Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка флуоресцентных методов определения концентрации и связывающей способности альбумина

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Разработка флуоресцентных методов определения концентрации и связывающей способности альбумина"

' а п 9 ь'

гэ МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

2-ой МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ им. НЛ.ПИГОГОВА

На правах рукописи

МИЛЛЕР Юрий Игоревич

УДК 616.037:591.111:535.37

РАЗРАБОТКА ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ И СВЯЗЫВАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ АЛЬБУМИНА

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1990

Работа выполнена в лаборатории биофизических методов диагнос-. тики Научно-исследовательского института физико-химической медицины МЗ РСФСР.

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук, профессор ГЕННАДИЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ ДОБРЕЦОВ

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук ГЕННАДИЙ ЮРЬЕВИЧ АЖИЦКИЙ, кандидат биологических наук, доцент ВЛАДИМИР АЛЕКСАНДРОВИЧ ПЕТРОВ.

Ведущая организация: 1 Московский медицинский институт

им. И.М.Сеченова.

Защита диссертации состоится "_"_^199_г.

в_часов на заседании специализированного ученого совета

К084.14.04 по защите кандидатских диссертаций по специальности „биофизика" 2 Московского ордена Ленина государственного медицинского института им. Н.И.Пирогова по адресу: 117869, г. Москва, ул. Островитянова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке 2 Московского медицинского института.

Автореферат разослан "_"_1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Е.А.Корепанова

---—

§88: ¡ГС« {

| *".. Актуальность тем?!. Сывороточный альбумин выполняет важную

фуйидап транспорта веществ в организме. Альбумин связывает много-иссертйций 1

"чиилсинис! эндогенные метаболиты, токсины, лекарственные вещества и переносит юс к соответствующим биологическим рецепторам или к органам детоксикации (печень). Однако при многих заболеваниях связывающая способность альбумина нарушается, особенно сильно - при недостаточности функции печени. Каковы механизмы этих процессов, какие факторы оказывают наибольшее влияние на связывание' веществ альбумином? Во многом эта вопросы остаются до сих пор открытыми.

Определение связывающей способности альбумина имеет и клиническое значение. Измерение этого показателя дает возможность характеризовать транспортные возможности альбумина, но, с другой стороны, позволяет оценивать также функциональное состояние печени, уровень интоксикации и, в конечном счете, - тяжесть состояния больного.

Широкое клиническое внедрение определения связывающей способности альбумина одерживается тем, что отсутствует удобный и достаточно информативный метод измерения этого показателя. Существующие способы сложны, требуют дорогостоящего оборудования или очень длительны. Метод флуоресцентных зондов позволяет разработать технически простые способы для измерения концентрации и сачзывающей емкости альбумина.

Цель и задачи исследования. Основной целью работы является разработка флуоресцентных методов определения овязывающей способности и концентрации альбумина.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи«

- изучить влияние условий среды на параметры люминесценции и связывания с альбумином флуоресцентных зондов;

- исследовать причины и механизмы нарушения связывающей способности альбумина;

- найти флуоресцентные зонда и разработать метода для измерения концентрации и связывающей емкости сывороточного альбумина;

- в ходе клинической ацробации разработанных методов выяснить возможные области их применения и диагностическую ценность для практической медицины.

Научная новизна работы. В работе изучены свойства и определе-.ны области применения новых флуоресцентных зондов, ранее не использовавшихся для исследования компонентов крови. Исследовано влияние различных условий среды и патологических воздействий на флуоресценцию зондов, которые в сыворотке крови соединяются преимущественно с альбумином. Впервые показано, что квантовый выход флуоресценции зондов, связанных с альбумином, практически во всех случаях остается неизменным, А изменения интенсивности флуоресценции эондов обусловлены ростом или снижением .числа, мест и констант связывания с альбумином. Это дает возможность использовать флуоресцентные зонда для исследования связывающей способности альбумина. Разработанные на этой основа метода позволили исследовать влияние билирубина, других веществ, разведения и сорбции сыворотки крови, закисления среды-на связывающие свойства альбумина.

Практическое значение работы»

- разработан флуоресцентный способ измерения концентрации альбумина в сыворотке крови при гипербилирубинемии;

- разработаны опособы определения связывающей емкости и удельной связывающей способности альбумина;

- техническая простота предложенных методов позволяет попользовать их в юшнико-дабораторной практике; проведано исследование возможности их применения для оценки тяжести состояния бального

и эффективности проводимого лечения.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на 3 и 4 конференциях молодых ученых НИИ физико-химической медицины (Москва, 1988,1989), Тульской областной хирургической конференции "Механическая желтуха" (Новомосковск, 1987), 2 Всесоюзной конференции "Электрохимические методы в медицине" (Конаково, 1989), 10 конференции молодых ученых института органического синтеза АН'Латв.ССР (Рига, 1989), шксле-семинаре "Новые физико-химические методы в медицине" (Алушта,1990), конференции кафедры общей и биоорганической химии Симферопольского медицинского института (Симферополь, 1990), конференциях кафедры и отделов биофизики 2 МОЛГМИ им.Н.И.Пирогова и НИИ физико-химической медицины (Москва, 1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, получено положительное решение по заявке на изобретение.

Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение результатов, выводы, библиография, включающая 300 ссылок на источники литературы. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами,39\ри-сунками,

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре рассмотрены следующие вопросы:

1. Связывание веществ с альбумином: центры связывания, регуляция, нарушение при патологии. ..

2. Методы измерения концентрации и связывятацей емкости сывороточного альбумина.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали сыворотку и плазму крови здоровых и бальных людей, a также коммерческие препараты альбумина.

Аналитическое определение и ттоеттэативвое выделение альбумина. Концентрацию альбумина Ь сыворотке крови оцределяли двумя способами) по реакции о броыкрезоловыы зеленым и путем электрофореза на ацетат-целлодозной пленке (Меньшиков В,В,, 1987)« Злектрофореграм-ыу окрашивали вмидочерным ЮБ, разрезали на две части (альбумин и

глобулины), краску шпоировали в растворе щелочи и определяли про-

•

центнод содержание альбумина. Общий белок определяли Скуратовым методом. Выделение альбумина из сыворотки крови проводили путем осаждения глобулинов пслидтиленгликолем 3000 ( Ыегск , ФРГ) ( inghcLB к.с. , 1978). Использовали коммерческие препараты сывороточного альбумина фирмы Reniai (Венгрия). Мономерную фракцию из раствора коммерческого препарата выделяли о помощь» гель-фильтрации на Сефадрексе C-I50 ( riuuxaoi» , Швеция).

Биохимические показатели в сыворотке крови оцределяли унифицированными лабораторными методами (Меньшиков В.В., 1987).

Флуоресцентные зонды. Испальаовали следующие флуореоцэнтные зонда« АНС (N -фети-1-Емино-в-сульфонафталин) фирмы Serva (ФРГ); К-33 (9,10-дианклино-2-сульфоантрацен), К-Э5 ( H (п-кар-бокси)феюшшид 4-даметилам{шонафт елевой кислоты) и MEA (3-метокои-бензантрон), синтезированные Б.М.Красовнцким, Э.Г.Вшно, Л.И,Корниловой, Н.Ф.Левченко (НПО "Монокриоталлреактш)", г.Харьков),

Оптические Интенсивность фдуореоценции измеряли па

фяуоримвтре медицинском Ш-Ц-2, спектры флуоресценции « па спектро-флуориметрах Hit»chl 4000 и МЙМ (Япония). Измерение кинетики затухания флуоресценции зондов проводил Ю.А.Кслчин на установке

FPA-3000 (Канада). Спзктри поглоцзйпя л оптичеспую плотность растворов измеряли на спектрофотометре СФ-26 и фотоколортгстре К5К-2МП.

Математическая обработка ляттх. Результаты измерений представлены в форме» среднее + осибяа среднего. Липли регрессии и коэффициенты линейной корреляции раосчитнвали на ЭВМ Искра-226 по стандартна.! программам.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Использование флуоресцентного зонда АНС для изучения связывающих свойств альбумина в норме и патология

Флуоресцентный зонд н -фенил-1~амино-8-сульфонафталин (АНС) известен о начала 50-х годов как вещество, связывающэсся в сыворотке крови преимущественно о альбумином ( Laurenco D.J.R., 1952), Это позволяет по флуоресценции АНС судить о влиянии раз-• личных факторов на связывание зонда с альбумином непосредственно в сыворотке крови.

Мы исследовали параметры лгаинеоценции АНС и его связывание с альбумином при конформадиояном зависимом от pH переходе и -Р альбумина, а также у бальных с гипербилирубинемией.

Переход и -С альбумина происходит при изменении pH среда от 7,4 до 4,0 и сопровождается увеличением интенсивности флуоресценции АНС СРднс) в сыворотке крови. Для здоровых доноров соотношение (РддС (4,0)^^(7,43= 1,46 + 0,03.

Увеличение может быть следствием либо увеличения квантового выхода флуоресценции АНС (Q), либо изменения параметров связывания. Чтобы выяснить, изменяется ли 0, провели измерение кинетики затухания флуоресценции АНС в сыворотке крови. Флуоресценция зонда затухает неэкспоненциально и метет быть представлена в врда

- б -

суммы двух экспонент«

HU = Р(о) (^expí-t/Ti) ♦rfíexp(-t/r2)) (I)

где Р(0) и Р( t) - интенсивности флуоресценции АНС в начальный момент и в момент времени t \ ¿i и - амплитуды, причем ■

¿i + ¿г = 1$ T¡ и Ъ - постоянные времени затухания (времена жизни возбужденного состояния). Время жизни прямо пропорционйльно квантовому выходу флуоресценции. Постоянная времени Ti изменяется в пределах 15-18 ноек, что согласуется о данными других авторов ( siavik i. , 1982), -.от 2,2 до 7,0 нсек в зависимости от условий. 80-9флуоресценции АНС обусловлено первой вкспо-нентой.

Таблица I

Влияние pH среды на параметры флуоресценции АНС в оыворотке крови (М +и )

Условия измерения К-во наблюдений «<1 . «i ноек нсек

pH 7,4 (2,15)® ' 17 0,60+0,02 I6,6¿0,2 4,8+0,5

pH 4,0 (2:15) 17 0,60+0,03 17,7+0,2 4,3+0,6

pH 7,4 (5«1) 12 0,6I¿0,02 16,6+0,3 4,3jt0,6

pH 4,0 (5:1) J2 0,53¿0,02 I5,9¿0,5 4,6x0,6

* в скобках - молярное отношение АНС/альбумин

Приведенные данные говорят о стабильности времени жизни АНС, связанного с альбумином в оыпороткекровя, при кислом и нейтраль-нон рН. Тагад образом, увеличение Рдд0 в сыворотке крови при рН 4,0 нельзя объяснить ростом

Параметры связывания АНС с альбумином в сыворотке едови мы определяли, представляя реаультаты флуоресцентного титрования в двой-

пых обратных координатах (рис. 1а).'При постоянном квантовом выходе продельная интенсивность флуоресценции СРиазс) пропорциональна числу центров связывания (N). и увеличивается при переходе к pH 4,0, одновременно снижается конотанта связывания (KQ). При значительном превышении концентрации зонда над концентрацией альбумина (молярные отношения) связывание АНС, а следовательно и интенсивность флуоресценции, зависит не от KQ, а от и . Таким образом, наблюдаемое увеличение Рщ, (избыток зонда) при структурном переходе N -р альбушна обусловлено ростом числа центров связывания.

Снижение интенсивности Флуоресценции АНС в сыворотке крови при патологии. Этот эффект наиболее выражен при механических желтухах. Для выяснения причин снижения измерили кинетику затухания флуоресценции зонда в сыворотках крови больных о желтухой и с нормальными биохимическими показателя;.™:

Таблица 2 .

Параметры, характеризующие затухание флуоресценции АНС, связанного с альбумином в сыворотке крови (М + и ) .

Пациенты К-во наблюдений «<1 Тк нсек Тг нсек FI*1

1 С нормальными биохимическими показателями 7 0,68+0,02 17,2+0,2 4,2+0,8 0,90+0,01

С гипербилирубин-емией 7 0,57+0,02 16,2+0,4 4,3+0,9 0,83+0,02

* вклад первой компоненты в общую флуоресценцию считали равным»

При гипербилпрубкнемии и почти не изменяется, следовательно, не изменяются к КЕантовде выхода флуоресценции молекул

Рис,I. Флуоресцентное титрование зондом АНС сывороток крови.

Двойные обратные координаты. Сыворотки крови разведаны в 200 раз буферпым раствором о ионной "илой 10 м-М, Продолжение прямых отсекает на горизонтальной оси отрезок, равный константе связывания (KQ), на вертикальной - величину (i/P дд,), обратную предельной интенсивности флуорвоцонцгга

а. I - рН 7,4| 2 - рН 4,0,

б. i - здоровый донор» 2 - больной механической желтухой (обеги билирубин 235 мкМ), рН 7,4, Результаты скорректированы с учетом разницы в кондентрацЕШ альбумина и поглощения билирубином флуоресцентного света А1Ю.

зонда, находящихся в первом и втором центрах связывания альбумина. В то же время снижение доли молекул, находящихся в первом центре ( ¿1), и вклада этих молекул в общую флуоресценцию (FI) свидетельствует об изменении параметров связывания и перераспределении АГО в центрах связывания альбумина. Как показало флуоресцентное титрование АНС сыворотки крови (рис.1б), при гипербилирубинемии резко снижено число центров связывания АНС. Одновременное увеличение константы связывания можно рассматривать как компенсаторный механизм. Действительно, если.при большом избытке зонда его связывание о альбумином пропорционально только N•, то при низкой концентрации АНС его связывание пропорционально уже произведет® (К0 • и ). Снижение N компенсируется высокой KQ.

Таким образом, и при изменении pH среда, и при патологических воздействиях изменяется число центров связывания в молекуле аль-бмйна, или, другими словами, его связывающая емкость. Связывающую емкость альбумина (СЕА) можно определять по интенсивности флуоресценции АНС в сыворотке кровй. Если у здоровых доноров СЕА варьирует в узком интервале значений (среднее значение - 100 условных единиц), то при ряда заболеваний она может быть резко снижена (таСй.З).

" Таблица 3

Параметры, характеризующие связывающие свойства альбумина

Группа пациентов К-во наблюдений Связывающая емкость %с<7.4> Связывающая способность

интервал гнтервал среднее (М +и )

Здоровые 20 82-117 100+3 93-108 100+3

Вирусный гепатит 19 24-76 46+4 76-95 со £

Механическая желтуха 30 9-62 28+4 41-90 67+4

Что вызывает снижение РддС в сыворотке крови при патологии? Поскольку при желтухе увеличена концентрация билирубина, мы исследовали его влияние на АНС. Добавление коммерческого препарата билирубина (не конъюгированного с глюкуроновой кислотой) к сыворотке крови здорового донора снижает Рщ;, но не до уровня, который наблюдается у больного желтухой (рис.2а), Следовательно, в сыворотке крови присутствуют также другие ингибиторы, препятствующие связыванию АНС о альбумином. Наиболее вероятно, что это - жирные кислоты и их производные, поскольку очистка сыворотки крови на активированном угле при рН 3, при которой с альбумина удаляются жирные кислоты ( Chen r.p. f 1967), приводит к росту на 15-33$ в разных образцах.

Уменьшить влияние ингибиторов на связывание АНС с альбумином можно путем закисления среды до рН 4,0 (рис,26). При этом влияние билирубина нивелируется полностью. Исходя из этих результатов, мы предложили параметр СРдас^'^/рАНС^4'^ ) Для характеристики удельной связывающей способности альбумина (ССА, тайл.З). Одновременное измерение СЕА и ССА позволяет разграничить ситуации, когда просто снижена концентрация альбумина и когда нарушена его связывающая функция. Последнее часто бывает при недостаточности функции печени - при механической желтухе, сепсисе, ожогах и др. Поэтому показатель ССА можно предложить для оценки детоксикационной функции печени.

Однако недостатком способа определения ССА с помощью АНС является то, что в знаменателе стоит величина, которая в ряде случаев не равна концентрации альбумина - использование АНС не позволяет измерять концентрацию альбумина при гипербилирубинемии. Длл решения этой проблемы мы использовали новые флуоресцирующие вещества, которые не применялись ранее в биологии или медицине.

5 10

[зонд] , мкМ

]?ио.2. Флуоресцентное титрование различных проб сыворотки крови зондам.

а - зонд АНС, рН 7,4; б - зонд АНС, рН 4,0; в - зонд К-33,рН 4,0.

I - сыворотка с нормальными биохимическими показателями; 2 - та же проба сыворотки, что и I, но с добавлением I мкМ билирубина, что соответствует 200 мкМ непрямого (связанного с альбумином) билирубина в неразведеннай сыворотке крови; 3 - сыворотка больного желтухой (общий билирубин 326 мкМ, непрямой 86 мкМ). Разведение сывороток крови в 200 раз. Данные выравнены по концентрации альбумина и с учетом поглощения билирубином флуоресцентного света АНС и возбуждающего К-33.

в в

I

F/ 1,0

0,5

'альбумин)

800 400 200 800 400 200 600 400 200

степень разведения сыворотки крови ;■ Рис.3. Зависимость удельной интенсивности флуоресценции зондов

от разведения сыворотки крови, а - зонд АНС, рН 7,4; б - зонд АНС, рН 4,0; в - зонд К-33,рН 4,0. I - сыворотка крови здорового донора, 2 - сыворотка больного механической желтухой. По вертикальной оси - отношение интенсивности флуоресценции зонда к концентрации альбумина. Условия измерения те же, что и на рте. 2.

3.2. Новые флуоресцентные зонды: свойства, взаимодействие с альбумином, применение

Флуоресцирующие вещества К-33 и К-35 не применялись ранее в медицине или биологии. Мы исследовали их оптические свойства (табл.4), а также связывание с различными фракциями сыворотки крови (табл.5). К-33 и К-35 в сыворотке крови флуоресцируют преимущественно в связанном с альбумином состоянии. Это позволяет исследовать свойства альбумина непосредственно в сыворотке.

' Таблице 4

Параметры поглощения и флуоресценции новых флуоресцентных зондов

Название параметра Среда Флуоресцентный зонд

К-33 К-35

Максимум спектра поглощения, км этанол 430 430

Молярный ковфф.поглощения, т (см.М) атанол 5 850. 10 700

Максимум спектра флуоресценции, нм вода этанол . 550 545 550 530

дал14 538 526

альбумин 543 515

Квантовый выход флуоресценция вода 0,005 0,002

втанол .0,066 0,023

ДМФА 0,113 0,013

альбумин** 0,30 0,12

Время затухания Флуоресценции, нсек . Г2 сыворотка крови ми 13,9+0,2 5,3+0,6 8,3*0,2 2,1*0,2 |

а ДМФА - диметилформамид

&х в растворе альбумина квантовый выход флуоресценции определен приблизительно «за для К-33 - рН 4,0; для К-35-- рН 7,4; усредаено по \ образцам

Таблица 5

Интенсивность флуоресценции зондов К-33 и К-35 во фракциях сыворотки крови

Зонд Интенсивность флуоресценции (отн.ед.)

буферный раствор. ЛП0НП + +ЛПНП глобулины альбумин альбумин + +глобулины

К-33 2 з - 13 100 105

К-35 I I 8 100 100

ДП0НП+ЛПШ1 - липопротеины очень низкой и низкой плотностей.

Разработка метода измерения концентрации альбумина при гипер-билирубинемии. Для решения этой задачи мы использовали флуоресцентный зонд К-33. Так же, как и в случае АНС, при рН 4,0 удается устранить влияние билирубина на связывание К-33 с' альбумином (рис.2в). Что касается других ингибиторов связывания, то их действие на К-33 почти в 2 раза меньше, чем на АНС (рис.2а,б), но все яе остается достаточно заметным.

Ингибиторы связывания могут быть либо обратимыми, либо необратимыми. В первом случае на комплексообразование зонда с альбумином будет влиять степень разведения раствора, то есть, другими словами,.концентрация конкурентного, ингибитора. На рис.З представлены результаты эксперимента, который показывает преимущество К-33 перед АНС. При степени разведения 1«400-1:800 интенсивность флуоресценции зонда К-33 при рН 4,0 дает истинное содержание альбумина в сыворотке крови бальных желтухой. В случае же АНС ни с помощью рН, ни разведением, не удается полностью избавиться от влияния ингибиторов связывания.

Основываясь на приведенных выше результатах, мы предложили следующую методику измерения концентрации альбумина в сыворотке крови. К 4 мл буферного раствора (10 мМ ацетат натрия рН 4,0) до-

бавить 10 мкл сыворотки крови и 60 мкл раствора I мМ К-33 в да-метилформамиде. Перемешать. Измерить интенсивность флуоресценции раствора при 550 нм (возбуждение при 420 нм) не позднее чем через минуту.со времени добавления зонда. При чрезвычайно массивной желтухе (общий билирубин более 300 мкМ) сыворотку крови развести буферным раствором в два раза, далее провести измерение по описанной схеме и результат умножить на два.

Провели измерение концентрации альбумина в сыворотке крови с нормальными биохимическими показателями, о повышенным содержанием билирубина и с повышенным содержанием креатинина описанным выше способом и по унифицированной методике с помощью бромкрезолового зеленого (рис.4а). Коэффициент корреляции 0,955. Средняя ошибка определения для желтых сывороток (-3$). Такой же эксперимент о зондом АНС дает среднюю ошибку определения альбумина (-21%) и коэффициент корреляции 0,844.

Предлагаемый флуоресцентный метод определения альбумина обладает рядом преимуществ. Он несравнимо проще электрофореза в любой модификации. Технологичен, может быть автоматизирован. По сравнению с бромкрезсловым зеленым не требуется импортного реактива Бридж-35, К тому же чувствительность флуоресцентного определения.на порядск выше, чем при измерении оптической плотности красителя.

Разработка метода измерения связывающей емкости альбумина. Флуоресцентный зонд К-35, в отличие от К-33,наоборот, очень чувствителен к присутствию различных ингибиторов связывания с альбумином. Он имеет меньшую константу связывания с альбумином, чем АНС. Лекарственные вещества-маркеры центров связывания альбумина в большей

щ

степени вытесняют К-35 из комплексов с альбумином, чем они вытесняют АНС,

F 1,0

0,5

F 1.0

0,5

50 [Альбумин] , г/л

25

50 [Мьбуыин] , г/л

Рис.4. Интенсивность флуоресценции зондов К-33 (а) и К-35 (б) в сыворотках крови с различии:.! содержанием альбумина.

Пустые кружки - здоровые люди и пациенты с нормальной связывающей функцией альбумина, черные кружки - сыворотки с общим билирубином от 28 до 326 мкМ, звездочки - сыворотки с креатинином от 202 до 966 мкМ, Прямые построены по точкам, соответствующим нормальным сывороткам крови. Разведение сывороток в 200 раз. pH 4,0 (а) и 7,4 (б). Концентрация зондов - 15 мкМ. Длины волн возбуждения -420 нм, флуоресценции - 550 нм.

На рис.46 показано, что интенсивность флуоресценции К-35 в сыворотке крови при ряде патологий снижается. Снижается связывающая емкость альбумина по отношению к зонду. Для определения связывающей емкости альбумина мы предлагаем следующую методику. К 2 мл буферного раствора (10 мМ трис.НС1, рН 7,4) добавить 10 мкл сыворотки крови и 30 мкл I мМ раствора К-35 в диметалформамиде. Перемешать. Измерить интенсивность флуоресценции раствора при длине веяны 550 нм (возбуждение при 420 юл). Калибровка проводится по нескольким сывороткам крови здоровых доноров с известным содержанием альбумина. Результат выражается в (г/л) - единицах измерения концентрации альбумина. Фактически, измерение связывающей емкости есть измерение количества функционально полноценного альбумина.

Определение CEA проводится при рН 7,4. Это физиологическое значение кислотности крови выбрано для того, чтобы приблизить условия измерения к реальным условиям, при которых альбумин связывает лиганда. Конечная концентрация зонда К-35 - 15 мкМ. Это - концентрация насыщения альбумина зондом для любой реальной сыворотки крови, разведенной в 200 раз. Избыточная концентрация зонда по Отношению к альбумину необходима для решения поставленной задачи -измерения связывающей емкости, то есть числа центров связывания

( N ). При [К-35] ^ 1Д„ связывание зонда пропорционально числу t

центров и , а при [К-35] ^ IДс связывание уже пропорционально произведению'(К ' N),

с

Предложенный метод прост методически. По сравнению с наиболее распространенным способом с использованием конго красного (Че-гер С.И., 1975) время анализа сокращается с 25 часов до 2-3 минут, сокращается число стадий исследования. Вместе с тем сохраняется точность выявления нарушений связывающей емкости альбумина при па-тодогии.

Определенна связывающей емкости альбумина - абсолютной величины, характеризующей транспорт веществ в крови, - ватно само по себе. Но выявить причины снижения связывания веществ с альбумином, оценить недостаточность детоксшсациошшх возможностей организма можно только с помощью относительного показателя - удвлыюй связывающей способности альбумина (ССЛ). Разработанные на основе флуоресцентных зондов К-35 и К-33 методы позволяют наиболее точно определить ССА - вычисляется отношение связывающей емкости альбумина к его концентрации.

Зонда К-33 и К-35 имеют близкие спектральные области.возбул-дзния и флуоресценции.' Это позволяет проводить измерения обоих параметров, а следовательно и ССА, при один п тех же длинах волн. Кроме того, условия измерения подобраны так, что .определение концентрации и связывающей емкости альбумина проводится1 в одном диапазоне чувствительности флуориметра.

3.3. Клинические иллюстрации разработанных методов исследования альбумина

Для проведения анализа альбумина достаточно крови из пальца. Но насколько могут быть сравним! результаты ясслодоватгия венозной и капиллярной крови у одного и того- яз пациента? Опасалось, что кснцеитраш-1 альбумина у здоровых доноров в среднем на 11% выше в взнознсЯ крози, чем а папиллярной; в группо тяжелых больных - в срэдпгм на 15% выгэ. Свявнзсащая способность альбумина может бить бслыгэ и в венозной, п в кепиллярной крови у разцкх пациентов; в срэдом ССА на 3~45 гтлта в воисзноа крови. Эти рэпультпти иообхо-дкно згштпвать, если у одного и того г:а пациента з разное время берется для анализа венозная или каплллярнач крова.

Результаты измерения связывающей емкости и связыва-

ющей способности альбумина (^к-зэ^к-ЗЗ^ у больных приведены в табл.6. Гипербшщрубинемия - наиболее яркий пример патологического повышения концентрации метаболита в крови, И, как правило, наиболее глубокие нарушения связывающей способности альбумина наблюдаются при механической желтухе, у бальных с желтушной формой леп-тоспироза. В группе бальных вирусным гепатитом изменения альбуминовых показателей в средаем не такие значительные. Изменения ССА не часто коррелируют с интенсивностью желтухи. В группе бальных с желтухами разного генеза (33 наблюдения) коэффициент корреляции снижения ССА с концентрацией общего билирубина равен 0,504, с содержанием непряного билирубина - 0,234, с активностью алагаштранс-аминазы - 0,220. Следовательно, ССА не повторяет уже известные показатели нарушения функции печени, и имеет самостоятельное значение как источник данных о состоянии бального. Особенно это важно в случае заболеваний,.не сопровождающихся заметными сдвигами биохимических показателей, измеряемых в клинических лабораториях. Это - гнойно-воспалительные заболевания, сепсис, ожоги, тяжелая травка, длительное сдавление мягких тканей и др. При всех этих состояниях печень не справляется с потоке*,i веществ, которые необходимо вывести из организма: либо вследствие болезни печени, либо вследствие того, что поток метаболитов и токсинов слишком велик. Все это приводит к перегрузке альбумина - основной молекулы, доставляющей к гепатоцитам токсичные вещества. Снижение ССА и СБА при ожогах, сепсисе, гнойно-воспалительных осложнениях бывает очень значительным (табл.6), не уступая в этом отношении механической желтухе.

Мотода лечения, направленные на выведение из крови метаболитов и токсинов, - метода экстракорпоральной детоксикации должны

.Таблица 6

Показатели связывающей функции альбумина

Группа пациентов Н-во наблюдений Связывающая емкость, г/л ®К-35) Связывающая способность, % ^-35^-33 ^

среднее Ш+» ) интервал среднее (Ы ) интервал

Здоровые 20 47+2 42-52 100+2 85-115

Механическая желтуха 39 15+3 2-33 55+3 23-83

Вирусный гепатит 28 24+4 7-36 70+3 42-96

Термический ожог II 18+3 12-25 63+4 43-81

Абсцессы, флегмоны 10 13+5 8-22 60+4 43-79

Гинекологический сепсис ЕЗ 16+2 10-19 64+2 47-78

Послеоперационные осложнения 12 17+2 12-СЗ 63+3 45-77

Почечная недостаточность 9 30+4 25-40 90+4 72-110

Разные (пневмония, лептоспи-роз, анемия, эклампсия, синдр. длительного сдавле1гпя) 10 18+3 9-25 62+3 51-81

способствовать восстановлению связывающей функции альбумина. Было проведано исследование влияния внутривенного введения гепарина - процедуры, необходимой для предотвращения экстраваскулярного свертывания крови, - на СБА г: ССА. Гепарин активирует липопроте-инлипазу, что приводит к повышению в несколько раз содержания в крови жирных кислот ( Drongoie s.h. ,1973), Следствием этого является снижение СЕА в среднем на 3-4/3, а ССА - в среднем на 21$. Поэтому проводить оценку эффективности того или иного метода следует через несколько часов после окончания цроцедуры.

Изменение СЕА и ССА после проведения гемосорбции, плазмафе-реза, так же как и клиническое состояние больного, - индивидуально. В целом наблюдается зависимость между состоянием больного и показателями альбумина. У 10 бальных измерили СЕА и ССА до и после проведения экстракорпорального подалючения донорской селезенки (ЭКПДС)4 В среднем по группе наблюдалось после ЭКПДС увеличение СЕА на Ъ%, ССА - на 39$.

Измерение в динамике связывающей способности альбумина может быть включено в систему критериев прогноза заболевания. У больных, у которых несмотря на проводимое лечение ССА оставалась низкой, исход заболевания был неблагоприятным. Напротив, выздоровление сопровождалось положительной динамикой ССА.

Приведенные в этом раздело диссертации примеры использования разработанных флуоресцентных методов определения концентрации и связывающей способности альбумина показывают перспективность их применения в клинико-лабораторной практике,

ВЫВОДЫ

. I. Исследован молекулярный механизм взаимодействия ряда флуоресцентных зондов: известного АНС и новых, впервые иаичаиных нами,

зондов К-33, К-35 и других, - с сывороточным альбумином человека. Определены параметры связывания зондов о альбумином, изменения их интенсивности и кинетики затухания флуоресценции, а также влияние pH среды, билирубина и других веществ на эти параметры.

2. Патологические изменения состава крови, в частности гипер-бгогарубинемия, сопровождаются снижением интенсивности флуоресценции зонда АНС в сыворотке крови. Нами обнаружено, что при этом квантовый выход (врет затухания) флуоресценции АНС практически

не изменяется. Эффект же объясняется снижением числа центров связывания зонда на альбумине. Одновременно увеличивается константа связывания АНС с альбумином, что можно рассматривать как компенсаторный механизм, направленный на сохранение связывания лигандов при их небольшой концентрации,

3. Найдены такие условия, при которых связывание АНС с альбумином наиболее или наименее чувствительно к присутствию различных метаболитов и ксенобиотиков в крови. Это позволяет использовать флуоресцентный зонд для измерения связывающей способности альбумина при гепатитах, механической желтухе, сепсисе, ожогах и при другой патологии.

4. Разработан новый способ определения концентрации йльбуми-па с помощью нового флуоресцентного-зонда К-33. Метод применим

в том числе и при гипербилирубинсмии.

5. Разработан новый споооб определения связывающей емкости альбумина о помощью нового флуоресцентного зонда К-35. Его прайму-• пвотва заключаются в значительном сокращении числа операций и длительности при сохранении информативности анализа. В сочетании о измерением концентрации альбумина опредэлэпио его овязывающей емкости позволяет характеризовать функциональную полноценность альбумина. ;

б. Клинические испытания разработанных методов показывают их диагностическую значимость при оценке тяжести интоксикации и состояния больного, эффективности проводимого лечения, в. том число методов экстракорпоральной'детоксикации. Простота, технологичность, быстрота исполнения, дешевизна реактивов, микроколичество исследуемой щюви позволяют рекомендовать предлагаемые способ для широкого использования в клинико-лабораторной практике.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Миллер Ю.И. Использованиа флуоресцентного зонда в оценке связывающей способности сывороточного альбумина человека при печеночной недостаточности. - Лабораторное дело, 1989, К 7,с.20-23.

2. Миллер Ю.И. Нарушение связывающей способности альбумина как критерий эндогенной интоксикации при сепсисе. - В кн.г 2 Всесоюзная конференция "Хирургический сепсис". - Тула, 1989,

с.26-27.

3. Миллер Ю.И. Нарушениз связывающей способности альбумина. Возможности" клинического применения. - Труда 1У конференции молодых ученых НИИ физико-химической медицины, - М., НИИ ФХМ

МЗ РСФСР, 1989, с.3-22. - Деп.ВИНИТИ К 63П-В-89.

4. Миллер Ю.И. Определение связывания биологически активных соединений с альбумином и нарушения комплексообразования при патологии. - Тезисы докладов 10-й конференции молодах ученых Института органического синтеза АН ЛатвССР "Синтез и исследование биологически активных соединений". -Рига,1989, с.107,

5. Миллер Ю.И., Юшко Э.Г., Добрецов Г.Е., Красовицкий Б.М., Айда-«

ралиев Р.К. Флуоресцентный метод оцределения альбумина в сыворотке крови при гипербшшрубинемии. - Вопросы медицинской химии, 1990, т.36, вып.2, с.86-88.

6, Миллер Ю.И., Добрецов Г.Е., Красовицкий Б.М., Корнилова Л.И., Ермоленко И.Г. Способ определения связывающей емкости альбумина в сыворотке крош. - Заявка на изобретение № 472098? от 25.07.89. Положительное решение от 20.03.90,

Т.ИЛЛ. ЦП т™,. !СО „р