуоресцентных меток, в то время как ЗНЧ обладают люминисценцией с очень низким квантовым выходом. Большинство стандартных методов флюоромикроскопических и цитофлуориметрических исследований не предполагают использования ПРЧ в силу принципиальных особенностей системы освещения и регистрации сигнала. В данной диссертационной работе проведено исследование возможности использования смешанных меток, состоящих из ЗНЧ и одного или нескольких флуоресцентных красителей, для определения колокализации ЗНЧ с клеточными органеллами и жизнеспособности клеток. Для визуализации клеток и ЗНЧ нам пришлось модифицировать системы освещения микроскопов и использовать комбинирование нескольких микроскопических режимов физического

контрастирования. В результате был разработан оригинальный метод использования смешанных меток в режимах темнопольной световой и КЛСМ, основаный на усилении светимости ЗНЧ и их агрегатов вследствие их взаимодействия с катионными флуоресцентными красителями.

Проведение исследований в области одновременной диагностики и терапии (тераностики) онкозаболеваний подразумевает постоянное совершенствование применяемых ПРЧ в плане увеличения емкости их полезной нагрузки (сорбционной емкости) и повышения энергии взаимодействия с индуцирующим возбуждение электромагнитным полем. Наиболее перспективным в этом плане является создание композитных наночастиц (кНЧ), состоящих из материалов с различными физическими и химическими свойствами, как правило, — структуры типа ядро/оболочка, например Аи/БЮг. Оболочки из двуокиси кремния (кремнезема), позволяют увеличить полезную поверхность по отношению к объему наночастиц, улучшить коллоидную стабильность и предотвратить агрегацию при смене растворителя.

Многолучевые золотые наночастицы (нанозвезды) являются одними из наиболее перспективных контрастирующих агентов и носителей лекарственных веществ благодаря высокой поляризуемости (чрезвычайной яркости в режиме светорассеяния), и сильно развитой поверхности. Они могут использоваться непосредственно как носители и оптические зонды или входить в качестве ядра в состав композитных нанозвезд (кНЗв).

Первые работы по синтезу и применению наночастиц такого рода появились сравнительно недавно, период практически совпадает со временем подготовки диссертации - 3-5 лет. Основной областью применения частиц указанного типа является рамановская спектроскопия (спектроскопия комбинационного рассеяния), где они выступают в качестве усилителей гигантского комбинационного рассеяния (ГКР). В нашей работе мы исследовали различные варианты синтеза частиц кНЗв структуры Аи/8Ю2 и их использования в оптической когерентной томографии (ОКТ).

Таким образом, к моменту начала исследований, описанных в данной диссертации, имелся ряд нерешенных вопросов, связанных с проблемой получения эффективно воздействующего на опухолевые клетки комплекса, состоящего из противоопухолевого препарата и золотых наночастиц; визуализации золотых наночастиц методами световой микроскопии, в том числе, КЛСМ, в культурах живых клеток; получением стабильных нанокомпозитных частиц, состоящих из золотых нанозвезд, покрытых кремнеземной оболочкой, используемых в качестве контрастирующих агентов для оптической когерентной томографии, а в перспективе и как носителей лекарственных веществ. Этим определяется актуальность и научная значимость темы диссертации.

Исходя из вышесказанного, целью диссертационной работы было сравнительное экспериментальное исследование золотых наносфер, нанонанозвезд и композитов (нанозвезды с оболочкой из двуокиси кремния) в качестве оптических зондов для цитологических исследований и носителей протвопухолевого препарата проспидина при взаимодействии с нормальными и опухолевыми клетками.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи исследования:

,1г» I

4. Экспериментально оценить варианты использования композитных нанозвезд в цитологических исследованиях и в оптической когерентной томографии на модельной жидкости фантомов тканей.

Научная новизна полученных результатов заключается в следующем:

I'I

; этого процесса на жизнеспособность клеточных культур. В частности, эти методы

уже нашли применение в таких учреждениях, как ИБФРМ РАН (г. Саратов, Россия), СГУ (г. Саратов, Россия), Университет Оулу и Биоцентр Оулу (г. Оулу, Финляндия). Полученный комплекс проспидин+ЗНЧ является перспективным потенциальным противоопухолевым препаратом. Золотые нанозвезды, покрытые кремнеземной оболочкой, используются в Университете Оулу для контрастирования фантомов тканей и крови в ОКТ.

Достоверность научных результатов подтверждается воспроизводимостью экспериментальных данных и их соответствием теоретическим расчетам, а также качественным и количественным согласием с результатами независимых исследований других авторов. Статистическую обработку данных проводили в программе Microsoft Excel. Все эксперименты проводили в 3-5 повторностях. На защиту выносятся следующие основные положения и результаты:

1. Катионные флуоресцентные красители, сорбируясь на частицах золота, и/или вызывая их агрегацию, увеличивают светимость золотых частиц (агрегатов), позволяя исследовать локализацию золота и жизнеспособность клеток методами KJICM и световой микроскопии в режиме темного поля и в комбинированных режима.

3. Усиление сигнала флуоресценции от препарата клеток, инкубированных с золотыми наночастицами, зависит от поверхностных свойств наночастиц. В отличие от ЦТАБ-покрытых золотых нанозвезд, золотые нанозвезды покрытые ХЕПЕС не увеличивают интенсивность регистрируемого сигнала релеевского светорассеяния от клеточных структур и флуоресценции красителей. Механизм увеличения сигнала флуоресценции можно объяснить изменением проницаемости цитоплазматических мембран.

Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с другими исследователями, и результаты, полученные совместно с другими исследователями. Экспериментальные результаты получены лично автором в сотрудничестве с д.б.н. В.А. Богатыревым, д.б.н. Л.А. Дыкманом, д.б.н. С.А. Староверовым, д.б.н. О.И. Соколовым, к.б.н. М.К. Соколовой, к.б.н. Т.Е. Пылаевым, аспирантом АЛО. Прилепским. Общее планирование экспериментов, их обсуждение и подготовка результатов к публикации проводились совместно с д.ф.-м.н. проф. Н.Г, Хлебцовым и д.б.н. В.А. Богатыревым. Эксперименты по синтезу нанокомпозитов и исследование их токсичности и оптических свойств выполнены совместно с к.ф.-м.н. А.П. Поповым, к.ф.-м.н. A.B. Быковым, к.б.н. И.Н. Сковородкиным, д.техн.н. М. Киннюнен, проф. С. Вайнио и проф. К. Кордаш в университете Оулу (Финляндия) и на базе Биоцентра Оулу (Финляндия). Работа выполнена на базовой кафедре биофизики факультета нелинейных процессов Саратовского госуниверситета и в лаборатории нанобиотехнологии ИБФРМ

Информация о работе

Бибикова, Ольга Александровна
кандидата физико-математических наук
Саратов, 2013
ВАК 03.01.02

Диссертация

Экспериментальное исследование золотых наносфер, нанозвезд и композитов на основе нанозвезд в качестве оптических зондов и носителей проспидина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы