Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование транспортных форм гомоцистеина при различных состояниях организма

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Блашко, Эдуард Львович

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Современные исследования транспорта гомоцистеина в крови в условиях оксидативного стресса, характерного для гипергомоцистеинемии

1.2. Исследование эндотоксического действия гомоцистеина

1.3. Основные сведения о современных методах определения гомоцистеина

Глава 2. Методы исследования

2.1. Объекты исследования

2.2. Методы анализа гомоцистеина

2.2.1. Метод ВЭЖХ - анализа гомоцистеина со спектрофотометрическим детектированием

2.2.2. Количественное определение соотношения общего и восстановленной формы Гци в плазме крови пациентов с различной патологией

2.3. Методы биохимического мониторинга эффектов повышения концентрации гомоцистеина

2.3.1. Определение ТБК - активных продуктов, включая малоновый диальдегид в плазме крови ^

2.3.2. Определение БН - групп

2.4. Моделирование акселерации токсических эффектов на фоне гипергомоцистеинемии различного уровня введением экспериментальным крысам гомоцистина и его смеси с аргинином

2.5. Получение очищенных препаратов и анализ содержания альфа-2-макроглобулина

2.5.1. Количественное определение альфа-2-макроглобулина

2.5.2. Очистка альфа-2-макроглобулина и приготовление образцов, активированных трипсином. 4д

2.6. Изучение распределения гомоцистеина во фракциях плазмы крови здоровых доноров и у пациентов с различной степенью гипергомоцистеинемии методом гель - фильтрации

2.7.Изучение гидрофобной сорбции гомоцистеина крупно -молекулярными фракциями плазмы крови

2.8. Изучение связывания гомоцистеина очищенными препаратами альфа-2-макроглобулина, активированными и неактивированными трипсином.

2.9. Вспомогательные общепринятые методики

3.0. Математический анализ и статистическая обработка полученных данных

Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение

Изучение свойств аминотиолов и их производных.

3.1. Абсорбционные спектры производных аминотиолов

3.2. Оптимизация высвобождения гомоцистеина из 58 дисульфидных форм

3.3. Усовершенствование процедуры калибровки анализа

3.4. Селективность анализа гомоцистеина по отношению к глутатиону при использовании колонок с обращенно - фазными сорбентами типа С8 и С

3.5. Серийный анализ плазмы крови

3.6. Исследование эндотоксического действия гомоцистина (окисленного гомоцистеина) при состояниях оксидативного 83 стресса

3.6.1. Моделирование акселерации токсических эффектов на фоне гипергомоцистеинемии различного уровня введением экспериментальным дд крысам гомоцистина и смеси гомоцистина с аргинином

3.6.2. Измерение уровня тиоловых групп и продукта перекисного окисления липидов - малонового альдегида у пациентов с гипергомоцистеинемиями дд

3.7. Определение соотношения общего гомоцистеина и его восстановленной формы в образцах плазмы крови больных

3.8. Изучение связывания гомоцистеина активированным альфа-2-макроглобулином

3.8.1. Изучение распределения гомоцистеина при гель - фильтрации плазмы крови у здоровых доноров и у пациентов с различной степенью гипергомоцистеинемии

3.8.2. Изучение гидрофобной сорбции гомоцистеина крупномолекулярными фракциями плазмы крови

3.8.3. Изучение связывания гомоцистеина очищенными препаратами альфа-2-макроглобулина, активированными и неактивированными трипсином

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование транспортных форм гомоцистеина при различных состояниях организма"

С 90-х годов прошлого века концентрация общего гомоцистеина плазмы крови признана независимым фактором риска развития атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний [36,42,44,47,53,71].

Исследования последних 25 лет подтвердили гомоцистеиновую теорию развития атеро - тромботических нарушений. Ежегодно появляются десятки публикаций, посвященных разным сторонам этой проблемы [37,41,53,56,67,71,103,111,114,120,121,122,125,131,140]. До этого в лабораторной диагностике использовали анализ гомоцистеина в моче [34,59,142,143] для выявления наследственной энзимопатии цистатионин-бета-синтазы (КФ 4.2.1.22).

Гипергомоцистеинемия (ГГци) является фактором, в значительной степени обусловливающим неблагоприятные тромбоэмболические осложнения при сердечно-сосудистых заболеваниях. Этот лабораторный показатель стоит в одном ряду с известными факторами увеличения смертности при развитии заболеваний кардиоренального континуума, такими как артериальная гипертензия, микроальбуминурия (протеинурия), ожирение, курение, гиперлипидемия, системное воспаление, оксидативный стресс, анемия. Эти патологические состояния вносят большой вклад в показатели смертности. Пути снижения вклада ГГци в показатели смертности населения при сердечнососудистых заболеваниях, занимающих по смертности ведущее место, является весьма актуальным.

Для измерения содержания общего гомоцистеина (оГци) в плазме необходима депротеинизация образцов, чувствительные методы определения. До открытия связанного с белком Гци, диагностика умеренных повышений его уровня в плазме крови была крайне затруднительной. По этой причине, ранние эпидемиологические исследования по распространенности умеренной гипергомоцистеинемии (ГГци) были основаны на измерении уровня оГци после пероральной нагрузки метионином, которая временно увеличивала его уровень и в плазме крови. С введением методов измерения оГци в крови, предусматривающих обработку проб редуцирующими агентами, стало реальным измерение его уровня в крови, взятой натощак. Современные хроматографические методы определения содержания оГци в плазме крови включают применение газовой хроматографии с масс - спектрометрией и жидкостной хроматографии высокого разрешения с флуориметрическим, спектрофотометрическим или электрохимическим детектированием [37,38,39,40,62,63,64,83,130,132,144].

Гци и его дисульфидные формы, накапливающиеся в плазме крови в концентрациях выше 12-15 мкМ в пересчете на собственно гомоцистеин, токсичны для тканей [139]. При длительном воздействии повышенных концентраций этого метаболита усиливается атерогенез [74,94].

Гци циркулирует преимущественно в окисленном состоянии в виде смешанных дисульфидов альбумина [42,43,102,103], также смешанных дисульфидов с цистеином и глутатионом. В небольшом количестве в плазме крови можно обнаружить Гци в виде специфичной для него формы тиолактона -Гци. Примерно 1% Гци в крови находится в виде свободного тиола [42,102,103,133]. В бактериях (Escherichia coli) тиолактон гомоцистеина, по-видимому, участвует в регуляции клеточных функций [70]. Какова роль тиолактона гомоцистеина в регуляции обмена веществ у высших организмов до настоящего времени не выяснено.

В клинической лабораторной диагностике используется термин "общий гомоцистеин плазмы крови" (оГци), который обозначает сумму различных состояний этого вещества. Следует отметить, что токсическое воздействие гомоцистеина связано именно с общим количеством остатков вещества, так как гомоцистеин или его смешанные дисульфиды, вступая во взаимодействие с эндогенными тиолами, восстанавливаются и могут быстро отдавать электрон кислороду, превращая последний в супероксиданион [24,25]. Супероксиданион, в свою очередь, непосредственно участвует в реакциях перекисного окисления липидов и образования пероксинитрита в случае конъюгации с оксидом азота [31,50].

Вклад других белков, помимо альбумина, в транспорт Г ци изучен, к настоящему времени недостаточно. Актуальность этой проблемы велика в связи с тем, что при рецепторном эндоцитозе белков, связанный с ними Г ци, может возвращаться в некоторые клетки. Недостаточно изучен также вопрос о метаболитах оксидативного стресса организма при различных ГГци.

Методы анализа оГци, в настоящее время, можно сравнить по чувствительности, точности, воспроизводимости и другим важным в практическом отношении параметрам. Имеются портативные специализированные ВЭЖХ -анализаторы оГци, такие как система для определения Гци ОБЗОНсу с флуориметрическим детектированием продукта модификации Гци.

В связи с изучением транспортных форм Гци в плазме крови, его влиянием на окислительно - восстановительные равновесия других аминотиолов, участием в генерации супероксиданиона, ковалентных модификациях нативных белков, а также использованием в качестве диагностического маркера, разработка и совершенствование методов анализа оГци приобрели актуальность не только для развития фундаментальной биохимии, но и имеют большое практическое значение при реализации программ охраны здоровья населения [125]. Надо заметить, что очень важно выявлять отклонения по содержанию оГци в плазме крови человека как можно раньше, так как его повышение на 5 мкМ приводит к повышению риска тромбозов, аналогично повышению уровня холестерина на 0,5 мМ [60].

Для получения модифицированных производных Гци с целью его количественного определения как аминокислоты можно использовать флуоресцентную метку по функциональной аминогруппе ортофталевым альдегидом [37,38,39,40,130,132]. Эти исследования впервые позволили установить повышенный уровень оГци у жителей нашего региона.

Модификация Гци другими агентами по тиоловой группе, наряду с оГци, позволяет определять соотношение общего гомоцистеина и его восстановленной формы (вГци). Еще одно преимущество модификации по тиоловой группе -возможность одновременного специфического определения других тиолов -глутатиона и цистеина, а также метаболита глутатиона цистеинилглицина [62,63,83,144]. Для такого приготовления хромофорных аддуктов могут использоваться различные химические агенты. Одни позволяют работать с флуоресцирующими модификатами, другие выявлять продукты спектрофотометрическим методом детектирования в ходе хроматографического анализа (ДТНБ - реактив Эллмана) [61]. Ключевой проблемой всех видов анализа оГци является воспроизводимый и исчерпывающий перевод различных форм гомоцистеина, имеющихся в плазме крови и других образцах тканей, в одну регистрируемую производную форму [92,121]. В данной области аналитических исследований до настоящего времени продолжается усовершенствование и модификация методов выявления оГци, это явилось одной из первоочередных задач настоящего исследования.

Цель исследования

Цель исследования заключалась в развитии представлений о транспортных формах гомоцистеина в плазме крови с использованием современного высокочувствительного экспресс - метода ВЭЖХ - анализа оГци; а также в изучении некоторых показателей оксидативного стресса при ГГци различных степеней.

Задачи исследования

1. Изучить параметры хроматографического разделения хромогенных производных аминотиолов глутатиона, гомоцистеина и пеницилламина с использованием колонок обращенно-фазных сорбентов Св и С18.

2. Изучить УФ - спектры поглощения ТНБ - производных различных аминотиолов и зависимость абсорбции света в области максимума поглощения для производных гомоцистеина, глутатиона и пеницилламина при различных концентрациях.

3. Выявить оптимальные параметры температурной обработки при высвобождении гомоцистеина из связанных дисульфидных форм. Для моделирования связанного состояния гомоцистеина в плазме крови изучить возможность использования раствора альбумина в качестве белка со свободной тиоловой группировкой. Оптимизировать условия подготовки экспериментальных образцов плазмы крови, при которых Гци претерпевает полную модификацию, сопоставимую с таковой для Глт, изучить воспроизводимость исчерпывающего перевода различных форм Гци, имеющихся в плазме крови, в одну регистрируемую производную форму.

4. Исследовать связывание гомоцистеина с фракциями белков крови методом гель - фильтрации у здоровых доноров и у пациентов с гипергомоцистеинемией. Методом гель - фильтрации изучить транспорт гомоцистеина белками плазмы крови при умеренных и промежуточных формах гипергомоцистеинемии (от 15 до 100 мкМ).

5. Получить очищенные препараты альфа-2-макроглобулина из плазмы крови человека и изучить методом гель - фильтрации связывание гомоцистеина и активированными и неактивированными трипсином препаратами альфа-2-макроглобулина.

6. Изучить влияние однократных инъекций препарата гомоцистина и его смеси с субстратом N0 - синтаз (КФ 1.14.13.39) аргинина экспериментальным животным на концентрации свободных тиоловых групп, малонового диальдегида и ТБК - активных продуктов.

7. Изучить корреляцию между уровнем гомоцистеина и концентрацией ЗН-групп, малонового диальдегида и ТБК - активных продуктов при умеренных и промежуточных формах гипергомоцистеинемии (от 15 до 100 мкМ).

Научная новизна

1. Показано, что при различных степенях гипергомоцистеинемии (ГГци), в отличие от здорового состояния организма, значительная часть Гци связывается не с альбумином, а с глобулиновыми фракциями плазмы крови, в частности, с альфа-2-макроглобулином (МГ).

2. Связывание гомоцистеина МГ становится возможным после активации последнего протеиназой, т.е. после экспрессии свободных тиоловых групп МГ. В работе показано, что тиоловые группировки активированного МГ являются центрами связывания Гци.

3. Впервые было показано, что Гци образует очень прочные, смешанные дисульфиды белков, которые могут быть полностью восстановлены только в более жестких условиях, чем другие дисульфиды.

4. Проанализирован протективный при развитии ПОЛ эффект аргинина при

ГГци.

5. Предложенная методика анализа Гци позволяет выявлять различные эндогенные аминотиолы и их восстановленные формы, в частности восстановленную форму Гци, которая содержится в значительно меньших количествах, чем оГци.

Практическая значимость исследования

1. Проведена модификация метода определения общего гомоцистеина (оГци) в плазме крови с предколоночной модификацией ДТНБ и фотометрическим детектированием продуктов реакции. Процесс подготовки проб сокращен с 10 до 7 стадий с одним буферным раствором для приготовления восстановителя -дитиотреитола и модификатора - ДТНБ.

2. Модификация метода определения оГци с предколоночной обработкой проб ДТНБ и фотометрическим детектированием позволяет определять соотношение общего и восстановленных форм Гци и Глт.

3. Впервые, в качестве калибровочных растворов, использовались растворы окисленного Глт и Гци, приготовленные с использованием сывороточного альбумина в качестве матрицы. Солюбилизация Гци альбумином позволяла моделировать образование дисульфидов Гци в крови. Растворы окисленных Глт и Гци, приготовленные на альбумине, рекомендуются в качестве калибровочных при анализе серий образцов плазмы крови.

4. В процессе обследования пациентов с церебрально - васкулярными нарушениями кровообращения, коронарным атеросклерозом, хронической почечной недостаточностью (ХПН) показано, что повышение содержания оГци выше нормы (<12 -15 мкМ) сопровождается активацией ПОЛ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Для анализа эндогенных аминотиолов с близкими параметрами удерживания при разделении с использованием обращенно - фазных сорбентов наряду с колонками на основе октадецильных сорбентов (С18) допустимо использовать обращенно - фазные сорбенты с октильными радикалами (Св).

2. УФ - спектры поглощения ТНБ - производных гомоцистеина, глутатиона и пеницилламина имеют совпадающий для различных производных аминотиолов максимум светопоглощения в области ЗЗОнм. Зависимость абсорбции света в области максимума поглощения для производных гомоцистеина, глутатиона и пеницилламина при различных концентрациях описывается линейными близкими друг другу уравнениями: для оГци у (тА11) = 1,209х + 1,071 (г = 0,9992); для Глт у (тАи) = 1,384х - 0,334 (г = 0,9999); для Пна у (тА11) = 1,376х + 0,342 (г = 0,9999).

3. В ходе инкубации в течение 10 минут при +60°С в среде избыточного содержания дитиотреитола наблюдается исчерпывающий перевод изученных аминотиолов в восстановленное состояние (и поддержание в восстановленной форме) с соответствующим образованием ТНБ - производных, тогда как при более низкой температуре +45°С в среде дитиотреитола наблюдается пониженный выход аминотиолов, в особенности, гомоцистеина.

4. В норме Гци связывется как с альбуминовыми фракциями, так и с крупномолекулярными фракциями крови в количестве 0,195±0,030 мкмоль/г белка и 0,175±0,026 мкмоль/г белка соответственно. При различных степенях гипергомоцистеинемии выявлено резкое повышение содержания Гци, связанного с крупномолекулярными фракциями - примерно 1,6 мкмоль/г белка, что почти в 10 раз больше, чем в плазме крови здоровых доноров.

5. Очищенные препараты альфа-2-макроглобулина после активации трипсином экспрессируют тиоловые группировки и связывают (по данным метода гель - фильтрации) гомоцистеин, в отличие от неактивированных препаратов альфа-2- макроглобулина.

6. В случае с ТБК - активными продуктами и собственно МДА, введение аргинина экспериментальным животным смягчает прооксидантные эффекты Гци, наряду с этим, тормозя окисление свободных тиолов плазмы крови.

7. При анализе концентрации тиоловых групп в плазме крови различных контингентов обследованных с гипергомоцистеинемией и уровня восстановленного Гци показано, что доля восстановленного Гци (вГци) увеличивается, а содержание тиоловых групп снижается при умеренной и промежуточной формах гипергомоцистеинемии различного генеза.

8. Предложенная модификация метода анализа гомоцистеина позволяет выявлять восстановленные формы гомоцистеина, присутствующие в плазме крови в концентрации до 0,1 мкМ и общую форму гомоцистеина и глутатиона в широком диапазоне концентраций.

9. Разработана высокочувствительная воспроизводимая, селективная модификация ВЭЖХ - анализа гомоцистеина и глутатиона на основе регистрации продуктов взаимодействия исследуемых аминотиолов и ДТНБ.

Внедрение результатов в практику

Результаты исследований внедрены в практику работы кафедр факультетской терапии, пропедевтики внутренних болезней, госпитальной хирургии №1; лаборатории интенсивного гемодиализа нефрологического центра ГОУ ВПО СПбГМУ имени И.П. Павлова Росздрава; лаборатории гомеостаза ЦЛД ГОУ ВПО СПбГМУ имени И.П. Павлова Росздрава; в практику обследования пациентов поликлиники №31 Петроградского района г. Санкт - Петербурга.

Апробация работы

Результаты исследований и основные положения работы были представлены на Международном Симпозиуме "Аналитический Форум - 2002" (Москва, 17 - 18.04.2002 г.) по высокоэффективным жидко-фазовым разделениям и смежным технологиям, организованном компанией "Hewlett Packard" // Agilent Technologies" (Germany) и ЗАО "Юнилаб" (Россия); на Симпозиуме "100 лет хроматографии" - 3-ем Международном Симпозиуме по современным разделениям в биологических исследованиях (Москва, 03 - 18.05.2003г.), на Симпозиуме "Неделя здорового сердца и мозга" (Санкт-Петербург, 25 - 30.05.2003 г.), на научно-практической конференции "Лабораторные исследования в диагностике сердечно-сосудистой патологии" (Санкт-Петербург, 14.04.2005г.), на Симпозиуме "Неделя здорового сердца и мозга" (Санкт-Петербург, 25 - 26.05.2005 г.), на Международном Конгрессе "ГИПЕРТЕНЗИЯ - от Короткова до наших дней" (Санкт-Петербург, 15 - 17.09.2005г.).

Публикации

По теме диссертации в отечественной и зарубежной печати опубликовано 11 работ, в том числе 7 статей. Внедрено одно рационализаторское предложение.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка используемых сокращений. Диссертация изложена на 125 печатных страницах, работа иллюстрирована 10 таблицами и 33 рисунками. Указатель литературы включает 40 отечественный и 104 иностранных источников.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Блашко, Эдуард Львович

Выводы

1. Параметры удерживания хромогенных производных аминотиолов допускают использование колонок с обращенно - фазными сорбентами двух типов модификаций - С8 и Ci8 для одновременного анализа гомоцистеина и гутатиона.

2. При переводе всех форм связанного гомоцистеина в восстановленную форму образуются ТНБ - производные, характеризующиеся таким же светопоглощением при А = ЗЗОнм, что и ТНБ - производные глутатиона, составляющим 1,28 mau/мкМ.

3. В результате 10 минут инкубации при +60°С наблюдается исчерпывающий и необратимый перевод различных аминотиолов в восстановленное состояние с соответствующим образованием ТНБ производных.

4. Связывание остатков гомоцистеина альбумином моделирует состояние этого аминотиола в крови и позволяет в ходе анализа контролировать полноту получения его хромогенных производных.

5. В плазме крови больных с гипергомоцистеинемией значительная часть гомоцистеина, в отличие от гомоцистеина здоровых доноров, связывается с крупно - молекулярными фракциями крови.

6. Очищенные препараты активированного трипсином альфа-2-макроглобулина, в отличие от неактивированного, связывают гомоцистеин.

7. Введение аргинина экспериментальным животным в дозе 100 мкмоль/кг смягчает прооксидантные эффекты гомоцистеина в отношении содержания свободных SH-групп и нарастания уровня МДА.

8. При умеренной и промежуточной формах гипергомоцистеинемии (от 15 до 100 мкМ) у пациентов с коронарным атеросклерозом наблюдается положительная корреляция между уровнем гомоцистеина и концентрацией малонового диальдегида и ТБК - активных продуктов и отрицательная корреляция между уровнем оГци и содержанием тиоловых групп.

9. Предложенная модификация метода пригодна для серийных анализов общего гомоцистеина плазмы крови и его различных форм в диагностической практике и научных исследованиях.

Заключение

Так же как и Гци, другие аминотиолы в плазме крови находятся, главным образом, в связанном с белком состоянии. Соотношения свободного с белком аминотиола составляют 0,2 для Гци, около 0,5 - 0,6 для цистеина и 4-5 для Глт [92]. Позднее было показано, что скорость связывания Гци с белками ниже, чем у цистеина и Глт, но в реакционных смесях с другими аминотиолами Гци, в отличие от других аминотиолов, практически полностью связывался с альбумином [92,93]. Связывающая способность белков плазмы крови в отношении Гци составляет 4,88±0,51 и 4,74±0,68 мкмоль/г для здоровых мужчин и женщин, соответственно [133]. Тиоловая группа цистеинового остатка в 34 положении в альбумине имеет необычно низкое значение рКа, приближающееся к 5,0 [62,140]. В противоположность другим эндогенным аминотолам, включая Гци, это довольно низкое значение. При рН 7,4 в плазме крови тиолат - анион альбумина термодинамически более стабилен, чем тиолаты других аминотиолов, тем более, что он стабилизируется электростатическим взаимодействием с гистидиновым остатком по 39 положению. Тиолат - анион альбумина гомоцистеинилируется при физиологических рН смешанными дисульфидами Гци и гомоцистином. Гци (рКа^н) = 8,7) имеет более высокое значение константы ионизации тиоловой группы, чем цистеин, рКа^н) = 8,15. Известно, что при атаке тиолат - анионом смешанных дисульфидов, уходящим из дисульфидной связи смешанных аминотиолов является тот, у которого рКа^н) ниже. Это означает, что в плазме крови в дисульфидах белков должно обнаруживаться больше Гци, чем в низкомолекулярных дисульфидах. Такое положение полностью соответствует картине наблюдаемой в плазме крови, в которой обнаруживается менее 20% Гци в виде низкомолекулярных дисульфидов и до 1,5-10% восстановленного Гци. При окислении восстановленного Гци в присутствии кислорода наблюдается генерация перекиси водорода. Исходя из имеющихся литературных и представленных в настоящем исследовании данных можно сделать вывод о том, что Гци образует дисульфиды при взаимодействии с тиоловыми группами белков медленнее, чем другие низкомолекулярные эндогенные тиолы. За счет того, что в смешанных дисульфидах гомоцистеинилированных белков связь прочнее, чем в дисульфидах цистеина или Глт, в растворах, содержащих белки, свободного Гци и его низкомолекулярных дисульфидов в растворах содержится относительно небольшое количество (Рис. 10).

В настоящем исследовании для солюбилизации гомоцистина мы использовали сывороточный альбумин человека, с помощью которого моделировали образование дисульфидов с белком. Растворы окисленных Глт и Гци, приготовленные на альбумине, мы использовали в качестве калибровочных при анализе серий образцов плазмы крови. Этот вариант калибровки стал возможен после того, как было доказано, что одинаковое количество Гци и Глт ТНБ - производных может быть получено восстановлением ДТТ в течение 10 минут при +60°С (рис. 8 и 9) и получаемые хромофорные аддукты имеют практически идентичные УФ - спектры поглощения с максимумом при ЗЗОнм. Ранее считалось, что продукты модификации различных аминотиолов имеют разные спектры поглощения в аналитическом диапазоне длин волн, при этом ТНБ - производное Гци имеет более низкое светопоглощение, чем производное Глт [121].

В настоящем исследовании показано, что этот эффект следует объяснять более полной модификацией других аминотиолов по сравнению с Гци (видимо из-за особенностей рКа тиоловой группировки). Как описано в разделе "Результаты исследований" (разд. 3.2.), после 10 минутной инкубации пробы при +60°С наблюдалась одинаковая хромогенность для Глт и Гци - производных. Смешанные с альбумином дисульфиды типа Тци-Бвз^альбумин более стабильны, чем низкомолекулярные в свободном состоянии. Мы употребляли процедуру калибровки с раствором двух аминотиолов, так как это давало возможность контролировать завершенность модификации обоих типов аминотиолов. Использование для калибровки пеницилламина или Глт совместно с Гци оправдано, так как при этом достигается контроль полноты модификации аминотиолов с различными свойствами тиоловых групп. При анализе серии проб с предложенным вариантом калибровки порядок приготовления и анализа проб построен так, что первую и последнюю пробы анализируют дважды, с прибавлением и без прибавления калибрующего раствора. Разница в площадях пиков анализируемых соединений со стандартом и без него позволяет проверять полноту выхода производных в ходе пробоподготовки. Таким образом, модификация анализируемых аминотиолов 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойной кислотой) в тандеме с восстановлением дитиотреитолом пригодна для проведения серийных анализов большого количества проб. Около 100 проб с плазмой крови и несколько калибрующих проб внутри серии анализов может быть проанализировано в автоматическом режиме за 21 час. Стандартная смесь из двух аминотилов, введенная в первый и последний образец серии, обеспечивала получение точных и воспроизводимых результатов. Для анализа, занимающего 11-12 мин, могут быть использованы обращенно - фазные колонки Се и С^. Преимущества предложенного метода анализа Гци: высокая точность; возможность выявления окисленных и восстановленных форм Гци; одновременный анализ других аминотиолов, включая Глт; быстрота и небольшой расход дорогостоящих реактивов в процессе пробоподготовки; высокая производительность анализа в режиме последовательности.

В результате проведенных экспериментов показано, что предложенный метод ВЭЖХ - анализа пригоден для серийных анализов оГци плазмы крови в диагностической практике и научных исследованиях.

В соответствии с полученными данными при ГГци значительная доля Гци переносится крупномолекулярными фракциями.

Количество транспортируемого этими фракциями Гци при гипергомоцистеинемии коррелирует с уровнем активированного МГ плазмы крови. Известно, что при активации, т.е. связывании протеиназ и некоторых других молекул, в активном центре этого поливалентного ингибитора экспрессируются свободные тиоловые группировки [13,68,76,123].

По - видимому, эти тиоловые группировки являются центрами связывания Гци. Таким образом, связывающая способность крупномолекулярных фракций плазмы крови зависит оттиоловых групп белков, в том числе активированного МГ. Экспрессия тиоловых группировок в молекуле МГ in vivo, в свою очередь, обусловлена активацией протеолитических систем крови, задействованных в регуляции свертывания и фибринализа, регуляции сосудистого тонуса [68,76,123]. После активации МГ быстро связывается с рецепторами макрофагов [91, 129].

Видимо, при патологических состояниях, сопровождающихся активацией протеолитических систем, происходит увеличение доли Гци, транспортируемого в составе активированного МГ (Рис. 32). Известно, что активированный МГ быстро извлекается из кровотока макрофагами, экспрессирующими рецептор LRP (Lipoprotein-Related-Protein-receptor) [13,68,76]. Макрофаги являются носителями этого рецептора и в большом количестве обнаруживаются при развитии атеросклероза в субэндотелиальном пространстве.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Блашко, Эдуард Львович, Санкт-Петербург

1. Асатиани В.А. Новые методы биохимической фотометрии// Изд. "Наука".-Москва,- 1965,-С. 196-197.

2. Владимиров Ю.А., Азизова O.A., Деев А.И. и др. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика,- 1991,- Т. 29,- С. 3,250.

3. Волин М.С.,.Дэвидсон К.А., Камински П.М. и др. Механизмы передачи сигнала оксидант- оксид азота в сосудистой ткани // Биохимия,- 1998.- Т. 63,- №7,-С. 958-965.

4. Донченко Е.В., Кочегура Т.Л., Шабуневич Л.В. Возможности компенсации у больных онкологического профиля с сопутствующей сердечно сосудистой патологией // В сборнике "Системные аспекты патологии" СПбМИ им. акад. И.П. Павлова.- Спб.-1991.- С. 14 -16.

5. Дорофейков В.В., Фрейдлин Т.С. Энзимологические методы определения альфа-2-макроглобулина и антитриптической активности плазмы крови // В сборнике "Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии",-СПб,- 1998.-Т.2.-С. 537- 542.

6. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика,- Москва,-1991,-С. 440-441.

7. Есауленко А.Н. Сорбенты для высокоэффективной жидкостной хроматографии ZORBAX™. Руководство для пользователей,- Киев- 2001.- С. 11.

8. Жлоба A.A. Очистка и свойства цистеиновых катепсинов тканей животных // Укр. Биохим. Журн,-1986,-Т. 58,-№4,- С. 100-113.

9. Жлоба A.A., Куликова А.И., Румянцев А.Ш., Козлов В.В. Исследование механизмов торможения лизосомального протеолиза при протеинурии // Третья конференция нефрологов Северозапада РСФСР,- Тезисы докладов,- Новгород,-1991.-С. 163.

10. Жлоба A.A. Лабораторная диагностика нарушений свободно радикального метаболизма // Методическое пособие.- СПб.- Изд.СПбГМУ им. И.П. Павлова.-2001.- С.25-27.

11. Жлоба A.A., Иванова С.Ю. Изучение свойств и выявление экспрессии рецептора активированного альфа-2-макроглобулина человека // Клиническая лабораторная диагностика.- 2002,- №4,- С.7-11.

12. Жлоба A.A., Никитина В.В. Выявление и лечение гипергомоцистеинемий. Пособие для врачей,- Москва 2004,- Изд. "Дружба народов",- С. 3-19.

13. Карпищенко А.И. Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы).- Спб,-1997.- Изд. "Интермедика".- 1997.- С. 296.

14. Карякина И.Ю., Зарембский P.A., Балябина М.Д. Использование метода комплексного определения активности трипсиноподобнгых протоеиназ, а1-антитрипсина и альфа-2-макроглобулина в гастроэнтерологической клинике // Лабораторное дело.- 1990,- №2.- С. 10-13.

15. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Липиды, липопротеиды и атеросклероз.-СПб,- 1995,-С. 356.

16. Комаров Ф.И., Коровкин Б.Ф., Меньшиков В.В. Биохимические исследования в клинике.- Элиста,- Изд."Джангар".- 1998.- С. 249.

17. Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалева Ж.В. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина // Вопр. мед. хим.- 1990,- Т.36.- №2,- С. 88-91.

18. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии.- Москва,- «Высшая школа».- 1980.-. 272 с.

19. Маеда X., Акаике Т. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке//Биохимия- 1998,- Т.63.- № 7,- С. 1007-1019.

20. Мецлер Д. Биохимия,- Москва- Изд. "МИР".- 1980,- Т.2.- С. 606.

21. Микеша О. Гликольметакрилатные гели сферой для хроматографии и биохимии // Методическое руководство фирмы "Лахема".- Чехия,- 1984.- С. 24.

22. Прайор У. Свободные радикалы в биологии.- Москва,- Изд. "Мир",- 1979.-Т.2.- С. 82-83.

23. Селютина С.Н., Селютин А.Ю., Паль А.И. Модификация определения ТБК-активных продуктов сыворотки крови // Клиническая лабораторная диагностика,-2000,- №2,- С. 8-10.

24. Сергеев П.В. Биологические мембраны.- Москва,- 1973.- Изд. "Медицина"-С. 248.

25. Соколовский В.В. Тиоловые антиоксиданты в молекулярных механизмах неспцефической реакции организма на экстремальные воздействия // Вопр. мед. химии,- 1988,- Т.34,- №6,- С. 52-56.

26. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // В книге "Современные методы в биохимии".- Москва.- Изд."Медицина".- 1977,- С. 66-68.

27. Стокле Ж.-К., Мюлле Б., Андрианцитохайна Р., Клещев А. Гиперпродукция оксида азота в патофизиологии кровеносных сосудов // Биохимия.- 1998.- Т.63.-№7,- С. 976-983.

28. Титов В.Н. Липопротеиды высокой плотности: структура, функция и диагностическое значение // Клиническая лабораторная диагностика,- 2000,- №2,-С. 25-32.

29. Титов В.Н. Рецепторный эндоцитоз полиеновых кислот: чувствительность и резистентность к атеросклерозу // Клиническая лабораторная диагностика.- 1999.-№1.-С. 3-8.

30. Тиц Н.У., Финли П.Р., Логан Н.М., Нельсон А.Д. и др. Клиническая оценка лабораторных тестов.- Москва.- Изд. "Медицина".- 1986,- С. 480.

31. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии -Москва. Изд. "Мир",-1981,- .Т.2.- С. 599-608.

32. Черкас Ю.В. Г ипергомоцистеинемия как фактор риска развития ишемической болезни сердца: Автореф. дисс. канд. биолог, наук.- Спб,- 2001.- С. 5-6.

33. Черкас Ю.В.Краснова И.Н., Карцова Л.А. Определение аминокислот в плазме крови в режиме изократической обращенно фазовой ВЭЖХ // Материалы Всероссийского симпозиума по теории и практике хроматографии и электрофореза.- Москва,- 1998.- С. 91.

34. Черкас Ю.В., Денисенко Т.В., Карцова Л.А. Краснова И.Н. Количественный анализ аминокислот в сыворотке крови человека методом обращенно фазовой жидкостной хроматографии в режиме изократического элюирования // Аналит. химия,- 2000.- Т.55.- №1,- С. 66-74.

35. Черкас Ю.В., Денисенко А.Д. Определение содержания гомоцистеина в плазме крови человекак методом изократической обращенно фазовой жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)// Клин. лаб. диагн,- 2001.- №5.- С. 35-37.

36. Alemán G.,Tovar A.R., Torres N. Metabolismo de la homocisteína y riesgo de enfermedades cardiovasculares: Importancia del estado nutricio en ácido fólico, vitaminas B6 у B12 // Rev. Invest. Clin.- 2001.- V.53.- №2,- P. 141-151.

37. Andersson A., Isaksson A., Hultberg B. Homocysteine export from erythrocytes and its implication for plasma sampling //Clin. Chem. 1992.- V. 38,- P. 1311-1355.

38. Bautista L.E., Arenas I.A., Penuela A., Martinez L.X. Total plasma homocysteine level and risk of cardiovascular disease: a meta-analysis of prospective cohort studies // J. Clin. Epidemiol.- 2002.- V.55.- P. 882-887.

39. Benesch R.E. The acid strength of the -SH group in cysteine and related compounds //J. Am. Chem. Soc.- 1955.- V.77.- P. 5877-5881.

40. Boushey C.J., Beresford S.A, Omenn G.S., Motulsky A.G. A quantitative assessment of plasma homocysteine as a risk factor for vascular diseaseprobable benefits of increasing folic acid intakes // JAMA.- 1995,- V.274.- P. 1049-1057.

41. Braakman I., Helenins J., Helenins A. Role of ATP and disulphide bounds during protein folding in the endoplasmic reticulum // Nature.- 1992,- V. 356.- № 6366,- P. 260262.

42. Brown M.S., Goldstein J.L. Scavenging for receptors // Nature.- 1990.- V. 343.-№3.- P. 508-509.

43. Brown A.S., Moro M.A., Masse J.M. et al. Nitric oxide-dependent and independent effects on human platelets treated with peroxinitrite // Card. Res 1998-V.40- P. 380-388.

44. Cenas N.H., Nivinskas Z., Anusevicius J. et. al. pH-dependent substrate preference of pig heart lipoamide dehydrogenase varies with oligomeric state: Response to Mitochondrial Matrix Acidification // J. Biol. Chem.- 2005,- V. 280,- №16,-P. 16106-16114.

45. Caselli A., Marzocchini R., Camici G. et. al. The inactivation mechanism of low molecular weight phosphotyrosine-protein phosphatase by H2O2// J. Biol. Chem.- 1998.-V.273.- №49.- P. 32554-32560.

46. Cattaneo M. Hyperhomocysteinemia, atherosclerosis and thrombosis // Thromb. Haemost.- 1999,-V. 81,- P. 165-176.

47. Christodoulou J., Sadler P., Tucker A. 1H NMR of albumin in human blood plasma: drug binding and redox reactions at Cys34 // FEBS Lett.- 1995,- V. 376,- P. 1-5.

48. Clarke R.; Smith A. D.; Jobst K.A.et. al. Folate, vitamin B12 and serum total homocysteine levels in confirmed Alzheimer disease // Arch. Neurol.- 1998,- V.55:-№11.- P. 1449-455.

49. Collins T. Endothelial nuclear factor kB and the initiation of the atherosclerotic lesion // Lab. Invest.- 1993,-V.68.- P. 499-508.

50. Cunnick, J.M., Dorsey J.F., Mei L., Wu J. Reversible regulation of SHP-1 tyrosine phosphatase activity by oxidation // Biochem. Mol. Biol. Int.- 1998.- V.45.- №5:- P. 887894.

51. Denu J.M. and Tanner K.G. Specific and reversible inactivation of protein tyrosine phosphatases by hydrogen peroxide: Evidence for a sulfenic acid intermediate and implications for redox regulation // Biochem 1998.- V. 37,- №16- P. 5633-5642.

52. De Groot P.G., Willems C., Boers G.H. et. al. Endothelial cell dysfunction in homocystinuria //Eur. J. Clin. Invest 1983-V. 13,- №5,- P. 405-410

53. Dudman N.P.B., Hicks C., Lynch J. et. al. Homocysteine thiolactone disposal by human arterial endothelial cells and serum in vitro //Arterioscler. Thromb.-1991.- V.11.-№3,- P. 663-670.

54. Ellmann G.L. Tissue sulfhydryl groups // Arch. Biochem. Biophys.- 1959.- V.82.-P. 70-77.

55. Fermo I., Arcelloni C., Mazzola G. et. al. High-performance liquid chromatographic method for measuring total plasma homocysteine levels // J. Chromatogr. B. Biomed. Sei. Appl.- 1998,- V.719.- P. 31-36.

56. Fermo I, de Vecchi E, Arcelloni C. et. al. Methodological aspects of total plasma homocysteine measurement // Haematologica.- 1997.- V.82.- P. 246-250.

57. Fiskerstrand T., Refsam H., Kvalheim G., Ueland P.M. Homocysteine and other thiols in plasma and urine: automated determination and sample stability // Clin.Chem.-1993.- V. 39.- №2,- P. 263-271.

58. Freidman M., Cavins J.F. and Wall J.S. Relative nucleophilic reactivities of amino groups and mercaptide ions in addition reactions with a,b-unsaturated compounds // J. Am. Chem.Soc.- 1965,-V.87.- P. 3672-3682.

59. Fülle S.; Mecocci P.; Fano G. et. al. Specific oxidative alterations in vastus lateralis muscle of patients with diagnosis of chronic fatigue syndrome // Free Radic. Biol, and Med.- 2000,- V.29.- P. 1252 -1259

60. Gielchimsky Y., Elstein D., Green R.N. et al. High prevelance of low serum vitamin B12 in multy-ethnic Israeli population // Br. J. of Haematology.- 2001. V.115.-P. 707-709.

61. Gonias S.L., La Marre J., Crookston K.P. et al. a2 macroglobulin and the a2 macroglobulin receptor/LRP, a groth regulatory axis // Ann. N. Y. Acad. Sei.- 1994-V.737.- P. 273-290.

62. Green J.M. A practical guide to analytical method validation // Anal Chem-1996.- V.68.-P. 305A-309A.

63. Goodrich-Blair H., Kolter R. Homocysteine thiolactone is a positive efector of rs levels in Escherichia coli//FEMS Microbiol. Lett.- 2000,-V. 185,-P. 117-121.

64. Guba S.C., Fink L.M., Fonseca V. Hyperhomocysteinemia. An emerging and important risk factor for thromboembolic and cardiovascular disease // Am. J. Clin. Pathol.- 1996,-V. 105,- P. 709-722.

65. Halliwell B., Chirico S. Lipid peroxidation Its mechanism, measurement, and significance//Am. J Clin. Nutr.- 1993-V.577- P. 715-725.

66. Harjai K.J. Potential new cardiovascular risk factors: left ventricular hypertrophy, homocysteine, lipoprotein(a), triglycerides, oxidative stress, and fibrinogen // Ann. Intern. Med.- 1999,- V.131.- P. 376-386.

67. Herrmann W, Knapp J.P. Hyperhomocysteinemia: a new risk factor for degenerative diseases // Clin. Lab.- 2002.- V.48.- №9-10,- P. 471-481.

68. Hogg N., Ravinder J. Singh and Kalyanaraman B. The role of glutathione in the transport and catabolism of nitric oxide // FEBS Lett.- 1996,- V. 382,- P. 223-228.

69. Holtet L.T., Nielsen K.L., Etzerodt M. Receptor- binding domain of human a2-macroglobuline. Expression, folding and biochemical characterization of hight- affinity recombinant dirivate // FEBS Lett.- 1994,- V.344.- P. 242-246.

70. Hwan C., Sinsky A.J., Lodish H.F. Oxidized redox state of glutathione in the endoplasmic reticulum // Science.- 1992.- V. 257,- №5076,- P.1496-1502.

71. Jakubowski H. Metabolism of homocysteine thiolactone in human cell cultures. Possible mechanism for pathological consequences of elevated homocysteine levels // The Am. Soc. for Biochem. and Molec. Biol. Inc. -1997. -V.272. -№3. -P. 1935-1942

72. Jakubowski H. The determination of homocysteine thialoctone in biological samples //Anal. Chem.- 2002,- V.308.- P. 112-119.

73. Jensen P.H., Moestrup S.K., Gluemann J.-J. Purification of the human placental oc2- macroglobuline receptor// FEBS Lett.- 1989.-V.255.- № 2,- P. 275-279.

74. Jourd'heuil D., Hallen K., Feelisch M., Grisham M.B. Dynamik state of S-nitrosothiols in human plasma and whole blood // Free Radic. Biol. Med.- 2000.- V.28.-P. 409-417.

75. Kim Y.-M., de Vera M.E., Watkins S.C. and Billar T.R. Nitric oxide protects cultured rat hepatocytes from tumor necrosis factor-induced apoptosis by inducing heat shock protein 70expression // J. Biol. Chem.- 1997,-V. 272,- P. 1402-1411.

76. Kim Y.-M., Talanian R.V. and Billiar T.R. Nitric oxide inhibits apoptosis by preventing increases in caspase-3-like activity via two distinct mechanisms // J. Biol. Chem.- 1997.- V. 212.- P. 31138 31148.

77. Kim Y.-M., Talanian R.V., Li J. and Billiar T.R. Nitric oxide prevents IL-1IJ and IFN-inducing factor (IL-18) release from macrophages by inhibiting caspase-1 (IL-1R-converting enzyme)//J. Immunol.- 1998. -V.161.- P. 4122-4128.

78. Kluge I., Gutteck-Amsler U., Zollinger M, Do K.Q. S-nitrosoglutathione in rat cerebellum: identification and quantification by liquid chromatography-mass spectrometry // J. Neurochem 1997,- V. 69.- P. 2599-2607.

79. Kokame K., Kato H. and Miyata T. Homocysteine-respondent genes in vascular endothelial cells identified by differential display analysis. GRP78/BiP and novel genes //J. Biol. Chem.- 1996,-V.271.- P. 29659-29665.

80. KROMASIL- for HPLC. The catalog of company "Waters".- 2004,- P. 187.

81. Krieger M., Herz J. Structure and function of mutiligand lipoprotein receptors: Macrophage scavenger receptor and LDL receptor- related protein // Annu. Rev. Biochem.- 1994,- V. 63,- P. 601-637.

82. Krijt J., Vackova M., Kozich V. Measurement of homocysteine and other aminothiols in plasma: advantages of using tris(2-carboxyethyl)phosphine as reductant compared with tri-n-butylphosphine // Clin. Chem.- 2001,- V.47.- №10,- P. 1821-182.

83. Kurecki T., Kress L.F. and Laskowski M. Purification of human plasma alpha 2 macroglobulin and alpha 1 proteinase inhibitor using zinc chelate chromatography // Anal. Biochem.- 1979,- V.99.- P. 415-420.

84. Langman L. J., Cole D.E.C. Homocysteine: cholesterol of the 90s? // Clin.Chim. Acta.- 1999,- V.286.- №1 -2,- P.63 -80.

85. Lentz S.R., Erger R.A., Dayal S. et al. Folate dependence of hyperhomocysteinemia and vascular dysfunction in cystathionine beta-synthase-deficient mice //Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol.- 2000,- V.279 P. 970-9755.

86. Liu Z., Rudd M.A., Freedman J.E. and Loscalzo J.S. Transnitrosation reactions are involved in the metabolic fate and biological actions of nitric oxide // J. Pharmacol. Exp. Therap.- 1998,-V.284.- P. 526-534.

87. Lowry O.H., Rosenbrowgh N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent//J. Biol. Chem.- 1951-V. 193 P. 265.

88. Luo X.P. and Lehotay D.C. Determination of hydroxyl radicals using salicylate as a trapping agent by gas chromatography-mass spectrometry // Clin. Biochem.- 1997.-V.30.- P. 41-46.

89. Mahoney C.W., Pak J.H., Huang K-P., Nitric oxide modification of Rat Brain neurogranin// J. Biol. Chem.- 1996.-V.15.- P. 28798-28804.

90. Mallis R.J., Buss J.E., Thomas J.A. Oxidative modification of H-ras: S-thiolation and S-nitrosilation of reactive cysteines // Biochem.J.- 2001.- V 355.- P 145-153.

91. Mannick J.B., Hausladen A., Liu L., Hess D.T. et. al. Fas-induced caspase denltrosylation // Science.- 1999,- V.284.- P. 651-654

92. Mansoor M.A., Svardal A.M., Ueland M. Determination of then in vivo redox status of cysteine, cysteingycine, homocsteine and glutathione in human plasma // Anal. BioChem.- 1992.-V.200,- P. 218-229.

93. McCully K.S. Vascular pathology of homocysteinemia: implications for the pathogenesis of atherosclerosis //Am. J Pathol.- 1969,- V.56.- P. 111-128.

94. McCully K.S. The biomedical significanse of homocysteine // J. of Scient. Explor.-2001.-V. 15,-№ 1.-P. 5-20.

95. Moestrup S.K. CD91 (a2MR/LRP) cluster workshop report // Leucocyte Typing V.- Oxford: Oxgord University Press.- 1995,- P. 971-975.

96. Mohr S., Zech B., Lapetina E.G. and Brune B. Inhibition of caspase-3 by S-nitrosation and oxidation caused by nitric oxide // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1997,- V. 238,-P. 387-391.

97. Narayanan P., Goodwin E. and Lehnert B. Alpha particles initiate biological production of superoxide anions and hydrogen peroxide in human cells // Cancer Res.-1997.-V.57,- P. 3963-3971.

98. Narazaki R., Hamada M., Harada K., Otagiri M. Covalent binding between bucillamine derivatives and human serum albumin // Pharm. Res (N. Y.).- 1996.- V. 13.-№49.-P. 1317-1321.

99. Narazaki R., Maruyama T., Otagiri M. Probing the cysteine 34 residue in human serum albumin using fluorescence techniques // Biochim Biophys Acta.- 1997.- V.1338.-№2,-P. 275-281.

100. Hultberg B, Isaksson A, Nilsson K, Gustafson L. Homocysteine and methylmalonic acid as markers of cobalamin/folate status. The association to neuropsychiatric symptoms in the elderly is explored // Lakartidningen.- 2000,- V.97.-№7,-P. 4131-4136.

101. Nourooz Zadeh J. Tajaddini - Sarmadi J., Ling K.L.E., Wolf S.P. Low density lipoprotein is the major carries of lipid hydroperoxides in plasma // Biochim. J.- 1996.-V.313.-P. 781-786.

102. Ohkawa H., Ohishi N., Kunio Y. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction //Anal.Biochem.- 1979,- V.95.- P. 351-358.

103. Peskin A.V., Winterbourn C.C. Kinetics of the hypochlorous acid and amino acid chloramines with thiols, methionine, and ascorbate // Free Radic Biol. Med.- 2001,-V.30.- №5,- C.572-579.

104. Pieraccini G., Ramponi G., Marzocchini R., Camic G. The inactivation mechanism of low molecular weight Phosphotyrosine-protein phosphatasea H202 // J. Biol. Chem.- 1998- V.273- P. 32554-32560.

105. Pressekonferenz "Homocystein-Neuer Risikofaktor fuer Hirn, Herz und Gefaesse?"- Duesseldorf.- 1998.-P. 48-56.

106. Pfeiffer C.M., Huff D.L., Smith S.J., Miller D.T., Gunter E.W. Comparison of plasma total homocysteine measurements in 14 laboratories: an international study // Clin. Chem.- 1999.-V.45.-P. 1261-1268.

107. Pfeiffer C.M., Twite D., Shih J. et. al. Method comparison for total plasma homocysteine between the Abbott IMx analyzer and an HPLC assay with internal standardization//Clin. Chem.- 1999,- V.45.- P.152-153.

108. Qi F., Sugihara T., Hattori Y. et. al. Functional and morphological damage of endothelium in rabbit ear artery following irradiation with cobalt60 // Br. J. Pharmacol.-1998,- V.123.- №4.- P. 653-660.

109. Rasmussen K, Moller J., Lyngbak M. Within-person variation of plasma homocysteine and effects of posture and tourniquet application // Clin. Chem.- 1999.-V.45.- №10.- P.1850-1855.

110. Rasmussen K, Moller J.Total homocysteine measurement in clinical practice // Ann. Clin. Biochem. -2000. V.37. -№5. - P.627-648.

111. Rauhala P., Lin A.M.-Y. and Chiueh C.C. Neuroprotection by S-nitrosoglutathione of brain dopamine neurons from oxidative stress // FASEB J.- 1998.-V.12.-P. 165-173.

112. Rauhala P., Parameswarannay K.P., Sziraki I. et. al. S-nitrosothiols and nitric oxide, but not sodium nitroprusside, protect nigrostriatal dopamine neurons against iron-induced oxidative stress in vivo // Synapse.- 1996.- V. 23,- P. 58-60.

113. Refsum H., Ueland P., Nygard 0., Vollset S.E. Homocysteine and cardiovascular disease//Annu. Rev. Med.- 1998.-V.49.- P. 31-62.

114. Refsum H., Smith A.D., Ueland P.M. et. al. Facts and recomendations about total homocysteine dterminations: an expert opinion // Clin. Chem.- 2004,- V.50.- №1,- P. 3132.

115. Rössig L., Fichtscherer B., Breitschopf K. et. al. Nitric oxide inhibits caspase-3 by S-nitrosation in vivo//J. Biol.- 1999,- V.274.- №11,-P. 6823-6826.

116. Sengupta S., Wehbe C., Alana K. et. al. Relative roles of albumin and ceruloplasmin in the formation of homocystine, homocysteine-cysteine-mixed disulfide, and cystinein circulation // J. Bio.l Chem.- 2001,- V. 276,- №50,- P 46896-46904.

117. Togawa T., Sengupta S., Chen H. et. al. Mechanism for the formation of protein -bound homocysteine in human plasma // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2000.- V. 211.- P.668-674.

118. Tsai J., Perrella M.A., Yoshizumi M. Promotion of smooth mascle cell growth by homocysteine // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.- 1994,-V. 91.- P. 6369-6373.

119. Tug T., Karatas F., Terzi S.M., Özdemir N. Comparison of serum malondialdehyde levels determined by two different methods in patients with COPD: HPLC or TBARS methods // LABMEDICINE.- 2005,- V. 36.- №1.- P. 41-44.

120. Upchurh G.R., Welch G.N., Fabian A.J. et al. Homocyst(e)ine decreases bioavailable nitric oxide by a mechanism involving glutathione peroxidase // J. Biol Chem.- 1997.- V272.- P 17012-17017.

121. Wang L., Jhee K.-H., Hua X. et al. Modulation of cystathionine ß-synthase level regulates total serum homocysteine in mice // Circ. Res.- 2004.- V.94.- P. 1318-1324.

122. Wan-hua amy Yu. Spatial and temporal correlation of nitric oxide synthase expression with CuZn-superoxide dismutase reduction in motor neurons following axotomy// Annals of the New York Academy of Sciences.- 2002,- V. 962,- P. 111-121.

123. Welch G.N., Upchurch G., Loscalzo J. Hyperhomocyst(e)inemia and atherothrombosis //Annals New York Academy of Sciences.- 1997.- V. 811.- P. 48.

124. Wiseman H., Halliwell B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer // Biochem. J.- 1996.-V.313.- №1,- P. 17-29

125. Yap S., Boers G.H., Wilcken B. et al. Vascular outcome in patients with homocystinuria due to cystathionine ß-synthase deficiency treated chronically: a multicenter observational study // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.- 2001.- V.21.- P. 2080-2085.

126. И.П. Павлова bp A.B. Смирнов2005 г.акт о вне;

127. РЕЗУЛЬТАТОВ НИР В ПРАКТИКУ ЛЕЧЕБНОЙ РАБОТЫ № //

128. Наименование предложения: "Способ определения гомоцистеина в плазме крови" при различных степенях гипергомоцистеинемии (ГГци).

129. Место и время использования предложения. Клиника кафедры факультетской терапии

130. ГОУ ВПО СПбГМУ имени академика И.П. Павлова, с 2003 года.

131. Форма внедрения: лабораторно- диагностический процесс.

132. Патентоспособность: не патентоспособна.

133. Руководитель подразделения базы внедрения:

134. Зам. директора клиники кафедры факультетской терапии по лечебной работе, д. м. н., профессор

135. Ответственный за внедрение ГОУ ВПО СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова:

136. Е.М. Нифонтов/ / М.Б. Хрусталев/

137. АКТ О ВНЕ, РЕЗУЛЬТАТОВ НИР В ПРАКТИКУ ЛЕ 1. Наименование предложения: "Способ определена различных степенях гипергомоцистеинемии (ГГци).1. УТВЕРЖДАЮ"

138. Проректор по лечебной работе ГОУ ВПО СПбГМУика И.П. Павлова ссор A.B. Смирнова<гпя£рииш г.цистеина в плазме крови при

139. Место и время использования предложения. Клиника кафедры пропедевтики внутренних болезней ГОУ ВПО СПбГМУ имени академика И.П. Павлова, с 2003 года.

140. Форма внедрения: лабораторно диагностический процесс.

141. Патентоспособность: не патентоспособна.

142. ГОУ ВПО СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова д.м.н, профессор

143. Ответственный за внедрение ГОУ ВПО СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова:а1. ЭЛ. Блашко/

144. Д.Г. Кучер/ .Б. Хрусталев/утверждаю"

145. Проректор по научной работе1. ГОУ ВПО СПбГМУ

146. РЕЗУЛЬТАТОВ НИР В ПРАКТИКУ НАУЧНО-ИСС.

147. Наименование предложения: "Способ определен!различных степенях гипергомоцистеинемии (ГГци).

148. Место и время использования предложения. Отдел биохимии НИЦ ГОУ ВПО СПбГМУ имени академика И.П. Павлова, с 2003 года.

149. Форма внедрения: лабораторно- диагностический процесс.

150. Патентоспособность: не патентоспособна.

151. Ответственный за внедрение ГОУ ВПО СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова

152. РЕЗУЛЬТАТОВ НИР В ПРАКТИКУ ЛЕЧЕБНОЙ РАБОТЫ № //

153. Наименование предложения: "Способ определения гомоцистеина в плазме крови" при различных степенях гипергомоцистеинемии (ГГци).

154. Место и время использования предложения. ЦЛД ГОУ ВПО СПбГМУ имени академика И.П. Павлова, с 2003 года.

155. Форма внедрения: лабораторно- диагностический процесс.

156. Патентоспособность: не патентоспособна.

157. Ответственный за внедрение по ГОУ ВПО СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова:1. М.Б. Хрусталев/