Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электрохимический анализ кардиомаркеров в плазме крови

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Электрохимический анализ кардиомаркеров в плазме крови"

На правах рукописи

Шумков Андрей Алексеевич ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КАРДИОМАРКЕРОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

17 ОКТ 2013

Москва 2013

005535203

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Шумянцева Виктория Васильевна

Официальные оппоненты:

Курочкин Илья Николаевич доктор химических наук, профессор, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Химический факультет, заведующий лабораторией

Соловьёва Нина Ивановна

доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «ИБМХ» РАМН, заведующая лабораторией

Ведущая организация:

ФГБУН Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится « 14» ноября 2013 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 001.010.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «ИБМХ» РАМН) по адресу: 119121, г. Москва, Погодинская ул., д. 10, стр. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ИБМХ» РАМН.

Автореферат разослан «//» октября 2013 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Карпова Е.А.

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из основных проблем Российского здравоохранения. Подход к персональной оценке рисков и правильному диагнозу должен включать в себя следующие критерии: профиль лабораторных данных, клинические и визуальные данные пациентов [Никулин Б.А., 2007].

В настоящее время в клинико-диагностических лабораториях для определения кардиомаркёров (белков-маркёров) основным методом остаётся иммуноферментный анализ, с нижним диапазоном определяемой концентрации белка 10 пг/мл. Несмотря на высокую чувствительность, данный метод требует большого объёма исследуемого образца (от 100 мкл), дополнительных расходных материалов, а сама процедура анализа занимает два часа. Кроме того, иммуноферментный анализ проводится в лабораториях стационаров, больниц и диагностических центрах, таким образом, время постановки диагноза составляет в среднем 6 часов [Hasanzadeh М. et al., 2013]. Необходимость диагностики инфаркта миокарда в ранние сроки продиктована тем, что тромболитическая терапия в первые 2-6 часов снижает смертность в среднем на 30%, а терапия, начатая через 7-12 часов - лишь на 13% [Ткачук В.А., 2008]. Тест-системы, которые разработаны на данный момент, и могли бы быть использованы в качестве профилактических тест-систем («point-of-care») и на скорой помощи, не нашли широкого применения, так как являются полуколичественными и имеют высокий порог чувствительности, что может приводить к появлению большого количества ложноотрицательных результатов. Следовательно, необходимы новые диагностические подходы к определению белков-маркёров инфаркта миокарда, которые бы отвечали требованиям, предъявляемым к профилактическим тест-системам: портативность, минимальное время анализа, сменный тип сенсорного элемента, чувствительность и селективность к определению белков-маркёров [Lewandrowski К. et al., 2009; Christenson R.H. et al., 2009]. Создание диагностических систем нового поколения, отвечающих требованиям, предъявляемым к профилактическим тест-системам, а также выявление новых белков-маркёров инфаркта миокарда, является одним из приоритетных направлений в современных биомедицинских исследованиях.

В лаборатории биоэлектрохимии ФГБУ «ИБМХ» РАМН с 2008 года ведутся научные

разработки новых подходов к определению белков-маркёров острого инфаркта миокарда в

плазме крови. Были получены патенты по прямому электрохимическому методу определения

кардиомиоглобина на поверхности печатного графитового электрода. Определение

кардиомиоглобина в плазме крови основано на прямом переносе электронов между гемовой

(простетической) группой кардиомиоглобина и поверхностью электрода [Арчаков А.И. и др.,

1

2008, 2009]. В то же время, большинство белков-маркёров острого инфаркта миокарда не содержат простетической группы и находятся в достаточно низком диапазоне концентраций, например тропонин I (20,4 пг/мл (0,9 пМ)) [Хи р. е1 а!., 2009]. Определить такие белки на немодифициронной поверхности электрода, без дополнительного усиления сигнала не представляется возможным. В связи с этим необходимо разработать новый электрохимический подход к селективному определению кардиомаркеров острого инфаркта миокарда.

Цель исследования: разработка принципов электрохимического анализа биохимических маркёров острого инфаркта миокарда.

В соответствии с поставленной целью в диссертационной работе были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать метод определения белков-маркёров инфаркта миокарда в плазме крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда по сигналу наночастиц металлов методами инверсионной, квадратно-волновой вольтамперометрии и с помощью потенциометрического анализа.

2. Отработать условия модификации печатных графитовых электродов:

а) наночастицами золота, полученными химическим синтезом и электросинтезом,

б) наночастицами серебра, полученными химическим синтезом и электросинтезом,

в) магнитными наночастицами на основе оксидов железа.

3. Найти оптимальные параметры электрохимической регистрации наночастиц металлов на поверхности электрода с помощью инверсионной и квадратно-волновой вольтамперометрии.

4. Разработать условия связывания антител с соответствующими белками-маркёрами инфаркта миокарда плазмы крови (кардиомиоглобин, тропонин I, тропонин Т, сердечный белок, связывающий жирные кислоты) на модифицированных электродах.

5. Провести сравнительный анализ иммуносенсоров по следующим параметрам: аналитическая и диагностическая чувствительность, воспроизводимость.

Научная новизна работы

В процессе проведения исследования впервые разработаны методы: -электрохимического определения белков-маркеров острого инфаркта миокарда, таких как сердечный белок, связывающий жирные кислоты, кардиомиоглобин, тропонин I и Т в плазме крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда по интенсивности сигнала наночастиц металлов (наночастиц золота, серебра и магнитных

наночастиц на основе оксидов железа), на поверхности печатного графитового электрода с помощью высокочувствительных электрохимических методов: инверсионной и квадратно-волновой вольтамперометрии.

-определения белка-маркёра тропонина I в плазме крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда потенциометрическим методом анализа, с использованием электродов, модифицированных наночастицами золота, полученными электросинтезом. Показано, что аналитическая чувствительность потенциометрического метода анализа для разработанного электрохимического иммуносенсора на тропонин I составляет 18,0 пг/мл (0,8 пМ).

Личный вклад автора

Соискателем проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Соискатель лично принимал участие в планировании экспериментов, осуществлял подбор необходимых условий в методиках и выполнении основных экспериментов.

Практическая значимость исследования

Результаты диссертационной работы имеют практическую ценность в решении задач ранней диагностики острого инфаркта миокарда, а также возможности своевременной постановки диагноза, и, как следствие, начала лечения, в больницах и отделениях скорой помощи. Разработанные электрохимические иммуносенсоры на основе одноразовых печатных графитовых электродов, модифицированных наночастицами металлов, для определения белков-маркёров инфаркта миокарда (сердечный белок, связывающий жирные кислоты, кардиомиоглобин, тропонина I и Т) обладают высокой чувствительностью: диапазон минимально-определяемых концентраций в плазме крови составляет 2,7 - 4,3 пМ. Специфичность определения белков-маркёров обеспечивается за счёт нанесения на поверхность печатного графитового электрода, модифицированного наночастицами металлов, моноклональных антител к соответствующим белкам-маркёрам инфаркта миокарда. Диагностическая чувствительность составляет 87%. Относительное стандартное отклонение среднего результата не превышает 9%. Анализ требует малого количества исследуемого образца (1 мкл плазмы или сыворотки крови), измерение занимает 2 минуты и может проводиться с помощью портативного электрохимического анализатора. Разработанные иммуносенсоры могут быть использованы в качестве профилактических тест-систем для самоконтроля.

Положения. выносимые на защиту:

-Разработка метода электрохимического определения белков-маркёров острого

инфаркта миокарда в плазме крови здоровых доноров и больных острым инфарктом

миокарда по сигналу наиочастиц металлов методом инверсионной и квадратно-волновой вольтамперометрии.

-Сравнительный анализ аналитической и диагностической чувствительности разработанных иммуносенсоров для определения белков-маркёров в плазме и сыворотке крови.

-Определение тропонина I потенциометрическим методом анализа с помощью электродов, модифицированных золотыми наночастицами, полученными электросинтезом, в плазме крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей в периодических изданиях, включённых в перечень ВАК и 5 публикаций в сборниках докладов научных конференций. Апробация работы

Основные положения диссертации были представлены на IV Международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2009), VII Международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2012), II всероссийской научной конференции молодых учёных «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012). Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов (глава 2), изложения результатов и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 186 источников. Работа иллюстрирована 63 рисунками, 8 таблицами и 1 приложением. Материалы и методы

Реактивы: Калибровочные растворы тропонина I (USBiological); тропонин Т (USBiological), моноклональные антитела к сердечному белку, связывающему жирные кислоты (АтсБСЖК) (Hycultbiotech); моноклональные антитела к кардиомиоглобину, тропонину Т и I (АтсМБ, Атт и At1, соответственно) (USBiological); магнитные наночастицы Fluid-MAG-СМХ (Chemicell); диметилдидодециламмония бромид (ДДАБ) (Sigma); сыворотка крови, очищенная от миоглобина (USBiological). Образцы плазмы крови больных острым инфарктом миокарда и здоровых доноров были предоставлены из банка данных крови ОАО РЖД ЦКБ №1 в рамках государственного контракта № 16.512.11.2212 с информированного согласия здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда. Концентрация тропонина I и кардиомиоглобина была подтверждена на промышленно выпускаемом

4

анализаторе RAMP (Response Biomedical Corp., Канада, http://www.analytica.ru). Все остальные используемые в работе вещества были по степени очистки не ниже ос.ч.

В работе использовались трехконтактные печатные электроды, рабочий (диаметр 2 мм) и вспомогательный электроды - графитовые, электрод сравнения - хлорсеребряный (ООО НПП «Автоком», Москва, www.membrans.ru).

Электрохимические измерения проводились с использованием потенциостата Autolab PGSTAT 12 (Eco Chemie, Нидерланды), с программным обеспечением GPES. Все потенциалы приведены относительно хлорсеребряного электрода сравнения (Ag/AgCl).

Получение наночастиц золота и серебра (химический синтез). Наночастицы золота и серебра были получены из тетрохлорзолотой кислоты или нитрата серебра с восстановителем боргидридом натрия и стабилизатором диметилдидодециламмония бромидом (AUx/ДДАБ и Agx/ДДАБ, соответственно) согласно ранее описанной методике [Shumyantseva V.V. et al., 2004]. Полученные наночастицы были охарактеризованы спектрально с помощью спектрофотометра Сагу 100 (Varían Inc, Нидерланды). Максимум поглощения для Аих/ДЦАБ в хлороформе соответствует длине волны 523 нм, а для Agx/ДДАБ 407 нм, что коррелирует с литературными данными [Кавецкая И.В., 2009; Tan Н. et al., 2012]. Относительное стандартное отклонение среднего результата аналитического сигнала для наночастиц составило 10%.

Получение наночастиц золота (электросинтез). На поверхность печатного графитового электрода в горизонтальном режиме наносили 60 мкл 0,005 М раствора НАиСЦ/0,1 М НС1. Электронанесение проводили в течение 180с (t,.n) при потенциале -0,5 В. Затем поверхность электрода промывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе.

Получение наночастиц серебра (электросинтез). На поверхность печатного графитового электрода в горизонтальном режиме наносили 60 мкл 0,005 М раствора AgN03/0,l М HNO3. Электронанесение проводили в течение 180с при потенциале -1,2 В. Затем поверхность электрода промывалась дистиллированной водой и высушивалась на воздухе.

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) проводилась сотрудником

лаборатории нанобиотехнологии отдела персонализированной медицины ФГБУ «ИБМХ»

РАМН C.J1. Конашенко. Изображения модифицированных электродов, получены с помощью

микроскопов S-3400N и S-5500 Hithachi Scanning Electron Microscope. Анализ изображений

показал, что размер Аих/ДДАБ составляют 5 - 10 нм, а Agx/ДДАБ 5 - 15 нм (рисунок 1А и Б,

соответственно). На рисунке 1В и 1Г представлена поверхность печатного графитового

5

электрода, модифицированная Аиу'ДДАБ и А£э/ДДАБ, соответственно. Средний размер Аиэ/ДДАБ, полученных на поверхности электрода составил 100 - 700 нм, а Agэ/ДДAБ 200 -1000 нм.

Рисунок 1. СЭМ. А) Аих/ДДАБ (5 - 10 нм). Б) AgJffUAE (5 - 15 нм), В) ПГЭ/Аи^ДДАБ (100 -700 нм), Г) nr3/Ag^MAE (200 - 1000 нм).

Приготовление электродов для анализа оксидов железа в составе магнитных наночастиц

Ковалентная иммобилизация антител проводилась согласно методике предлагаемой фирмой-производителем магнитных наночастиц [http://www.chemicell.com/]. К 3 мкл плазмы крови добавляли 3 мкл магнитных наночастиц с ковалентно иммобилизованными антителами. Инкубация белка-маркёра и антитела проводилась в течение 15 мин при 37°С. Затем проводилась стадия магнитного сепарирования и нанесение (1 мкл) комплекса (магнитные наночастицы-антитело-тропонин I) на поверхность печатного графитового электрода. Модифицированный электрод высушивали в течение 10 мин при 37°С, затем наносили 1 мкл 0,1 М диметилдидодециламмония бромида в хлороформе. Электрод перед измерением сигнала помещали в электрохимическую ячейку с 1мл фосфатного буфера (0,1 М КН2РО4 + 0,05 М NaCl), рН 7,4 на 15 мин при комнатной температуре. Измерения проводили в 1 мл 0,2 М цитратного буфера (ЫазС6Н507) рН 6,0 в диапазоне развёртки потенциалов от -0,6 В до +0,2 В, амплитуда сигнала 0,019 В, частота 10 Гц.

Приготовление модифицированных электродов для анализа

На рабочую поверхность печатного графитового электрода, наносили 2 мкл золотых или серебряных наночастиц, полученных химическим синтезом (ПГЭ/Аих/ДДАБ и ПГЭ/А^/ДДАБ, соответственно). На рабочую поверхность электрода, модифицированного наночастицами золота или серебра, полученными электросинтезом, наносили 1 мкл 0,1 М ДДАБ (ПГЭ/АЦэ/ДДАБ и ПГЭЛ^э/ДЦАБ, соответственно). Затем наносили 1 мкл раствора антител к соответствующему белку-маркёру (кардиомиоглобину, сердечному белку, связывающему жирные кислоты, тропонину I и Т) на рабочую поверхность электрода (ПГО/Аи/ДДАБ/Ат, ПГЭ/А&1/ДДЛБ/Лт, ПГЭ/Аих/ДЦАБ/Ат, ПГЭ/А&УДДАБ/Ат) и высушивали в течение 20 мин при комнатной температуре. Иммуносенсоры на основе наночастиц металлов оставляли на 12 часов при 4°С. Затем на рабочую поверхность иммуносенсора, модифицированного наночастицами золота или серебра, наносили 1 мкл исследуемого образца. Связывание белка-маркёра со специфическими антителами для электродов, модифицированных наночастицами серебра, проводилось в течение 15 мин (1ИНК) при 37°С, а для электродов модифицированных наночастицами золота, 45 мин при 37°С. Перед измерением электрод помещали в электрохимическую ячейку (1 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 М №С1, рН 7,4) на 5 мин (1отм) при 25°С для ПГЭ/А§, и на 30 мин при 37°С для ПГЭ/Аи. Тестирование каждого образца плазмы крови и стандартных растворов проводилось по три раза (п = 3). Относительное стандартное отклонение среднего результата аналитического сигнала по трём измерениям (плазмы крови или стандартных растворов), было сопоставимо с относительным стандартным отклонением среднего результата аналитического сигнала электродов, модифицированных наночастицами металлов, и составило 9-12% (п = 3).

Измерение электрохимического сигнала наночастиц золота

Сигнал регистрировали методом инверсионной вольтамперометрии с линейной развёрткой потенциала. Фоновая кривая (1ф0Н) для наночастиц золота, полученных электросинтезом, регистрировалась в диапазоне развёртки потенциалов от +0,6 до -0,6 В, V = 0,05 В/с. Затем, прикладывался фиксированный потенциал +1,2 В в течение 30с (10К), после чего регистрировали сигнал (1СИгнал)-

Аналитическим сигналом служила высота катодного (восстановительного) пика оксида золота, которая рассчитывалась по полученной вольтамперометрической кривой (Д1 = ^сигнал — 1фон ) с использованием программного пакета вРЕБ (рисунок 2А). Для наночастиц

золота, полученных химическим синтезом, измерение и расчёт интенсивности сигнала производился аналогично.

I

_ сигнал

- A! = I " I

- сигнал фон

- I 1

фон v--

1 1 1 1 1 1

Потенциал, В (Ag/AgCl)

Потенциал, В (Ag/AgCI)

Рисунок 2. А. Расчёт высоты катодного (восстановительного) пика оксида золота. Условия эксперимента: на электрод в горизонтальном режиме, покрывая рабочий, вспомогательный и электрод сравнения, наносили 60 мкл 0,005 М HAuClj/0,1 М HCl, потенциал -0,5 В, = 180с. Условия измерения сигнала: Еок = +1,2 В, tOK = 30с, диапазон развёртки потенциача от +0,6 до -0,6 В, v = 0,05 В/с, 1 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 М NaCl (pH 7,4) . п = 3. Б. Расчёт высоты анодного (окислительного) пика наночастиц серебра. Условия эксперимента: на электрод в горизонтальном режиме, покрывая рабочий, вспомогательный и электрод сравнения наносит 60 мкл 0,005 М AgNO/0,1 М HNOj, потенциал -1,2 В, (-,, = 180с. Условия измерения: диапазон сканирования от -0,4 до +0,6 В, v = 0,05 В/с, 1 мл 0,1 Мкалий-фосфатного буфера 0,05 MNaCl (pH 7,4). п = 3.

Измерение электрохимического сигнала наночастиц серебра

Сигнал наночастиц серебра, полученных электросинтезом, регистрировали методом инверсионной вольтамперометрии с линейной развёрткой потенциала в диапазоне от -0,4 до +0,6 В, v = 0,05 В/с.

Аналитическим сигналом служила высота анодного (окислительного) пика наночастиц серебра, которая рассчитывалась по полученной вольтамперометрической кривой (AI = I сигнал- I фон) с использованием программного пакета GPES (рисунок 2Б). Для наночастиц серебра, полученных химическим синтезом, измерение и расчёт интенсивности сигнала производился аналогично.

Измерение сигнала при проведении потенциометрического титрования

На электрод в горизонтальном режиме наносили 55 мкл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 М №С1 (рН 7,4), внесение образцов проводилось с интервалом 400с. Аналитическим сигналом служило изменение потенциала рабочего электрода (ЛЕ = Е] - Е2),

рассчитанное по полученной потенциометрической кривой с использованием графического пакета Origin 8,5 (рисунок 3).

■0 325

Ш -0.335

ш

ДЕ = Е2-Е]

■0345

350

375

400

425

450

475

Время, с

Рисунок 3. Расчёт изменения потенциалов (АЕ). Условия измерения: в горизонтальном режиме наносилось 55 мкл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 М ЫаС1 (рН 7,4), внесение образцов проводилось с интервалам 400с, объём вводимого образца 5 мкл. п = 3.

Диагностическая чувствительность (ДЧ) рассчитывалась по формуле

Количество оольньк инфарктом миокарда, имеющих положительный результат

Результаты и их обсуждение

Разработка оптимальных условий модификации электродов наночастицами золота и серебра (электросинтез)

Метод электросинтеза основан на восстановлении катионов металла электронами, поставляемыми с поверхности рабочего электрода. Величина электрохимического сигнала наночастиц золота или серебра, воспроизводимость, стабильность и чувствительность метода зависит от количества осаждённых наночастиц. В связи с этим, были отработанны оптимальные условия электрохимического получения наночастиц золота и серебра. На рисунке 4А представлен график зависимости высоты катодного (восстановительного) пика оксида золота от потенциала и времени электросинтеза наночастиц золота. На рисунке 4Б представлена зависимость высоты анодного (окислительного) пика наночастиц серебра от потенциала и времени электросинтеза наночастиц серебра на поверхности печатного графитового электрода.

ЛЧ =

Кол1гчество больных инфарктом миокарда

Рисунок 4. А. Зависимость высоты катодного (восстановительного) пика оксида золота от потенциала и времени электросинтеза наночастиц золота на поверхности печатного графитового электрода. Условия эксперимента: на электрод в горизонтапьном режиме, покрывая рабочий, вспомогательный и электрод сравнения, наносили 60 мкл 0,005 М НАиСЦ/ 0,1 М HCl, потенциал от -0,1 до +0,5 В, tm = от 5 до 600с. Условия измерения сигнала: Еок = +1,2 В, tOK = 30с, диапазон развертки потенциала от +0,6 до -0,6 В, v = 0,05 В/с, 1 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 М NaCl (pH 7,4). п = 3. Б. Зависимость высоты анодного (окислительного) пика серебра от потенциала и времени электросинтеза наночастиц серебра на поверхности печатного графитового электрода. Условия эксперимента: на электрод в горизонтальном режиме, покрывая рабочий, вспомогательный и электрод сравнения, наносили 60мкл 0,005 М AgNO]/0,l МHNO3, потенциал от +0,6 до -1,4 В, t3„ от 5 до 600с. Условия измерения: диапазон развёртки потенциала от -0,4 до +0,6 В, v = 0,05 В/с, 1 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 М NaCl (pH 7,4). п = 3.

На основе полученных данных, были выбраны оптимальные условия

электровосстановления наночастиц золота и серебра на поверхности электрода. Так, наночастицы золота получали при электрохимическом потенциале восстановления -0,5 В и времени электросинтеза 180с, а для наночастиц серебра электрохимический потенциал восстановления составил -1,2 В и время электросинтеза 180с. Относительное стандартное отклонение среднего результата электрохимического сигнала для наночастиц золота (Аиэ) или серебра (Ag,), составило 9% и 12%, соответственно.

Отработка оптимальных условий связывания белков-маркёров с антителами, иммобилизованными на поверхности иммуносенсора

Интенсивность электрохимического сигнала наночастиц металлов зависит от наличия на поверхности электрода биологического материала. Для повышения чувствительности метода были отработаны оптимальные условия связывания белков-маркёров с антителами, иммобилизованными на поверхности модифицированного электрода. Эксперименты проводились на примере электродов, модифицированных наночастицами золота или серебра, полученными электросинтезом, и антителами к тропонину I (Ат1) (ПГЭ/Аиэ/ДДАБ/Ат'/ и ПГЭ/А§э/ДДАБ/Ат'/). На рабочую поверхность иммуносенсора наносили 1 мкл плазмы крови больного острым инфарктом миокарда с концентрацией тропонина I 5,09 нг/мл (0,22 нМ).

На рисунке 5А представлена зависимость величины катодного (восстановительного) пика оксида золота от времени связывания белка-маркёра с антителами, иммобилизованными на поверхности электрода, для модификации ПГЭ/Аиэ/ДДАБ/Ат'/плазма крови, при 37'С. На рисунке 5Б представлена зависимость высоты анодного (окислительного) пика наночастиц серебра от времени связывания белка-маркёра с антителами, иммобилизованными на поверхности электрода, для модификации ПГЭА^э/ДЦАБ/Ат'/плазма крови, при 37'С.

Рисунок 5. А. Зависимость высоты катодного (восстановительного) пика оксида золота от времени связывания белка-маркёра с антителами, иммобилизованными на поверхности электрода при ЗТС, для модификации ПГЭ/Аи-ЛЩАБ/Ат'/плагиа крови. Условия измерения сигнала: {оти — 5 мин при 25 С, Еок — +1,2 ! 30с, диапазон развёртки потенциала от +0,6 до -0,6 В, V = 0,05 В/с, 1 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 М МаС1 (рН 7,4). п = 3. Б. Зависимость высоты анодного (окислительного) пика наночастиц серебра от времени связывания белка-маркёра с антителами, иммобилизованными на поверхности электрода при 37°С, для модификации ПГЭ/А£/ДДАБ/кт/плазма крови. Условия измерения: /„„„ = 5 мин при 25'С, диапазон развёртки потенциача от -0,4 до +0,6 В, V = 0,05 В/с, 1 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 МЫаС1 (рН 7,4). п = 3.

Из представленных графиков следует, что величина электрохимического сигнала возрастает с увеличением времени инкубации. Однако для наночастиц золота (рисунок 5А) максимальная величина катодного (восстановительного) пика оксида золота достигается к 45 мин инкубации (30 мкА), а к 60 мин наблюдается некоторое уменьшение электрохимического сигнала (до 29 мкА), что связано, по-видимому, с началом процесса диссоциации белка-маркёра и антитела. В то же время, для наночастиц серебра (рисунок 5Б) высота анодного (окислительного) пика наночастиц серебра начинает уменьшаться спустя 15 мин. Таким образом, для наночастиц золота было выбрано время инкубации равное 45 мин, а для наночастиц серебра 15 мин при 37'С.

Плазма крови в своём составе содержит достаточно большое количество разнообразных биологических компонентов (фибриноген, маркёрные белки, глобулины, липопротеиды и т.д.). Такие компоненты могут влиять на электрохимический сигнал,

поэтому необходимо проводить стадию удаления неспецифически связавшихся компонентов с поверхности иммуносенсора. В связи с этим, были выполнены эксперименты по отработке оптимальных условий удаления биологических компонентов с поверхности иммуносенсора. Эксперименты проводились на примере электродов, модифицированных наночастицами золота или серебра, полученными электросинтезом, и антителами к тропонину I (Ат1) (ПГЭ/Ацэ/ДДАБ/Ат1/ и ПГЭ/А§/ДЦАБ/Ат'/). На рабочую поверхность иммуносенсора наносили 1 мкл плазмы крови больного острым инфарктом миокарда с концентрацией тропонина 15,09 нг/мл (0,22 нМ).

На рисунке 6А представлена зависимость величины катодного (восстановительного) пика оксида золота от времени удаления с поверхности иммуносенсора неспецифически связавшихся компонентов, для модификации ПГЭ/Аиэ/ДДАБ/Ат'/плазма крови, при 37°С. На рисунке 6Б представлена зависимость высоты анодного (окислительного) пика наночастиц серебра от времени удаления неспецифически связавшихся компонентов с поверхности иммуносенсора, для модификации ПГЭА^э/ДДАБ/Ат'/плазма крови, при 37°С.

10 20 30 40 50 60 . 1. я »

Время, мин Время, мин

Рисунок 6. А. Зависимость величины катодного (восстановительного) пика оксида золота от времени удаления неспецифического компонента с поверхности иммуносенсора при 3 ТС для модификации ПГЭ/Л и^ДДАБ/Ат/плазма крови. Условия измерения: /„„,,■ = 45 мин при ЗТС, Е„к = +1,2 В, 1,,к = 30с, диапазон развёртки потенциала от +0,6 до -0,6 В, V = 0,05 В/с, 1 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 М ЫаС1 (рН 7,4). п = 3. Б. Зависимость высоты анодного (окислительного) пика наночастиц серебра от времени удаления неспецифического компонента с поверхности электрода при ЗТС для модификации ПГЭ/А%ЛЩЛБ//гиазма крови. Условия измерения: /„„„ = 15 мин ЗТС, диапазон развёртки потенциала от +0,4 до -0,6 В, V = 0,05 В/с, 1 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 М МаС1 (рН 7,4). п = 3.

Как видно из представленного рисунка 6А, при времени отмывки 30 - 60 мин

наблюдается максимальный электрохимический сигнал, который стабилизируется и составляет 32 - 33 мкА. К 60 мин инкубации и отмывки (рисунок 5А и 6А, соответственно) наблюдается уменьшение электрохимического сигнала. Таким образом, для удаления неспецифически связавшихся компонентов с поверхности электродов, модифицированных наночастицами золота, было выбрано оптимальное время 30 мин при 37'С. Как видно из

графика 6Б, при инкубации электродов ПГЭА^э/ДДАБ/Ат1'/плазма крови более 30 мин, наблюдается уменьшение анодного (окислительного) пика наночастиц серебра. Для 5, 15 и 30 мин при 37*С наблюдается одинаковый электрохимический сигнал (0,37 - 0,38 мкА). В то же время, для электродов со временем отмывки 5 мин и при 25°С, электрохимический сигнал составляет 0,35 мкА. Таким образом, экспериментально установлено, что оптимальным временем удаления неспецифического компонента с поверхности электродов, модифицированных наночастицами серебра, составляет 5 мин при 25°С.

Разработка иммуносенсоров для анализа тропонина I и Т

Аналитические и диагностические возможности разработанных иммуносенсоров были продемонстрированы на образцах плазм крови и на стандартных растворах тропонина I и Т. Электроды были модифицированы наночастицами золота и серебра, полученными химическим синтезом и электросинтезом, моноклональными антителами к тропонину I или Т. Иммобилизация моноклональных антител на поверхность модифицированных электродов осуществлялась с использованием жидкокристаллического мембраноподобного вещества ДДАБ. Электрохимические параметры, регистрируемые с помощью наночастиц металлов, изменяются в зависимости от количества адсорбированных биологических молекул на рабочей поверхности иммуносенсора. На рисунке 7 представлен график зависимости 1п(1/1о) от концентрации тропонина I в образцах плазмы крови для модификации ПГЭ/Аиэ/ДДАБ/Ат1. В качестве базового тока (10) взят усредненный сигнал наночастиц золота, полученных электросинтезом, для пяти образцов плазм крови здоровых доноров. На вставке рисунка 7, кривая А соответствует образцу плазмы крови здорового донора, кривая Б соответствует образцу плазмы крови больного ОИМ.

Образцы плазм крови

Рисунок 7. Зависимость 1п(1/1о) от концентрации тропонина I в образцах плазм крови для ПГЭ/Аиэ/ДДАБ/Ат. В качестве базового тока (1„) взят усредненный сигнал высоты катодного (восстановительного) пика оксида золота для пяти образцов плазм крови здоровых доноров. На вставке кривая А соответствует образцу плазмы крови здорового донора, кривая Б соответствует образцу плазмы крови больного острым инфарктом миокарда.

На основе электродов, модифицированных наночастицами золота и серебра с иммобилизованными на их поверхности антителами к тропонину I или Т, были получены четыре вида иммуносенсоров на тропонин I (ПГЭ/Аих/ДЦАБ/Ат', ПГЭ/Аиэ/ДЦАБ/Ат1, ПГЭ/Аа/ДДАБ/Ат1 и ПГЭ/А&ЛЩАБ/Ат1) и тропонин Т (ПГЭ/Аих/ДДАБ/Атт, ПГЭ/Аиэ/ДЦАБ/Атт, ПГЭ/Лд/ЦДАБ/Ат7 и ПГЭ/А£х/ДДЛБ/Лтт). С помощью данных модификаций были получены калибровочные кривые на соответствующие белки-маркёры инфаркта миокарда для образцов плазм крови и стандартных растворов. В работе использовались образцы плазм крови больных острым инфарктом миокарда и здоровых доноров. Концентрация тропонина I, в плазме крови здоровых доноров по данным анализатора RAMP, составляет 0 нг/мл. Концентрация тропонина Т в плазмах крови не определялась с помощью промышленно выпускаемого анализатора RAMP, поэтому для получения калибровочных кривых были использованы стандартные растворы тропонина Т, с использованием которых была показана аналитическая чувствительность. На образцах плазм крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда была показана диагностическая чувствительность разработанных иммуносенсоров на тропонин Т. По электрохимическим параметрам образцы плазм крови были разделены на две группы: здоровые доноры и больные острым инфарктом миокарда (рисунок 8). В работе использовалось 22 образца плазм крови: из них 7 образцов плазм крови здоровых доноров, и 15 образцов плазм крови больных острым инфарктом миокарда.

Образцы плазм крови

Рисунок 8. Зависимость высоты катодного (восстановительного) пика оксида золота от концентрации тропонина Те образцах плазм крови (ПГЭ/Аи/ДЦАБ/Ат7).

По полученным данным, была проведена оценка результатов лабораторных исследований. Были оценены следующие параметры разработанных тест-систем: ложноположительные (тест имеет положительный ответ, хотя заболевания у пациента не

имеется) и ложноотрицательные результаты (тест имеет отрицательный ответ, хотя у пациента имеется заболевание), диагностическая чувствительность теста, которая определяет вероятность положительного результата и показывает, с какой степенью уверенности можно ожидать положительный результат теста у больных.

В таблице 1 представлены аналитические характеристики разработанных иммуносенсоров на основе электродов, модифицированных наночастицами золота и серебра, полученными электросинтезом и химическим синтезом, на тропонин I (п = 3).

Таблица 1. Аналитические характеристики иммуносенсоров для анализа тропонина I.

Аналитическая характеристика Аи/ДДАБ Аи/ДДАБ Ag/ДДАЕ Ag/ДДАБ

Линейный диапазон определяемых концентраций для стандартных растворов 0,54 - 5,09 нг/мл (0,02 - 0,22 нМ) 0,54 - 5,09 нг/мл (0,02 - 0,22 нМ) 1,08 - 5,08 нг/мл (0,05-0,22 нМ) 0,54 - 5,08 нг/мл (0,02-0,22 нМ)

Линейный диапазон определяемых концентраций в плазме крови 0,1 -32,00 нг/мл (0,0043-1,34 нМ) 0,95 -16,00 нг/мп (0,04 - 0,68 нМ) 1,80 -32,00 нг/мл (0,08-1,34 нМ) 0,95 -16,00 нг/мл (0,04 - 0,68 нМ)

Диагностическая чувствительность 87% 67% 73% 80%

Ложноположительные 2 3 2 3

Ложноотрицательные 2 5 4 3

Для разработанных иммуносенсоров на тропонин I диапазон определяемых концентраций в плазме крови составляет 0,10 - 32,00 нг/мл (0,0043 - 1,34 нМ) и 0,54 - 5,08 нг/мл (0,02 - 0,04 нМ) для стандартных растворов тропонина I, диагностическая чувствительность составляет 87%. Относительное стандартное отклонение среднего результата аналитического сигнала по трём измерениям образцов плазм крови или стандартных растворов, было сопоставимо с ранее рассчитанным стандартным отклонением среднего результат аналитического сигнала для каждой модификации электрода и составило 9-12% (п = 3). Время пробоподготовки занимает от 20 до 75 мин, а электрохимический анализ - 2 мин. Объём исследуемого образца плазмы крови 1 мкл.

В таблице 2 представлены аналитические характеристики разработанных иммуносенсоров на тропонин Т (п = 3).

Таблица 2. Аналитические характеристики иммуносенсоров для анализа тропонина Т.

Аналитическая характеристика Аи/ДДАБ Аи,/ДДАБ Ag/ДДАБ Ag/ДДАБ

Линейный диапазон определяемых концентраций для стандартных растворов 0,1-1,0 нг/мл (2,7-27,0 пМ) 1,0 -3,0 нг/мл (27- 80,0 пМ) 1,0-6,0 нг/мл (27,0- 160,0 пМ) 0,1 -1,0 нг/мч (2,7-27,ОпМ)

Диагностическая чувствительность 87% 67% 73% 80%

Ложнопопожитепьные 3 3 3 2

Ложноотрицательные 3 3 5 4

Концентрация тропонина Т в норме составляет 0,1 - 0,5 нг/мл (2,7 - 13,5 пМ) [Kawde A.N. et al. 2005]. Диапазон определяемых концентраций иммуносенсоров ПГЭ/Аиэ/ДДАБ и ПГЭА^э/ДДАБ 0,1 - 1,0 нг/мл (2,7 - 27,0 пМ). Диагностическая чувствительность для электродов, модифицированных наночастицами золота (Аиэ), составила 87%. Среди всех предложенных модификаций лучшие аналитические и диагностические характеристики показали ПГЭ/Аиэ/ДДАБ, поэтому для анализа сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и кардиомиоглобина были использованы электроды, модифицированные Аиэ/ДДАБ.

Определение сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и кардиомиоглобина

Для селективного определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, или кардиомиоглобина на поверхность ПГЭ/Аиэ/ДДАБ наносились специфические моноклональные антитела к сердечному белку, связывающему жирные кислоты (АтсБСЖК), или кардиомиоглобину (АткМБ). Аналитическая чувствительность иммуносенсоров к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, была продемонстрирована на стандартных растворах, а диагностическая чувствительность - на образцах плазм крови больных острым инфарктом миокарда и здоровых доноров. В работе использовалось 22 образца плазм крови: из них 7 образцов плазм крови здоровых доноров, и 15 образцов плазм крови больных острым инфарктом миокарда. По электрохимическим параметрам образцы плазм крови были отнесены к одной из двух групп: здоровые доноры и больные острым инфарктом миокарда (ПГЭ/Аиэ/ДДАБ/АтсБСЖК) (рисунок 9А). На рисунке 9Б представлен график зависимости высоты катодного (восстановительного) пика оксида золота от концентрации кардиомиоглобина для модификации ПГЭ/Аи/ДДАБ/АткМ1>.

Обрати плазм крови Концентрация ка рл и ом иогл оби на, нг/мл

Рисунок 9. А. Зависимость высоты катодного (восстановительного) пика оксида золота от образцов плазм крови с разчичной концентрацией сердечного белка, связывающего жирные кислоты для модификации ПГЭ/Л и/ДДА£УАтсКС , Б. Зависимость высоты катодного (восстановительного) пика оксида золота от концентрации кардиомиоглобина в плазме крови, для модификации ПГЭ/Аи/ДЦАБ/АткМБ.

В таблице 3 представлены аналитические характеристики разработанных

иммуносенсоров для анализа сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и кардиомиоглобина для электродов, модифицированных наночастицами золота, полученными электросинтезом. Относительное стандартное отклонение среднего результата не превышало 9% (п = 3).

Таблица 3. Аналитические характеристики иммуносенсоров.

Аналитическая характеристика Сердечный белок, связывающий жирные кислоты Кардиомиоглобин

Диапазон определяемых концентраций для платы крови 58,0-400,0 нг/мл (3,3 нМ- 23,0 нМ)

Диапазон определяемых концентраций для стандартных растворов 0,5 -6,0 нг/мл (33,0 - 396,0 пМ) ¡0,0-600,0 нг/мл (0,6-35,0 нМ)

Диагностическая чувствительность 67% 86%

Ложноположи тельные 2 2

Ложноотрицательные 5 4

Концентрация кардиомиоглобина в норме по разным литературным данным составляет 70 - 200 нг/мл (4-11 нМ) [McDonnell В. et al. 2009; Apple F.S. et al. 1999]. Однако большинство исследователей придерживаются среднего значения 100 нг/мл (6 нМ) [Kawde A.N., et al. 2005]. Аналитическая чувствительность разработанных иммуносенсоров для анализа кардиомиоглобина составляет 10,0 - 600,0 нг/мл (0,6 - 35,0 нМ) для стандартных растворов кардиомиоглобина, 58,0 - 400,0 нг/мл (3,3 - 23,0 нМ) для плазмы крови, а диагностическая чувствительность иммуносенсоров 86%. Для сердечного белка, связывающего жирные кислоты, аналитическая чувствительность составляет 0,5 - 6,0 нг/мл (33,0 - 396,0 пМ), в то время как пороговая концентрация в норме 0,7 - 1,2 нг/мл (50,0 - 80,0 пМ). Диагностическая чувствительность составила 67%. Таким образом, разработанные

иммуносенсоры обладают высокой аналитической и диагностической чувствительностью по отношению к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и кардиомиоглобину.

Определение тропонина I по электрохимическому сигналу железа в составе магнитных наночастиц

В настоящее время в биомедицинских исследованиях в разных формах используются магнитные наночастицы [ТаПа] Р. й а1. 2006]. Использование магнитных наночастиц может повысить аналитическую чувствительность иммуносенсоров для белков, которые находятся в низком диапазоне концентраций. Был разработан электрохимический метод регистрации оксидов железа в составе магнитных наночастиц на поверхности печатного графитового электрода с помощью квадратно-волновой вольтамперометрии. Предложен подход для определения тропонина I в плазме крови по электрохимической регистрации железа в составе магнитных наночастиц, с ковалентно иммобилизованными на их поверхности антителами (ПГЭ/мНЧ-Ат'-тропонин 1/ДДАБ). На рисунке 10А представлена вольтамперограмма для электродов, модифицированных магнитными наночастицами на основе оксидов железа (I) и для немодифицированных электродов (II). На рисунке 10Б представлена зависимость высоты анодного (окислительного) пика оксидов железа в составе магнитных наночастиц от концентрации тропонина I после предварительного концентрирования с помощью магнитного сепаратора.

Рисунок 10А. Вольтамперограмма I - электрод, модифицированный магнитными наночастицами на основе оксидов железа. II — электрод, немодифицированный магнитными наночастицами. Условия измерения: 1 мл 0,2 М цитратного буфера (рН 6,0), диапазон развёртки потенциала от -0,6 до +0,2 В, амплитуда сигнала 0,019 В, частота 10 Гц. Е. Зависимость высоты анодного (окислительного) пика оксидов железа в составе магнитных наночастиц от концентрации тропонина / в плазме крови.

Таким образом, были отработаны условия регистрации оксидов железа в составе

магнитных наночастиц в 0,2 М цитратном буфере (рН 6,0) на поверхности печатного графитового электрода, и предложена методика определения тропонина I. Чувствительность данного метода составила 5,09 нг/мл (0,21 нМ), что существенно ниже по сравнению с ранее разработанным методом инверсионной вольтамперометрии по измерению сигнала наночастиц золота или серебра.

Потенциометрический метод определения тропонина I

Метод потенциометрической регистрации основан на уникальных физико-химических свойствах наночастиц металлов, которые обладают высокой чувствительностью к изменению микроокружения. В последнее время в литературе опубликован ряд работ по потенциометрическому определению различных белков-маркеров, таких как С-реактивный белок, онкомаркёры и т.д. Данный метод позволяет определять вещества в достаточно низком диапазоне концентрации. Действие потенциометрических сенсоров основано на измерении разности потенциалов между индикаторным (рабочим) электродом и электродом сравнения, таким образом, чувствительность метода зависит от характеристик рабочего электрода [Будников Г.К. и др., 2003; 1Ьирои> й а1., 2013; геЫа-ОиШеп О.А. е1 а1„ 2013]. Был разработан потенциометрический метод определения тропонина I как белка, имеющего самый низкий порог концентрации (20,4 пг/мл (0,87 пМ) [Хц р. е1 а1., 2009]). Для проведения экспериментов были использованы электроды, модифицированные наночастицами золота, полученными электросинтезом, и антителами к тропонину I (ПГЭ/Аиэ/ДДАБ/Ат'). Изменение потенциала (ДЕ) рабочего электрода ПГЭ/Аиэ/ДДАБ/Ат1/ после введения стандартных растворов тропонина I в систему представлено на рисунке 11 А. Изменение потенциала (ДЕ) рабочего электрода ПГЭ/Аи/ДДАБ/Ат1/ после введения образцов плазм крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда представлено на рисунке 11 Б.

Рисунок 11. А. Изменение потенциала (АЕ) рабочего электрода ПГЭ/Аи/ДЦАБ/Ат/ после введения стандартных растворов тропонина I в систему. О — стандартные растворы, не содержащие тропонин I. О —стандартные растворы с различной концентрацией тропонина I (от 0 до 9,14 нг/мл). Б. Изменение потенциача (АЕ) рабочего электрода ПГЭ/А и/ДДА£/Ат'/ после введения образцов плазм крови здоровых доноров и больных острым инфарктам миокарда. П — образцы плазм крови здоровых доноров. О — образцы плазм крови больных острым инфарктом миокарда (от 18,0 пг/мл до 1,6 нг/мл (0,8 - 69,0 пМ)). Условия измерения на электрод в горизонтальном режиме, покрывая рабочий, вспомогательный и электрод сравнения, наносили 55 мкл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 М ЫаС1 (рН 7,4), внесение образцов проводилось с интервалом 400с, объём вводимого образца 5 мкл. п = 3.

Как видно из представленного графика, для стандартных растворов, не содержащих тропонин I (■), изменение потенциалов рабочего электрода составляет 794 - 854 мкВ; для растворов, содержащих тропонин I (О), происходит уменьшение изменения потенциала рабочего электрода с увеличением концентрации белка на поверхности электрода. Минимально определяемая концентрация тропонина I с помощью данного метода составляет 45 пг/мл (2 пМ).

На следующем этапе были проанализированы образцы плазм крови здоровых доноров (И) и больных острым инфарктом миокарда (О). На рисунке 11Б представлен график изменения потенциала рабочего электрода ПГЭ/Аиэ/ДЦАБ/Ат1/ после введения образцов плазм крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда. Из представленного графика видно, что, как и в случае стандартных растворов тропонина I, для здоровых доноров наблюдается незначительное изменение потенциалов рабочего электрода — от 1387 до 1601 мкВ. Для образцов плазм крови, содержащих различные концентрации тропонина I, наблюдается уменьшение изменения потенциала рабочего электрода с увеличением концентрации тропонина I. Линейный диапазон определяемых концентраций для данного метода составляет 18,0 пг/мл - 1,6 нг/мл (0,8 - 69,0 пМ). Таким образом, минимально определяемая концентрация тропонина I потенциометрическим методом составляет 18,0 пг/мл (0,8 пМ). Потенциометрический метод определения тропонина I более чувствителен по сравнению с методом инверсионной вольтамперометрии, для которого минимально определяемая концентрация составляет 100,0 пг/мл (4,3 пМ).

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методики определения белков-маркёров инфаркта миокарда в плазме крови с помощью инверсионной, квадратно-волновой вольтамперометрии и потенциометрического анализа.

2. Отработаны условия модификации печатных графитовых электродов наночастицами золота и серебра, полученными электросинтезом и химическим синтезом, и магнитными наночастицами на основе оксидов железа.

3. Определены оптимальные электрохимические параметры регистрации наночастиц металлов на поверхности электрода с помощью инверсионной и квадратно-волновой вольтамперометрии.

4. Отработаны условия связывания белков-маркёров с соответствующими антителами на разных типах модификаций электродов (ПГЭ/Agэ/ДДAБ/AтI/плaзмa крови и ПГЭ/Аиэ/ДДАБ/Ат'/плазма крови).

5. Проведен сравнительный анализ разработанных иммуносенсоров по следующим параметрам: аналитическая чувствительность, воспроизводимость и диагностическая чувствительность. Наилучшие аналитические характеристики для метода инверсионной вольтамперометрии показали иммуносенсоры, модифицированные наночастицами золота, полученными электросинтезом, (для тропонина I и Т - 0,1 нг/мл (4,3 и 2,7 пМ), соответственно), диагностическая чувствительность - 87 %, относительное стандартное отклонение среднего результата не превышало 9%. Для потенциометрического метода определения тропонина I аналитическая чувствительность составила 18,0 пг/мл (0,8 пМ).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: Статьи:

1. Шумков A.A., Супрун Е.В., Шумянцева В.В., Арчаков А.И. Сенсорные электрохимические системы для анализа кардиомиоглобина// Биомедицина. 2010. №5. С. 146-148.

2. Шумков A.A., Супрун Е.В., Шумянцева В.В., Арчаков А.И. Сенсорный элемент на основе наночастиц золота для определения кардиомаркёров // Биомедицина. 2011. №3. С. 46-49.

3. Шумков A.A., Шумянцева В.В., Арчаков А.И. Новый электрохимический подход к определению тропонина I в плазме крови // Медицинский академический журнал. 2012. Том 12. №4. С. 40-42.

4. Andrey А. Shumkov, Elena V. Suprun, Sophiya Z. Shatinina, Alexander V. Lisitsa, Victoria V. Shumyantseva, Alexander I. Archakov. Gold and Silver Nanoparticles for Electrochemical Detection of Cardiac Troponin I based on Striping Voltammetry // BioNanoScience. 2013. V. 2. №3. P. 216-222.

5. Агафонова JI.E., Шумков A.A., Шумянцева В.В., Арчаков А.И. Новые подходы для определения кардиотропонина I в плазме крови // Вестник Российского государственного медицинского университета. 2013. №2. С. 75-79.

Материалы конференций:

6. Супрун Е.В., Шумков A.A. Золотые наночастицы как модификаторы поверхности графитовых электродов для электрохимических биосенсоров // Вестник Российского государственного медицинского университета. 2009. Специальный выпуск №3. С. 288-289.

7. Шумков А.А., Супрун Е.В. Электрохимические биосенсоры на основе наночастиц золота для определения кардиомаркёров тропонинов I и Т // Вестник Российского государственного медицинского университета. 2012. Специальный выпуск №1. С. 215.

8. Шумянцева В.В., Булко Т.В., Супрун Е.В., Агафонова Л.Е., Кузиков А.В., Чаленко Я.М., Шумков А.А., Арчаков А.И. Электрохимические методы в биомедицинских исследованиях // Биотехнология: состояние и перспективы развития. 2013. Материалы конгресса, часть 2. С. 149-150.

9. Shumyantseva V.V., Bulko T.V., Suprun E.V., Agafonova L.E., Kuzikov A.V., Chalenko Ya.M., Shumkov A.A., Archakov A.I. Electrocatalysis and electrochemical methods in biomedical researches // International conference «Biocatalysis-2013»: fundamentals & applications Abstract. 2013. P. 39-40.

10. Шумянцева B.B., Булко T.B., Супрун E.B., Агафонова Л.Е., Кузиков А.В., Чаленко Я.М., Шумков А.А., Арчаков А.И. Электрохимические методы в биомедицинских исследованиях // Материалы конференции IX всероссийской конференции «Химия и медицина» с молодежной научной школой по органической химии. Уфа-Абзаково. 2013. С. 27-28.

Список сокращений

ПГЭ/НЧ/ДДАБ/Ат/ — печатный графитовый электрод, модифицированный наночастицами (таблица 4), ДЦАБ и антителами к соответствующему белку маркёру инфаркта миокарда; Таблица 4. Тип наночастиц

Ацэ - наночастицы золота, полученные электросинтезом.

нч Аих - наночастицы золота, полученные химическим синтезом.

Aga - наночастицы серебра, полученные электросинтезом.

Agx - наночастицы серебра, полученные химическим синтезом.

Ат1 — моноклональные антитела к тропонину I; Атт - моноклональные антитела к тропонину Т;

дтсбсжк _ моноклональные антитела к сердечному белку, связывающему жирные кислоты; дткмб_ моноклональные антитела к кардомиоглобину;

Заказ № 25-Р/10/2013 Подписано в печать 10.10.13 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,2

' ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76

www.cfr.ru; e-mail: info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шумков, Андрей Алексеевич, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОМЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ ИМЕНИ В.Н.ОРЕХОВИЧА» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

На правах рукописи

04201363618

Шумков Андрей Алексеевич

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КАРДИОМАРКЕРОВ В ПЛАЗМЕ

КРОВИ

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, Шумянцева В. В.

Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ:............................................4

ВВЕДЕНИЕ...............................................................................................................7

ГЛАВА 1. ТЕСТ СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ БЕЛКОВ-МАРКЁРОВ ИНФАРКТА МИОКАРДА 12

1.1. Белки - маркёры инфаркта миокарда............................................................12

1.1.1. Тропонины.....................................................................................................13

1.1.2. Креатинкиназа - MB....................................................................................15

1.1.3. Кардиомиоглобин..........................................................................................16

1.1.4. сБСЖК............................................................................................................17

1.1.5. Цитохром с.....................................................................................................18

1.1.6. Перспективные белки-маркёры в диагностике инфаркта миокарда.......20

1.2. Клинические методы анализа белков-маркёров инфаркта миокарда........21

1.2.1. Лабораторные тесты, использующиеся в клиниках..................................22

1.2.2. Тест системы, использующиеся в клинической практике, и как самоконтроль для определения острого инфаркта миокарда.............................24

1.3. Роль нанотехнологий в биомедицинских исследованиях............................26

1.4. Новые подходы к созданию тест-систем для анализа белков-маркёров инфаркта миокарда..................................................................................................26

1.4.1. Оптические биосенсоры...............................................................................27

1.4.2. Акустические биосенсоры...........................................................................29

1.4.3. Биосенсоры на основе магнитных наночастич..........................................30

1.4.4. Пьезокварцевые иммуносенсоры................................................................32

1.4.5. Электрохимические биосенсоры.................................................................33

1.4.6. Альтернативные подходы к определению белков маркёров инфаркта

миокарда...................................................................................................................44

2

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................48

2.1. Материалы........................................................................................................48

2.2. Оборудование...................................................................................................49

2.3. Методики приготовления растворов..............................................................51

2.4. Методы..............................................................................................................54

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..........................................64

3.1. Модификация электродов наночастиц золота..............................................64

3.2. Модификация электродов наночастицами серебра......................................73

3.3. Модификация электрода магнитными наночастицами на основе оксидов железа.......................................................................................................................77

3.4. Изучение структуры модифицированных электродов.................................79

3.5. Разработка электрохимических иммуносенсоров на белки-маркёры инфаркта миокарда..................................................................................................82

3.6. Анализа тропонина I и Т с помощью разработанных электрохимических иммуносенсоров на основе AgH4 и АиНЧ...........................................................90

3.7. Определение сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и кардиомиоглобина.................................................................................................118

3.8. Определение цитохрома с в плазме крови..................................................125

3.9. Определение тропонина I по электрохимическому сигналу железа в составе магнитных наночастиц............................................................................130

3.10. Потенциометрический метод определения тропонина I.........................132

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................................137

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..................................................139

ПРИЛОЖЕНИЕ...................................................................................................161

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ:

СН - сердечная недостаточность;

ИМ - инфаркт миокарда;

ОИМ - острый инфаркт миокарда;

ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания;

НЧ - наночастицы;

Ат - антитела;

Ат1 - моноклональные антитела к тропонину I; Атт - моноклональные антитела к тропонину Т;

АтсБСЖК - моноклональные антитела к сердечному белку, связывающему жирные кислоты;

АткМб - моноклональные антитела к кардиомиоглобину;

КК - креатинкиназа;

КК-МВ - креатинкиназа МВ;

ИЛ - интерлейкин;

ФНОа - фактор некроза опухоли а;

ИФА - иммуноферментный метод анализа;

ЭРЯ - поверхностный плазмонный резонанс;

АиНЧ - наночастицы золота;

А§НЧ - наночастицы серебра;

мНЧ - магнитные наночастицы;

ДДАБ - диметилдидодециламмония бромид; ПГЭ - печатный графитовый электрод;

ПГЭ/Аиэ/ДДАБ/Ат/ - печатный графитовый электрод, модифицированный наночастицами золота (электросинтез), ДДАБ и антителами к соответствующему белку маркёру инфаркта миокарда;

ПГЭ/Аих/ДДАБ/Ат/ - печатный графитовый электрод, модифицированный наночастицами золота, стабилизированными ДДАБ в хлороформе (химический синтез) и антителами к соответствующему белку маркёру инфаркта миокарда;

ПГЭМ£э/ДДАБ/Ат/ - печатный графитовый электрод, модифицированный наночастицами серебра (электросинтез), ДДАБ и антителами к соответствующему белку маркёру инфаркта миокарда;

ПГЭ/Agx/ДДAБ/Aт/ - печатный графитовый электрод, модифицированный наночастицами серебра, стабилизированными ДДАБ в хлороформе (химический синтез) и антителами к соответствующему белку маркёру инфаркта миокарда;

ФБ - фосфатный буфер (рН 7,4);

ЦБ - цитратный буфер (рН 6,0);

Е - потенциал относительно А§М£С1, В;

V - скорость развертки потенциалов, В/с;

ИВА - инверсионная вольтамперометрия;

ДИВА - дифференциально-импульсная вольтамперометрия;

КВВА - квадратно-волновая вольтамперометрия;

I - время, с;

1:ох - время окисления, с; Еох - потенциал окисления, В;

время инкубации, мин; ^тм- время отмывки, мин; 1ЭЛ- время электросинтеза, с; СЭМ - сканирующая электронная микроскопия;

ВВЕДЕНИЕ

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются одной из основных проблем Российского здравоохранения. Подход к персональной оценке рисков и правильному диагнозу должен включать в себя следующие критерии: профиль лабораторных данных, клинические и визуальные данные пациентов [1].

В настоящее время в клинико-диагностических лабораториях для определения сердечных белков-маркёров основным методом остаётся иммуноферментный анализ (ИФА), с нижним диапазоном определяемой концентрации белка 10 пг/мл. Несмотря на высокую чувствительность, данный метод требует большой объём исследуемого образца (от 100 мкл), использует дополнительные расходные материалы, а сама процедура анализа занимает два часа. Кроме того, иммуноферментный анализ проводится в лабораториях стационаров, больниц и диагностических центрах, таким образом, время постановки диагноза составляет в среднем 6 часов [2]. Необходимость диагностики инфаркта миокарда (ИМ) в ранние сроки продиктована тем, что тромболитическая терапия в первые 2-6 часов снижает смертность в среднем на 30%, а терапия, начатая через 7-12 часов - лишь на 13% [3]. Тест-системы, которые разработаны на данный момент, и могли бы быть использованы в качестве профилактических тест-систем («ронй-о^саге») и на скорой помощи, не нашли широкого применения, так как являются полуколичественными и имеют высокий порог чувствительности, что может приводить к появлению большого количества ложноотрицательных результатов. Следовательно, необходимы новые диагностические подходы к определению белков-маркёров ИМ, которые бы отвечали требованиям, предъявляемым к профилактическим тест системам: портативность, минимальное время анализа, низкая стоимость, сменный тип сенсорного элемента, чувствительность и селективность к определению белков-маркёров [4, 5]. Создание диагностических систем нового поколения, отвечающих

требованиям, предъявляемым к профилактическим тест-системам, а так же выявление новых белков-маркёров инфаркта миокарда, является одним из приоритетных направлений в современных биомедицинских исследованиях.

В лаборатории биоэлектрохимии ФГБУ «ИБМХ» РАМН с 2008 года ведутся научные разработки новых подходов к определению белков-маркёров острого инфаркта миокарда (ОИМ) в плазме крови. Были получены патенты по прямому электрохимическому методу определения кардиомиоглобина на поверхности печатного графитового электрода. Определение кардиомиоглобина в плазме крови основано на прямом переносе электронов между гемовой группой кардиомиоглобина и поверхностью электрода [6, 7]. В то же время, большинство белков-маркёров ОИМ не содержат гемовой группы и находятся в достаточно низком диапазоне концентраций, например как тропонин I (20,4 пг/мл (0,9 пМ)) [8]. Определить такие белки на немодифициронной поверхности электрода, без дополнительного усиления сигнала не представляется возможным. В связи с этим необходимо разработать новый электрохимический подход к селективному определению кардиомаркеров острого инфаркта миокарда.

Цель исследования: разработка принципов электрохимического анализа биохимических маркёров острого инфаркта миокарда.

В соответствии с поставленной целью в диссертационной работе были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать метод определения белков-маркёров инфаркта миокарда в плазме крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда по сигналу наночастиц металлов методами инверсионной, квадратно-волновой вольтамперометрии и с помощью потенциометрического анализа.

2. Отработать условия модификации печатных графитовых электродов:

а) наночастицами золота, полученными химическим синтезом и электросинтезом,

б) наночастицами серебра, полученными химическим синтезом и электросинтезом,

в) магнитными наночастицами на основе оксидов железа.

3. Найти оптимальные параметры электрохимической регистрации наночастиц металлов на поверхности электрода с помощью инверсионной и квадратно-волновой вольтамперометрии.

4. Разработать условия связывания антител с соответствующими белками-маркёрами инфаркта миокарда плазмы крови (кардиомиоглобин, тропонин I, тропонин Т, сердечный белок, связывающий жирные кислоты) на модифицированных электродах.

5. Провести сравнительный анализ иммуносенсоров по следующим параметрам: аналитическая и диагностическая чувствительность, воспроизводимость.

Научная новизна работы

В процессе проведения исследования впервые разработаны методы: -электрохимического определения белков-маркеров острого инфаркта миокарда, таких как сердечный белок, связывающий жирные кислоты, кардиомиоглобин, тропонин I и Т в плазме крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда по интенсивности сигнала наночастиц металлов (наночастиц золота, серебра и магнитных наночастиц на основе оксидов железа), на поверхности печатного графитового электрода с помощью высокочувствительных электрохимических методов: инверсионной и квадратно-волновой вольтамперометрии.

-определения белка-маркёра тропонина I в плазме крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда потенциометрическим методом анализа, с использованием электродов, модифицированных

наночастицами золота, полученными электросинтезом. Показано, что аналитическая чувствительность потенциометрического метода анализа для разработанного электрохимического иммуносенсора на тропонин I составляет 18,0 пг/мл (0,8 пМ). Личный вклад автора

Соискателем проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Соискатель лично принимал участие в планировании экспериментов, осуществлял подбор необходимых условий в методиках и выполнении основных экспериментов. Практическая значимость исследования

Результаты диссертационной работы имеют практическую ценность в решении задач ранней диагностики острого инфаркта миокарда, а также возможности своевременной постановки диагноза, и, как следствие, начала лечения, в больницах и отделениях скорой помощи. Разработанные электрохимические иммуносенсоры на основе одноразовых печатных графитовых электродов, модифицированных наночастицами металлов, для определения белков-маркёров инфаркта миокарда (сердечный белок, связывающий жирные кислоты, кардиомиоглобин, тропонина I и Т) обладают высокой чувствительностью: диапазон минимально-определяемых концентраций в плазме крови составляет 2,7 - 4,3 пМ. Специфичность определения белков-маркёров обеспечивается за счёт нанесения на поверхность печатного графитового электрода, модифицированного наночастицами металлов, моноклональных антител к соответствующим белкам-маркёрам инфаркта миокарда. Диагностическая чувствительность составляет 87%. Относительное стандартное отклонение среднего результата не превышает 9%. Анализ требует малого количества исследуемого образца (1 мкл плазмы или сыворотки крови), измерение занимает 2 минуты и может проводиться с помощью портативного электрохимического анализатора. Разработанные иммуносенсоры могут быть использованы в качестве профилактических тест-систем для самоконтроля.

Апробация работы

Основные положения диссертации были представлены на IV Международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2009), VII Международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2012), II всероссийской научной конференции молодых учёных «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012). Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов (глава 2), изложения результатов и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 186 источник. Работа иллюстрирована 63 рисунками, 8 таблицами и 1 приложением.

Положения, выносимые на защиту:

-Разработка метода электрохимического определения белков-маркёров

острого инфаркта миокарда в плазме крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда по сигналу наночастиц металлов методом инверсионной и квадратно-волновой вольтамперометрии.

-Сравнительный анализ аналитической и диагностической чувствительности разработанных иммуносенсоров для определения белков-маркёров в плазме и сыворотке крови.

-Определение тропонина I потенциометрическим методом анализа с помощью электродов, модифицированных золотыми наночастицами, полученными электросинтезом, в плазме крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда.

ГЛАВА 1. ТЕСТ СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ БЕЛКОВ-МАРКЁРОВ ИНФАРКТА МИОКАРДА

1.1. Белки - маркёры инфаркта миокарда

В качестве первых маркёров инфаркта миокарда были предложены биологически активные вещества, такие как катехоламины, в частности, норадреналин. В 1990 году, была продемонстрирована взаимосвязь сердечной недостаточности с ренин-ангиотензиновой-альдостероновой системой [9]. После исследования катехоламинов, внимание исследователей было сосредоточенно на эндотелиальном пептиде (ЕТ)-1. Данный пептид состоит из 21 аминокислоты, и обладает мощным вазоконстрикторным действием [10]. (ЕТ)-1 пептид вызывает фиброз желудочков и эндотелия сосудов, а также является мощным индуктором высвобождения других нейрогормонов, в том числе и натрийуретического пептида. Последний, в свою очередь, играет важную роль в биогуморальной регуляции сердечной недостаточности. Например, попадая в кровеносное русло, мозговая изоформа натрийуретического пептида и Ы-терминальный про-натрийуретический пептид может свидетельствовать о повреждении кардиомиоцитов [11]. В 90-х годах в патофизиологию сердечной недостаточности был включён С-тип натрийуретического пептида [12]. Увеличение концентрации данного белка в крови указывает на тяжесть сердечной недостаточности [13]. В 90-х годах прошлого века была показана роль интерлейкинов (ИЛ-6) и фактора некроза опухоли а (ФНОа) в воспалительном процессе при сердечно-сосудистой недостаточности [14, 15], и был обнаружен новый биомаркёр сердечной недостаточности - пентраксин (РТХ)-З. Как ранний маркёр воспаления, данный маркёр принадлежит к семейству С-реактивного белка [16]. Высокая концентрация в плазме крови РТХ-3 может указывать на повреждение миокарда [17].

Сердечные тропонины - чувствительные и специфические маркёры ОИМ. Появление данных белков в крови служит показателем воспалительных и окислительных процессов в кардиомиоцитах, а также нервно-гуморальной активности [18]. Увеличение концентрации сердечного тропонина I показывает степень повреждения миофибрилл, а также может использоваться в качестве независимого прогностического фактора смертности при сердечной недостаточности [19, 20]. сБСЖК является белком-мар�