Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение связывающих центров альбумина при психических расстройствах и при стрессе

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изменение связывающих центров альбумина при психических расстройствах и при стрессе"

На правах рукописи

Смолина Наталья Викторовна

Изменение связывающих центров альбумина при психических расстройствах и при стрессе: детектирование флуоресцентным методом с использованием наносекундной спектроскопии

Специальность 03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0 5 ДЕК 2008

Москва 2008

003454235

Работа выполнена в лаборатории биофизических методов диагностики ФГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава

Научный руководитель'

доктор биологических наук, профессор Грызунов Юрий Анатольевич

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Потапенко Александр Яковлевич

(ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава)

доктор физико-математических наук, профессор Петрусевич Юрий Михайлович (Московский государственный университет им М В Ломоносова)

Ведущая организация

ГУ НИИ Экспериментальной Медицины РАМН

Защита состоится « /У » декабря 2008 г. в 10 00 часов на заседании диссертационного совета Д 208 057 01 при ФГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава: 119998, Москва, ул Малая Пироговская, д 1-А

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава

Автореферат разослан

«ib

ноября 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

М А Мурина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Поиск новых, более информативных показателей для оценки состояния организма в норме и при заболеваниях является актуальной задачей медико-биологической науки. Такой поиск ведется различными методами, включая биофизические. В частности, в последние годы внимание исследователей привлекают изменения конформации (например, у прионов) и других физико-химических свойств белков, связанные с развитием патологических процессов в организме.

Одним из белков, легко подвергающихся модификациям, является альбумин - белок (около 66 кДа), составляющий около половины массы белков плазмы крови и присутствующий во всех жидкостях организма. В составе межклеточной жидкости альбумин взаимодействует почти со всеми клетками и в процессе циркуляции изменяется в зависимости от состояния органов и тканей Около 15 лет назад в НИИ ФХМ был создан флуоресцентный метод для обнаружения модификаций альбумина Метод основан на нековалентном взаимодействии с альбумином оригинального специфического красителя, получившего название К-35 В сыворотке или плазме крови К-35 флуоресцирует практически только из альбумина, что позволяет изучать этот белок без его выделения из плазмы, то есть в нативном состоянии [Грызунов и Добрецов 1994,1998]

Этот новый тест позволил обнаружить изменения центров альбумина при ряде заболеваний. Причем изменения оказались зависимы от тяжести состояния больного и прогноза развития заболевания Клинические исследования показали высокую информативность флуоресцентного теста при распространенном перитоните, острых отравлениях, острых сердечно-сосудистых состояниях, при хронических заболеваниях печени, при ряде офтальмологических заболеваний [Гринберг 1999, Родоман 2001, ^Игнкоу 2002, Титов 2002, Курышева 2000]

Биофизические основы изменений альбуминовых центров при заболеваниях и механизмы высокой чувствительности показателей флуоресцентного теста к состоянию организма оставались во многом неясными Раскрытие этих основ имеет как фундаментальное, так и прикладное значение для медико-биологической науки и биофизики

Ранее взаимодействие К-35 с альбумином характеризовали лишь двумя измеряемыми флуоресцентными параметрами (см Рис I на стр 7) Имело смысл увеличить число измеряемых параметров за счет регистрации кинетики затухания флуоресценции зонда, чтобы иметь больше информации об изменениях в молекуле альбумина. Эти новые параметры нуждались в физической интерпретации. Особенно актуально стоял вопрос об интерпретации гетерогенности затухания флуоресценции К-35 в альбумине

Усовершенствовав таким образом метод, можно было попытаться обнаружить и исследовать изменения молекулы альбумина при психических расстройствах, особенно при их первом эпизоде (когда обычные лабораторные показатели чаще всего остаются в пределах нормы).

Изменения альбуминовых центров были обнаружены при самых разных заболеваниях [Грызунов и Добрецов 1998] Такая универсальность реакции альбумина на патологический процесс может быть связана с тем, что стресс, который сопровождает каждое заболевание, приводит к изменению связывающих центров альбумина. Необходимо было проверить это предположение в прямых опытах

Анализ состояния проблемы позволил сформулировать цель и задачи настоящего исследования

Цель работы - повышение информативности флуоресцентного альбуминового теста и раскрытие механизмов его чувствительности к изменениям связывающих центров альбумина при заболеваниях.

Задачи исследования:

1 Методом флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением КГ10 сек исследовать молекулярные механизмы взаимодействия флуоресцентного зонда К-35 с альбумином.

2. Расширить информативность флуоресцентного альбуминового теста путем воздействия на молекулу альбумина средами разного ионного состава и регистрации процессов затухания флуоресценции зонда К-35 с временным разрешением 1СГ10 сек.

3. Используя новые параметры, исследовать связывающие центры альбумина у больных параноидной шизофренией и депрессией при первом эпизоде болезни до начала терапии и при хроническом течении заболевания

4 В прямых опытах на животных выяснить, существует ли связь между особенностями их поведения, реакцией на стресс и свойствами связывающих центров альбумина.

Научная новизна работы. В работе с помощью флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением Ю"10 сек раскрыты молекулярные механизмы взаимодействия с молекулой альбумина флуоресцентного зонда К-35, используемого для регистрации изменений альбуминовых центров Впервые показано, что различным временам затухания флуоресценции зонда соответствуют различные участки связывания в альбуминовой глобуле

Возможности альбуминового флуоресцентного теста были расширены путем воздействия на молекулу альбумина средами разного ионного состава и регистрации процессов затухания флуоресценции с временным разрешением Ю"10 сек Это позволило впервые зарегистрировать изменения связывающих

центров альбумина при первом эпизоде шизофрении и при депрессии до начала лечения

Впервые в экспериментах на животных показана связь между особенностями поведения, стрессом и свойствами альбуминовых центров. Выявлены молекулярные и патофизиологические факторы, определяющие высокую чувствительность флуоресценции К-35 и альбуминовых центров к состоянию организма

Положения, выносимые на защиту.

1. С использованием флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением 10~10 сек изучены молекулярные механизмы взаимодействия зонда К-35 (Ы-(карбокси)фенилимида диметиламинонафталевой кислоты) с альбуминовыми центрами. Молекулы К-35, флуоресцирующие с разным временем затухания, связываются с четырьмя различными центрами в альбуминовой глобуле. Эти центры имеют различные свойства, и наносекундная спектроскопия позволяет наблюдать за каждым типом центров в отдельности.

2. Информативность альбуминового флуоресцентного теста ' была расширена путем использования наносекундной спектроскопии и воздействия на молекулу альбумина средами разного ионного состава Это подход позволил выявить изменения связывающих центров альбумина при первом эпизоде параноидной шизофрении и при тревожной депрессии до начала лечения Изменения альбумина у хронических больных могут быть зарегистрированы методом стационарной флуорометрии

3. Особенности поведения, стресс и свойства альбуминовых центров взаимосвязаны Возможно, стресс является неспецифическим фактором, обуславливающим изменение альбумина при различных заболеваниях

Практическое значение работы и внедрение.

Раскрытие молекулярных механизмов взаимодействия альбумина с флуоресцентным зондом К-35 открывает путь к созданию новые, более информативные тесты для оценки состояния больных при различных заболеваниях

С помощью наносекундной флуоресцентной спектроскопии были обнаружены изменения связывающих центров альбумина при первом эпизоде шизофрении до начала лечения и зарегистрирован эффект терапии депрессии на ранних стадиях лечения Эти результаты могут явиться основой для создания принципиально новых методов прогноза и оценки эффективности терапии при этих заболеваниях.

I"

Выявленная в работе взаимосвязь между особенностями поведения, стрессом и свойствами связывающих центров альбумина может открыть новые

возможности для объективной биофизической оценки изменений, происходящих при стрессе.

Результаты работы используются в учебном процессе на медико-биологическом факультете РГМУ, в практике работы лаборатории патологии мозга МНИИ психиатрии Росздрава и лаборатории биофизических методов диагностики ФГУ НИИ ХМ Росздрава.

Апробация работы. Результаты работы были доложены, на III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), на I съезде физиологов СНГ (Дагомыс, 2005), на международном конгрессе по биологической психиатрии (Вена, 2005), на конференциях РАН «Фундаментальные науки - медицине (Москва, 2006, 2007), на Третьем междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2007), на международной конференции по применению синхротронного излучения (Новосибирск, 2006), на конференции «Взаимодействие науки и практики в современной психиатрии» (Москва, 2007, 2008), на конференции «Медицинская физика и инновации в медицине» (Троицк, 2008), на II Международной конференции «Современные информационные и телемедицинские технологии для здравоохранения» (Минск, 2008)

Результаты работы были обсуждены на заседаниях Ученого Совета ФГУ НИИ ФХМ Росздрава, конференциях молодых ученых ФГУ НИИ ФХМ Росздрава, итоговых конференциях НИИ ФХМ МЗ РФ, на заседаниях и семинарах отдела биофизики ФГУ НИИ ФХМ Росздрава.

Публикации. По результатам исследования опубликовано 20 работ, в том числе, 7 статей (из них три - в ведущих научных периодических изданиях) и 13 тезисов

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы с описанием результатов работы, обсуждения, выводов, списка работ по теме диссертации, списка цитированной литературы, благодарностей Работа изложена на 137 страницах печатного текста, содержит 7 таблиц, проиллюстрирована 34 рисунками. Библиография включает 219 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ посвящено обоснованию актуальности исследования, формулированию цели и задач работы

В главе ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ рассмотрены определение, метаболизм, функции альбумина человека. Изложены современные представления о связывающих центрах молекулы альбумина, о влиянии на них физико-химических воздействий Описан альбуминовый флуоресцентный тест с использованием зонда К-35 (Рис. 1) и результаты его клинического применения. Сформулированы

нерешенные задачи, касающиеся механизмов теста и его чувствительности к состоянию альбуминовых центров.

В главе МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ приведены сведения об использованных материалах и реактивах, препаративных процедурах, методах исследования Описана методика измерения затухания флуоресценции с временным разрешением 1СГ10 сек на установке ФИАН им П.Н.Лебедева РАН; изложен метод изучения затухания флуоресценции в биологических образцах («метод амплитудного стандарта»), позволяющий рассчитать парциальные концентрации молекул зонда, флуоресцирующих в альбумине с разным временем затухания [ОоЬге1БОУ 1998, С^ипоу 2000] Описана методика экспериментов с животными Приведена характеристика обследованных больных, сведения о примененных методах статистического анализа результатов

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Роль различных центров в связывании альбумином Флуоресцентного зонда К-35

Известно, что связывание К-35 с сывороточным альбумином человека (ЧСА) имеет сложный характер. Результаты определения связывания К-35 с альбумином прямыми методами (равновесный диализ, безызлучательный перенос энергии, ультрафильтрация) свидетельствуют о наличии четырех участков связывания К-35 на альбуминовой глобуле со средней константой связывания около 104 л/моль [Грызунов 2004] Методы стационарной флуорометрии дают усредненную информацию обо всех центрах. Возможность следить за событиями в разных центрах могла бы значительно расширить информативность флуоресцентного теста Потенциально это можно сделать с помощью регистрации затухания флуоресценции зонда после импульсного возбуждения с временным разрешением около 10~1° сек (0,1 не). Однако в этом случае остро встает вопрос о физической интерпретации измеряемых

Рис 1. Схема, иллюстрирующая два главных понятия (ЭКА и ОКА) флуоресцентного альбуминового теста на основе зонда К-35

показателей. Он известен в литературе как проблема гетерогенности затухания флуоресценции [Лакович 1986, Lakowicz 1999].

Эксперименты, выполненные совместно с сотрудниками ФИАН им П Н Лебедева, показали, что функция F(t) затухания флуоресценции зонда К-35, связанного с ЧСА, в общем случае может быть представлена в виде суммы трех экспонент

F(t) = А, ехр(-1 / т9) + А3 ехр(-1 / т3) + А, ехр(-1 / Tt) (1)

с характерными временами около 9 не (Т9), около 3 не (Т3) и около 1 не (Tj) и амплитудами А9, A3 и А|. Величины амплитуд А9, A3 и Ai пропорциональны числу молекул, флуоресцирующих с временами Т9, Тз и Ti, соответственно. Таким образом, при связывании К-35 с ЧСА возникает гетерогенность: после возбуждения зонда видно не менее трех типов флуоресцирующих молекул. Кроме того, было показано, что нельзя исключить возможность существования связанных молекул зонда с очень малым временем затухания (менее 0,1 не) [Gryzunov 2001, 2002], которые не могли быть зарегистрированы нашей установкой (четвертый тип молекул, условно названных не флуоресцирующими, «н/ф»)

Как интерпретировать гетерогенность затухания флуоресценции зонда? Соответствуют ли четыре времени затухания четырем типам центров, или в любом из связывающих центров возможны все четыре времени затухания? Результаты, полученные в работе, свидетельствуют о том, что в случае взаимодействия К-35 с альбумином различные времена затухания зонда происходят от его молекул, связанных с разными центрами, и свойства этих центров неодинаковы.

Этот тезис подтверждается следующими результатами.

Во-первых, о неодинаковости альбуминовых центров, занимаемых К-35, свидетельствуют данные титрования Раствор альбумина титровали зондом и после каждой добавки измеряли затухание флуоресценции К-35. Амплитуды (формула 1) были пересчитаны в реальные концентрации молекул К-35, флуоресцирующих с разными временами, и представлены в двойных обратных координатах (Рис 2) Отсечки на вертикальной оси соответствуют предельному количеству центров каждого типа, заполняемых зондом Эти предельные количества центров (п), рассчитанные в среднем на 1 молекулу ЧСА, приведены в Таблица 1, в строке 2

Отсечки на горизонтальной оси являются оценками для констант связывания [Klotz 1946] Как видно, Кз и Ki (около 10 103 М~1) почти совпадают друг с другом, но резко отличаются от Kg (около 50 103 М~\ см Таблицу 2). Константа связывания отражает скорости процессов образования и распада комплекса. Следовательно, различия между центрами связывания К-35

существуют уже на стадиях ассоциации и/или диссоциации То есть структура окружения связанных молекул зонда сформировалась еще до (или в момент) образования комплекса зонд/ЧСА и существует в течение всего времени жизни комплекса

'З4 с о 2 6

Рис 2 Титрование раствора 4 мкМ альбумина человека зондом К-35 с повышением концентрации зонда от 10 до 48,3 мкМ Буферный раствор с ионной силой 0,159 М и рН 7,4 По вертикали (г,) - концентрация связавшегося К-35. Индексы соответствуют временам затухания флуоресценции Прерывистые линии показывают результаты моделирования связывания моделью с параметрами, приведенными в Табл 1, строки 2-5

1 1[ К-35 ] (литр / микромоль)

Таблица 1

Параметры связывания К-35 с альбумином человека ,

свободным от жирных кислот

№ Тип центров тип «9 не» тип «3 не» ТИП «1 НС» тип «н/ф»

1 Т (не) *) 10,1 - 9,0 3,9 - 3,3 1,1- 1,0 <0,1

2 п при г/СА > 0,2 0,16 1,1 1,1 1,5

3 Кп (103М-1) **) 7,8 7,9-13 7,9 - 13 10

4 К (103МЧ)

5 при г/Сд < 0,2 **) 50 7-12 7-12 6

при т/СА > 0,2 50 10 10

6 Квантовый выход О 0,68 0,25 0,08 <0,02

Т - время затухания флуоресценции, не - наносекунды, К - константа связывания; п - число участков связывания на молекулу альбумина, г - концентрация К-35, связанного с альбумином, СА - концентрация альбумина «н/ф» - нефлуоресцирующие молекулы.

*) величины Т снижаются по мере заполнения центров зондом от максимального до минимального значения (показано стрелками)

**) величины Кп и К возрастают от минимального до максимального значения (показано стрелками) по мере заполнения центров зондом

-0,04 0,00 0,04 0,08 0,12

Во-вторых, концентрации связанного зонда г, по-разному зависят от ионной силы раствора (Рис 3) связывание с центрами типа «9 не» возрастает более чем в 3 раза при снижении ионной силы от 0,159 М до 0,002 М, связывание с центрами типа «1 не» слабо зависит от ионной силы, а тип «3 не» занимает промежуточное положение. Интересно, что здесь видна заметная разница между типами «3 не» и «1 не» (Рис 3), тогда как в опыте с титрованием (Рис. 2) разницы не было заметно То есть число центров, из которых К-35 флуоресцирует со временем 3 не и 1 не, примерно одинаково, константы связывания при ионной силе 0,159 М близки, однако, центры не идентичны

В-третьих, опыты со специфическим лигандом свидетельствуют в пользу того, что центры связывания К-35 пространственно не совпадают: маркер лекарственного центра I фенилбутазон [Kragh-Hansen 1988, Carter 1994] снижает rg в 3,5 раза, гораздо слабее снижает г3 и увеличивает п (Рис 4), при этом времена затухания не изменяются Вероятно, фенилбутазон путем конкуренции приводит к перераспределению зонда между определенными центрами.

ПI По

3,0

♦ h

* Гз

Рис. 3. Влияние ионной силы раствора на связывание К-35 с альбумином человека По горизонтальной оси отложен корень квадратный из ионной силы раствора, по вертикальной - концентрация г, связанных молекул К-35 каждого типа при данной ионной силе, деленная на концентрацию г,о при ионной силе 0,159 М. Концентрация К-35 10 мкМ, альбумина - 20 мкМ

2,0

1,0

0,0

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 Корень квадратный из ионной силы

Г|/гю

1,6

iyr0(1 не)

Рис 4. Влияние фенилбутазона на связывание молекул К-35 разного типа с альбумином человека По горизонтальной оси - молярное отношение (Фенилбута-зон/Альбумин), по вертикальной - концентрация г, связанных молекул К-35 каждого типа при данной концентрации фенилбутазона, деленная на концентрацию гю в отсутствие фенилбутазона Концентрация К-35 20 мкМ, альбумина - 20 мкМ.

Фенилбутазон / Альбумин, моль/моль

Влияние вариации ионного состава среды на затухание флуоресценции К-35 в альбумине

Как показано выше, молекулы К-35, флуоресцирующие с разным временем затухания, связываются с различными центрами в альбуминовой глобуле Наносекундная спектроскопия дает возможность наблюдать за каждым типом центров в отдельности, и это расширяет число параметров, характеризующих альбуминовые центры. Вместе с тем, опыты показали, что дополнительным приемом, способным расширить информативность альбуминового флуоресцентного теста, является воздействие на альбумин средами разного ионного состава. Различие между центрами выявляется, например, при изменении ионной силы (Рис 3), что свидетельствует о разном вкладе электростатических сил во взаимодействие между зондом и разными центрами.

В данной работе мы расширили число параметров, характеризующих альбуминовые центры, используя два воздействия 1) замену ионов хлора в среде на ионы нитрата и 2) вариацию ионной силы раствора. Эффекты этих воздействий оценивали с использованием наносекундной спектроскопии

Рис 5. Влияние замены ионов хлора на ионы нитрата в среде на амплитуды компонент затухания флуоресценции К-35 из альбумина сыворотки человека. По вертикали -отношение амплитуд затухания при 180 ммоль/л ионов нитрата к амплитудам при отсутствии нитрата в среде Концентрация альбумина 20 мкМ, К-35 - 10 мкМ, рН 7,4, ионная сила одинаковая во всех растворах Данные представлены в виде M±SD (п=7)

Увеличение концентрации ионов нитрата в среде от 0 ммоль/л до 180 ммоль/л, как и увеличение ионной силы от 0,01 моль/л до 0,159 моль/л, приводило к уменьшению интенсивности флуоресценции К-35 из альбумина сыворотки. Однако эффект вариации состава среды на амплитуды кинетики затухания был различен Изменение ионной силы раствора оказывало большее влияние на А9, в то время как A3 и А] почти не изменялись (Рис. 3, стр 10) В противоположность этому, замена ионов хлора на ионы нитрата сказывалась преимущественно на величинах амплитуд A3 и А), в то время как А9 изменялась в значительно меньшей степени (Рис. 5) Влияния изменения состава среды на времена затухания Т9, Т3 и Т] не было обнаружено Эти результаты подтверждают различие между центрами, связывающими К-35 в альбуминовой глобуле

A, (NO'3= 180 мМ) 1,0 -, A,(NO5=0mM)

0,5 -

0,0

А(9нс) А(Знс) А{1 не)

Изменение связывающих центров альбумина при параноидной шизофрении и тревожной депрессии

Результаты, полученные при изучении взаимодействия К-35 с альбумином методом наносекундной спектроскопии, расширили представления о молекулярных основах чувствительности флуоресцентного теста к состоянию больных. Число параметров, характеризующих альбуминовые центры, значительно увеличилось, но могут ли они быть информативными в практическом плане, при характеристике состояния больных? Или они ничего нового не привносят по сравнению со стандартными показателями теста, ЭКА и ОКА (Рис 1)?

Представляло интерес попытаться обнаружить изменения альбуминовых центров при первом эпизоде психических расстройств. Ранее нами совместно с сотрудниками МНИИ психиатрии Росздрава было показано, что у хронических больных параноидной шизофренией и депрессией связывающие центры альбумина изменены [Грызунов 1994, Мисионжник 1998, Gryzunov 2000] Однако все время стоял вопрос, не связаны ли наблюдаемые изменения с длительно проводимой терапией? В работе была предпринята попытка прямого ответа при обследовании больных с первым эпизодом психического заболевания до начала лечения и в процессе терапии. Также были обследованы группы хронических больных

Оказалось, что у хронических больных параноидной шизофренией и тревожной депрессией изменения связывающих центров альбумина можно выявить методами стационарной флуорометрии, используя методику замены ионов хлора на ионы нитрата в среде. При описании тушения флуоресценции нитратов моделью Lehrer (1971) с двумя параметрами - бимолекулярной константой тушения и долей флуоресценции, доступной для тушения, - были выявлены различия между группами больных и здоровых: оба параметра в сыворотках обследованных больных были достоверно ниже, чем у здоровых (р<0,01, Таблица 2, [Смолина 2007, Узбеков 2008]).

Таблица 2

Параметры тушения флуоресценции К-35 нитратом в альбумине

хронических (14±6 лет болезни) больных психическими расстройствами

Параноидная шизофрения (п=24) Тревожная депрессия (п=26) Здоровые (п=22) р-значение при сравнении со здоровыми*

Константа тушения, л/моль 2,5 ±0,17 2,7 ±0,34 4,65 ±0,33 <0,01 - шизофрения <0,01 - депрессия

Доля флуоресценции, доступной для тушения 0,60 ± 0,03 0,59 ± 0,03 0,75 ± 0,03 <0,01 - шизофрения <0,01 - депрессия

* Использовап непараметрический тест Манна-Уитни, данные приведены в виде М±т

Однако при использовании стационарной флуорометрии не удалось отличить больных с первым эпизодом заболеваний от здоровых (Таблица 3)

Использование наносекундной спектроскопии в сочетании с воздействием на молекулу альбумина средами разного ионного состава изменило ситуацию Оказалось, что альбуминовая глобула у больных с первым эпизодом параноидной шизофрении изменена- влияние ионной силы на амплитуды Аз и А1 затухания флуоресценции К-35 в альбумине больных не такое, как у здоровых (р<0,001, Рис. 6). Эффективность разделения групп составила 85 % (95-% доверительный интервал от 67% до 96%) По-видимому, баланс электростатических сил в альбумине больных и здоровых различен, и это сказывается на центрах, связывающих К-35 с относительно слабым сродством

Таблица 3

Параметры тушения флуоресценции К-35 нитратом в альбумине больных с первым эпизодом психических расстройств до начала лечения

Парапонлмал шизофрения (п=13) Тревожная депрессия (п=7) Здоровые (п=31) р-зпачсппс при сравнении со здоровыми*

Константа тушения, л/моль 3,8 ± 0,22 4,21 ±0,76 0,71 ±0,07 0,16 - шизофрения 0,71 - депрессия

Доля флуоресценции, доступной для тушения 0,68 ± 0,03 0,71 ±0,07 0,74 ± 0,02 0,18 - шизофрения 0,32 - депрессия

* Использован непараметрическпй тест Манна-Унтнн, данные приведены в виде М±т

A,(l = 10 мМ) А,(1 = 159мМ) 1,6

Рис 6 Влияние ионной силы на амплитуды затухания флуоресценции К-35 в альбумине здоровых и больных с первым эпизодом параноидной шизофрении

По осям - отношение амплитуд затухания флуоресценции К-35 в альбумине при ионных силах 1=10 мМ и 1=159 мМ' Аз (по горизонтали) и А] (по вертикали). Разбавление сыворотки в 20 раз, концентрация К-35 27 мкМ

1А

1,2

1,0

□

И

- здоровые

- 1-й эпизод

1.3

1,5

1,7

A,(l = 10 мМ) А3(1 = 159мМ)

У больных депрессией весьма актуальной является проблема ранней объективной оценки (до 6 недель) эффективности назначаемой терапии [Mossner 2007] В работе были обследованы 6 больных тревожной депрессией (впервые обратившихся по поводу депрессии, ранее не лечившихся) в динамике терапии ингибиторами обратного захвата серотонина Обнаружено, что у всех этих больных терапия оказывала однонаправленное действие на амплитуды Ад и At (р<0,05, Рис. 7) уже на 3-4-й неделе лечения В отличие от первого эпизода шизофрении, изменения выявлялись не при действии ионной силы, а при замене в среде ионов хлора на ионы нитрата Это свидетельствует об изменении баланса между гидрофобными и электростатическими взаимодействиями в альбуминовой глобуле у больных депрессией

Рис 7 Эффект терапии при тревожной депрессии на изменение амплитуд затухания К-35 в сыворотке при замене ионов хлора на ионы нитрата По осям - отношение амплитуд затухания флуоресценции К-35 в альбумине при концентрации нитрата NO3 = 0 мМ и NO3 = 180 мМ Ая (по горизонтали) и Ai (по вертикали) Треугольники - первое обращение к психиатру, до начала лечения Квадраты - 3-4-я неделя терапии Стрелки указывают направление изменения параметров у одних и тех же обследованных Разбавление сыворотки в 20 раз, концентрация К-35 27 мкМ

Результаты, изложенные в этом разделе, показывают информативность характеристик альбумина, получаемых с помощью наносекундной спектроскопии. Они могут быть основой для разработки принципиально новых методов контроля состояния и эффективности терапии больных психическими расстройствами

Роль особенностей поведения и стресса в модификации альбуминовых центров

Многочисленные клинические наблюдения показали, что свойства альбумина, выявляемые флуоресцентным тестом, изменяются при самых различных заболеваниях хирургических, сердечно-сосудистых, печени и почек и др [Грызунов, Добрецов 1994, 1998]. При этом степень изменения центров часто отражает состояние больных. Было сделано предположение, что за этими изменениями стоит некоторый «большой» патофизиологический механизм, являющийся универсальным, и молекула альбумина является участником и/или

MNS|°0)

A, (NOJ = 130 мМ)

индикатором этого процесса [Лопухин 2003] Решение этого вопроса могло пролить свет на причины чувствительности альбуминового теста

Были получены указания на то, что патофизиологическим фактором влияющим на альбуминовые центры, может быть стресс [Грызунов 1994, Шалаева 2001, Лопухин 2003] Однако не было получено прямых экспериментальных доказательств того, что стресс (по Селье) влияет на свойства альбуминовых центров и что это влияние зависит от поведенческих особенностей индивидуума.

Одной из задач работы явилась попытка прямого разрешения этого вопроса. Эксперименты были выполнены совместно с сотрудниками НИИ нормальной физиологии им ПК Анохина РАМН, условия экспериментов соответствовали указаниям Европейского Совета от 24 ноября 1986 г (86/609/ЕЕС) Опыты проводили на крысах линии Вистар (78 самцов массой 220 ± 5,2 г, питомник РАМН «Столбовая») в осенне-зимний период

Активность поведения крыс определяли в тесте открытое поле (Рис 8) Животное помещали в установку на периферию пола и в течение 180 секунд регистрировали следующие параметры латентные периоды начала движения и выхода в центр (сек), горизонтальные амбуляции (пересечение секторов), вертикальную (приподнимание на лапы) и исследовательскую активность (заглядывание в норы, исследование стоек), время грумминга (умывания), показатель вегетативного баланса (дефекацию).

Для количественной характеристики активности крыс в тесте открытого поля был предложен «временнбй» индекс активности (Time Activity Index, TAI), представляющий собой долю времени, затраченного в тесте открытого поля на исследовательскую активность (Ехр_А), амбуляции (Amb, передвижение по квадратам) и отдых (Rest) [Gryzunov 2005]

TAi~ExpA + A"lb + Res\m%' 180

Животных с истерическим поведением (более 120 амбуляций при отсутствии исследовательской активности) не включали в дальнейший эксперимент.

После тестирования животных случайным образом делили на две группы опытную и контрольную Через 3 суток после тестирования по поведенческим реакциям в открытом поле опытную группу крыс подвергали острому стрессовому воздействию (иммобилизация + стохастическое электрокожное воздействие) Животных контрольной группы стрессу не подвергали. После опытов животных сакрифицировали, и получали сыворотку стандартным способом путем центрифугирования крови после образования сгустка при комнатной температуре

Свойства альбуминовых центров характеризовали отношением R(N/F) интенсивности флуоресценции К-35 из сыворотки при двух значениях рН: 7,4 и 4,2 (т.е. когда альбумин находится в конформациях Normal и Fast, соответственно):

R{N/F) = F(7,4)/F(4,2) (2)

В контрольной группе была обнаружена достоверная (р=0,0005) отрицательная корреляция средней силы (rs= - 0,55) между индексом активности поведения TAI и параметром R(N/F) (Рис. 8). Таким образом, было показано, что у животных, различающихся по активности поведения, свойства альбуминовых центров различны [Gryzunov 2005].

(а)

Объекты для Сектора исследования

Рис. 8.

(а): Схема теста «открытое поле» ;

(б): связь между временным индексом активности поведения (TAI, %, по горизонтали) и показателем свойств альбуминовых центров R(N/F) (формула 2) у животных без стресса;

(в): то же, что и на рис 8(6), но у животных после острого стресса. Концентрация альбумина соответствует сыворотке, разбавленной в 200 раз, концентрация К-35 - 18 мкМ.

(б)

R(N/F) 3,2

Животные без стресса (контроль, п=40)

rs = - 0,55, р<0,001

50 60 70 80 90 100 Индекс активности поведения (TAI), %

R(N/F) 3,2

2,4

1,6

0,8

(В)

Животные с острым стрессом (п=38)

rs = + 0,56, р<0,001

50 60 70 80 90 100 Индекс активности поведения (TAI), %

Острый стресс резко изменил состояние альбуминовых центров корреляция между поведенческой активностью и показателем свойств альбуминовых центров Я(Ы/Р) стала положительной (г5= + 0,56, р=0,0001, Рис. 8) Это означает, что у крыс с разным поведением острый стресс приводил к разнонаправленным изменениям альбуминовых центров: увеличению отношения Р([\1/Р) у более активных крыс и к уменьшению - у менее активных

Результаты, полученные в этом разделе работы, указывают на наличие связи между особенностями поведения, стрессом и свойствами альбумина Следовательно, стресс как неспецифическая составляющая заболеваний оказывает влияние на альбуминовые центры, связывающие зонд К-35 Этот фактор вносит вклад в высокую чувствительность альбуминового флуоресцентного теста к состоянию организма.

В главе ОБСУЖДЕНИЕ приведены размышления автора о полученных результатах, их сопоставление с известными данными, высказаны гипотезы о возможных механизмах изменения альбуминовых центров при заболеваниях и при стрессе, о возможной роли альбумина в патогенезе психических расстройств.

Выводы

С целью повышения информативности флуоресцентного теста и раскрытия основ его чувствительности к состоянию организма при заболеваниях были изучены молекулярные механизмы взаимодействия зонда К-35 с альбуминовыми центрами методом флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением 1СГ10 сек. С использованием новых параметров были исследованы изменения связывающих центров альбумина при психических расстройствах и при стрессе. Результаты сводятся к следующему. 1. Зонд К-35 (1\|-(карбокси)фенилимид диметиламинонафталевой кислоты) связывается с четырьмя центрами в молекуле альбумина и при связывании флуоресцирует как сумма компонент с временами затухания около 9, 3 и 1 наносекунд Часть молекул зонда, связавшихся с альбумином, не флуоресцирует.

2 Молекулы К-35, флуоресцирующие с разным временем затухания, связываются с различными центрами в альбуминовой глобуле Эти центры имеют разное сродство к молекулам зонда (константы связывания составляют от 0,6*103 до 50*103 л/моль), и их взаимодействие с К-35 по-разному зависит от ионного состава среды и от присутствия специфических маркеров альбуминовых центров Наносекундная спектроскопия позволяет наблюдать за каждым типом центров в отдельности

3 Информативность альбуминового флуоресцентного теста была расширена путем комбинации наносекундной спектроскопии и воздействия на молекулу альбумина средами разного ионного состава. Этот подход позволил различить больных первого эпизода параноидной шизофрении (до начала лечения) и здоровых лиц (р<0,001), а также выявить влияние терапии при тревожной депрессии на 3-4-й неделе лечения (р<0,05)

4 У больных параноидной шизофренией и тревожной депрессией с хроническим (14±6 лет) течением заболевания изменения альбуминовых центров можно выявить методом стационарной флуорометрии, используя методику замены ионов хлора на ионы нитрата в среде Константа тушения флуоресценции К-35 в присутствии нитрата и доля флуоресценции зонда, доступной для тушения, у больных шизофренией и депрессией были достоверно ниже, чем у здоровых (р<0,01)

5 В прямых опытах на животных получены доказательства связи между особенностями поведения, стрессом и свойствами альбумина Время, затрачиваемое крысами на активное поведение, коррелировало (г = -0,55, р<0,001) с отношением интенсивности флуоресценции К-35 из альбумина при рН 7,4 к интенсивности при рН 4,2 Острый стресс приводил к увеличению этого отношения у более активных крыс и к уменьшению - у менее активных

6. Выявлены факторы, лежащие в основе высокой чувствительности флуоресценции зонда К-35 к состоянию больных

• зондирование глобулы альбумина молекулами К-35 в четырех различных центрах, что определяет чувствительность флуоресценции зонда к событиям в разных участках глобулы,

• различие реакций этих центров на процессы в организме, что детектируется методом наносекундной спектроскопии;

• влияние стресса как неспецифической составляющей заболеваний на альбуминовые центры, связывающие зонд К-35

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1 Смолина Н В , Грызунов Ю А , Дегтярев Д Н , Иванова А В Изучение свойств альбумина новорожденных методом тушения флуоресценции Альбумин сыворотки крови в клинической медицине Кн. 2. Под ред. Ю. А. Грызуноваи Г Е Добрецова. Москва ГЭОТАР 1998 333-336.

2 Коплик Е В , Грызунов Ю А., Смолина Н В , Копаева Л Б , Добрецов Г Е , Судаков К В.. Сывороточный альбумин у крыс с различной устойчивостью к эмоциональным стрессорным нагрузкам Системный подход в физиологии. Труды Межведомственного Научного Совета по Экспериментальной и Прикладной Физиологии 2004, (12) 301-316

3 Gryzunov Yu , Koplik Е , Smolina N., Kopaeva L, Dobretsov G„ Sudakov K. Conformational properties of serum albumin binding sites in rats with different behaviour in the open field test The International Journal on the Biology of Stress 2006,9(1)53-60

4 Смолина H В, Грызунов Ю A, Максимова H.M., Добрецов Г.Е, Узбеков М Г , Мисионжник Э Ю , Вертоградова О П Свойства связывающих центров молекулы альбумина у больных тревожной депрессией: исследование методом тушения флюоресценции Бюллетень экспериментальной биологи и медицины 2007; (11).514-516. (Smolina N.V., Gryzunov Y А , Maximova N М , Dobretsov G E , Uzbekov M.G., Misionzhnik E.Y , Vertogradova О P Characteristics of albumin molecule binding centers in patients with anxious depression. Study by the fluorescence quenching method. Bull Exp Biol Med. 2007, 144(5) 674-676.)

5. Узбеков M Г , Смолина И В , Мисионжник Э Ю , Молодецких А В , Добрецов Г Е, Грызунов Ю А. Нарушение конформации связывающих центров сывороточного альбумина при шизофрении Журнал неврологии и психиатрии имени С С Корсакова. 2008, 5(108) 67-70.

6 Сырейщикова Т И , Грызунов Ю А , Смолина Н В , Добрецов Г.Е , Комар А А, Узбеков М Г , Мисионжник Э Ю , Молодецких А В., Максимова Н М. (2008) Пикосекундная флуоресцентная спектроскопия белков как новый подход к оценке эффективности терапии психических заболеваний Альманах клинической медицины 2008, XVII(1) 94-96

7. Грызунов Ю А , Смолина Н.В , Добрецов Г.Е , Узбеков М Г., Мисионжник ЭЮ, Максимова Н.М., Курмышева НЯ, Сырейщикова Т.И., Комар А А. (2008) Конформационные изменения альбумина при психических расстройствах. Материалы II международной конференции "Современные информационные и телемедицинские технологии для здравоохранения". 2008-158-163

Тезисы докладов

8 Грызунов Ю А , Киселев М А , Добрецов Г Е , Комарова М Н , Смолина Н В Проблема размера и формы молекулы сывороточного альбумина человека в растворе и ее исследование методом малоуглового рассеяния нейтронов Материалы III Съезда биофизиков России Воронеж 2004,1 50-51

9 Smolina N , Sokolova Т , Gryzunov Yu , Kopaeva L , Misionzhnik E , Uzbekov M Albumin conformation and thiol reactivity in mental diseases The World Journal of Biological Psychiatry 2005; 6(Suppl. 1) 330.

10 Gryzunov Yu , Koplik E, Smolina N , Kopaeva L., Dobretsov G , Sudakov K. Albumin binding sites state and individual stress resistance. The World Journal of Biological Psychiatry 2005, 6(Suppl 1)333

11. Соколова T H., Смолина HB, Мисионжник Э.Ю , Узбеков МГ, Грызунов Ю А, Копаева Л Б. Реакционная способность тиола альбумина сыворотки крови как показатель изменения конформации альбуминовой глобулы Клиническая Лабораторная Диагностика 2005, (9)71

12 Грызунов ЮА, Е В Коплик, Н В Смолина, Л.Б Копаева, Г Е Добрецов, К В Судаков Конформационные свойства связывающих центров альбумина крыс с различным поведением в тесте открытого поля Научные труды 1-го съезда физиологов СНГ Дагомыс, 19-23 сентября 2005, 1 37-38

13. Smolina N V , Gryzunov Yu А, Syrejshchikova Tl, Alekseev S S . On the 'mechanism of quenching of human albumin bound fluorescence probe -dimethylaminonaphthalimine derivate - with nitrate anion Digest reports of the XVI international synchrotron radiation conference Novosibirsk, July 10-14, 2006.70.

14 Syrejshchikova T I, Gryzunov Yu A , Smolina N V , Alekseev S S Red edge excitation shift of fluorescence of human albumin bound probe The study by the time-resolved fluorescent spectroscopy Digest reports of the XVI international synchrotron radiation conference. Novosibirsk July 10-14, 2006 71

15.Комар A.A, Сырейщикова Т.И., Грызунов ЮА, Смолина НВ, Добрецов Г.Е , Мисионжник Э Ю , Узбеков М Г Разработка новых подходов для индивидуального прогноза эффективности терапии депрессий на основе пикосекундной флуоресцентной спектроскопии белков «Фундаментальные науки - медицине» Материалы конференции Москва, 27-29 ноября 2006 Изд-во «Слово» 78

16 Грызунов ЮА, Сырейщикова ТИ., Комар АА, Смолина НВ, Добрецов Г.Е , Узбеков М Г, Мисионжник Э Ю , Молодецкий А В , Максимова Н М , Соколова Т.Н. Разработка новых подходов для индивидуального прогноза эффективности терапии психических заболеваний на основе пикосекундной флуоресцентной спектроскопии белков Материалы Третьего

Заказ № 104/11/08 Подписано в печать 12 11 2008 Тираж 100 экз Уел пл 1,25

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76,(495) 778-22-20 ) www.cfr.ru ; e-mail:mfo@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Смолина, Наталья Викторовна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Некоторые сведения о сывороточном альбумине человека. Строение, функции, связывающие центры.

1.1.1. Метаболизм и распределение альбумина.

1.1.2. Распределение и циркуляция.

1.1.3. Функции альбумина в организме.

1.1.3.1. Поддержание онкотического давления плазмы.

1.1.3.2. Связывание и транспорт низкомолекулярных веществ и экзогенных лигандов

1.1.3.3. Альбумин — участник окислительио-восстановитсльных реакций в организме

1.1.3.4. Пластическая функция альбумина.

1.1.3.5. Регуляция гемостаза.

1.1.3.6. Участие в поддержании кислотно-основного равновесия в крови.

1.1.3.7. Регуляция апоптоза.

1.1.4. Структура молекулы.

1.1.4.1. Первичная последовательность.

1.1.4.2. Вторичная структура. Домены.

1.1.4.3. Распределение аминокислотных остатков и зарядов.]

1.1.5. Связывающие центры альбумина.

1.1.5.1. Главные («лекарственные») центры.

1.1.5.2. Центр связывания двухвалентных катионов.

1.1.5.3. Тиоловая группа остатка Суз-34.

1.1.5.4. Центры связывания неэстерифицированных жирных кислот.

1.1.5.5. «Минорные» центры.

1.1.6. Влияние физико-химических факторов на свойства центров альбумина.

1.1.6.1. Влияние рН.

1.1.6.2. Повышение температуры.

1.1.6.3. Концентрация неорганических солей.

1.1.6.4. Связывание лигандов.

1.2. Флуоресцентный метод исследования альбумина в биологических жидкостях.

1.2.1. Изучение белков с помощью красителей (история вопроса). Флуоресцентный зонд К-35.

1.2.2. Понятия «эффективная концентрация альбумина» (ЭКА) и «общая концентрация альбумина» (ОКА).

1.2.3. Информативность альбуминового флуоресцентного теста. Клинические наблюдения.

1.3. Конформационные изменения связывающих центров альбумина как универсальная реакция на патологический процесс.

1.4. Исследование молекулярных механизмов чувствительности альбуминового флуоресцентного теста. Достижения и нерешенные проблемы.

1.4.1. Определение параметров связывания К-35 с препаратами альбумина.

1.4.2. Влияние маркеров связывающих центров альбумина на связывание и квантовый выход флуоресценции зонда К-35.

2. Материалы и методы исследования.

2.1. Реактивы.

2.2. Спектрофотометрия, спектрофлуорометрия.

2.3. Измерение затухания флуоресценции, анализ амплитуд.

2.4. Метод изучения гетерогенного затухания флуоресценции в биологических образцах («метод амплитудного стандарта»).

2.4.1. Выбор специальной среды (амплитудного стандарта).

2.4.2. Расчет парциальных концентраций молекул зонда в альбумине.

2.5. Тушение флуоресценции.

2.6. Ультрафильтрация.

2.7. Электрофорез.

2.8. Выделение фракции альбумина из сыворотки.

2.9. Определение уровня НЭЖК.

2.10. ЭК А, ОКА, массовая концентрация альбумина.

2.11. Квантово-химические расчеты.

2.12. Определение уровня гормонов.

2.13. Характеристика обследованных больных.

2.14. Животные.

2.15. Тест открытого поля, и характеристики поведения, острый стресс.

2.16. Статистический анализ результатов.

3. Результаты.

3.1. Роль различных центров в связывании альбумином флуоресцентного зонда К

3.1.1. Центры связывания зонда К-3 5 в молекуле ЧСА.

3.1.2. Оценка соотношения величин К; п; для разных центров.

3.1.3. Модель связывания зонда К-3 5 с ЧС А.

3.1.4. Центры связывания молекул К-35, не флуоресцирующих в альбумине.

3.1.5. Квантовый выход флуоресценции К-35 в растворе ЧСА.

3.1.6. Влияние маркеров связывающих центров I и II. на флуоресценцию К-35 из альбумина.

3.1.7. Влияние вариации ионного состава среды на затухание флуоресценции К-35 в альбумине.

3.1.8. Обсуждение результатов раздела.

3.2. Изменение связывающих центров альбумина при параноидной шизофрении и тревожной депрессии.

3.2.1. Исследование сывороток больных шизофренией с хроническим течением.

3.2.2. Исследование больных первого эпизода шизофрении.

3.2.2.1. Данные стационарной флуорометрии: различий между больными и добровольцами не обнаружено.

3.2.2.2. Наносекундная флуоресцентная спектроскопия выявила различия между больными первого эпизода и здоровыми.

3.2.3. Свойства альбуминовых центров у больных тревожной депрессией.

3.2.3.1. Свойства альбумина у больных депрессией с хроническим течением.

3.2.3.2 . Стационарная флуорометрия: больные депрессией до лечения, во время лечения и доноры неразличимы по свойствам альбумина.

3.2.3.3 Ранний эффект терапии тревожной депрессии: детектирование с помощью ианосекундной флуоресцентной спектроскопии.

3.3. Свойства альбуминовых центров у крыс с различным поведением в тесте открытого поля.

3.3.1. Избирательность флуоресценции К-35 из альбумина крыс.

3.3.2. Тестирование конформациопных свойств альбумина крыс.

3.3.3. Поведенческая активность животных в гесте открытого поля и свойства альбумина.

3.3.4. Перенос альбумином жирных кислот у крыс с различным поведением.

3.3.5. Уровень коргизола у животных разных групп.

4. Обсуждение.

4.1. Предпосылки и задачи работы.

4.2. Формирование сигнала флуоресценции К-35 из альбумина.

4.3. О механизме уменьшения флуоресценции К-35 в присутствии нитрата.

4.4. Свойства альбумина и поведенческие особенности крыс.

Выводы.

Работы, опубликованные по теме диссертации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменение связывающих центров альбумина при психических расстройствах и при стрессе"

Поиск новых, более информативных показателей для оценки состояния организма в норме и при заболеваниях является актуальной задачей медико-биологической пауки. Такой поиск ведется различными методами, включая биофизические. В частности, в последние годы внимание исследователей привлекают изменения конформации (например, у прионов) и других физико-химических свойств белков, связанные с развитием патологических процессов в организме.

Одним из белков, легко подвергающихся модификациям, является альбумин - белок (около 66 кДа), составляющий около половины массы белков плазмы крови и присутствующий во всех жидкостях организма. В составе межклеточной жидкости альбумин взаимодействует почти со всеми клетками и в процессе циркуляции изменяется в зависимости от состояния органов и тканей. Около 15 лег назад в НИИ ФХМ был создан флуоресцентный метод для обнаружения модификаций альбумина. Метод основан на нековалентном взаимодействии с альбумином оригинального специфического красителя, получившего название К-35. В сыворотке или плазме крови К-35 флуоресцирует практически только из альбумина, что позволяет изучать этот белок без его выделения из плазмы, то есть в нативном состоянии [1,2].

Этот новый тест позволил обнаружить изменения центров альбумина при ряде заболеваний. Причем изменения оказались зависимы от тяжести состояния больного и прогноза развития заболевания. Клинические исследования показали высокую информативность флуоресцентного теста при распространенном перитоните, острых отравлениях, острых сердечно-сосудистых состояниях, при хронических заболеваниях печени, при ряде офтальмологических заболеваний [3-8].

Биофизические основы изменений альбуминовых центров при заболеваниях и механизмы высокой чувствительности показателей флуоресцентного теста к состоянию организма оставались во многом неясными. Раскрытие этих основ имеет как фундаментальное, так и прикладное значение для медико-биологической науки и биофизики.

Ранее взаимодействие К-35 с альбумином характеризовали лишь двумя измеряемыми флуоресцентными параметрами. Имело смысл увеличить число измеряемых параметров за счет регистрации кинетики затухания флуоресценции зонда, чтобы иметь больше информации об изменениях в молекуле альбумина. Эти новые параметры нуждались в физической интерпретации. Особенно актуально стоял вопрос об интерпретации гетерогенности затухания флуоресценции К-35 в альбумине.

Усовершенствовав таким образом метод, можно было попытаться обнаружить и исследовать изменения молекулы альбумина при психических расстройствах, особенно при их первом эпизоде (когда обычные лабораторные показатели чаще всего остаются в пределах нормы).

Изменения альбуминовых центров были обнаружены при самых разных заболеваниях [1,2]. Такая универсальность реакции альбумина на патологический процесс может быть связана с тем, что стресс, который сопровождает каждое заболевание, приводит к изменению связывающих центров альбумина. Необходимо было проверить это предположение в прямых опытах.

Анализ состояния проблемы позволил сформулировать цель и задачи настоящего исследования.

Цель работы — повышение информативности флуоресцентного альбуминового теста и раскрытие механизмов его чувствительности к изменениям связывающих центров альбумина при заболеваниях.

Задачи исследования:

1. Методом флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением Ю-10 сек исследовать молекулярные механизмы взаимодействия! флуоресцентного зонда К-35 с альбумином.

2. Расширить информативность флуоресцентного альбуминового теста пу1ем воздействия на молекулу альбумина средами разного ионного состава и регистрации процессов затухания флуоресценции зонда К-35 с временным разрешением Ю-10 сек.

3. Используя новые параметры, исследовать связывающие центры альбумина у больных параноидной шизофренией и депрессией при первом эпизоде болезни до начала терапии и при хроническом течении заболевания.

4. В прямых опытах на животных выяснить, существует ли связь между особенностями их поведения, реакцией на стресс и свойствами связывающих центров альбумина.

1. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Смолина, Наталья Викторовна

Выводы

С целью повышения информативности флуоресцентного теста и раскрытия основ его чувствительности к состоянию организма при заболеваниях были изучены молекулярные механизмы взаимодействия зонда К-35 с альбуминовыми центрами методом флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением Ю-10 сек. С использованием новых параметров были исследованы изменения связывающих центров альбумина при психических расстройствах и при стрессе. Результаты сводятся к следующему.

1. Зонд К-35 (Ы-(к ар б о кс и) ф ени л им ид диметиламинонафталевой кислоты) связывается с четырьмя центрами в молекуле альбумина и при связывании флуоресцирует как сумма компонент с временами затухания около 9, 3 и 1 наносекунд. Часть молекул зонда, связавшихся с альбумином, не флуоресцирует.

2. Молекулы К-35, флуоресцирующие с разным временем затухания, связываются с различными центрами в альбуминовой глобуле. Эти центры имеют разное сродство к 3 3 молекулам зонда (константы связывания составляют от 6*10 до 50*10 л/моль), и их взаимодействие с К-35 по-разному зависит от ионного состава среды и от присутствия специфических маркеров альбуминовых центров. Наносскупдная спектроскопия позволяет наблюдать за каждым типом центров в отдельности.

3. Информативность альбуминового флуоресцентного теста была расширена путем комбинации наносекупдной спектроскопии и воздействия на молекулу альбумина средами разного ионного состава. Этот подход позволил различить больных первого эпизода параноидной шнзофрении (до начала лечения) и здоровых лиц (р<0,001), а также выявить влияние терапии при тревожной депрессии на 3-4-й неделе лечения (р<0.05).

4. У больных параноидной шизофренией и тревожной депрессией с хроническим (14±6 лет) течением заболевания изменения альбуминовых центров можно выявить методом стационарной флуорометрии, используя методику замены ионов хлора на попы нитрата в среде. Константа тушения флуоресценции К-35 в присутствии нитрата и доля флуоресценции зонда, доступной для тушения, у больных шизофренией п депрессией были достоверно ниже, чем у здоровых (р<0,01).

5. В прямых опытах на животных получены доказательства связи между особенностями поведения, стрессом и свойствами альбумина. Время, затрачиваемое крысами на активное поведение, коррелировало (г = -0,55, р<0,001) с отношением интенсивности флуоресценции К-35 из альбумина при рН 7,4 к интенсивности при рН 4,2. Острый стресс приводил к увеличению этого отношения у более активных крыс и к уменьшению - у менее активных.

6. Выявлены факторы, лежащие в основе высокой чувствительности флуоресценции зонда К-35 к состоянию больных:

• зондирование глобулы альбумина молекулами К-35 в четырех различных центрах, что определяет чувствительность флуоресценции зонда к событиям в разных участках глобулы;

• различие реакций этих центров на процессы в организме, что детектируется методом наносекундной спектроскопии;

• влияние стресса как неспецифической составляющей заболеваний на альбуминовые центры, связывающие зонд К-35.

Работы, опубликованные по теме диссертации Статьи

1. Смолина Н.В., Грызунов Ю.А., Дегтярев Д.Н., Иванова А.В. Изучение свойств альбумина новорожденных методом тушения флуоресценции. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. Кн. 2. Под ред. Ю. А. Грызунова и Г. Е. Добрсцова. Москва: ГЭОТАР. 1998:333-336.

2. Коплик Е.В., Грызунов Ю. А., Смолина Н. В., Кошева J1. Б., Добрецов Г.Е., Судаков К. В. Сывороточный альбумин у крыс с различной устойчивостью к эмоциональным стрессорным нагрузкам. Системный подход в физиологии. Труды Межведомственного Научного Совета по Экспериментальной и Прикладной Физиологии. 2004, (12):301-316.

3. Gryzunov Yu., Koplik Е., Smolina N., Kopaeva L., Dobretsov G., Sudakov K. Conformational properties of serum albumin binding sites in rats with different behaviour in the open field test. The International Journal on the Biology of Stress. 2006, 9(l):53-60.

4. Смолина H.B., Грызунов 10.А., Максимова H.M., Добрецов Г.Е., Узбеков М.Г., Мисионжник Э.Ю., Вертоградова О.П. Свойства связывающих центров молекулы альбумина у больных тревожной депрессией: исследование методом тушения флюоресценции. Бюллетень экспериментальной биологи и медицины 2007; (11):514-516. (Smolina N.V., Gryzunov Y.A., Maximova N.M., Dobretsov G.E., Uzbekov M.G., Misionzhnik E.Y., Vertogradova O.P. Characteristics of albumin molecule binding centers in patients with anxious depression. Study by the fluorescence quenching method. Bull Exp Biol Med. 2007, 144(5):674-676.)

5. Узбеков М.Г. Смолина И.В., Мисионжник Э.Ю., Молодецких А.В., Добрецов Г. Е., Грызунов Ю.А. Нарушение конформации связывающих центров сывороточного альбумина при шизофрении. Журнал неврологии и психиатрии имени С.С. Корсакова. 2008, 5(108):67-70.

6. Сырейщикова Т.Н., Грызунов Ю.А., Смолина Н.В., Добрецов Г.Е., Комар А.А, Узбеков М.Г., Мисионжник Э.Ю., Молодецких А.В., Максимова Н.М. (2008) Пикосекундная флуоресцентная спектроскопия белков как новый подход к оценке эффективности терапии психических заболеваний. Альманах клинической медицины. 2008; XVII(l):94-96.

7. Грызунов Ю.А., Смолина Н.В., Добрецов Г.Е., Узбеков М.Г., Мисионжник Э.Ю., Максимова Н.М., Курмышева Н.Я., Сырейщикова Т.И., Комар А.А. (2008) Конформационные изменения альбумина при психических расстройствах. Материалы II международной конференции "Современные информационные и телемедицинские технологии для здравоохранения". 2008:158-163.

Тезисы докладов

8. Грызунов Ю.А., Киселев М.А., Добрецов Г.Е., Комарова М.Н., Смолина Н.В. Проблема размера и формы молекулы сывороточного альбумина человека в растворе и ее исследование методом малоуглового рассеяния нейтронов. Материалы III Съезда биофизиков России. Воронеж: 2004; 1:50-51.

9. Smolina N., Sokolova Т., Gryzunov Yu., Kopaeva L., Misionzhnik E.,. Uzbekov M. Albumin conformation and thiol reactivity in mental diseases. The World Journal of Biological Psychiatry. 2005; 6(Suppl. 1):330.

10. Gryzunov Yu., Koplik E., Smolina N., Kopaeva L., Dobretsov G., Sudakov K. Albumin binding sites state and individual stress resistance. The World Journal of Biological Psychiatry. 2005; 6(Suppl. 1):333.

П.Соколова Т.Н., Смолина H.B., Мисионжник Э.Ю., Узбеков М.Г.,. Грызунов Ю.А, Копаева Л.Б. Реакционная способность тиола альбумина сыворотки крови как показатель изменения конформации альбуминовой глобулы. Клиническая Лабораторная Диагностика. 2005; (9):71.

12. Грызунов Ю.А., Е.В.Коплик, Н.В.Смолина, Л.Б.Копаева, Г.Е.Добрецов, К.В.Судаков Коиформационные свойства связывающих центров альбумина крыс с различным поведением в тесте открытого поля Научные труды 1-го съезда физиологов СНГ. Дагомыс, 19-23 сентября 2005; 1:37-38

13. Smolina N.V., Gryzunov Yu.A., Syrejshchikova T.I., Alekseev S.S. On the mechanism of quenching of human albumin bound' fluorescence probe — dimethylaminonaphthalimine derivate — with nitrate anion. Digest reports of the XVI international synchrotron radiation conference. Novosibirsk, July 10-14, 2006:70.

14. Syrejshchikova T.I., Gryzunov Yu.A., Smolina N.V., Alekseev S.S. Red edge excitation shift of fluorescence of human albumin bound probe. The study by the time-resolved fluorescent spectroscopy. Digest reports of the XVI international synchrotron radiation conference. Novosibirsk. July 10-14, 2006:71.

15. Комар A.A., Сырейщикова Т.И., Грызунов Ю.А., Смолина Н.В., Добрецов Г.Е., Мисионжник Э.Ю., Узбеков М.Г. Разработка новых подходов для индивидуального прогноза эффективности терапии депрессий на основе пикосекундной флуоресцентной спектроскопии белков. «Фундаментальные науки — медицине». Материалы конференции. Москва, 27-29 ноября 2006. Изд-во «Слово»::78

16. Грызунов Ю.А., Сырейщикова Т.И., Комар А.А., Смолина Н.В., Добрецов Г.Е., Узбеков М.Г., Мисионжник Э.Ю., Молодецкий А.В., Максимова Н.М., Соколова Т.Н. Разработка новых подходов для индивидуального прогноза эффективности терапии психических заболеваний на основе пикосекундной флуоресцентной спектроскопии белков. Материалы Третьего международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак ,12-20 июня 2007:90.

17. Грызунов Ю.А, Смолина Н.В., Коплик Е.В., Калинина В.В. Конформационное состояние альбумина крови у крыс с различным поведением в тесте открытого поля. Нейронаука для медицины и психологии. Материалы Третьего международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии», Судак, 12-20 июня 2007:91.

18. Грызунов Ю.А., Смолина Н.В., Коплик Е.В., Калинина В.В. Конформационные свойства альбумина крови у крыс с различным поведением в тесте открытого поля. «Взаимодействие науки и практики в современной психиатрии». Материалы конференции. Москва, 9-11 октября 2007:327.

19. Комар A.A., Грызунов Ю.А., Сырейщикова Т.И., Добрецов Г.Е., Смолина Н.В., Узбеков М.Г., Мисионжник Э.Ю., Молодецкий A.B., Максимова Н.М., Соколова Т.Н. Индивидуальный прогноз эффективности терапии психических заболеваний: новые подходы на основе пикосекундной флуоресцентной спектроскопии белков. «Взаимодействие науки и практики в современной психиатрии». Материалы конференции. Москва, 9-11 октября 2007:337.

20. Комар A.A., Сырейщикова Т.И., Грызунов Ю.А., Смолина Н.В., Добрецов Г.Е., Мисионжник Э.Ю., Максимова Н.М., Узбеков М.Г. Разработка новых подходов для оценки эффективности терапии депрессий на основе пикосекундной флуоресцентной спектроскопии белков. 2. Модельные эксперименты и начало клинических исследований. «Фундаментальные науки - медицине». Материалы конференции. Москва, 3-4 декабря 2007: 81-82.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смолина, Наталья Викторовна, Москва

1. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. Грызунов ЮА, Добрецов ГЕ (eds) Москва, Ириус, 1994, р 226.

2. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. Книга 2. Грызунов ЮА, Добрецов ГЕ (eds) .Москва, ГЭОТАР, 1998, р 440.

3. Luzhnikov ЕА. Gol'dfarb Iu S, Marupov AM: Features of diagnosis and treatment of endotoxicosis syndrome in acute chemical poisoning. Anesteziol Reanimatol 2002: 9-14.

4. Гринберг AA, Грызунов ЮА, Черныш ТИ, Добрецов ГЕ, Игнатова ТП: Новый подход к раннему прогнозу течения перитонита. Анналы хирургии 1999; ? 3: 21-25.

5. Курышева НИ, Деев АИ, Грызунов ЮА, Комарова МН: Связывающая способность альбумина водянистой влаги у больных первичной глаукомой: Глаукома. Москва, 1999, рр 308-312.

6. Курышева НИ, Деев АИ, Грызунов ЮА, Комарова МП: Способ оценки инволюционного офтальмоэндо токсикоза путем флуоресцентного исследования слезной жидкости. Вестник офтальмологии 2000; 3: 16-18.

7. Родоман ГВ, Шалаева ТИ, Добрецов ГЕ, Сумиди ИР: Новый подход к прогнозу течения и исхода острого панкреатита: Опыт лечения и диагностики. Труды научно-практической конференции клинической больницы МСЧ ? 1. Москва, АМО ЗИЛ, 2001, рр 170-175.

8. Титов ВН, Староверов ИИ, Амелюшкина В A et al\ Диагностическое значение альбуминовых транспортных характеристик и уровня тропонина Т в крови при инфаркте миокарда. Клиническая лаб. диагностика 2002; 1: 3-7.

9. Нейрат Г, Бейли К. Белки. Биохимия белковых веществ. Москва, Изд-во Иностранной Литературы, 1958, vol 3, р 844.

10. Encyclopaedia Britannica. 2003.

11. Альбумины: Химическая энциклопедия. Москва, Советская энциклопедия, 1988, vol 1, Р 191.

12. Peters TJ: Serum albumin. Adv Protein Chem 1985; 37: 161-245.

13. He XM, Carter DC: Atomic structure and chemistry of human serum albumin. Nature 1992; 358:209-215.

14. Harper ME, Dugaiczyk A: Linkage of the evolutionarily-related serum albumin and alpha-fetoprotein genes within qll-22 of human chromosome 4. Am J Hum Genet 1983; 35: 565572.

15. Miller LL, Bale WF: Synthesis of all plasma protein fractions except gamma globulins by the liver. The use of zone electrophoresis and lysine-C14 to define teh plasma proteins synthesis by isolated perfused liver. JExper Med 1954; 99: 125-133.16