Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Латеральный проточный иммуноанализ кардиомаркёров для экспресс-диагностики острого инфаркта миокарда

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Латеральный проточный иммуноанализ кардиомаркёров для экспресс-диагностики острого инфаркта миокарда"

На правах рукописи

ЯКОВЛЕВА ЕЛЕНА АЛЕКСЕЕВНА

Латеральный проточный иммуноанализ кардиомаркёров для экспресс-диагностики острого инфаркта миокарда

03.01.06 — биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.01.04 - биохимия

г 8 НОЯ 2013

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва-2013

005539715

005539715

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научные руководители:

академик РАН, доктор биологических наук, профессор Егоров Алексей Михайлович

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Григоренко Виталий Георгиевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией иммунобиохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии имени А.Н.Баха РАН Дзантиев Борис Борисович

доктор биологических наук, заведующая лабораторией фосфолипидных нанолекарств и транспортных систем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича РАМН

Ипатова Ольга Михайловна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение Институт экспериментальной кардиологии Российского

кардиологического научно-производственного комплекса, г. Москва

Защита состоится «17» декабря 2013 года в 15-00 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «15» ноября 2013 года

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 501.001.59 кандидат химических наук

Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Лабораторная диагностика является неотъемлемой частью современной медицины, без которой немыслима полноценная врачебная помощь. Методы лабораторной диагностики довольно многочисленны и продолжают активно развиваться. Широкое применение в клинической диагностике нашли иммунохимические методы, в частности, методы иммуноферментного анализа. В течение последнего десятилетия в мировой аналитической практике очень интенсивно развиваются иммунохимические методы экспресс-анализа, которые приходят на смену стандартным методам иммуноферментного анализа благодаря своим преимуществам - простоте выполнения, возможности проведения анализа во внелабораторных, а зачастую и в домашних условиях, отсутствию необходимости использования дорогостоящих приборов, высокой чувствительности, возможности визуальной регистрации результатов анализа, низкой стоимости и т.д. Наиболее распространенным вариантом является метод латерального проточного иммуноанализа (ЛПИА), также известный как иммунохроматографический анализ (ИХА). Данный вид анализа осуществляется при помощи индикаторных полосок, содержащих все необходимые для анализа компоненты в готовом виде. В качестве метки используются наночастицы золота, позволяющие визуально детектировать результаты анализа.

Методы иммунохроматографического анализа наиболее подходят для определения веществ, содержание которых в норме незначительно или отсутствует, и значительно возрастает при развитии патологии. К таким веществам относятся кардиомаркеры, определение которых является актуальным для диагностики различных сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе острого инфаркта миокарда (ОИМ). Развитие ОИМ сопровождается обширным разрушением кардиомиоцитов и выбросом в кровь многих специфических белков.

В настоящее время наиболее предпочтительными биохимическими маркерами повреждения миокарда являются тропонины вследствие их абсолютной кардиоспецифичности. При повреждении миокарда повышенная концентрация тропонина в крови обнаруживается через 3-4 часа, пик приходится на 3-4 сутки, и она остается повышенной до 7-10 дней. Однако определение тропонинов не подходит для ранней диагностики ОИМ, поэтому наряду с исследованиями тропонинов рекомендуется определять ранние миокардиальные маркеры.

Автор выражает искреннюю благодарность доценту кафедры химической энзимологии, к.х.н. Осипову А.П. и н.с., к.х.н. Андреевой И.П. за участие в постановке задач и обсуждении результатов.

Выбор второго объекта исследования - белка, связывающего жирные кислоты (с-БСЖК), обусловлен актуальностью проблемы ранней и точной диагностики острой ишемической болезни, включая острый инфаркт миокарда, в современной кардиологии. В настоящее время ни один из известных методов не гарантирует надежной диагностики ОИМ на ранней стадии болезни. Так, например, до 25% всех ОИМ не вызывают никаких изменений на кардиограмме (ЭКГ), от 20% до 30% всех случаев ОИМ протекают без болевого приступа, особенно у пожилых, а также больных диабетом и гипертонической болезнью. Недавно в качестве нового биохимического маркера ранней диагностики ОИМ был предложен с-БСЖК. Было показано, что при повреждении миокарда, подобно миоглобину, концентрация с-БСЖК в крови значительно повышается в течение 3 часов после появления симптомов ОИМ и возвращается к нормальному уровню через 12-24 часа. Этот факт, а также хорошая тканеспецифичность в сравнении с миоглобином, делают с-БСЖК перспективным маркером ранней диагностики ОИМ.

Одновременное определение с-БСЖК и тропонина I повышает эффективность диагностики ОИМ на ранних стадиях, позволяет определить скрытые формы инфаркта.

В настоящее время на отечественном рынке экспресс тест-системы на основе ЛПИА, в основном, представлены продукцией зарубежных производителей. В связи с этим актуальным с точки зрения потребности практики и развития технологической и реагентой базы является проведение исследований по созданию практически значимых аналитических систем отечественного производства на основе латерального проточного иммуноанализа.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение основных принципов создания тест-систем на основе латерального проточного иммуноанализа для определения концентрации белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина I, а также их совместного одновременного определения в сыворотке и цельной крови.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

• получение и характеристика наночастиц золота;

• изучение условий стабильности золотых наночастиц и конъюгатов с антителами на их основе;

• изучение влияния мембран, размера наночастиц золота, соотношения антител на чувствительность и специфичность иммунохроматографического анализа;

• оптимизация условий проведения иммунохроматографического анализа с-БСЖК и тропонина I;

• оптимизация условий проведения совместного одновременного анализа с-

БСЖК и тропонина I;

• апробация разработанных тест-систем на образцах крови пациентов.

Научная новизна. Разработаны основные подходы к созданию

иммунохроматографических тест-систем с использованием наночастиц золота для определения концентрации белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина I для диагностики острого инфаркта миокарда. Изучено влияние свойств мембран, размера наночастиц золота на результаты проведения иммунохроматографического анализа, определены оптимальные соотношения антител, иммобилизованных на мембране и меченых наночастицами золота, условия сорбции антител на наночастицах золота.

В результате выполнения данной работы были разработаны высокочувствительные методы для определения с-БСЖК и тропонина I с использованием в качестве визуальной метки наночастиц золота.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований созданы тест-системы для индивидуального определения с-БСЖК, тропонина I, а также для их совместного одновременного визуального экспресс определения.

В проведенных исследованиях была показана возможность определения с-БСЖК и тропонина I в сыворотке и цельной крови практически здоровых людей и пациентов с диагнозом острого коронарного синдрома. Было показано, что разработанные тест-системы обладают высокой чувствительностью и специфичностью для диагностики острого инфаркта миокарда на ранних стадиях. Разработанные экспресс тест-системы можно использовать в клинико-диагностических лабораториях медицинских учреждений кардиологического профиля, а также отделениях скорой помощи и кардиореанимации для подтверждения или опровержения диагноза острого инфаркта миокарда на ранних и более поздних стадиях заболевания.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнология: проблемы и перспективы» (Белгород, 2010), VI Всероссийской конференции-школе «Высокореакционные интермедиаты химических и биохимических реакций» (Москва, 2011), 5м Конкурсе проектов молодых ученых в рамках 16й международной специализированной выставки «Химия-2011» (Москва, 2011), VII Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2013), XVIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013» (Москва,

2013), Международной конференции «Биокатализ-2013: Фундаментальные основы и применение» (Москва, 2013).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 работ, в том числе 2 статьи в отечественных журналах из Перечня журналов ВАК, 6 тезисов докладов международных и российских конференций.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (главы 1 и 2), экспериментальной части (глава 3), описывающей материалы и методы исследования, результатов и обсуждения (главы 4-8), выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 121 странице, содержит 10 таблиц и 62 рисунка. Список литературы включает 134 ссылки.

Используемые сокращения. ИФА - иммуноферментный анализ, ЛПИА -латеральный проточный иммуноанализ, ИХА - иммунохроматографический анализ, БСА - бычий сывороточный альбумин, ЗХВК - золотохлористоводородная кислота, МАт - моноклональные антитела, НЧЗ - наночастицы золота, ОИМ - острый инфаркт миокарда, ПАт - поликлональные антитела, с-БСЖК - белок, связывающий жирные кислоты из сердца человека, Тн1 - тропонин I, ФБ - 0,01 M К-фосфатный буфер, рН 7,4; ФБС - 0,01 M К-фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 M NaCl; ФБСТ - 0,01 M К-фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 M NaCl, 0,1% Твин-20.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Материалы исследования. В работе были использованы моноклональные антитела к с-БСЖК: MAt<F9>, MAt<F10>, поликлональные антитела к с-БСЖК ПАт<К-5>, ПАт<К-10>; Тн1; моноклональные антитела к Тн1: Мат<1С-19>, МАт<1-18>, MAt<IF7>, МАт<1-60> («Биалекса», Россия); с-БСЖК; антивидовые антитела овцы против IgG мыши, антивидовые антитела овцы против кролика (ЗАО «НВО Иммунотех», Россия).

Были использованы следующие мембраны: аналитические нитроцеллюлозные мембраны - CNPF (размер пор 10 ц), CNPC (размер пор 15 ц), 150-CNPH-N; мембрана для нанесения конъюгата - РТ-5 (MDI, Индия); мембраны для нанесения образца - GFB-R7L, GFB-R4, FR1(0,6), FR1(0,35), FR2, WFR1 («MDI», Индия), MAPDS-0300 («Arista Biologicals», США), CFSP223000 («MilliPore», Франция); впитывающая мембрана - АР045 («MDI», Индия).

Образцы сывороток крови были предоставлены клиническими больницами №50 и №67. Данные по результатам определения с-БСЖК в сыворотке крови методом ИФА были предоставлены ЗАО «НВО Иммунотех».

Определение концентрации Тн1 в сыворотках крови проводилось с помощью набора для иммуноферментного анализа «Troponin-ELISA» («Biomerica», США) согласно инструкции производителя.

Методы исследования.

Наночастицы золота получали по методу Френса (Frens G., 1973). К 100 мл кипящего раствора 0,01% ЗХВК при перемешивании добавляли необходимое количество 1%-ного водного раствора цитрата натрия. Раствор кипятили еще 15 минут, затем охлаждали и хранили при температуре +4°С в темном месте.

Определение оптимальных условий сорбции антител на наночастицах золота

В лунки планшета вносили по 200 мкл растворов коллоидного золота с соответствующими значениями рН от 5,5 до 9,0 и по 20 мкл растворов антител с концентрациями 0, 30, 60, 120, 180, 360 мкг/мл в деионизованной воде. Планшет инкубировали 15 мин при перемешивании и добавляли по 50 мкл 10%-го раствора хлорида натрия. Измеряли оптическое поглощение в лунках планшета на длинах волн 520 и 580 нм.

Получение конъюгата наночастиц золота с антителами

К 10 мл раствора наночастиц золота с рН 7,5-8,0 добавляли по каплям при перемешивании 1 мл раствора антител с выбранной концентрацией, перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем последовательно добавляли раствор БСА до конечной концентрации 0,2% и сахарозу до конечной концентрации 10%. Для удаления несвязавшихся антител конъюгат центрифугировали 30 минут при 11000g и температуре +4'С. Супернатант удаляли, осадок суспендировали в требуемом объеме ФБ, содержащего 0,1% БСА, 10% сахарозы и 0,01% азида натрия.

Изготовление иммунохроматографической тест-полоски

На аналитическую нитроцеллюлозную мембрану, наклеенную на пластиковую основу (260x75 мм), наносили раствор специфических антител в ФБС с помощью программируемого автоматического диспенсера BioDot XYZ 3050 (BioJet Quanti 3000, BioDot, США) для формирования аналитической зоны и раствор антивидовых антител овцы против мыши или овцы против кролика с концентрацией 1 мг/мл для формирования контрольной зоны. Высушивание проводили в течение 24 ч при +37'С.

Растворы конъюгатов антител с наночастицами коллоидного золота наносили на мембраны РТ-5 и высушивали на воздухе при комнатной температуре.

На подложку с аналитической мембраной последовательно наклеивали мембрану с иммобилизованным конъюгатом РТ-5 (260x5 мм), впитывающую

мембрану и мембрану для образца (260x27 мм) (Рис.4) и резали на тест-полоски (4x75 мм).

Проведение иммунохроматографического анализа

На нижний край тест-полоски наносили пипеткой 30 мкл раствора анализируемого образца или стандартного раствора и помещали тест-полоски в лунки полистиролового планшета со 120 мкл ФБСТ. Через 20 минут тест-полоски доставали, помещали на горизонтальную поверхность, визуально оценивали результат и высушивали.

Для количественной оценки результатов анализа тест-полоски после проведения анализа сканировали, полученные изображения обрабатывали с помощью программы Scion Image для Windows, определяли интенсивность окраски полос в аналитической зоне и строили градуировочные графики зависимости интенсивности полос от концентрации антигена в анализируемом растворе.

Результаты и обсуждение

1. Получение наночастиц золота и конъюгатов антител на их основе

В разработанных тест-системах в качестве метки использовались наночастицы золота (НЧЗ), которые получали восстановлением ЗХВК цитратом натрия. В работе были получены 3 препарата наночастиц золота (15, 25 и 35 нм), отличающихся количеством добавленного восстановителя и, следовательно, размером частиц. При увеличении размера частиц, пик поглощения коллоидного раствора сдвигался в более длинноволновую область (с 518 до 526 нм), и цвет растворов, соответственно, менялся от оранжево-красного цвета у наименьшего размера частиц до пурпурного у коллоидного раствора золота с размером частиц 35 нм. На рис. 1 представлено изображение НЧЗ со средним диаметром частиц 15 нм, полученное методом сканирующей электронной микроскопии, и спектр поглощения, характерный для частиц данного размера.

Наночастицы золота были использованы для получения конъюгатов с антителами. Процесс получения антител, меченых наночастицами золота, представляет собой сложную задачу, связанную как с сохранением антигенной активности, так и обеспечением стабильности коллоидного раствора наночастиц золота, которая сохраняется только в условиях низкой ионной силы. Адсорбирующиеся на поверхности НЧЗ антитела образуют вокруг коллоидных частиц золота гидратные оболочки, которые препятствуют коагуляции НЧЗ. В связи с этим необходимо было подобрать оптимальное значение рН сорбции и минимальную стабилизирующую концентрацию антител. В настоящей работе были использованы два вида поликлональных антител (ПАт<К5>, ПАт<К10>) и два вида

Рис. 1. Фотография наночастиц золота со средним диаметром 15 нм (А) и спектр поглощения раствора наночастиц золота (Б).

моноклональных антител (МАт<Р9>, МАт<1:10>), специфичных к с-БСЖК, и 4 вида моноклональных антител(МАт< 1С-19>, МАт< 1Р-7>, МАт<1-18>, МАт<1С-60>), специфичных к Тн1. Для выбора оптимальных значений рН и концентрации антител проводили перекрестное титрование. К растворам коллоидного золота с разными значениями рН (от 5,5 до 9,0) добавляли специфические антитела с разной концентрацией (от 0 до 30 мкг/мл). При увеличении ионной силы раствора добавлением до 0,3 М раствора хлорида натрия происходила агрегация нестабилизированных наночастиц золота, что сопровождалось изменением цвета раствора с красного до серо-синего, вплоть до бесцветного. Стабилизированный антителами коллоидный раствор золота не изменял цвета при добавлении в раствор электролита. Для определения количественного эффекта стабилизации вычисляли разность оптических поглощений раствора при длинах волн 520 и 580 нм (А52о~Лпо) и по зависимости разности оптических поглощений {А52о~^5&о) от рН раствора и от концентрации антител определяли оптимальное значение рН сорбции и оптимальную стабилизирующую концентрацию антител. Для каждого вида имеющихся антител были подобраны оптимальные условия сорбции антител на НЧЗ (стабилизирующая концентрация антител и оптимальные значения рН сорбции). На рис. 2 представлены полученные данные для моноклональных антител МАт<Б10>, специфичных к с-БСЖК. Минимальная стабилизирующая концентрация антител определялась выходом кривой на плато, и для МАт<Р10> она составила 15 мкг/мл. Выбранные концентрации были одинаковы для всех размеров НЧЗ. На рис. 3 представлены зависимости разности оптических поглощений от значений рН для разных антител для выбранной концентрации. Для получения конъюгатов антител с наночастицами золота в качестве оптимального значения рН для всех видов антител

9

было выбрано рН раствора 7,0-^7,5. Исключение составили МАт<1-18>, для которых наблюдалась ярко выраженная колоколообразная зависимость разности оптического поглощения от рН раствора коллоидного золота, пик которой соответствует оптимальному значению рН сорбции и составляет 6,(Н6,5. Стоит отметить, что с увеличением концентрации добавляемых антител влияние рН раствора на стабилизацию, начиная с 8,0, уменьшается.

Рис. 2. Зависимости разности оптического поглощения от концентрации МАт<Р10> для разных значений рН раствора НЧЗ (15 нм).

рН

Рис. 3. Зависимости разности оптического поглощения от рН

для концентрации антител 15 мг/мл : 1 - МАт<Р 10>; 2 - МАт<Р9>; 3 - МАт<1С-19>; 4 - МАК1-18>.

2. Разработка иммунохроматографической тест-системы для определения с-БСЖК

Для разработки иммунохроматографической тест-системы для определения с-БСЖК использовалась сэндвич-схема анализа. На аналитической части мембраны в тестовой зоне были иммобилизованы специфические антитела к с-БСЖК. На мембране для конъюгата были иммобилизованы специфические антитела к с-БСЖК, меченые НЧЗ. В присутствии с-БСЖК в образце по мере продвижения вдоль мембраны происходит его взаимодействие с мечеными НЧЗ антителами и образование специфического иммунокомплекса. В тестовой зоне происходит связывание этого иммунокомплекса с иммобилизованными специфическими антителами, и наблюдается появление окрашенной полосы, интенсивность цвета которой пропорциональна содержанию анализируемого вещества в образце. Избыток несвязавшихся меченых антител мигрирует далее и в контрольной зоне взаимодействуют с вторичными антителами, где образуется вторая окрашенная линия. При отсутствии в исследуемом образце определяемого антигена, меченые золотом антитела задерживаются лишь вторичными антителами в контрольной зоне (рис. 4).

Мембрана Аналитическая мембрана

для образца / ^ Адсорбирующая

\1 щж мембрана

/ г \

Мембрана для конъюгата Тестовая линия Контрольная антител с НЧЗ "имия

Рис. 4. Строение иммунохроматографической тест-полоски для сэндвич-схемы анализа.

На первом этапе разработки метода ИХА с-БСЖК были исследованы различные пары антител, иммобилизованные в тестовой зоне мембраны и меченые 1 наночастицами золота, обеспечивающие максимальную чувствительность анализа с-БСЖК. Для каждой комбинации был проведен ИХА для стандартных растворов с- 2 БСЖК в ФБСТ (рис. 5) и построены градуировочные графики зависимости интенсивности полос (в условных единицах) от концентрации с-БСЖК в анализируемом растворе (рис. 6).

abc d e f g Рис. 5. Результаты определения стандартных растворов с-БСЖК: а - 0; b - 2,5; с - 5; d - 10; е - 20; f- 50; g- 100 нг/мл).

1 - контрольная линия, 2 - тестовая линия. Самая высокая чувствительность и аналитический сигнал были получены для пары моноклональных антител MAt<F10>, иммобилизованных на аналитической мембране 150-N-CNPH, и MAt<F9>, меченых наночастицами золота (рис. 6, график «1»). В случае использования поликлональных антител, иммобилизованных в тестовой зоне аналитической мембраны и меченых наночастицами золота, наблюдалось присутствие фонового сигнала и самая низкая чувствительность анализа. Возможно, это связано с тем, что меченые поликлональные антитела связываются с небольшой по размеру молекулой с-БСЖК, блокируя доступные эпитопы связывания. Для дальнейших экспериментов была выбрана пара антител:

МАт<Р10>, иммобилизованных в тестовой зоне мембраны, использованных для приготовления конъюгата с НЧЗ.

и MAt<F9>,

1 Иммобилизованные антитела в тестовой зоне Конъюгат антител с НЧЗ

2 MAT<F10> MAKF9>

3 ПАт<К5> MAKF9»

4 5 MAT<F9> MAt<F10>

ПАт<К5> MAT<F10>

ПАт<К5> ПАт<К10>

40 60 80

[с-БСЖК], нг/мл

Рис. 6. Градуировочные графики определения с-БСЖК, полученные для разных пар специфических антител.

Было показано, что на чувствительность анализа влияет размер НЧЗ, используемых в конъюгате с антителами. При увеличении размера частиц золота интенсивность аналитического сигнала возрастает, однако, при использовании

частиц с максимальным размером для выбранной пары антител наблюдался фоновый сигнал, связанный с неспецифической сорбцией на мембране.

Следующим этапом работы был выбор аналитических мембран, которые являются основными компонентами иммунохроматографической тест-системы. В работе было рассмотрено три вида нитроцеллюлозных мембран, отличающихся между собой по сорбционной емкости, скорости протекания жидкости и связывающей способности (рис. 7). Для мембран 150-N-CNPH и CNPC (15ц) была изучена зависимость интенсивности аналитического сигнала от времени анализа (рис. 8). Для мембраны CNPC, характеризующейся самой высокой скоростью протекания жидкости (100 сек/4 см), интенсивность аналитического сигнала через 10 минут после начала анализа в 2 раза превышала аналогичный показатель для мембраны 150-N-CNPH (150 сек/4 см). Для дальнейших экспериментов была выбрана мембрана CNPC, так как при схожих с 150-N-CNPH значениях аналитического сигнала мембрана CNPC обеспечивала более короткое время проведения анализа, что важно для экспресс-диагностики.

25

1 2

ч

о

d 3

о >.

CI 15 ф

с

8. «

О 20 40 60 80 100

[с-БСЖК], нг/мл

Рис. 7. Градуировочные графики, полученные для аналитических мембран: 1 - CNPF (Юр); 2 - 150-N-CNPH; 3 - CNPC (15ц).

20 30 40

время, мин.

Рис. 8. Зависимость интенсивности аналитического сигнала от времени анализа для мембран: 1 - 150->1-СЫРН; 1 - СЫРС (15 ц) для концентрации с-БСЖК 20 нг/мл.

Далее было изучено влияние структуры мембран для нанесения образца на результаты анализа. Основная функция мембраны для нанесения образца состоит в отделении компонентов, входящих в состав анализируемых образцов, которые могут оказывать влияние на чувствительность и специфичность анализа. Кроме того, эта мембрана должна обеспечивать свободное протекание образца и не должна адсорбировать белок. Наибольший аналитический сигнал и максимальная

чувствительность были получены для стекловолоконной мембраны МАРОЗ-ОЗОО, отличающейся по структуре от остальных исследуемых мембран, но в данном случае наблюдался значительный фоновый сигнал, поэтому для дальнейших исследований была выбрана целлюлозная мембрана ОРВ-Я7Ь (рис. 9). Кроме того, были выбраны оптимальные концентрации антител, сорбированных на фазе, а также антител в составе конъюгата с НЧЗ.

На рис. 10 представлен градуировочный график определения с-БСЖК в стандартных буферных растворах. Предел обнаружения при визуальной детекции через 20 минут составил 10 нг/мл, при инструментальной детекции — 3 нг/мл. Для стандартных растворов с-БСЖК с концентрациями 2,5 - 100 нг/мл коэффициенты вариации составили 1,6-8,5%.

20 40 60

[с-БСЖК], нг/мл

35

30-

25-

2 ч 0> 20-

3 с и 16-

-т 4 —

10-

100 0-

40 60 80

[с-БСЖК], нг/мл

Рис. 9. Градуировочные графики, полученные для мембран для нанесения образца: 1 - МАЮв-ОЗОО; 2 - СРВ-Я7Ь; 3 - ОРВ-Я4; 4 - СР8Р223000.

Рис. 10. Типичный градуировочный график для определения с-БСЖК в ФБСТ.

Одна из задач настоящей работы заключалась в создании тест-системы для определения с-БСЖК как в сыворотке крови, так и в цельной крови. Это позволило бы легко и быстро проводить анализ не только в лабораторных условиях, но и в условиях скорой помощи, в отделениях кардиореанимации, а также у постели больного. В связи с этим на основе разработанной ранее тест-системы были проведены эксперименты по определению с-БСЖК в сыворотке и цельной крови человека методом ИХА с наночастицами золота в качестве метки. Градуировочные зависимости, полученные для стандартных растворов с-БСЖК в ФБСТ и сыворотке, не содержащей с-БСЖК, показали, что в случае проведения анализа в сыворотке крови уровень максимального сигнала выше по сравнению с аналогичными

14

условиями анализа в буферном растворе, что свидетельствует о влиянии компонентов сыворотки крови на результаты анализа (рис. 11).

Для проведения анализа с-БСЖК в цельной крови человека в первую очередь необходимо было подобрать мембрану для нанесения образца, которая позволяла бы задерживать клетки крови и не пропускать их в аналитическую зону. Кроме того, при выборе мембран необходимо учитывать время протекания жидкости и степень вытекания на аналитическую зону клеток, так как это приводит к помутнению протекаемой плазмы и появлению фонового сигнала, что затрудняет визуальную детекцию результатов.

Было изучено 5 видов целлюлозных мембран, предназначенных для фильтрации клеток крови, отличающихся структурой, толщиной и способом применения - FR1(0,35), FR1(0,6), FR2(0,35), FR2(0,7), WFR1. Из всех представленных мембран только мембраны FR1(0,6) и FR1(0,35) хорошо отделяли эритроциты от плазмы и не пропускали их на аналитическую часть мембраны. Однако при использовании мембраны FR1(0,35) скорость протекания крови была значительно ниже, поэтому для дальнейших экспериментов была выбрана мембрана FR1(0,6).

Градуировочные графики, полученные для стандартных растворов с-БСЖК, приготовленных в сыворотке крови и в цельной крови, не содержащей с-БСЖК, с использованием мембраны FR1(0,6) незначительно отличались друг от друга, и на результаты анализа это не оказывало существенного влияния (рис. 12).

[с-БСЖК], нг/мл

Рис. 11. Градуировочные графики, полученные для стандартных растворов с-БСЖК, приготовленных: 1 - в сыворотке крови; 2 - в ФБСТ.

[с-БСЖК], нг/мл

Рис. 12. Градуировочные графики, полученные для стандартных растворов с-БСЖК, приготовленных: 1 - в сыворотке крови; 2 - в крови, с использованием мембраны 1(0,6).

Таким образом, была разработана иммунохроматографическая тест-система для определения с-БСЖК в сыворотке и цельной крови человека. Предел обнаружения разработанного метода составил 2 нг/мл с-БСЖК в анализируемом образце, метод характеризуется хорошей воспроизводимостью результатов (относительное стандартное отклонение не превышало 4%). При визуальной детекции результатов через 20 минут предел обнаружения составил 10 нг/мл, что соответствует верхней границе норме определения с-БСЖК, и полностью удовлетворяет задачам диагностики ОИМ. Разработанная тест-система стабильна в течение 12 месяцев при хранении при +4°С и может быть использована для быстрого качественного определения уровня с-БСЖК в клинической практике. Время проведения анализа составляет 20 минут.

3. Разработка иммунохроматографической тест-системы для определения тропонина I

Целью следующего этапа была разработка иммунохроматографической тест-системы для определения Тн1.

Для выбора пары антител, обеспечивающих максимальную чувствительность анализа Тн1, были исследованы различные комбинации имеющихся в распоряжении антител (рис. 13). Из всех вариантов была выбрана пара антител: иммобилизованные моноклональные антитела МАт<1-60> и конъюгат НЧЗ (15 нм) с МАт<1С-19>, обеспечивающая максимальный аналитический сигнал.

Иммобилизованные антитела в тестовой зоне Конъюгат антител с НЧЗ (15 нм)

1 МАт<1-60> МАт<1С-19>

2 МАт<1С-19> МАт<1-60>

3 МАт<1-60> МАт<1-18>

4 МЛт<1С-19> МАк1-18>

[Тн1], нг/мл

Рис. 13. Градуировочные графики определения Тн1 для разных пар специфических антител. Аналитическая мембрана 150-Ы-СКРН, мембрана для нанесения образца МАРИЭ-ОЗОО.

Далее были проведены исследования по выбору аналитической мембраны и мембраны для нанесения образца. Самая высокая чувствительность при отсутствии

фонового сигнала была получена для аналитической мембраны СЫРС (15д) и для стекловолоконной мембраны для образца МАРОЭ-ОЗОО.

Было проведено сравнение конъюгатов антител, полученных с частицами золота диаметра 15 нм и 35 нм. При использовании НЧЗ с большим диаметром (35 нм) аналитический сигнал и чувствительность заметно повышались. Предел обнаружения увеличился в 1,5 раза и составил 0,02 нг/мл (рис. 14). При увеличении размера НЧЗ происходит увеличение коэффициента экстинкции (1ли X., 2007). Также при визуальной детекции результатов анализа человеческий глаз лучше воспринимает более контрастный темно-пурпурный цвет, характерный для большого размера золота, что связано с особенностями зрения человека. В дальнейших экспериментах для получения конъюгатов антител использовались НЧЗ диаметром 35 нм.

После оптимизации условий проведения анализа в буферном растворе было проведено изучение влияние компонентов крови на результаты определения Тн1. Проведенное сравнение стандартных градуировочных графиков ИХА в ФБСТ и в сыворотке крови показало, что матрикс-эффект оказывает значительное влияние на аналитический сигнал (рис. 15), что приводит к снижению минимально определяемой концентрации тропонина I в 5 раз.

1Е-3 0,01 0,1 1 10 100

(Тн|], нг/мл

Рис. 14. Градуировочные графики, полученные для конъюгатов антител МАт<1С-19> с золотом: 1 - диаметра 35 нм; 2 - диаметра 15 нм.

50 45

1Е-3 0,01 0,1 1 10 100

[Тн1], нг/мл

Рис. 15. Градуировочные графики, полученные для стандартных растворов Тн, приготовленных: 1 - в ФБСТ; 2 - в сыворотке крови.

На количественное определение концентрации Тн1 в крови может оказывать влияние ряд факторов, мешающих взаимодействию специфических антител с антигеном. Известно, что Тн1 в крови находится не в свободной форме, а в форме комплексов Тн1-ТнС и Тн1-ТнТ-ТнС, и образование подобных комплексов может

ухудшать связывание Тн1 с антителами (Кай-икЬа А., 1999). Было предложено использование комбинации нескольких моноклональных антител, иммобилизованных в тестовой зоне мембраны и меченых НЧЗ, специфичных к разным эпитопам молекулы тропонина I. Для выбранной ранее схемы в буферной системе - пары антител МАт<1С-60> - МАт <1С-19>, специфичных к центральному участку Тн1, - были составлены различные комбинации с добавлением антител МАк1-18> и МАт<1Р7>, специфичных к концевым участкам Тн1, и проведен ИХА для стандартных растворов Тн1 в сыворотке крови (рис. 16).

Использование смеси антител МАт<1С-60> и МАт<1-18> (1:1), иммобилизованных на мембране, и смеси меченых НЧЗ антител МАт<1С-19> и МАт<1Р7> (1:1) позволило значительно увеличить величину аналитического сигнала при определении Тн1 в сыворотке крови. Возможно, это связано с тем, что пара антител МАт<1-18> и МАт<1Р7> может связываться как со свободным Тн1, так и с Тн1, находящимся в комплексе. Однако самая высокая чувствительность наблюдалась при иммобилизации комбинации антител МАт<1С-60> и МАт<1-18> (1:1) и конъюгата только с МАт<1С-19>. Для всех других комбинаций результаты либо не отличались от ранее разработанной системы, либо были существенно хуже.

Иммобилизованные Коныогат

антитела в тестовой антител с НЧЗ

40- зоне (35 нм)

1 <1-60>+<1-18> <1С-19>

35-

<1-60>+<1-18> <1С-19>+<П'-7>

30-

25- / з / ж <1-60> <1С-19>

20- //4 <1-60> <1С-19>+<1Р-7>

15- И/,5 <1-18> <Ш-7>

Рис. 16. Градуировочные графики, полученные для стандартных растворов Тн1, приготовленных в сыворотке крови, при использовании разных комбинаций антител.

Кроме того, было исследовано влияние разного соотношения иммобилизованных в аналитической зоне антител (МАК1-60> : МАт<1-18>) - 1:1, 1:3, 3:1, соответственно, на результаты анализа и показано, что при увеличении в соотношении количества МАК1-60> (от 1:3 до 3:1) наблюдалось увеличение аналитического сигнала.

По аналогии с тест-системой для определения с-БСЖК в сыворотке и цельной крови были изучены все возможные мембраны, предназначенные для фильтрации крови, и для определения Тн1 как в сыворотке, так и в цельной крови, была также выбрана мембрана ГШ (0,6).

Таким образом, была разработана иммунохроматографическая тест-система для определения Тн1 в сыворотке и цельной крови человека. При визуальной детекции результатов через 20 минут предел обнаружения метода составил 1,0 нг/мл, что сравнимо с пределом обнаружения уже существующих иммунохроматографических тест-систем для определения Тн1. При инструментальной детекции предел обнаружения составил 0,05 нг/мл, для стандартных растворов Тн1 с концентрациями от 0,05 до 30 нг/мл коэффициенты вариации составили 2,3- 10%.

4. Определение с-БСЖК и Тн1 в образцах сыворотки крови

С помощью разработанных тест-систем для определения Тн1 и с-БСЖК в сыворотке и цельной крови были проанализированы образцы сыворотки крови, взятых у пациентов с диагнозом ОИМ, с диагнозом нестабильная стенокардия, а также у здоровых людей. Кровь отбиралась в момент поступления в больницу и далее через 6-12 часов в течение 5-7 суток. Диагноз ОИМ был поставлен клинически и затем был подтвержден методами иммуноферментного анализа для определения с-БСЖК и Тн1.

Для определения с-БСЖК были проанализированы 94 образца сывороток крови, взятых у 14 пациентов с подтвержденным диагнозом ОИМ. Результаты определения с-БСЖК представлены в таблице 1. У 11 из 14 пациентов отмечалось повышенное содержание с-БСЖК уже при поступлении в больницу, а через 6 ч после поступления в больницу с-БСЖК определялся у всех пациентов. К концу вторых суток повышенный уровень с-БСЖК сохранялся только у 5 пациентов. Все результаты коррелировали с данными, полученными методом ИФА. Таким образом, чувствительность тест-системы для определения с-БСЖК (доля истинных положительных случаев среди пациентов с диагнозом ОИМ) при поступлении в больницу составила 78%, а через 6ч- 100%.

При анализе 25 образцов сыворок крови, взятых у здоровых людей, а также образцов сывороток крови, взятых у пациентов с диагнозом нестабильная стенокардия (N=32), в аналитической части тест-полоски наблюдалась одна контрольная полоса, что свидетельствует о том, что концентрация с-БСЖК в них была ниже предела обнаружения нашего метода. Для одного пациента с диагнозом нестабильная стенокардия был выявлен один ложноположительный результат.

Таблица 1. Результаты определения с-БСЖК в сыворотках крови пациентов с

диагнозом ОИМ методом ИХА.

Пациент При поступлении Через 6 ч Через 18 ч Через 24 ч Через 48 ч Через 3 суток Через 4 суток Через 5 суток Через 7 суток Через 14 суток

67-004 + + + + + + + + - -

67-006 + + - - - - - - - -

67-007 - + + - - - - - - -

67-009 + + + + + - - - - -

67-010 + + + + + - - - - -

67-013 - + + + + - - - - -

67-014 + + + + - н/д н/д н/д н/д н/д

50-010 - + + - - н/д н/д н/д н/д н/д

50-013 + + н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д

50-020 + + н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д

50-028 + + + - - н/д н/д н/д н/д н/д

50-031 + + - - - н/д н/д н/д н/д н/д

50-036 + + - - - н/д н/д н/д н/д н/д

50-039 + + + + + н/д н/д н/д н/д н/д

Таблица 2. Результаты определения Тн1 в сыворотках крови пациентов с диагнозом ОИМ методом ИХА.

Пациент При поступлении Через 6 ч Через 18 ч г ^ V С. и В" Через 48 ч Через 3 суток Через 4 суток Через 5 суток Через 7 суток Через 14 суток

67-004 - + + + + + + - -

67-006 - + + - - - - - -

67-007 - + + + - - - - -

67-009 + + + + + + + + +

67-010 - + + + + + + + -

67-013 - - + + + - - - -

50-010 - + + + н/д н/д н/д н/д н/д н/д

50-028 - - + + + н/д н/д н/д н/д н/д

50-032 - + + + + н/д н/д + н/д н/д

50-039 - - + + н/д н/д н/д н/д н/д н/д

Условные обозначения:

"-" - отрицательный результат (отсутствие окрашенной полосы в тестовой линии); "+" - положительный результат (наличие окрашенной полосы в тестовой линии); н/д - нет данных.

Таким образом, специфичность теста (доля истинных отрицательных случаев) составила 97 %.

Для определения достоверности и надежности разработанного метода для определения Тн1 было проведено сравнительное определение концентрации Тн1 методами иммуноферментного и иммунохроматографического анализа. Сравнение полученных результатов показало хорошую сходимость данных, коэффициент корреляции составил Я=0,96 (N=52).

С помощью разработанного метода ИХА для определения Тн1 были проанализированы 79 образцов сывороток крови, взятых у 10 пациентов с подтвержденным диагнозом ОИМ, отобранные в различное время после наступления инфаркта миокарда (Таблица 2). При поступлении в больницу только у одного пациента был обнаружен Тн1. К концу первых суток (через 18-24 ч после наступления ОИМ) повышенное содержание Тн1 было обнаружено во всех образцах. У трех пациентов повышенный уровень Тн1 сохранялся до 5 суток, а у одного пациента-до 8 суток. Превышение порогового значения для Тн1 (1 нг/мл) наступает позже, чем для с-БСЖК. Чувствительность тест-системы для определения Тн1 составила 100% только через 18 ч после поступления в больницу.

При определении Тн1 в сыворотках крови, взятых у пациентов с диагнозом нестабильная стенокардия (N=12), а также образцов сывороток крови, взятых у здоровых людей (N=25), результат теста был отрицательный. Специфичность теста для данной выборки составила 100 %.

Таким образом, с помощью разработанных экспресс тест-систем на основе латерального проточного иммуноанализа для определения с-БСЖК и Тн1 у всех проанализированных пациентов был подтвержден диагноз острого инфаркта миокарда (N=14 для с-БСЖК и N=10 для Тн1).

5. Разработка иммунохроматографической тест-системы для одновременного определения Тн1 и с-БСЖК

Основная цель работы заключаясь в создании иммунохроматографической тест-системы для совместного одновременного определения раннего кардиомаркера с-БСЖК и более позднего Тн1, что дает возможность увеличить эффективность диагностики ОИМ.

Было рассмотрено два варианта тест-систем, отличающихся последовательностью нанесения антител, специфичных к с-БСЖК и Тн1, на мембране: (1) - первыми на аналитической мембране иммобилизованы МАт к с-БСЖК, затем на расстоянии 5 мм от них МАт к Тн1, далее вторичные антитела, являющиеся контрольной зоной, и (2) - первыми иммобилизованы МАт к Тн1, далее МАт к с-БСЖК и затем вторичные антитела (рис. 17).

21

Сравнение двух вариантов тест-систем показало, что на результаты анализа

существенное влияние оказывает положение антител на мембране: чувствительность

анализа Тн1 значительно уменьшалась при проведении анализа на тест-полосках с

последовательностью антител в варианте (2), в случае с-БСЖК кривые практически

совпадали на начальном участке. 60

с-БСЖК

40 60 80 100

[Тн1, с-БСЖК], нг/мл

—м— вариант (1)

вариант (2)

Контрольная линия АнтителакТн! Антитала к с-БСЖК

Вариант 1

Контрольная линия Антитела к с-БСЖК Антитела к Тн(

Вариант:

Рис. 17. Градуировочный график, полученный для двух вариантов расположения антител на мембране.

В связи с этим было изучено влияние расстояния, на котором были иммобилизованы на мембране антитела, специфичные к Тн1, на кинетику образования в аналитической зоне тест-полоски тройного окрашенного комплекса, состоящего из иммобилизованных моноклональных антител, Тн1 и антител, меченых НЧЗ. Были изготовлены тест-полоски с антителами, нанесенными на различном расстоянии (14, 17, 20 и 22 мм) от начала аналитической зоны, и проведен иммунохроматографический анализ Тн! для стандартных растворов в сыворотке крови. В результате было показано, что аналитический сигнал повышался с увеличением расстояния иммобилизованных антител от начала аналитической зоны (Таблица 3). Это можно объяснить тем, что Тн1 требуется больше времени как на связывание с мечеными антителами, так и для образования тройного комплекса с антителами, иммобилизованными на мембране. Наибольший аналитический сигнал наблюдался в случае, когда антитела иммобилизованы на расстоянии 22 мм от края аналитической мембраны, что соответствовало положению антител к Тн1 в варианте (1). В дальнейших экспериментах были использованы тест-полоски, на аналитической части которых последовательно нанесены антитела к с-БСЖК, далее антитела к Тн1 и антивидовые антитела.

Таблица 3. Зависимость аналитического сигнала Тн1 от расстояния иммобилизованных антител на мембране (для концентрации Тн! 20 нг/мл).

Расстояние иммобилизованных антител, мм 14 мм 17 мм 20 мм 22 мм

Интенсивность аналитического сигнала, усл.ед. 5,3 6,5 9,6 11,9

Разработанная тест-система была апробирована с использованием 36 образцов сывороток крови, отобранных в разное время после наступления инфаркта, взятых у 6 пациентов с подтвержденным диагнозом ОИМ. В случае определения с-БСЖК не было выявлено ни ложноположительных, ни ложноотрицательных результатов. При определении Тн1 для одного образца (67-007, через 48 ч) был получен положительный результат, в то время как при индивидуальном определении Тн1 результат был отрицательным. Это может быть связано с тем, что в тест-системе для совместного определения с-БСЖК и Тн1 тестовая линия для Тн1 расположена дальше от начала аналитической зоны, и времени на образование комплекса Тн1 с антителами проходило больше, что приводило к увеличению аналитического сигнала. На рисунке 18 представлены результаты определения с-БСЖК (внизу) и Тн1 (вверху) в динамике пациента 67-009 с момента поступления в больницу в течение 3 суток.

Анализ 25 образцов сывороток крови, взятых у здоровых людей, а также образцов сывороток крови, взятых у пациентов с диагнозом нестабильная стенокардия, не выявил превышения пороговых концентраций с-БСЖК и Тн1, в аналитической части тест-полоски наблюдалась только одна контрольная полоса.

т Контрольная линия ТропонинI с-БСЖК

ж

Рис. 18. Результаты определения с-БСЖК и Тн1 у одного пациента с диагнозом ОИМ: а - при поступлении в больницу, б - через 6 ч, в - через 18 ч, г - через 24 ч, д — через 36 ч, е - через 48 ч, ж - через 72 ч.

ж § щ в» ш ж

1«. ЩгУ ■

» •

а б в г д е

Разработанная тест-система для совместного одновременного определения с-БСЖК и Тн1 может использоваться в клинико-диагностических лабораториях медицинских учреждений кардиологического профиля, а также отделениях скорой помощи и кардиореанимации для подтверждения или опровержения диагноза ОИМ на ранних и более поздних стадиях заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Изучены общие подходы к созданию тест-систем на основе латерального проточного иммуноанализа. Показано влияние свойств мембранных носителей и размера наночастиц золота на чувствительность и специфичность иммунохроматографического анализа. Определены условия получения конъюгатов антител с наночастицами золота, оптимальные концентрации антител, иммобилизованных на мембране и меченых наночастицами золота. Изучены условия проведения мультианализа.

2. Разработана иммунохроматографическая тест-система для количественного определения с-БСЖК в сыворотке и цельной крови. Предел обнаружения составил 2 нг/мл, коэффициент вариации не превышал 10 %.

3. Разработана иммунохроматографическая тест-система для количественного определения тропонина I в сыворотке и цельной крови. Предел обнаружения составил 0,05 нг/мл, коэффициент вариации не превышал 10 %.

4. Имунохроматографические тест-системы для определения с-БСЖК и Тн1 апробированы на образцах сывороток крови человека. Для пациентов с диагнозом острого инфаркта миокарда диагностическая чувствительность тест-системы составила 100% при проведении анализа через 6 часов после поступления в больницу для с-БСЖК и через 18 часов - для тропонина I; специфичность - 97% и 100% для с-БСЖК и тропонина I, соответственно.

5. Разработана иммунохроматографическая тест-система для одновременного совместного визуального определения с-БСЖК и тропонина I в сыворотке и цельной крови для экспресс-диагностики острого инфаркта миокарда. Время анализа составило 20 минут.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Яковлева Е.А.. Андреева И.П., Григоренко В.Г., Осипов А.П. Иммунохроматографический экспресс-анализ белка, связывающего жирные кислоты, для диагностики острого инфаркта миокарда. Вестн.Моск.Ун-та. Сер. 2. Химия. 2011, т. 52, №6, с.432-437.

2. Яковлева Е.А.. Андреева И.П., Григоренко В.Г., Осипов А.П, Егоров A.M. Латеральный проточный иммуноанализ тропонина I. Вестн.Моск.Ун-та. Сер. 2. Химия. 2012, т. 53, №б, с.363-368.

3. Яковлева Е.А. Латеральный проточный иммуноанализ белка, связывающего жирные кислоты, для экспресс-диагностики острого инфаркта миокарда. Сборрик тезисов III Всероссийской школы-семинара для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы», Белгород, 6-9 октября, 2010, с. 160.

4. Яковлева Е.А.. Андреева И.П., Григоренко В.Г., Осипов А.П. Разработка физико-химических основ и технологии производства отечественных диагностических систем экспресс-определения кардиомаркеров на основе метода проточного латерального иммуноанализа. Сборник тезисов VI Всероссийской конференции-школы «Высокореакционные интермедиа™ химических и биохимических реакций», Москва, 10-13 октября, 2011, с.49-50

5. Яковлева Е.А.. Андреева И.П., Григоренко В.Г., Осипов А.П. Разработка физико-химических основ и технологии производства отечественных диагностических систем экспресс-определения кардиомаркеров на основе метода латерального проточного иммуноанализа. Сборник тезисов 5го Конкурса проектов молодых ученых в рамках 16й международной специализированной выставки «Химия-2011» Москва, ЦВК «Экспоцентр», 25 октября, 2011, с. 17-18.

6. Яковлева Е.А.. Андреева И.П., Григоренко В.Г., Осипов А.П., Егоров A.M. Латеральный проточный иммуноанализ тропонина I для экспресс-диагностики острого инфаркта миокарда. Материалы VII Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 19-22 марта, 2013, т.1, с.150-152.

7. Яковлева Е.А. Иммунохроматографический анализ кардиомаркеров для экспресс-диагностики острого инфаркта миокарда. Материалы XVIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013», Москва, 9-11 апреля, 2013 — Электронный сборник тезисов (www.lomonosov-msu.ru).

8. Yakovleva Е.А., Andreeva I.P., Grigorenko V.G., Egorov A.M., Osipov A.P. Immunochromatographic assay of cardiomarkers for rapid detection of acute myocardial infarction. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2013: Fundamentals and Applications", Moscow, June 2013, p.l 17.

Подписано в печать 14 ноября 2013 г. Объем 1,0 усл. п. л. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии «Реглет». Заказ № 225 119526 г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 www. reglet. Ru, тел. +7 495 363 78 90

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Яковлева, Елена Алексеевна, Москва

На правах рукописи

04201453204

ЯКОВЛЕВА Елена Алексеевна

Латеральный проточный иммуноанализ кардиомаркёров для экспресс-диагностики острого инфаркта миокарда

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва - 2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ЛПИА - латеральный проточный иммуноанализ ИХА - иммунохроматографический анализ ОИМ - острый инфаркт миокарда

с-БСЖК - белок, связывающий жирные кислоты из сердца человека ИФА - иммуноферментный анализ ПАВ - поверхностно-активные вещества Ат - антитело Аг - антиген

НЧЗ - наночастицы золота

ЗХВК - золотохлористоводородная кислота

КТ - квантовые точки

ТЭОС - тетраэтилортосиликат

АПТЭС - 3-аминопропилтриэтоксисилан

КФК - креатин фосфокиназа

Тн1 - тропонин I

ТнТ-тропонин Т

ТнС - тропонин С

ТГФХ - тетракис(гидроксиметил) фосфоний хлорид

БСА - бычий сывороточный альбумин

ПАт - поликлональные антитела

МАт - моноклональные антитела

СЭМ - сканирующий электронный микроскоп

СОДЕРЖАНИЕ

I. ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................6

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................8

Глава 1. ЛАТЕРАЛЬНЫЙ ПРОТОЧНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ................................8

1.1. Строение иммунохроматографической тест-полоски.........................................10

1.2. Теоретические основы латерального проточного иммуноанализа.......................13

1.3. Основные компоненты иммунохроматографических тест-систем..........................17

1.3.1. Аналитическая мембрана.......................................................................................17

1.3.1.1. Полимерный состав и свойства мембран..........................................17

1.3.1.2. Факторы, влияющие на сорбцию белков на мембране..........................20

1.3.2. Мембрана для нанесения образца.......................................................................22

1.3.3.Мембрана для нанесения конъюгата.......................................................................23

1.3.4.Абсорбирующая (впитывающая) мембрана..........................................................23

1.3.5.Антитела в иммунохроматографическом анализе.................................................24

1.3.6. Метки, используемые в иммунохроматографическом анализе...........................25

1.3.6.1. Латексные частицы...........................................................................................26

1.3.6.2. Флуоресцентные метки....................................................................................26

1.3.6.3. Квантовые точки...............................................................................................27

1.3.6.4. Парамагнитные частицы..................................................................................28

1.3.6.5. Коллоидное золото...........................................................................................29

1.3.6.6. Нанооболочки....................................................................................................32

Глава 2. БИОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ОСТРОГО ИНФАРКТА

МИОКАРДА...................................................................................................35

2.1. Белок, связывающий жирные кислоты (с-БСЖК)...........................................36

2.1.1. Структура и функции с-БСЖК...............................................................................36

2.1.2. Методы определения с-БСЖК................................................................................40

2.2. Тропонин...............................................................................................43

2.2.1. Структура и функции тропонина...........................................................................43

2.2. 2. Методы определения тропонинов.........................................................................46

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ................................................................................50

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..........................................................................50

3.1. Материалы и оборудование......................................................................50

3.2. Методы исследования.............................................................................52

3.2.1. Получение наночастиц коллоидного золота по методу Френса.........................52

3.2.2. Получение золотых нанооболочек на сферах из диоксида кремния..................52

3.2.3. Определение оптимальных условий сорбции антител на наночастицах золота53

3.2.4. Получение конъюгата частиц золота с антителами..............................................54

3.2.5. Получение конъюгата наносфер с антителами.....................................................54

3.2.6. Составление иммунохроматографической тест-полоски....................................54

3.2.7. Проведение иммунохроматографического анализа.............................................55

3.2.8. Определение чувствительности и специфичности тест-системы.......................55

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..................................................................................57

Глава 4. ПОЛУЧЕНИЕ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА И КОНЪЮГАТОВ АНТИТЕЛ НА ИХ

ОСНОВЕ........................................................................................................57

4.1. Получение и характеристика наночастиц золота.............................................57

4.2. Получение конъюгатов антител, специфичных к с-БСЖК, с наночастицами золота.60 Глава 5. РАЗРАБОТКА ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ С-БСЖК...................................................................................64

5.1. Оптимизация условий проведения иммунохроматографического анализа с использованием в качестве метки наночастиц золота для определения с-БСЖК...............64

5.1.1. Выбор пары антител................................................................................................64

5.1.2. Влияние размеров наночастиц золота на аналитические характеристики тест-системы...............................................................................................................................66

5.1.3. Выбор аналитической мембраны...........................................................................67

5.1.4. Оптимизация концентраций специфических реагентов......................................69

5.1.5. Выбор мембран для нанесения образца.................................................................71

5.2. Иммунохроматографический анализ с-БСЖК с использованием золотых нанооболочек в качестве метки...............................................................................................75

5.2.1 .Получение и характеристика золотых нанооболочек...........................................75

5.2.2. Использование нанооболочек в качестве метки в иммунохроматографическом анализе.................................................................................................81

5.3. Определение с-БСЖК в сыворотке и цельной крови человека...................................83

5.4. Стабильность тест-системы с-БСЖК...........................................................86

Глава 6. РАЗРАБОТКА ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРОПОНИНА1..........................................................................88

6.1. Получение конъюгатов антител, специфичных к тропонину I, с наночастицами золота............................................................................................................

6.2. Оптимизация условий проведения иммунохроматографического анализа с использованием наночастиц золота для определения тропонина 1.................................91

6.2.1. Выбор пары антител................................................................................................91

6.2.2. Выбор мембран........................................................................................................92

6.2.3. Влияние размеров наночастиц золота на аналитические характеристики тест-системы ...............................................................................................................................94

6.3. Определение тропонина I в сыворотке и цельной крови..................................95

6.4. Стабильность тест-системы тропонина 1................................................................98

Глава 7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ с-БСЖК И ТРОПОНИНА I И В ОБРАЗЦАХ СЫВОРОТКИ

КРОВИ.........................................................................................................101

Глава 8. РАЗРАБОТКА ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ

ОДНОВРЕМЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЕ с-БСЖК и ТРОПОНИНА 1.............................105

VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................112

I. ВВЕДЕНИЕ

Лабораторные исследования играют важную роль в диагностике различных заболеваний. Методы лабораторной диагностики довольно многочисленны и продолжают активно развиваться. Широкое применение в клинической диагностике нашли иммунохимические методы, в частности, методы иммуноферментного анализа. В течение последнего десятилетия в мировой аналитической практике очень интенсивно развиваются иммунохимические методы экспресс-анализа, которые приходят на смену стандартным методам иммуноферментного анализа благодаря своим преимуществам - простоте выполнения, возможности проведения анализа во внелабораторных, а зачастую и в домашних условиях, отсутствию необходимости использования дорогостоящих приборов, высокой чувствительности, возможности визуальной регистрации результатов анализа, низкой стоимости и т.д. Наиболее распространенным вариантом является метод латерального проточного иммуноанализа (ЛПИА), также известный как иммунохроматографический анализ (ИХА). Данный вид анализа осуществляется при помощи индикаторных полосок, содержащих все необходимые для анализа компоненты в готовом виде. В качестве метки используются наночастицы золота, позволяющие визуально детектировать результаты анализа.

Методы иммунохроматографического анализа наиболее подходят для определения веществ, содержание которых в норме незначительно или отсутствует, и значительно возрастает при развитии патологии. К таким веществам относятся кардиомаркеры, определение которых является актуальным для диагностики различных сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе острого инфаркта миокарда (ОИМ). Развитие ОИМ сопровождается обширным разрушением кардиомиоцитов и выбросом в кровь многих специфических белков.

В настоящее время наиболее предпочтительными биохимическими маркерами повреждения миокарда являются тропонины вследствие их абсолютной кардиоспецифичности. При повреждении миокарда повышенная концентрация тропонина в крови обнаруживается через 3-4 часа, пик приходится на 3-4 сутки и остается повышенной до 7-10 дней [1]. Однако определение тропонинов не подходит для ранней диагностики ОИМ, поэтому наряду с исследованиями тропонинов рекомендуется определять ранние миокардиальные маркеры.

Выбор второго объекта исследования - белка, связывающего жирные кислоты (с-БСЖК) - обусловлен актуальностью проблемы ранней и точной диагностики острой ишемической болезни, включая острый инфаркт миокарда, в современной кардиологии. В настоящее время ни один из известных методов не гарантирует надежной диагностики ОИМ на ранней стадии болезни. Так, например, до 25% всех ОИМ не вызывают никаких изменений на кардиограмме, от 20% до 30% всех случаев ОИМ протекают без болевого приступа, особенно у

пожилых, а также больных диабетом и гипертонической болезнью. Недавно в качестве нового биохимического маркера ранней диагностики ОИМ был предложен с-БСЖК. Было показано, что при повреждении миокарда, подобно миоглобину, концентрация с-БСЖК в крови значительно повышается в течение 3 часов после появления симптомов ОИМ и возвращается к нормальному уровню через 12-24 часа [2]. Этот факт, а также хорошая тканеспецифичность в сравнении с миоглобином, делают с-БСЖК перспективным маркером ранней диагностики ОИМ.

Одновременное определение с-БСЖК и тропонина I повышает эффективность диагностики ОИМ на ранних стадиях, позволяет определить скрытые формы инфаркта миокарда.

В настоящее время на отечественном рынке экспресс тест-системы на основе ЛПИА в основном представлены продукцией зарубежных производителей. В связи с этим актуальным с точки зрения потребности практики и развития технологической и реагентой базы является проведение исследований по созданию практически значимых аналитических систем отечественного производства на основе латерального проточного иммуноанализа.

Целью настоящей работы являлось изучение основных принципов создания тест-систем на основе латерального проточного иммуноанализа для определения концентрации белка, связывающего жирные кислоты и тропонина I, а также разработка иммунохроматографической тест-системы для одновременного совместного визуального определения с-БСЖК и тропонина I в сыворотке и цельной крови для экспресс-диагностики острого инфаркта миокарда.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. ЛАТЕРАЛЬНЫЙ ПРОТОЧНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ

Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли в аналитическую практику и используются в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности, для целей охраны окружающей среды.

История иммуноанализа берет начало с методов иммунопреципитации, которые основаны на образовании нерастовримых комплексов антиген-антитело [3]. Однако для визуальной детекции результатов были необходимы высокие концентрации компонентов, а также длительное время анализа. Кроме того, результаты этого анализа носили качественный или полуколичественный характер.

Детекция образующихся в процессе иммунохимической реакции комплексов антиген-антитело может быть осуществлена, если в один из компонентов реакционной системы ввести метку (изотопную, флуоресцентрую, ферментную и др.), которая легко регистрируется соответсвующими высокочувствительными физико-химическими методами. Поскольку процесс образования пары анализируемое соединение-специфическое антитело происходит в строго количественном соотношении, то экспериментально определяется концентрация метки, входящей в состав обазующегося комплекса [3].

Поворотным моментом в развитии иммунохимических методов анализа стала разработка в 50-х годах Р. Йалоу и С. Берсоном радиоиммунологического анализа, который представлял собой принципиально новый метод, основанный на введении в систему радиоактивной метки -изотопа 1251 [4]. Благодаря возможности определять эту метку в очень малых концентрациях данный метод позволял определять концентрации аналита в образце с высокой чувствительностью, вплоть до Ю'10 М. Однако сложность в использовании радиоактивной метки из-за ее ограниченного срока жизни, а также необходимость использования дорогостоящего оборудования ограничивало применение данного метода анализа. Кроме того, использование радиоактивной метки представляет потенциальную угрозу для здоровья человека, поэтому встала необходимость разрабатывать альтернативные пути детекции реагентов. Подходящей альтернативой радиоиммуноанализа стала замена радиоактивной метки на ферментативную. Как и в методах радиоиммунологического анализа, ферментативная метка должна быть ковалентно связвана со специфически взаимодействующим соединением. С. Аврамисом и Г. Пирсом был разработан метод связывания ферментов с антителами или антигенами через глутаровый альдегид [5, 6].

Для достижения высокой чувствительности, специфичности и воспроизводимости иммунохимических методов анализа необходимо было проводить эффективное разделение комплексов и свободных компонентов. Это стало возможно легко осуществить, если антиген или антитело прочно иммобилизовать на твердом носителе. В 1966 году в работе [7] была впервые показана возможность использования твердой фазы в качестве носителя для иммобилизации антител или антигенов. На протяжении последних десятилетий наибольшее распространение получили методы твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), в которых для иммобилизации антител/антигенов используются твердые носители, например, полистироловые планшеты, а образовавшиеся иммунокомплексы выявляют с помощью меченых ферментами компонентов анализа. Впервые такой анализ, основанный на использовании ферментов в качестве метки и использовании твердой фазы, провели в 1971 году Энгвал и Перлман и в этом же году независимо от них Ван Веемен и Шуре [8, 9].

Позднее стали развиваться методы иммуноферментного анализа с использованием различных меток - флуорофоров, липосом, наночастиц [10, 11].

Наряду с несомненными достоинствами, такими как высокая чувствительность метода, воспроизводимость, простота проведения анализа, стабильность при хранении всех компонентов анализа, метод твердофазного иммуноанализа имеет и определённые недостатки: анализ включает многочисленные стадии, отмывки несвязавшихся реагентов, поэтому на проведение анализа требуется значительное количество времени.

Решением данной проблемы стала разработка методов проточно-инжекционного анализа в тонкослойных ячейках, которые позволили сократить время проведения анализа, и перевели иммунохимические реакции из равновесного режима в кинетический [12].

В последнее время активно развивается новый метод иммуноанализа - латеральный проточный иммуноанализ (ЛПИА, Lateral flow immunoassay, LFIA), или как его еще называют, иммунохроматографический анализ (ИХА), положивший начало развитию «быстрых методов» проведения анализа различных соединений с визуальной регистрацией результатов [13]. Метод основан на использовании мембранных носителей с заранее импрегнированньши в них реакционными компонентами, позволяющими при нанесении на мембрану анализируемого образца выявлять наличие определяемого соединения по окрашиванию тестовой зоны мембраны наночастицами золота. Дешевые, быстрые и простые аналитические технологии на основе иммунохроматографии позволяют проводить высокочувствительные качественные измерения без специальных навыков и оборудования в домашних, лабораторных и полевых условиях. Иммунохроматографические экспресс-тесты позволяют в течение нескольких минут определить и оценить содержание различных диагностич