Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы чувствительности флуоресценции зонда К-35 к изменениям связывающих центров альбумина в модельной системе и на примере шизофрении

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы чувствительности флуоресценции зонда К-35 к изменениям связывающих центров альбумина в модельной системе и на примере шизофрении"



На правах рукописи

РГБ ОД

1 Г) о

Комарова Мария Николаевна

МЕХАНИЗМЫ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ЗОНДА К-35 К ИЗМЕНЕНИЯМ СВЯЗЫВАЮЩИХ ЦЕНТРОВ АЛЬБУМИНА В МОДЕЛЬНОЙ СИСТЕМЕ И НА ПРИМЕРЕ ШИЗОФРЕНИИ

03.00.02 БИОФИЗИКА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2000

Работа выполнена в лаборатории биофизических методов диагностики Научно-исследовательского института физико-химической медицины МЗ РФ

Официальные оппоненты:

д. м.н., профессор Сороковой В.И. д.м.н., профессор Титов В.Н.

Ведущая организация:

НИИ Экспериментальной медицины РАМН (г. Санкт-Петербург)

Защита диссертации состоится_ 2000 года в_часов на

заседании диссертационного Совета Д 084.66.01 при НИИ физико-химической медицины МЗ РФ по адресу: ул.Малая Пироговская, 1-а, Москва, 119828, Россия.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ физико-химической медицины МЗ РФ

Автореферат разослан 02 октября 2000 г. Ученый секретарь

диссертационного Совета Д 084.66.01, кандидат биологических наук

Научный руководитель: к.б.н. Грызунов Ю.А. Научный консультант: чл.-корр. РАМН, д.ф.-м.н., профессор

Добрецов Г.Е.

М.А.Мурина

р6<?5~. ово- з 0

л

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы. Развитие патологических процессов в организме практически всегда сопровождается накоплением эндогенных и/или экзогенных веществ, оказывающих токсическое действие или изменяющих направленность метаболических процессов. Для удаления этих продуктов и предотвращения токсикоза существует система, включающая в себя органные и молекулярные механизмы детоксикации. Важным звеном этих механизмов являются транспортные молекулы, в том числе альбумин крови - один из главных переносчиков низкомолекулярных гидрофобных и амфифильных веществ.

Ранее показано, что при ряде заболеваний способность альбумина связывать различные вещества изменяется [Чегер С.И. 1975, Brodersen R 1985-1989, Миллер Ю.И. 1990-1992]. Оценка связывающей способности альбумина важна для клинической практики. Конкуренция между лигандами за места связывания на альбумине может влиять на эффективность лекарственной терапии и проявление токсичности метаболитов.

Наиболее простым и доступным методом исследования свойств альбумина является метод флуоресцентных зондов, когда об изменении свойств альбумина судят по изменению интенсивности флуоресценции зонда. Одним из таких зондов является К-35, который при добавлении в сыворотку крови избирательно флуоресцирует из альбумина [Красовицкий Б.М. 1988, Айдыралиев Р.К. 1988, Миллер Ю.И. 1990]. Клинический метод исследования альбумина с помощью К-35 был разработан в НИИ ФХМ МЗ РФ и в течение последних 5-7 лет применяется во многих клиниках России [Миллер Ю.И. 1991, Добрецов Г.Е. 1991, Грызунов Ю.А., Добрецов Г.Е. 1994, 1998].

В многочисленных клинических исследованиях показано, что у здоровых людей значения интенсивности флуоресценции К-35, нормированные на концентрацию альбумина в сыворотке, в 1,1 - 2,5 раза выше, чем у больных. Этот эффект наблюдается при самых различных заболеваниях: неотложных состояниях и хирургических болезнях [Закс И.О., 1995, Федоровский 1994, Гринберг A.A. 1999, Родоман Г.В. 1999], болезнях сердца и сосудов, печени, легких [Арутюнов

к

Г.П. 1994, 1998, Андреева О.Л. 1998, Титов В.Н. 1999], при стоматологических [Андреева О.Л. 1998] и даже при психических заболеваниях [Мисионжник Э.Ю 1994, 1997, Гамалея Н.Б. 1998].

Молекулярные механизмы такой универсальной реакции и причины высокой чувствительности флуоресцентного теста к даже небольшим изменениям в состоянии здоровья остаются невыясненными. Раскрытие эт1гх механизмов важно для понимания реакции организма на болезнь и для целей практической медицины - для интерпретации клинического теста, а также для решения вопросов тактики лекарственной терапии и детоксикации. Особенно актуален этот вопрос для оценки и прогнозирования эффективности терапии при психических заболеваниях, когда возможно развитие резистентности к терапии.

Таким образом, цель и задачи работы определяются требованиями медицинской практики, необходимостью раскрытия молекулярных механизмов теста, используемого в клинике.

Вопрос о причинах изменения интенсивности флуоресценции зондов в альбумине при заболеваниях стоит с 1952 года, когда Лоуренс предложил зонд ани-линонафталинсульфонат (АНС) и обнаружил, что интенсивность его флуоресценции у больных ниже, чем у здоровых. Возможны две причины: конкуренция зонда с другими лигандами альбумина и конформационные изменения связывающих центров самого белка без конкуренции. Обычно полагают, что доминирует первый механизм - конкурентный. [Миллер Ю.И. 1991, Добрецов Г.Е. 1992, Грызунов Ю.А., Добрецов Г.Е. 1994]. Однако некоторые данные, полученные при исследовании альбумина с зондом К-35 свидетельствуют о конформацион-ных изменениях связывающих центров при некоторых заболеваниях, в частности при шизофрении [Андреева О.Л. 1995, Мисионжник Э.Ю. 1997]. Возможно, конформационные изменения связывающих мест для К-35 индуцированы связыванием лигандов в других центрах.

Специального исследования, посвященного вопросам связывания К-35, изменения конформации связывающих центров для К-35 при связывании других лигандов проведено не было. Также оставались невыясненными молекулярные механизмы изменения флуоресценции зонда при шизофрении.

Цель и задачи исследования. Целью диссертации было выяснение молекулярных механизмов высокой чувствительности флуоресценции К-35 к изменениям связывающих центров, вызванных в модельной системе — изолированном альбумине - и происходящим при патологических процессах в организме человека, выявление роли изменения конформации связывающих центров и конкуренции при связывании лигандов с альбумином в изменении интенсивности флуоресценции К-35.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• установить связь между изменениями сродства зонда К-35 к альбумину и интенсивностью флуоресценции К-35, определяемой в клинико-лабораторной практике, на примере доноров и больных шизофренией;

• разработать метод, позволяющий одновременно и независимо исследовать связывание К-35 с альбумином и флуоресценцию зонда из этого белка;

• исследовать влияние на связывание К-35 с альбумином важного физиологического лиганда - насыщенной жирной кислоты;

• исследовать конкурентные и аллостерические влияния различных лигандов - маркеров "лекарственных" связывающих центров I и II - на взаимодействие К-35 с альбумином;

• методом анализа затухания флуоресценции с временным разрешением 1(Г10 сек исследовать механизмы, приводящие к изменению интенсивности флуоресценции зонда на примере сывороток больных шизофренией.

Научная новизна работы. Впервые с использованием референтного метода равновесного диализа проведено исследование связывания К-35 с изолированным альбумином и с фракциями сыворотки. Показано, что в условиях клинического теста зонд К-35 при добавлении в сыворотку крови не только флуоресцирует из альбумина, но и связывается в основном с альбумином.

Разработан новый метод оценки связывания зонда с белком, позволяющий работать в широком диапазоне концентраций белка и в одном эксперименте исследовать как связывание, так и флуоресценцию зонда. Метод основан на безыз-лучательном переносе энергии возбуждения с комплекса (ортофталевый альдегид - белок) на зонд.

С помощью предложенного метода показано, что изменение концентрации альбумина в растворе в пределах 4-40 мкМ не влияет на связывание с ним К-35.

Исследовано влияние лигандов на связывание и квантовый выход флуоресценции К-35. Впервые выделен вклад изменений конформации связывающих центров в изменение интенсивности флуоресценции К-35. Показано однонаправленное совместное влияние изменения связывания и квантового выхода флуоресценции на интенсивность флуоресценции К-35. Определены условия, при которых интенсивность флуоресценции К-35 изменяется только в результате изменения квантового выхода флуоресценции, без нарушений связывания зонда.

Показано, что флуоресценция К-35 наиболее чувствительна к связыванию с альбумином насыщенных жирных кислот и маркеров центра I; при этом изменяются и связывание зонда, и его квантовый выход. Связывание маркеров центра II не влияет на связывание зонда, но оказывает в присутствии жирной кислоты влияние на квантовый выход флуоресценции К-35 путем аллостерического изменения конформации связывающего центра для К-35.

Впервые выявлены изменения связывающих центров альбумина крови больных шизофренией, не сопровождающиеся изменением связывания К-35. С помощью нового метода исследования процесса затухания флуоресценции К-35 с временным разрешением Ю"10 сек показано, что механизм выявленных изменений состоит в перераспределения пулов ярко и слабо флуоресцирующих молекул К-35, связанных с альбумином, и отражает изменение микрогетерогенности альбумина.

Практическое значение работы. Предложена простая методика одновременного исследования связывания и флуоресценции зонда К-35. Определение параметров связывания при этом не зависит от флуоресцентных свойств зонда. Методика позволяет работать в широком диапазоне концентраций белка.

С помощью данной методики возможна быстрая оценка как изменения связывающих свойств, так и изменения конформации альбумина. Простота и невысокая стоимость каждого исследования позволяет использовать эту методику как в клинических, так и в лабораторных условиях.

Обнаруженные изменения конформации альбумина при психических заболеваниях, ведущие к изменению свойств белка, могут быть основой для разработки новых путей решения проблемы лекарственной резистентности, которая часто развивается в процессе терапии психических заболеваний.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей и 5 тезисов на конференциях.

Апробация работы. Фрагменты диссертации были доложены на Международных конгрессах по флуоресцентной спектроскопии (MAFS V, Берлин 1995; MAFS VI, Париж 1999), на Съезде биофизиков России (Москва, 1999), конференциях по использовании синхротронного излучения (СИ-1998, СИ-2000, Новосибирск), конференциях НИИ ФХМ (1998, 1999), совместном заседании отдела биофизики НИИ ФХМ и кафедры биофизики РГМУ (Москва, 2000).

Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение результатов, выводы, библиография. Работа изложена на 110 страницах, иллюстрирована 26 рисунками и 10 таблицами. Библиография содержит 245 работ отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Биологический материал. В работе использовали изолированный обезжиренный альбумин человека (Sigma); изолированный альбумин человека, лиган-дированный пальмитиновой кислотой в соотношении 1:1 моль/моль; сыворотку крови доноров и изолированный из нее альбумин.

I I

Сыворотки больных психическими заболеваниями были предоставлены для исследования отделом биохимии МНИИ психиатрии МЗ РФ (зав. - д.м.н. М.Г.Узбеков). Отбор больных для участия в исследовании осуществлялся специалистами МНИИ психиатрии.

Реактивы. Флуоресцентный зонд К-35 (n-карбоксифенилимид диметила-минонафталевой кислоты) был синтезирован и любезно предоставлен Б.М.Красовицким, Л.И.Кормиловой и И.Г.Ермоленко (НПО "Монокристаллре-актив", Харьков, Украина). Были также использованы следующие реактивы: ор-тофталевый альдегид, 2-меркаптоэтанол, билирубин, пальмитиновая кислота, абсолютный этанол, азид натрия (все - производство Sigma); L-глутамин, ибу-профен, фенилбутазон, гидрофосфат натрия, дигидрофосфат натрия, соляная кислота, гидроксид натрия (Реахим, Россия); полиэтиленгликоль 3000 (Reanal), хлорид натрия (Диа-М, Россия). Для определения концентрации альбумина использовали набор фирмы "Human" (Германия) на основе реактива с бромкрезо-ловым зеленым; для определения эффективной и общей концентрации альбумина - набор "Зонд-Альбумин" (НИМВЦ "Зонд", Россия); для определения общей концентрации белка в сыворотке крови - биуретовый реактив.

Оборудование. Измерения оптической плотности были проведены на спектрофотометрах Beckman BU-7 (США) и Solar (Беларусь) в кюветах с длиной оптического пути 0,5 и 1 см. Измерения интенсивности флуоресценции были проведены на спектрофлуориметре Hitachi F4000 (Япония) в кюветах сечением 0,5x0,5 и 1x1 см и на клиническом флуориметре АКЛ-01 "Зонд" (Россия) в кюветах сечением 1x1 см. Спектры флуоресценции были корректированы с учетом спектральной чувствительности прибора. Коррекцию эффектов внутреннего фильтра проводили в соответствии с ранее описанным методом [Грызунов Ю.А., 1990].

Фракционирование сыворотки проводили путем осаждения глобулинов и липопротеинов в двухфазной водной системе с полиэтиленгликолем по методу [Vasileva R. 1981]. Качество осаждения контролировали по концентрации альбумина, а также по интенсивности флуоресценции К-35 в осажденной фракции (глобулины + липопротеины) и в надосадочной жидкости (альбумин).

Равновесный диализ проводили в аппарате Dianorm (Германия) в тефло-новых камерах объемом 1 мл при непрерывном перемешивании растворов в течение 24 часов при температуре 36°С. В качестве диализной мембраны использовали мембрану Купрофан (Россия). В отдельном опыте было показано, что инкубация альбумина с К-35 в этих условиях не изменяет свойств связывающих центров альбумина. Количество зонда, связавшегося с мембраной, не превышало 1,5% от добавленного. Концентрацию связавшегося зонда г рассчитывали по формуле:

г - ^>"<т _ 2* > где ^>кх - концентрация зонда в камере до начала диализа, е*1 е*1 е*1

^>/"7"" - концентрация свободного зонда после установления равновесия, D -

Е*1

оптическая плотность раствора, £ - коэффициент молярной экстинкции зонда К-35 в воде (для X = 420 нм s = 8900 (Моль*см)"'), I - длина оптического пути.

Измерение эффективности безызлучательного переноса энергии между ортофталевым альдегидом (ОФА), ковалентно присоединенным к альбумину, и зондом К-35. Присоединение ОФА к альбумину проводили, как описано в [Roth М., 1971] при pH 7,4. Реактив хранили в холодильнике не более 24 часов. Измеряли интенсивность флуоресценции комплекса ОФА-Альбумин (ОФА-А) до (F0 альб) и после (/""альб) добавления К-35; длина волны испускания ОФА-А ^ст=445 нм, длина волны возбуждения Лех=350 нм В качестве контроля измеряли интенсивность флуоресценции комплексов ОФА с глутамином до (Fn глу.) и после (Fl:,y) добавления К-35, полагая, что в растворе эффективность переноса энергии равна нулю. Полноту протекания реакции между ОФА и альбумином контролировали по отсутствию увеличения интенсивности флуоресценции ОФА-А при добавлении к образцу глутамина. Эффективность переноса энергии Q/Q(0) рассчитывали ( F

по формуле: п

-In

0(0)

Измерение затухания флуоресценции проводили на измерительном комплексе, установленном в пучке синхротронного излучения синхротрона С-60

Физического института им. П.Н.Лебедева РАН. Измерения проводили в плоских кварцевых кюветах с толщиной 2 мм. Возбуждение и регистрацию флуоресценции осуществляли с передней стенки кюветы. Расчет концентрации флуоресцирующих молекул вели по методике [Dobretsov G.E. 1998]. Аппроксимация функции затухания флуоресценции проведена ст.н.с., к.ф.-м.н. Т.И.Сырейщиковой.

Концентрацию общего белка измеряли по стандартной методике колориметрическим методом с биуретовым реактивом [Меньшиков В.В. 1987].

Концентрацию альбумина (ОКА) измеряли по стандартной методике колориметрическим методом с бромкрезоловым зеленым [Меньшиков В.В. 1987] и флуориметрическим методом с зондом К-35 [Грызунов Ю.А. 1994].

Определение показателя "эффективная концентрация альбумина" (ЭКА) в сыворотке проводили в соответствии с инструкцией к набору реактивов (НИМВЦ "Зонд", Россия). Сыворотку разбавляли в 200 раз, концентрация К-35 составляла 18 мкМ.

Обработку данных проводили с использованием ППП Office 97, Statistica for Windows. Расчет связывания лиганда с двумя независимыми центрами белка проводили с помощью специально созданной программы "Cubic" (автор - к.ф.-м.н. Н.Н.Синельников).

Библиографический поиск осуществляли в информационном центре НИИ ФХМ по базам Medline (http://igm.nlm.nih.gov).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Связывание К-35 с альбумином

и показатель ЭКА/ОКА в сыворотке крови

До недавнего времени считали, что в условиях клинического теста интенсивность флуоресценции К-35 не зависит от свойств связывающих центров альбумина, а характеризует заполнение этих центров лигандами, и единственной причиной, приводящей к снижению ЭКА/ОКА, является прямая конкуренция К-35 с этими лигандами [Миллер Ю.И. 1991, Грызунов Ю.А., Добрецов Г.Е. 1994]. Некоторые клинические наблюдения почти полностью подтверждали это положение [Гринберг A.A. 1999], другие - косвенно указывали на значение измене-

ния квантового выхода флуоресценции [Миллер Ю.И. 1994]. Появилось предположение о том, что в клинических условиях могут изменяться три параметра: число связывающих центров, константа связывания и квантовый выход флуоресценции [Андреева О.Л. 1995]. Однако во всех исследованиях сродство К-35 к альбумину определяли косвенно, как правило, методами флуориметрического титрования, чувствительными к изменению квантового выхода. Прямые данные, полученные референтными методами изучения связывания и доказывающие нетождественность изменений интенсивности флуоресценции зонда и его связывания, получены до настоящего исследования не были.

Для исследования были взяты сыворотки доноров и больных психическими заболеваниями. В каждом образце определили флуоресцентный параметр ЭКА/ОКА и сродство зонда к альбумину - произведение К*п - константы связывания (К) и числа участков связывания на молекулу альбумина (и). Параметры связывания определяли методом равновесного диализа. Результаты приведены на рисунке 1.

Рисунок 1.

Показатель ЭКА/ОКА и сродство к зонду К-35 в образцах сывороток доноров (кружочки) и больных психическими заболеваниями (треугольники).

Сродство выражено как величина (К*п), л/мкмоль, где К- константа связывания зонда, п - число участков связывания на одной молекуле альбумина.

Параметры связывания определены методом равновесного диализа. ЭКА/ОКА - флуоресцентным методом.

СЦ Ц15 02 К*п, .'Акмгь

Видно, что сродство к зонду, определенное прямым методом, и величина ЭКА/ОКА не коррелируют между собой. Существуют образцы сыворотки больных, в которых низкая удельная флуоресценция зонда (ЭКА/ОКА) сочетается с высокой величиной К*п, и образцы со сниженным сродством к К-35, но величиной ЭКА/ОКА около 1, что характерно для здоровых испытуемых [Андреева

О.Л. 1998, Сыромятникова Е.Д. 1998].

Таким образом, изменение интенсивности флуоресценции К-35 в условиях клинического теста может происходить как в результате снижения связывающей способности альбумина, так и в результате конформационных изменений связывающего центра для К-35, когда при неизменном связывании зонда уменьшается квантовый выход его флуоресценции. Это подтверждает результаты, полученные ранее в работе [Андреева О.Л. 1995]. Возможно, что эти процессы (изменение связывания и квантового выхода флуоресценции) могут протекать параллельно. Для того, чтобы выяснить причины, которые могут повлиять на интенсивность флуоресценции путем изменения связывания и/или путем изменения квантового выхода флуоресценции in vitro, в дальнейшей работе мы исследовали взаимодействие изолированного альбумина с зондом К-35 в присутствие важнейших физиологических лигандов и маркеров главных связывающих центроЕ альбумина. Кроме того, на примере сывороток больных исследовали происходящие в молекуле альбумина процессы, которые приводят к уменьшению квантового выхода in vivo.

Связывание К-35 с цельной сывороткой и ее фракциями:

изучение методом равновесного диализа.

Причинами выявленного несоответствия между сродством зонда к сыворотке и интенсивностью флуоресценции К-35, измеряемой в условиях клинического теста, могут быть:

1) существенное связывание К-35 с неальбуминовыми компонентами сыворотки, в то время как более 95 % флуоресцентного сигнала происходит из альбумина;

2) различие условий определения параметров связывания методом равновесного диализа (альбумин в концентрации 40 мкмоль/л) и клинического теста (около 4 мкмоль/л альбумина); в литературе обсуждается вопрос о зависимости параметров связывания лигандов с альбумином от его концентрации;

3) различие квантового выхода флуоресценции К-35 в сыворотках.

Методом равновесного диализа исследовали параметры связывания К-35 с

изолированным обезжиренным альбумином; с изолированным альбумином, ли-гандированным пальмитиновой кислотой; с фракциями альбумина и (глобулины + липопротеины), изолированными из цельной сыворотки донора; с цельными сыворотками доноров. Константы связывания (К) и число центров связывания на молекуле альбумина (п) определяли, используя преобразование Скэтчарда (г/с уб. г).

Во всех препаратах, за исключением цельных сывороток, графики Скэтчарда (рисунок 2) хорошо описывались единственной прямой (Я2 = 0,86 для диализа раствора изолированного обезжиренного альбумина), что означает наличие только одного типа центров связывания. В цельных сыворотках обнаружены два типа центров связывания для К-35 (рисунок 2). Константа связывания центров первого типа в цельной сыворотке близка по величине к константе связывания К-35 с комплексом (альбумин + пальмитиновая кислота) и с фракцией альбумина; константа связывания центров второго типа - к константе связывания К-35 с фракцией (глобулины + липопротеины). Сродство К-35 в разных сыворотках варьировало почти в 10 раз. Результаты определения параметров связывания для всех препаратов приведены в таблице 1. ;

Рисунок 2.

Результаты равновесного диализа обезжиренного альбумина (слева) и сыворотки донора (справа) с зондом К-35, представленные в координатах Скэтчарда.

По горизонтальной оси: концентрация связанного зонда, мкМ; по вертикальной оси: г/с - отношение концентрации связанного зонда (г) к концентрации свободного (с). Концентрация изолированного альбумина 40 мкМ, альбумина в сыворотке - 43 мкМ

Таким образом, показано, что в цельной сыворотке К-35 связывается не только с альбумином, но также с глобулинами и липопротеинами. Однако сродство (К*п) К-35 к альбумину в 7-Ю раз выше, чем к глобулинам и липопротеинам.

Расчет показывает, что в разбавленных в 200 раз сыворотках, в условиях проведения клинических измерений, связано около 25 % добавленного К-35, из которых более 85 % связывается с альбумином и около 15 % — с другими компонентами сыворотки. Таким образом, зонд К-35 в условиях проведения клинического теста не только избирательно флуоресцирует из альбумина, но и связывается с ним с высокой специфичностью, и объяснить несоответствие между флуоресценцией К-35 и его сродством к альбумину (рисунок 1) связыванием зонда с другими белками не удается.

Таблица 1

Параметры связывания К-35 с сывороткой крови и ее фракциями

Препарат Константа связывания К, мкМ"1 (М±т) Число участков связывания на молекуле, n, (М±т)

Обезжиренный альбумин (Sigma) 0,01 ±0,006 4,4 ± 0,3

Альбумин (Sigma), ли-гандированный пальмитиновой кислотой 0,015 ±0,003 4,2 ± 0,5

Альбумин, выделенный из цельной сыворотки 0,016 + 0,01 3,4 ±0,5

Фракция глобулинов и липопротеинов 0,0006 ± 0,0002 7 + 3*

Цельная сыворотка доноров (среднее по 9 сывороткам) 0,026 ± 0,006 0,0014 ±0,0035 4,3 ±0,5 18,9 ±3,0

* -мкМ связавшегося К-35/1 г белка

Связывающие и "флуорогениые" центры альбумина для К-35

С учетом разрешающей способности метода, с помощью равновесного диализа на молекуле изолированного альбумина обнаруживаются четыре центра связывания для К-35 с одинаковой константой связывания К= 1 * 104 М"'.

Возникает вопрос: из всех ли четырех центров К-35 может флуоресцировать, т.е. все ли центры - "флуорогенные"?

Рисунок 3

Заполнение связывающих центров (квадраты, правая вертикальная ось) и изменение интенсивности флуоресценции К-35 (круги, левая вертикальная ось) в изолированном обезжиренном альбумине при увеличении концентрации зонда. По горизонтальной оси - концентрация добавленного зонда

По левой вертикальной оси - интенсивность флуоресценции, отн ел), по правой - число связавшихся молекул зонда на одну молекулу альбумина. Концентрация альбумина 30 мкМ.

концентрация К-35. мкМ

Сопоставление заполнения центров зондом и изменения интенсивности флуоресценции показывают, что не все центры являются флуорогенными (рисунок 3), и в этом смысле альбуминовые центры связывания для К-35 гетерогенны, хотя и имеют одинаковую константу связывания. Флуоресценция перестает нарастать гораздо раньше полного заполнения центров зондом. Флуоресцирующими являются, в среднем, не более 2,2 центров из четырех. В условиях проведения клинического теста заполнено не более одного центра, но поскольку все центры имеют близкие константы связывания, то и в этих условиях должна проявляться их гетерогенность.

В клинических исследованиях и в данной работе измерения интенсивности флуоресценции К-35 проводили в разбавленных растворах сывороток или изолированного альбумина, концентрация белка составляла 2-5 мкМ. Измерения параметров связывания методом равновесного диализа проводили при концентрации альбумина 40 мкМ. Оставался неясным вопрос, влияет ли концентрация альбумина на параметры связывания К-35? В литературе продолжительное время обсуждается вопрос о влиянии концентрации белка на связывание различных лигандов.

В работе был предложен специальный метод, позволяющий исследовать одновременно как связывание, так и флуоресценцию К-35 в широком диапазоне концентраций белка.

Метод изучения свойств альбумина с использованием

безызлучательного переноса энергии с ОФА-А на К-35

Метод основан на явлении безызлучательного переноса энергии с ковалент-ной флуоресцентной метки на нековалентно связанный зонд К-35. В качестве ковалентной метки использовали ортофталевый альдегид, который в присутствии 2-меркаптоэтанола образует иминную связь со свободными аминогруппами (первичными аминами), формируя флуоресцирующий комплекс 1-алкилтио-2-алкил-изоиндол (ОФА-А). Комплекс ОФА-А использовали в качестве донора энергии для К-35. Явление переноса энергии с ОФА-А на К-35 был показано качественно - по уменьшению интенсивности флуоресценции донора - и количественно - по соответствующему увеличению интенсивности флуоресценции акцептора. Спектры испускания ОФА-А и поглощения К-35 практически полностью перекрываются (рисунок 4), оценка радиуса Ферстера для пары (ОФА-А) -(К-35) составила 4,1 нм.

В основе оценки параметров связывания зонда с альбумином по переносу энергии с метки лежат следующие утверждения:

1) эффективность переноса энергии с метки на зонд зависит только от числа молекул зонда, связанных с молекулой альбумина - г/А; зонд, находящийся в растворе, в переносе энергии не участвует;

2) константа скорости переноса энергии не зависит от концентрации белка.

Вид зависимости эффективности переноса энергии от концентрации акцептора в общем случае зависит от количества молекул донора и акцептора на одной молекуле альбумина, т.е. от геометрии переноса.

В простейшем случае, когда на одной глобуле белка находится не более одной молекулы метки и зонда (т.е. при условиях г/А< 1, [ОФА]/А<1 и одномерной геометрии переноса) график зависимости -1п(^/Р0) уб. г/А есть прямая линия. Экспериментально измеренные зависимости эффективности переноса от концентрации добавленного зонда при разной концентрации белка будут, безусловно, различны. Однако можно попытаться найти такие параметры Кип, при которых

Рисунок 4.

Спектры испускания флуоресценции комплекса ОФЛ-Л (ортофталевый &'1ьде-гид — альбумин) и поглощения зонда К-35 в молекуле альбумина. По горизонтальной оси: длина волны, им: по вертикальным осям: слева - оптическая плотность К-35. справа - интенсивность флуоресценции комплекса ОФА-А. Сплошная линия: спектр поглощения К-35. пунктирная линия - спектр испускания флуоресценции ОФА-А.

зависимости -ln(F/F0) vs. г/А для разных концентраций совмещаются (г рассчитывают по К и п). Это означает, что заполнение центров при выбранных концен- : трациях происходит одинаково и описывается найденными параметрами К и п.

В приведенных в работе экспериментах по исследованию свойств альбумина с помощью безызлучательного переноса энергии соотношение концентраций ОФА : альбумин было равно 0,5. В отдельном опыте было показано, что присоединение ОФА к альбумину в этом соотношении не влияло на флуоресценцию К-35.

По эффективности переноса было оценено среднее расстояние между меткой и К-35; оно оказалось равным 3,2 нм. Если полагать, что в выбранных экспериментальных условиях присоединение метки происходит главным образом по Lys-199 (этот остаток имеет низкое значение рК аминогруппы, менее 7,8 [Carter D.C., 1994]), то область локализации К-35 охватывает домены I и II (при модели молекулы альбумина как эллипсоида вращения с осями 14x4x4 нм [Brown 1985]) или домен II и половину каждого из доменов I и III (при модели альбумина в форме сердца - треугольника со сторонами около 8,5 нм [Carter D.C. 1994]).

Зависимость связывающих свойств альбумина от его концентрации

С помощью исследования безызлучательного переноса энергии с ОФА-А на К-35 была определена зависимость параметров связывания К-35 с альбумином от концентрации альбумина. В качестве начального приближения при поиске пара-

300 400 500 600

длина волны,нм

метров связывания, описывающих связывание К-35 в растворах 38,7 и 3,78 мкМ, были выбраны результаты равновесного диализа. Оказалось, что параметры связывания К-35 с альбумином /С=0,01 мкМ"1 и п=4 не зависят от концентрации альбумина в диапазоне 4-40 мкМ: при расчете концентрации связанного зонда г по этим параметрам кривые переноса совпали (рисунок 5). Дополнительный анализ показал, что качество совпадения не ухудшается (по критерию х2), если варьировать К и пв 1,8 раза, сохраняя произведение К*п.

Таким образом, значения параметров связывания, полученные методом равновесного диализа в растворах с концентрацией альбумина 40 мкМ, можно использовать при исследовании разбавленных растворов белка и сыворотки, когда концентрация альбумина мала. Различное сродство зонда к альбумину в условиях проведения равновесного диализа и измерения и флуоресцентных показателей (рисунок 1) не является причиной выявленных несоответствий.

г/А 1,2

Рисунок 5

Зависимость эффективности тушения комплексов ОФА-А от степени заполнения центров в растворах обезжиренного альбумина концентрацией 37,9 (круги) и 3,78 (треугольники) мкМ

По горизонтальной оси: степень заполнения центров связывания зондом К-35. Величина г/А рассчитана при одинаковых параметрах связывания К = 1 * 104 М'1, п = 4; По вертикальной оси: эффективность переноса энергии с ортофталевой метки на К-35.

Влияние других лигандов на связывание и флуоресценцию К-35 в альбумине

Свойства связывающих центров альбумина для К-35 могут быть модифицированы другими лигандами, связавшимися с альбумином.

Альбумин является транспортным белком для огромного количества экзогенных и эндогенных лигандов. Большинство из этих лигандов связываются с центрами I и/или II ("лекарственные" центры или регионы [БисНош 1986, Уаша-Ба1а 1998]). Лиганды, которые связываются только с центром I или с центром II,

называют маркерами соответствующего центра связывания. Отдельную группу лигандов составляют жирные кислоты, которые являются важнейшими физиологическими регуляторами альбумина и имеют специфические центры связывания [УатаБакл, 1998].

Представлялось важным оценить, как влияют маркеры центров связывания и жирные кислоты на связывание и флуоресценцию К-35.

Было исследовано влияние лигандов четырех типов: фенилбутазона и ибупрофена как маркеров, соответственно, I и II типа центров связывания; пальмитиновой кислоты — как маркера центра связывания жирных кислот и часто встречающейся в физиологических условиях; билирубина, который имеет на молекуле альбумина специфический участок связывания.

Маркеры центров добавляли до соотношения (связанный ли-ганд)/(центр связывания) = 1; билирубин добавляли до заполнения 0,5 центра связывания. Расчет связывания лигандов вели по параметрам связывания, опубликованным в литературе.

Оценивали влияние лигандов на связывание, интенсивность флуоресценции и квантовый выход флуоресценции К-35. Использовали метод равновесного диализа и метод, основанный на явлении безызлучательный перенос энергии. Результаты представлены в таблице 2.

Из результатов следует, что присоединение лигандов к любому из главных связывающих регионов альбумина вызывает изменение квантового выхода флуоресценции зонда К-35; в некоторых случаях такое изменение квантового выхода происходит без изменения сродства зонда к альбумину.

Необходимо отметить, что изменения сродства и квантового выхода К-35 практически всегда протекали в одном направлении: увеличение - увеличение, уменьшение - уменьшение.

Полученные данные говорят о том, что изменение флуоресценции К-35 в условиях клинического теста может быть обусловлено изменением конфор-мации связывающего центра для К-35 при связывании с альбумином лиган-да в другом центре и при отсутствии прямой конкуренции зонда и другого лиганда. Однонаправленность, синергизм влияния лигандов на связывание

и на квантовый выход флуоресценции К-35, вероятно, является причиной высокой чувствительности флуоресценции зонда даже к небольшим нарушениям в организме.

Таблица 2.

Влияние лигандов - маркеров центров связывания на связывание,

флуоресценцию и квантовый выход флуоресценции К-35 в альбумине

Препарат Исследуемый лиганд Исследуемый параметр (Т - увеличение, 4 - уменьшение)

связывание зонда интенсивность флуоресценции зонда квантовый выход флуоресценции зонда

Изолированный обезжиренный альбумин Пальмитиновая кислота Т в 1,15-1,3 раза Т в 1,5-2 раза Т в 1,8-2,2 раза

Фенилбута-зон 4 в 1,6-1,8 раза 1 в 2-2,1 раза 4 в 1,2-1,3 раза

Ибупрофен нет эффекта нет эффекта нет эффекта

Билирубин нет эффекта 1 в 1,7-1,8 раза 4 в 1,7-1,8 раза

Изолированный альбумин, лиган-дированный пальмитиновой кислотой Фенилбута-зон !в 1,2-1,3 раза 1 в 2 раза 4 в 1,6-1,7 раза

Ибупрофен нет эффекта 4 в 1,15-1,2 раза 4 в 1,15-1,2 раза

Билирубин нет эффекта 4 в 2,2-2,4 раза 4 в 2,2-2,4 раза

Можно выделить причины изменения интенсивности флуоресценции К-35 в клиническом тесте исследования альбумина:

• Изменение связывания зонда с альбумином в результате:

1) присоединения молекул жирных кислот;

2) присоединения лигандов - маркеров I типа центров связывания.

• Изменение квантового выхода флуоресценции зонда в результате:

1) присоединения молекулы жирной кислоты;

2) присоединения лигандов - маркеров I типа центров связывания ;

3) присоединения билирубина;

4) присоединения лигандов - маркеров II типа центров связывания (слабое влияние).

Изменение свойств альбумина у больных шизофренией:

возможная роль гетерогенности связывающих центров для К-35.

Данные, полученные ранее в совместном исследовании с НИИ психиатрии, свидетельствуют о драматическом изменении свойств альбуминовых центров при психических заболеваниях [Мисионжник Э.Ю. 1997].

Анализ сывороток больных с помощью метода равновесного диализа показал, что в ряде случаев наблюдаемые нарушения обусловлены только снижением квантового выхода, без изменения сродства зонда к альбумину (см. рис.1).

В данной работе и в наших предварительных исследованиях было показано, что пул молекул К-35, связавшихся с альбумином, не однороден: не все связывающие центры являются флуорогенными, в некоторых флуоресценция зонда существенно потушена [Добрецов Г.Е. 1996, Огугипоу Уи.А. 2000].

Не может ли в основе изменения квантового выхода флуоресценции К-35 (и, следовательно, изменения конформации белка) лежать изменение характера этой гетерогенности?

В работе этот вопрос исследовали с помощью метода анализа затухания флуоресценции, позволяющего определить концентрацшо флуоресцирующих молекул [ОоЬг^боу С.Е. 1998].

Эксперименты были проведены совместно с ст.н.с. к.ф.-м-н-Т.И.Сырейщиковой и проф. М.Н.Якименко (ФИАН им. П.Н.Лебедева, Москва). Исследовали сыворотки 5 больных параноидной шизофренией, у одной из больных (М.) было проведено три повторных взятия крови в процессе терапии. Сыворотки для исследования отбирали таким образом, что изменения интенсивности флуоресценции К-35 были не менее, чем на 90% связаны с изменением среднего квантового выхода флуоресценции. Для сравнения использовали стандартную объединенную сыворотку доноров серии 00. Все измерения проводили в цельной сыворотке без выделения фракции альбумина.

Затухание флуоресценции К-35 в сыворотках описывалось суммой двух

экспонент: т = к^А*ехр(1±; + /,2*ехРГ^^ ™е *> и *>- характерные времена,

через которые происходит высвечивание квантов флуоресценции, А] и А2 - амплитуды компонент затухания, пропорциональные числу молекул зонда, принимающих участие во флуоресценции и имеющих времена жизни, соответственно, г/ и г?; к - приборная константа, одинаковая во всех измерениях, X - время, прошедшее после возбуждения флуоресценции зонда короткой вспышкой света.

Неэкспоненциальный характер затухания флуоресценции обусловлен гетерогенностью микроокружения К-35 в альбумине, и релаксация окружения за время жизни возбужденного состояния отсутствует [Огугипоу Уи.А., 2000].

Были рассчитаны концентрации флуоресцирующих и полностью потушенных молекул К-35. Результаты анализа представлены в таблице 3.

Наличие молекул зонда с разным временем жизни возбужденного состояния (Г/ и г?) соответствует двум различным типам микроокружения флуоресцирующих молекул К-35 в альбумине сыворотки.

Таблица 3.

Группы молекул зонда К-35, связанные с сывороткой

больных шизофренией и со стандартной сывороткой

Обследованные ?7,(HC) ai т2( не) а2 аз

и. 8,5 0,04 1,8 0,17 0,79

н. 7,9 0,09 1,8 0,27 0,64

с. 7,7 0,07 1,4 0,25 0,68

x. 7,6 0,07 1,2 0,28 0,65

м,. 8,6 0,06 1,5 0,30 0,64

м2. 3,5 0,16 0,6 0,28 0,55

м3. 7,9 0,11 1,2 0,34 0,55

М±ш 7,38±0,7 0,08210,016 1,3±0,55 0,2710,021 0,6610,03

Стандартная сыворотка, М±т 7,6±0,06 0,13+0,08 1,5+0,2 0,1310,08 0,75+0,01

г/и Т2- времена жизни флуоресценции К-35

А[ и А2 - доли молекул зонда, связанных с альбумином, принимающих участие во флуоресценции и имеющих времена жизни г/и г_>;

Аз - доля связавшихся с альбумином, но не флуоресцирующих молекул К35. Для больных приведены средние из трех измерений функции затухания.

Молекулы зонда, имеющие большее время жизни возбужденного состояния Г/, и, соответственно, больший квантовый выход, были названы ярко флуоресцирующими. Молекулы со временем жизни г,и с меньшим квантовым выходом были названы слабо флуоресцирующими. Расчеты показывают, что в стандартной сыворотке здоровых доноров имеется приблизительно одинаковое количество ярко и слабо флуоресцирующих молекул К-35. В сыворотке больных шизофренией ярко флуоресцирующих молекул в среднем на 30 % меньше, а слабо флуоресцирующих молекул в среднем в 2 раза больше, чем в стандартной сыворотке.

Полученные результаты указывают на то, что изменение конформации связывающих центров альбумина при шизофрении сопровождается уменьшением среднего квантового выхода флуоресценции К-35 в сыворотке, и что причиной этих нарушений является изменение микрогетерогенности альбуминовых центров - изменение соотношения между центрами разной степени "флуороген-ности" в отношении К-35.

ВЫВОДЫ

Исследованы механизмы чувствительности флуоресценции зонда К-35 к изменениям связывающих центров альбумина в модельной системе и на примере шизофрении. С этой целью изучали связывание зонда с альбумином, изменение конформации связывающих центров для К-35 при связывании с альбумином других лигандов, возможную роль этих механизмов в реакции альбумина на патологический процесс при шизофрении. В работе показано следующее.

1. Изменение интенсивности флуоресценции зонда К-35 может не сопровождаться нарушением сродства альбумина к зонду. Таким образом, изменения интенсивности флуоресценции К-35 и сродства альбумина к зонду не тождественны.

2. Предложена новая методика определения параметров связывания зонда с альбумином одновременно с измерением флуоресценции самого зонда. Методика основана на использовании явления безызлучательного переносе

энергии с флуоресцентной метки - комплекса (ортофталевый альдегид-белок) - на флуоресцентный зонд. Определение параметров связывания с помощью предложенной методики не зависит от флуоресцентных свойств зонда. Методика проста в использовании, анализ одного образца альбумина занимает не более 10 минут.

3. Исследовано влияние лигандов, заполняющих главные центры альбумина, на связывание и параметры флуоресценции К-35: пальмитиновой кислоты, фенилбутазона, ибупрофена и билирубина. Связывание с альбумином каждого из лигандов сопровождалось изменением квантового выхода флуоресценции зонда, тогда как связывание в ряде случаев оставалось неизменным. Таким образом, связывание лигандов в каждом из центров изменяет кон-формацию связывающих центров альбумина для К-35 и (или) микрогетерогенность молекул альбумина.

4. Изменения сродства альбумина к К-35 и изменения квантового выхода его флуоресценции при связывании с альбумином других лигандов носили однонаправленный характер: увеличению связывания зонда соответствовало увеличение квантового выхода флуоресценции, и наоборот. Этим можно объяснить высокую чувствительность флуоресценции зонда к различным, даже небольшим, нарушениям в организме.

5. С помощью анализа затухания флуоресценции показано, что связывающие центры альбумина для К-35 гетерогенны: имеются центры, в которых К-35 флуоресцирует с высоким квантовым выходом (ярко флуоресцирующие молекулы К-35), центры, в которых флуоресценция зонда частично потушена (слабо флуоресцирующие молекулы К-35) и центры, в которых квантовый выход зонда близок к нулю (нефлуоресцирующие молекулы К-35). Доля флуоресцирующих молекул К-35 в исследованных образцах составила не более 50 % от связанных с альбумином молекул зонда.

6. У больных шизофренией интенсивность флуоресценции К-35 из альбумина снижена. Показано, что причиной изменения интенсивности флуоресценции

К-35 при шизофрении является изменение среднего квантового выхода флуоресценции при не изменяющемся сродстве зонда к сыворотке. Причиной изменения квантового выхода флуоресценции является изменение характера гетерогенности связывающих центров альбумина: уменьшение доли центров, соответствующих ярко флуоресцирующим, и увеличению количества центров, соответствующих слабо флуоресцирующим молекулам К-35, связанных с альбумином.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Грызунов Ю.А., Сырейщикова Т.И., Комарова М.Н., Мисионжник Э.Ю.,

Молодецких А.В., Узбеков М.Г., Якименко М.Н. О качественных физико-химических изменениях связывающих участков альбумина крови у больных шизофренией // Соц. клин, психиатрия, 1997, №2, стр. 55-60.

2. Грызунов Ю.А., Добрецов Г.Е., Закс И.О., Комарова М.Н. Альбумин крови: свойства, функции и их оценка при неотложных состояниях // Новости науки и техники. Сер. мед. Вып. Реаниматол. и интенсив, терапия / ВИНИТИ, 1997, №3, с тр.3-13.

3. Комарова М.Н., Грызунов Ю.А. Строение молекулы альбумина и ее связывающих центров // В кн.: Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. Книга 2 // М.: Гэотар, 1998, стр. 28-51.

4. Добрецов Г.Е„ Грызунов Ю.А., Комарова М.Н., Сырейщикова Т.И., Якимен-

ко М.Н. Определение числа флуоресцирующих молекул в гетерогенных биологических образцах с помощью функции затухания флуоресценции // Препринт ФИ АН № 33, Москва, 1996,49 стр.

5. G.E.Dobretsov, Yu.A.Gryzunov, M.N.Komarova, T.I.Syrejschchikova,

M.N.Yakimenko Determination of the number of fluorescence emitting molecules in heterogeneous biological objects by use of fluorescence decay function and synchrotron pulse radiation // Nuclear Instruments & Methods in Physics Research, 1998, v.405, Nos.2,3, pp. 344-347.

6. Yu.A.Gryzunov, T.I.Syrejshchikova, M.N.Komarova, E.Yu.Misionzhnik,

M.G.Uzbekov, A.V.Molodetskich, G.E.Dobretsov, M.N.Yakimenko Serum albumin binding sites properties in donors and in schizophrenia patients: the study of fluorescence decay of the probe K-35 using S-60 synchrotron pulse excitation // Nuclear Instruments & Methods in Physics Research, 2000, A 448, pp.478-482.

7. Gryzunov Yu.A., Syrejshchikova T.I. Komarova M.N., Yakimenko M.N., Misionzhnik E.Yu.,Uzbekov M.G., Molodetskich A.V. Changes of serum albumin binding sites in schozophrenia: the study with a fluorescence decay analysis // Proc. Of V-th Intern. Conf. on Methods and Application of Fluorescence Spectroscopy, Berlin - Germany, 1997, 21-24 Sept., P54.

8. Gryzunov Yu.A., Dobretsov G.E., Komarova M.N., Syrejshchikova T.I. Yakimenko M.N. Amplitude analysis of the fluorescence decay: application to the study of various states of serum albumin binding sites // Proc. Of V-th Intern. Conf. on Methods and Application of Fluorescence Spectroscopy, Berlin - Germany, 1997, 21-24 Sept., P56

9. Komarova M.N., Gryzunov Yu.A., Syrejshchikova T.I. Yakimenko M.N., Jones G.R., Clarke D.T., Munro I.A. A fluorescent method for albumin study in whole serum: a molecular bases // Proc. Of Vl-th Intern. Conf. on Methods and Application of Fluorescence Spectroscopy, Paris - France, 1999,12-15 Sept., P80

10. Грызунов Ю.А., Сырейщикова Т.И., Комарова M.H., Мисионжник Э.Ю., Узбеков М.Г., Молодецких А.В., Добрецов Г.Е., Якименко М.Н., Jones G.R., Clarke D.T., Munro I.A. Изменения свойств связывающих центров альбумина при психических заболеваниях // II съезд биофизиков России, 23-27 августа 1999, Тезисы докладов, Т.2, стр. 662.

11. Сырейщикова Т.И., Якименко М.Н., Грызунов Ю.А., Комарова М.Н., Добрецов Г.Е., Jones G.R., Clarke D.T., Munro I.A. Моделирование конформацион-ных изменений сывороточного альбумина, наблюдающихся при развитии патологических процессов // XIII Всеросийская конференция по использованию синхротронного излучения. Новосибирск. 17-21 июля 2000 г. Тезисы докладов, стр. 218.