Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нарушения свойств связывающих центров сывороточного альбумина при заболеваниях человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Нарушения свойств связывающих центров сывороточного альбумина при заболеваниях человека"

на правах рукописи

СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 -Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Екатеринбург, 1996

Работа иыиолнена в Уральской Государстийшой Медицинской Академии (г, Екатеринбург) и Научно-Исследоиате;и>ском Институте Физнко-Хнмнчсской Медицины Минздраимеднрома РФ (г. Москва).

Научные руководи«ели: доапр^тмтлодиш'кдоишук, (цхфяерр Г.Е. ДОБРЕЦОВ

кандидат медицинских наук Л.Т. ШМЕЛЕВА

Официальные ошкшеши: доктор медицинских наук, профессор В.И. СОРОКОВОЙ; доктор биологических наук, профессор Г.И. KJIECAllOU

Ведущее учредимте: Российский Кардиологический Производственный Научный Комплекс Мннздраимедпрома

Защита состоится " f} " ИЮНЯ 1996 г в dO 'í.icoii на заседании Специализированного Совета Д.084.66.01 и Научно-Исследоцательском Инстигуче Фнзнко-Химической Медицины по адресу: 119828 Москва, ул. Малая Пироговская. Дом 1а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ ФХМ по адресу: 119828 Москва, ул. Малая Пироговская, дом 1а.

Автореферат разослан " 3 " МО Л__1996г.

Учены» секретарь Сонета кандидат биологических наук М.А МУРИНД

ОБЩАЯ хлрлктчгстикл РЛпоты

AKTNv^jbHnçn.^iipijG/ioNibr^A-ibfnAiitii ила шм кропи является белком, выполняющим весьма нажиме фумкшш м оркннп.ме. Одна из них - пахтержаипс осм:мичсскот давления.; потеря зпачшелыюго колпчеста а.н.бумина (например, при кроионогере или нарушении функции почек) прмполпт к отекам и лрутм тяжелым после.тсишнч. По ному концентрация альбумина контролируете? и оСнгшелыюм п. «рядке при любом апаппе кропи i? клинике.

Лрутая важнейшая ф>нкпня ан.бумипа - свял.тлнис амфпфильпых пткомолекуд.чрных веществ - жирных кислот, билирубина, miioim.x лрушх метболшом. токсинов и ксенобиотиков ( и том числе лекареiiieum.ix вешест) и перенос их к оришам деюксикапии и гшлизлпии /Чен-р C.II., 1975: j'IyiiK A.N., 19,S4/. Олнако способность атьбумина связывать различите метаболиты не котролирусгся в клинике и не является прелмеюм шпереса клпнппиств, d о?личие or концентрации ап.бумина.

A между тем уже более J0 лег и литературе лпиолически появляются сведения о том, что ошметка свяшваюших центров альбумина могут имешо измеп.чться ??ри нарушениях функции оргатнмл. Это наблюдали при многих заболеваниях: желтухах /Rees V.U., et al.. 1954/, инфаркте миокарла / Мельник И.А. и лр., 19N5; Грызуном Ю.А. и др., 1994/, отравлениях /Андреичин М.А. и лр.: 1985/. ожогах /Сатоматина В.13. и лр., 19,S7/, почечной недостаточности и сепсисе /Миллер Ю.И., Добрепов Г.Е.. 199V, лиабетс ferner et al., 1992, Keila et al.. 1993, Okabe et al.. 1994, 1995/, билирубиновои энцефалопатии новорожденных /Ebbesen et al., 1992/, операннониых осложнениях /Миллер Ю.И., 1993: Voruni • * al., 1993/ и т.д.

Такие изменения свойств связывающих пентроп альбумина были показан?.? тлаьны.м образом с помошыо специальных тестовых молекул-лиганлоп, напоминающих но структуре npiipo;j)i?,ie метаболит?.?, которые способны связываться с атьбумнмом. Особенно удобными оказа'???сь флуоресцирующие молекулы ("флуоресиент??ые зонл?.|") и среди них в последние годы - флуоресцентный зонд К-35 /Миллер Ю.И., Добрецов Г.Е.. Красоп?шки1'| Б.М.. Грь?зу??ов Ю.А., 1993-1995/.

Оказалось, tu» интенсивность флуоресценции зонд.: К-35 Ii плазме (сыворотке) кропи больных различными заболеваниями можег снижаться на десятки пропсптч.в и лаже п несколько раз, н то время как общая копией грация альбумина не испытывает столь значительных изменении п часто остается н пределах нормы.

Таким образом, было обнаружено некоторое явление, которое широко распространено и состоит и изменении свойств связывающих центров альбумина при ряд'- заболевании человека. Самым простым и чувствительным способом выявления подобных изменении является применение флуоресцентных зоилом, прежде всею - предложенного недавно зонда К-35.

Флуоресценции К-35 отражает количество и состояние сия тыкающих не трон альбумина к плазме кропи. Однако оставались не исследованными конкретные причины изменении флуоресценции. Что именно изменяется н молекуле альбумина: число связывающих центром их сродсшо к лнганлам ( м том числе к зоилу К-35) ? пли число центром и их сродсшо к лнганлам остаются неизменными, но изменена структура центра?

Целью данной диссертационной работы было выяснить, что происходит со связывающими центрами альбумина при нарушении:» функции организма: изменяется ли их колпчестно, сродство к низкомолекудярным органическим лнганлам, или происходят структурные перестройки Петра связывания, не затрагивающие их связывающие свойства.

Задачи диссертационной работы 1. Исследовать взаимодействие флуоресцентного зонда К-35 с альбумином в сыворотке крови игровых доноров и определить величины и лиапазон вариации трех параметров альбумина, формирующих величину интенсивности флуоресценции К-35, а именно:

-концентрацию связывающих центров альбумина -ксн icnu пу сия luí ¡алия 'jnix петров с молекулами joi uia К-35 и -величину кнанового выхода флуоресценции молекул К-35, расположенных в связывающем центре альбумина, которая отражает структурные перестройки связывающих центров.

2. Исследовать аллостеричг :кое влияние жирных к [слот на связывающие центры альбумина в сыворотке крови, которое

выявляется с помощью флуоресцентно^? зонда К-35.

3. Выяснить, какие из перечисленных иышс параметров, характеризующих состояние спя зыкающих центром альбумина а сыворотке кр1.;и, изменяются- при нарушении функций организма.

Научная нопизнп работы Впервые исследованы параметры, характеризующие взаимодействие флуоресцентного зоила К-35 с молекулами альбумина н сыворотке и плазме кропи, а именно:

-количество центров н каждой. молекуле а;п.бумина, доступных зонду,

-константа спязмнпмия ими зоила К-35 и -конфирмация центра, влияющая па квантовый выход флуоресцсннии связанных молекул К-35.

Эти параметры измерялись как » групче допоров, так и н группах пациентов с различными нарушениями функций организма.

В результате проведенных исследований установлено, что при различных нарушениях функции организма в молекуле альбумина происходят конформационные перестройки. Эти перестройки могут быть обнаружены с помощью флуоресцентного зонда К-35 как в венозной; так и в капиллярной крови. Они имеют три характерные особенности: -способность молекулы альбумина связывать зонд К-35 у больных людей испытывает, резкие отклонения от диапазона, свойственного здоровым людям, однако среднее значение этой связывающей способности остается таким же, как и у здоровых людей;

-наряду с этим происходят конформационные изменения связывающих центров, приводящие к снижению интенсивности флуоресценции К-35. Они выявляются у большинства пациентов. г Вероятно, молекула К-35, расположенная в альбуминовых центрах, становится более доступной мол кулам воды;

-при некоторых нарушениях функции организма изменяется (чаше всего - возрастает) чувствительность альбуминовых центров к аллостерическому влиянию неэстерифицированных жирных кислот.

Практическая ценность. Полученные результаты могут иметь общетеоретическое и прикладное значение. Вклад в

теоретическую биохимию состоит и том, что показано явление определенного изменения свойств связывающих центров альбумина при ряде нарушении функции организма. Это изменение может быть выявлено с помощью специального флуоресцентного зоила. Оно может сопровождаться или не сопровождаться нарушением способности альбумина связывать некоторые органические лигапды. Таким образом, иго конформаниопное изменение не смолится только к нарушениям связывания. Раисе, до проведения нашего исследования, всякие изменения связывающих центров альбумина обычно понимались только как изменение их способности связывать лигапды.

Полученные данные представляют интерес для практической медпцнпы, поскольку неследованная реакция молекулы альбумина на патологический процесс могла бы быть использован.! ;иж оценки тяжести патологического процесса и прогноза развития заболевания и результатов лечения. Зонд К-35 уже используется в ряде клиник с аелыо диагностики, и выяснение молекулярного механизма его взаимодействия с альбумином позволит лучше понять его диагностические и прогностические возможности.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на заседании отдела биофизики Научно-Исследовательского Института Фпзико-Химнческоп Медицину (19%), а также на итоговой научной сессии УрГМИ (1995, Екатеринбург), 2м симпозиуме "Нешпшпвные мегодь! диагностики" (1995, Москва).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения," обзора литературы, методической части, экспериментальной части (результаты и их обсуждения), заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа состоит из пяти глав и изложена на 134 страницах, включая 1 1 рисунков. Список литературы содержит 200 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе измеряли флуоресцентно зонда К-35 н образцах сыворотки кропи доноров и больных некоторыми заболеваниями. Флуоресценция зоила характеризовалась параметрами ОКА, ЭКА, ЭК А/ОКА и индексом токсичности (ИТ).

Интенсивность флуоресценции К-35 в сыворотке крови изучали при двух условиях:

а) При pH 4,0 и в присутствии нечопнои» летергеита интенсивность флуоресценции К-35 зависит практически только от количества молекул альбумина в пробе. Эти интенсивность, выраженная в единицах концентрации^ называется "общая концентрация альбумина" (ОКА) /Грызунов Ю.А.,1994/.

б) При физиологическом pH интенсивность флуоресценции К-35 в сыворотке зависит не только от его концентрации, но и от физико-химического состояния альбуминовой глобулы: присутствия лиганлов (метаболитов, токсинов), ковалентноп и нековале1: гноп модификации аминокислотных остатков, конформанни - т. е. факторов, изменяющихся » зависимости от состояния организма. Эту интенсивность флуоресценции также выражают в единицах концентрации (г/л) и называют "эффективная концентрация альбумина" (ЭКА) /Миллер Ю.И., Добрснов Г.Е 1993/.

Индекс ЭКА/ОКА не зависит от числа молекул альбумина в пробе и характеризует только физико-химические свойства молекулы альбумина.

Общую и эффективную концентрацию альбумина определяли флуоресцентным методом /Грызунов Ю.А., Миллер Ю.И., 1994/. Кроме тою, использовали два расчетных показателя:

(ЭКА/ОКА)* 100% и ИТ= (ОКА/ЭКА) - 1.

Параллельно в icx же образцах сыворотки крови измеряли содержание липидов и некоторые другие показатели, изменения которых сопоставляли с изменениями флуоресцентных параметров.

Уровень суммарного содержания холестерина и триглицеридов (ХС+ТГ) определяли флуоресцентным методом /Лапшин E.H., 1991/.

Общий билирубин измеряли с помощью наборов фирмы "Бпо-ЛА-Тест".

Активность аспартатамииотрансферазы (ЛСТ) определяли с использованием наборов реактивов фирмы "ЬАСППМЛ".

Для решения основной задачи исследования в образцах сыворотки крови определяли квантовый выход флуоресценции К-35, концентрацию петров связывания и константу связывания зоила К-35 с альбумином /ПоЫеЬоу С.Ус., 1996/.

В соответствии с поставленной целью н задачами были измерены параметры ОКЛ, ЭК А, ИТ п ХС+ТГ в образцах крови нескольких групп больных. В первую группу вошли лица с острым инфарктом миокарда, данная группа панпентов состояла из 13 человек. Вторую группу составили 22 человека - пациенты кардиологического отделения, страдающие стенокардией. В третью группу были включены лица с острым и хроническим гепатитом в количестве 37 человек. Четвертую группу составили 10 пациентов с циррозом печени в острой стадии. Пятую группу составили 9 панпентов с острым сепсисом В шестую группу вошли 10 пациентов, имеющих сочетанпую черенио - мозговую травму. Группой сравнения служили дне группы доноров общей численностью 40 человек отделения переливания крови.

Сыворотку венозной крови п плазму капиллярной кров»! получали обычным способом и использовали для анализа и течение суток после получения крови. От Момента получения до анализа сыворотку хранили на холоду.

Все исследуемые параметры крови, описанные выше, всех обследуемых групп больных измеряли вперемежку в один и тот же период времени. Поэтому какПе-либо систематические расхождения между результатами, полученными для разных групг1 пациентов, исключены.

Статистическая обработка результатов: и качестве критериев достоверности различий между группами использовали параметрический критерий Стыодента и непараметрйчесК11й критерий Вилкоксоиа.

ИПУЛЫЛТЫ и ш.сужднииг.

Ичмсис!111я ф.1у(1рссис"Н"И1011дз К-35 в_сыкпрпткс.крпш1сфП ряде зашмснамин человека

Флупрссцгнция inwhi K-JS при некоторых ¡имитациях

С помгпш.м потно флуоресцентного метода мы привели исследование-динамики изменений свойств связывающих ncitrpnn альбумина после острого инфаркта, а также при стенокардии, гепатите, иирроче печени, сепсисе и травме.

При инфаркте снижены оба параметра: ОКА - ira 10 ío и ЭКА - на 30) *Ъ по сравнению с группой лонпрон. Вследствие этого снижается параметр 'ОКА/О КЛ* I00ft.

Pajiiniiat между больными и зл"|нтммм становится cinc более заметноИ, еелт оперировать сочетанием измеряемых параметров (ОКА и ЭКА): это сочетание позволяет полностью отделить данные по больным (2-й и 3-й лень наблюдения; от данных по группе доноров. Причина состоит в наличии линейной снят между обоим» параметрами, которая не одинакова у доноров и у больных инфарктом (рис.1.)

Как вишпв на рис.1, между величинами ОКА и ЭКА, измеренными! стандартным способом, имеется линейная связь. В группе донороа практически все точки ложатся на пряыуво линию, ТТЛ ешь связь между исследуемыми параметрами отбывается) линейной функцией вида:

L = OKA^a•ЭКА + Ь = 0, гас константен а = - 0,81 и о = - 10,6 .

Коэффициент линейной корреляции в группе доноров близок к единице г = 0,88 (р < 0,01). В группе бальных (третьи сутки) лннелишп связь менее жесткая, однако ппффкшют корреляции! еяллпк (г = 0,84; р < 0,01). При этом позе итак, соответствуют! ок Донорам, ошекяо от пазя тага йптши людей.

При стаюязрлин , ашпзпа акгяопгпгое ошшис параметров! ОШ^, ЭКА и ЭКА/ОКА, хотя оно менее выражено, чей при иифщмк ииокарлд. Подобные пвххша шЯшцциашса и при лрупо^зябшгиитигх-

ЬО; 40 ■ 30 Ч

й 20-\ о

10-

0

доноры г = О.ОН

+ г = 0.84

инфаркт 3 дня

г 10

т 20

ОКА

30

40 (г/л) '

50

Рис. 1. Сочетание величин ОКА и ЭКА у доиороп (полые точки) и у больных инфарктом на третьи сутки наблюдения (крестики). Для каждого больного приведены величины всех трех измерений, проведенных в разное время третьих суток у каждого больного. Через точки доноров и больных проведены линии наилучшей регрессии.

Сравнение свойств связывающих центров альбумина в венозной и капиллярной крови

Предыдущие исследования флуоресценции К-35 при

заболеваниях - как описанные выше в нашей работе, так и

о

выполнен! те ранее другими авторами - проводились в основном на образцах сыворотки венозной крови. Между тем представляет интерес и капиллярная кровь - гораздо более доступный объект исследования, т.к. для анализа требуется только 20 мкл плазмы.

ь: <о я о.

с

я <

о

ПО 40

302010-

0 10 20 30 40 50 ОКЛ венозная (г/л)

Рис.2. Сравнение ОКЛ п венозной и капиллярной крови (доиороп-8, больных ге-папггсм-12, циррозом печсни-2).

4 5040

»-4

►д

а. ЗОН я к

5 20 »-я

С

« 10-* О о

т-1-Г

О 10 20 30 40 50 ЭКА венозный (г/л)

Рис. 3. Сравнение Э1СЛ в венозной и капиллярной крови (доноров-8, больных ге-патитом-12, циррозом печсни-2).

Мы сравнили результаты, которые получаются на сыворотке венозной кропи (ВС) к плазме капиллярной крови (КП) при использовании стандартной методики, реактивов и флуоресцентного анализатора, описанных мнее /Грызунов Ю.А., Миллер Ю.И., 1994/. Кровь была взята одновременно из вены и из налша у У доноров, 12 больных гепатитом и 2 - циррозом печени, которых специально не подбирали.

Ок.оалоеь, что имеется хорошая линейная связь между величинами ОКА в ВС и КП с наклоном, близким к 1: ОКАвс = (0,96Ч)КАкн) при коэффициенте корреляции г " 0,88 (рис.2). Линейная связь наблюдается и дли ЭКА: ЭКАвс = (0,89*ЭКАки) при т = 0,81 (рнс.З).

Вместе с тем в большинстве случаев ОКА, ЭКА/ОКА н особенно ЭКА в КП ниже, чем в ВС. Это особенно заметно и группе больных.

Отмечены достоверные различия между флуоресценз лымп параметрами, измеренными п сыворотке венозной и в плазме капиллярной крови.

Таким образом, изменения ОКА и ЭКА при заболеваниях идут параллельно как в венозной, так и в капиллярной крови. Полной идентичности не наблюдается: более того, отмечена тенденция более значительных изменений связывающих центров альбумина в капиллярной крови по сравнению с венозной. Капиллярная кровь часто более доступна (например, и педиатрии), чем венозная.

Возможно, проведение флуоресцентного теста с зондом К-35 даже более предпочтительно в капиллярной крови, учитывая ее более высокую чувствительность к нарушениям функций организма.

Влияние жирных кислот на флуоресценцию К-35 при некоторых заболеваниях

Как известно, в альбумине имеются специальные центры связывания жирных кислот. В результате заполнения этих центров жирными кислотами о :и оказывают аллостер ;ческое влияние на параметры центров, связывающих билирубин или флуоресцентные зонды.

Ранее в работе /Грызунов Ю.А., 1994/ исследовались

олеиновая и пальмитиновая кислоты, которые несколько по-разному влияли па флуоресценцию К-35. Влияние жнгчых кислот на К-35* было исследовано тогда только в образце слитой сыворотки здоровых людей. В случае сывороток больных людей аллостернческое влияние жирных кислот на флуоресценцию К-35 не изучалось.

Мы исследовали влияние стеариновой кислоты" на флуоресценцию К-35 в сыворотках больных. К сыворотке вначале добавляли стеариновую кислоту до молярного соотношения кислота/альбумпп=1,1/1. Затем лобавляли зонт и измс|^.1Н .интенсивность его флуоресценции (Fie). Затем добавляли кислоту до конечного соотношения 5,5/1,0 и измеряли флуоресценцию зонда (F2c).

Параметр F2c/Flc отражает способность жирной кислоты регулировать связывающие свойства альбумина, т.е. отражает аллостернческое действие жирной кислоты на связывающие центры альбумина. У здоровых доноров эта способность почти одинакова (параметр варьирует только в очень узких пределах). При инфаркте влияние жирной кислоты на связывающую способность альбумина резко возрастает (параметр становится значительно выше): добавление жирной кислоты иногда способно увеличить флуоресценцию связанного с альбумином зонда почти в 5 раз. При этом в 65% случаеп измерения этого параметра у больных инфарктом его величина превышала верхнюю границу для доноров (была выше 2,63), у больных стенокардией величина параметра F2c/Flc превышала верхнюю границу доноров "ri 45% случаев, у больных гепатитом - в 57% случаев, у больных циррозом - в 30% случаев, в группе сепсиса -в 78% случаев, у пациентов с сочетанной черепно-мозговой травмой - в 10% случаеп.

Как видно, чувствительность молекулы альбумина к аллостерическому влиянию на нее жирных кислот значительно возрастает при нарушениях функций организма.

Другие определяемые показатели в обследуемых группах пациентов

Представлялось интересным сравнить данные используемых нами флуоресцентных тестов с некоторыми общепринятыми биохимическими показателями в тех же образцах сыворотки

крови.

Так, при инфаркте обязательно определяют активность аспартатампнотрансферазы (ACT). В 31% случаев острого инфаркта заметных нарушений активности фермента не наблюдалось. Не было и заметной динамики этого показателя на протяжении трех суток наблюдения. В то же время флуоресцентные параметры зонда К-35 на 2-й и 3-й день поело инфаркта в 81-87% случаев выходили за пределы диапазона, характерною для группы доноров, а в сочетании с параметров ХС+ТГ, измеренным другим флуоресцентным зондом, - в 100% случаев. Более того, эти изменения нарастали на протяжении трех суток наблюдения.

По-видимому, изменения свойств связывающих центров альбумина - характерное проявление инфаркта миокарда, чего нельзя сказать о таком широко распространенном биохимическом показателе крови как активность ACT.

Другой исследованный биохимический показатель - уровень билирубина. Билирубин, занимая альбуминовые центры, способен снижать параметры ЭКА и ЭКА/ОКА, что наблюдается, например, при желтухе различного генеза /¿Миллер Ю.И., 1991/. Однако после инфаркта уровень билирубина в 18 образцах сыворотки крови составил в среднем 9±1 .нкМ и ни в одном образце не превышал границу нормы (20 мкМ). При концентрации билирубина 20 мкМ всего лишь одна молекула билирубина приходится на 35 молекул альбумина. Очевидно, что билирубин не является причиной наблюдавшихся изменений связывающих центров альбумина после инфаркта.

Уровень билирубина, как общепринятый биохимический показатель, существует для объективной характеристики состояния больного при гепатите и циррозе печени. В группе гепатита 62% пациентов, как и доноры, имели нормальный уровень билирубина, и лишь у 38% пациентов билирубин был выше нормы. Между тем индекс токсичностй в этой группе был высоким (выше 0,2) у 90% больных.

Следовательно, при гепатите флуоресцентный метод оказывается более чувствительным к наличию заболевания, чем Общепринятый биохимический метод определения б;ширубина.

Это наводит на мысль о том, что диагностическая

информация, которую можно получить флуоресцентным методом, не дублирует ту информацию, которую получают биохимическим определением билирубина. Подтверждением служит рис.4. 4где по горизонтальной оси отложен уровень билирубина, в но вертикальной - величина ЭКА/ОКА в группе гепатита. Хотя очевидно, что билирубин у большинства пациентов повышен, а ЭКА/ОКА - снижен, тем не менее корреляции этих двух параметров не наблюдается. То есть эти два показателя не идентичны, они по-разному отражают нарушения транспортной функции альбумина прн гепатите.

Аналогичная ситуация наблюдается и для группы больных цирродом печени. . . г

100

80

в

о *

а 40

о <

% 20 о

Билирубин, мкмоль/л

Р1Ю.4. Уровень билирубина п параметр ЭКА/ОКА в группа больных гепатитом

Параметры связывающих центров альбумина, ответственные за изменения флуоресценции Зонда К-33 при ряде заболеваний

человека

Известно, что интенсивность флуоресценции зонда К -35 в образцах сыворотки больных изменяется. В настоящей работе предстояло выяснить, что является непосредственной причиной изменений:

- конкуренция с метаболитами, занимающими связывающие центры альбумина, которая приводит к снижению либо количества доступных зонду центров (N1), либо константы связывания зонда с доступными центрами (К),

- или снижение квантового выхода флуоресценции молекул зонда, обязавшихся с альбуминовыми Центрами.

В результате проведенных исследований показано, что связанный с альбумином Зонд в группе инфаркта имеет в среднем на 18% более ННзкИй Выход флуоресценции, чем у доноров. В группе больных стенокардией этот параметр снижен по сравнению с донорами - на 9%, в группе гепаттгга - на 4%, в группе цирроза - на 21%, сепсиса - на 4%, травмы - на 32% (табл.1.).

Таблица 1

Величины ЭКА/ОКА и выхода флуоресценции связанного с альбумином зонда К-35 (выход характеризуется величиной 0*СЗ) в группах пациентов с различными заболеваниями ___

Группы Число измерений ОКА,г/л ЭКА/ОКА,% D*Q Доля случаев с D*Q <55

Доноры 15 40±1 91±5 68+3 0

Гепатит 37 38±2 69±2 65±5 15

Цирроз 10 35+4 62±3 54+6 100

Сепсис 9 43±3 78±2 65±5 11

Травмы 10 30+1 54±3 • 46+4 80

Инфаркт 107 36±1 72tl 56±2 45

Стенокардия 22 41+1 76+1 62±3 90

Обгеружто, то щи jraMfflbix зйЕот цр снижен герамлр, проставляющий собой опюшяок ЭКАДЖА, снижен

и нычол флуоресценции связанного с альбумином зоила.

Па рис.5 представлена снял, между срслними значениями параметра ЭКА/ОКА и квантовым выходом, умноженным на риборпую константу (0*0), ио всех исследованных группах нацистов. Пидиа определенная корреляция между этими величинами с коэффициентом линейной корреляции г = 0,54. По-видимому, ли данные позволяют предполагать, что главное явление, которое исследовалось в работе - а именно, снижение флуоресценции К-35 в альбумине при ряде заболевании - может быть в значительной степени обусловлено не конкуренцией зонда с метаболитами за центры связывания, а снижением кнанюного выхода флуоресценции зонда, связанного с этими альбуминовыми центрами, в результате каких-то нарушений структуры связывающих центров при этих заболеваниях.

Однако такая взаимосвязь параметров ЭКА/ОКА и 0*0 не наблюдается для индивидуальных значений. Это было проверено на группе пациентов с сочетаииой черепно-мозговой травмой, поскольку в ней средние значения 0*0 и ЭКА/ОКА в наибольшей степени отклонялись от средних значений в группе доноров и поэтому вносили весьма ощутимый вклад в величину коэффициента корреляции (г;. Данные, представленные на рис.6, показывают, что хотя при травме у всех 10 пациентов сильно снижены и ЭКА/ОКА, и 0*0, корреляции между этими величинами не наблюдается.

Другим фактором, определяющим величину интенсивности флуоресценции К-35 в сыворотке, является концентраций связывающих центров альбумина.

Показано, что концентрация центров связывания остается практически неизменной При всех видах патологий по сравнению с донорам». Исключение составляет только группа сепсиса, где наблюдается достоверное ( р<0,001) снйжеНйе концентрации альбуминовых цеИ1рой на 18 % По сраЬНейию с группой доноров.

Концентрацию альбумина в сыворотке, как праййло, измеряют По связыванию альбумином красителей (обЫчНсв эромкрезолового зеленого Или Пурпурного). "Таким Ьб{Мзом, предполагается, Что количество Центров свяЗЫИанЙй этйх <расйтелей, приходящееся на 1 молекулу альбумина, одинаково в иобой сыворотке. Измерение ЬбЩеЙ концентрации аЛЬбуМйна

(ОКА) флуоресцентным методом /Грызунов Ю.А., 1994/ полностью коррелирует с определением альбумина с помощью бромкрезоловото пурпурного.

Поскольку величины N оказались очень близкими в разных группах пациентов, а величины ОКА в них несколько различались, то формально получилось, что среднее количество центров в одной молекуле альбумина не одинаково, снижаясь при сепсисе на 25 % и, наоборот, возрастая при травме на 31%.

В-среднем на 1 молекулу альбумина приходится 1,3 ±0,1 центров связывания К-35. Эта величина практически одинакова как у больных инфарктом, так и у доноров. Она близка к величине 1,7 ± 0,4, полученной ранее для альбумина доноров точными методами /РоЬге^оу в/Уе., 1996/.

Подобно концентрации центров связывания (Г>)), которая оказалась почти одинаковой во всех группах пациентов, константа связывания также остается практически неизменной при различных заболеваниях по сравнению с донорами. Исключение составила только группа гепатита, где наблюдается небольшое, но достоверное (р<0,001) снижение константы связывания по сравнению с группой доноров.

Таким образом, конкуренция с метаболитами, занимающими связывающие центры альбумина, не является непосредственной причиной изменений интенсивности флуоресценции зонда К-35 в образцах сыворотки больных. Эти изменения вызваны, главным образом, снижением квантового выхода флуоресценции молекул зонда, связавшихся с альбуминовыми центрами.

По-видимому, непосредственной причиной снижения квантового выхода флуоресценции молекул К-35, расположенных в альбуминовых центрах связывания, может быть увеличение проникновения молекул воды в эти центры. Вода гушит флуоресценцию К-35. Полагают, что при связывании с альбумином молекула К-35 становится недоступной воде, что и является причиной роста ее флуоресценции в десятки раз /Добрецов Г.Е., Миллер Ю.И., 1994/. Можно предполагать, что при нарушениях функций организма конформацня "альбуминовых центров изменяется так, что в них начинает проникать вода, которая частично тушит флуоресценцию К-35.

О' *

о

я

X

4) Л

о

г: -о-

Ч о X

А «

« 3

(Я

о н К

а «

К

О 20 40 60 80 (ЭКЛ/ОКЛ)*ЮО%

СУ *

о

Рис. 5. Связь квантового выхода с (ЭКЛЮКА)МОО % для сред них значений в группах доноров, инфаркта, стенокардии, гепатита,сепсиса, травмы, шфроэа

к а и

«и

я

а

<и

«ч

о-' >>

•в*

1

ч

о ' х

з

я

и о

80-

Л 1-1--Г-т

О 20 40 60 80

(ЭКА / ОКА )*100 %

Рис.6. Связь квантового выхода с (ЭКЛЮКЛ)Моо% в груцпс стравмами (п=10). . .. ,г- "

выводы

1. Исследовано взаимодействие альбумина с молекулами флуоресцентного зонда К-35 в сыворотке крови здоровых людей и у больных с нарушениями функций организма: гепатитом, циррозом печени, стенокардией, инфарктом миокарда, острым сепсисом и сочетанной черепно-мозговой травмой. Измерялись. три показателя, характеризующие это взаимодействие:

- количество центров в каждой молекуле альбумина, доступных зонду, , . -

- константа связывания ими зонда К-35 и

- конформацпонное состояние центра, влияющее на квантовый выход флуоресценции связанных молекул К-35.

2. Показано, что при исследованных заболеваниях свойства молекул альбумина изменяются таким образом, что все три показателя становятся гораздо более вариабельными, чем это наблюдается в группе доноров. В результате у больных удельная флуоресценция К-35, приходящаяся в среднем на каждую молекулу альбумина в сыворотке, как правило выходит за пределы диапазона, характерного для доноров. Это наблюдалось в 81-87% случаев сердечно-сосудистых заболеваний и в 78-100% случаев гепатита, цирроза, сепсиса и травмы.

Рост вариабельности сопровождается снижением среднего значения удельной интенсивности флуоресценции К-35 при каждом из этих заболеваний.

.3. Основной причиной снижения удельной флуоресценции К-35 в целом по всей совокупности данных можно назвать конформационные изменения связывающих центров альбумина, отражающиеся на квантовом выходе флуоресценции. По-видимому, молекула К-35, расположенная в связывающем центре альбумина, становится более доступной молекулам воды.

Константа связывания альбумином зонда К-35 в среднем по каждой группе пациентов не испытывала значительных изменений.

Число доступных зонду связывающих центров в каждой молекуле альбумина варьировало так, что в среднем " увеличивалось при одних заболеваниях и уменьшалось при

других.

Таким образом, способиоси. альбумина сыворотки связывать молекулы К-35 в среднем не изменялась при исследованные нарушениях функции организма, тогда как конформаиия связывающих центров заметно изменялась.

4. Показано, что изменение свойств связывающих центров альбумина происходит не только п сыворотке венозной крови, но и в плазме капиллярно!! крови. Для обнаружения этих изменений зондом К-35 достаточно 20 мнкролнтрон капиллярной плазмы. Это обстоятельство может цредсышвдь .интерес для педиафнн н в ряде других случаев. г

5". Обнаружено, что аллостерическое влияние пеэстерифицпрованных жирных кислот на связывающие центры альбумина может изменяться при гепатите и сердечнососудистых заболеваниях.

6. Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, чго при различных нарушениях функций организма в молекуле альбумина происходят конфорчанпонные перестройки. Эти перестройки могут быть обнаружены с помошыо флуоресцентного зонда ,К-35 как в венозной, так и в капиллярной крови.

Они имеют три характерные особенности: -способность молекул альбумина связывать зонд (К-35 у больных людей испытывает резкие отклонения от диапазона, свойственного здоровым людям, однако в,цредцем связывающая способность альбумина сыворотки остается такой же, как и у здоровых людей;.

-наряду с этим происходят конформацнонные изменения связывающих центров, приводящие к снижению интенсивности флуоресценции К-35. Они выявляются у большинства пациентов. Вероятно, молекула К-35 п альбуминовых центрах становится более доступной молекулам воды;

-аллостерическое влияние неэстерифицнрованных жирных кислот на альбуминовые центры, связывающие зонд К-35, можег значительно возрастать при некоторых нарушениях функций организма.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Андреева O.J1.. Добрецов Г.П., Шмелева J1.Ï., Габинскнй ЯЛ., Шелягина Е.Д. Нарушения транспортной функции альбумина и их контроль методом флуоресцентных зондов при остром инфаркте миокарда // Вестник УРГМА. -1995. - вын.1. - С.58-М).

2. Андреева О.Л., Осадчая H.A., Шмелева J1.T., Рожденственская Е.Д. Эф||)ектнвная копцешрация альбумина и липнды крови при гепатше // Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. Под ред. Ю.А. Грызунова и Г.Е. Добрсцова. М.: Ириус, - 1994. - С.189-191.

3.Андреева О.Л.. Шмелева Л .Т., Добрецов Г.Е. Нарушение транспортной функции альбумина и их контроль флуоресцентным методом при гепатите и циррозе печени // Эфферентная терапия. - 1995. - N3. - С.

4. Андреева О.Л., Баранова C.B., Ястреб Ж.Ю. Выявление гиперлипидсмии при обследовании работников крупного промышленного предприятия // Флуоресцентные методы исследования и клинической диатостнки. - 1991. -выи.2 -С.36-37.

5. Шмелева Л.Т., Андреева О.Л., Турина Л.Д., Ларионов Л.П., Юшков Б.Г. Опенка радиоиротекторных свойств препаратов золотого корпя и чаги в эксперименте по показателям эффективной концентрации альбумина и антиоксплаиюв // Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. Под ред. Ю.А. Грызунова и Т.Е. Добрепова. М.: Ириус, 1994. - С. 112-115.

6 Андреева О.Л., Осадчая H.A., Шмелева Л.Т., Рождественская Е.Д. Особенности обмена альбумина у лиц с вирусным renal том в анамнезе // Тезисы докл. науч. конф. " 30 лет ЦНИЛ УГМ11" - 1994. - С. 3-4.

7 Осадчая H.A., Андреева О.Л., Рождественская Т.Д., Шмелева Л.Т. Перенесенный вирусный гепатит как возможная причина формирования стойких вторичных нарушении лнпидпого обмена // Там же .- С. 38-39.

8.Андреева О.Л. Сравнительная оценка определения холестерина н триглицерндов методами флуоресцентных зондов и унифицированными // Там же.-С.1-2.