Иммуноферментные тесты определения витамина B12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора в гематологической практике

Мамукова, Юлия Иосифовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммуноферментные тесты определения витамина B12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора в гематологической практике
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммуноферментные тесты определения витамина B12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора в гематологической практике"

Государственное учреждение Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук

На правах рукописи

Мамукова Юлия Иосифовна

Иммуноферментные тесты определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора в гематологической практике

03.00.04 - биохимия 14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в Гематологическом Научном Центре Российской Академии Медицинских Наук

Научные руководители:

Кандидат медицинских наук Н.В. Цветаева Кандидат биологических наук Н.С. Кузьмина

Официальные оппоненты

Доктор биологических наук И. Д. Гроздова Доктор медицинских паук, профессор С. А. Луговская

Ведущая организация - Научный Исследовательский Институт Общей Патологии и Патофизиологии Российской Академии Медицинских Наук

Защита состоится «_» 2004 г. в «_» часов

на заседании диссертационного совета Д 001.042.02 в ГУ Гематологический научный центр РАМН (125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд, 4а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Гематологический научный центр РАМН

Автореферат разослан «_» 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

В. Д. Реук

2 5$ г $36

/?S?o3 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Дифференциальная диагностика анемий - актуальная проблема гематологии и терапии. В мире наиболее распространены анемии, вызванные дефицитом железа, витамина В12, фолиевой кислоты и, так называемые, «анемии хронических заболеваний» или анемии воспаления. Клинические и морфологические проявления, принципы диагностики и лечения анемий, обусловленных дефицитом железа, витамина В12 и фолиевой кислоты хорошо известны. Однако, именно у этих категорий больных встречается наибольшее число диагностических и тактических лечебных ошибок. Нередко анемические синдромы обусловлены двумя или более причинами (механизмами) и представляют собой трудно разрешимую дифференциально-диагностическую проблему даже для высоко квалифицированных лечебных учреждений. В связи с этим, разработка и внедрение информативных лабораторных методов дифференциальной диагностики анемий имеет большое значение д ля клинической практики.

Особый интерес представляют тесты, основанные на иммуноферментном анализе, который позволяет проводить большое количество исследований, обеспечивает точность, воспроизводимость результатов и возможность динамического контроля показателей в процессе лечения. С помощью иммуноферментного анализа можно определять содержание в крови витамина В12, фолатов, растворимого трансферринового рецептора и гомоцистеиыа,

Витамин В12 и фолиевая кислота участвуют в реакциях, необходимых для пролиферации и нормального метаболизма клеток. Это, прежде всего, реакции переноса метальных и формальных групп на гомоцистеин, образование метионинсинтетазы - важного звена в каскаде реакций, ответственных за проведение нервных импульсов, а также реакции мутазного типа по превращению метилмалонового-СоА в сукцинил-СоА - ключевой стадии в различных метаболических и синтетических процессах. [Green R., Joshua W., 1999; Wickramasinhe S.N., 1999]. Витамин B12 и фолаты необходимы для нормального эритропоэза. Дефицит этих .витаминов ассоциируется с грубыми нарушениями в созревании эритробластов и появлении гигантских элементов - мегалобластов, с нарушениями в развитии клеток мегакариоцитопоэза, лейкопоэза и эпителия желудочно-кишечного тракта. Витамин В12 и фолиевая кислота играют важную роль в обмене жирных кислот, в процессе которого из метилмалоновой кислоты образуется янтарная кислота. При дефиците витамина В12 накапливается токсичная для нервной ткани метилмалоновая кислота, ответственная за демиелинизацию нервных волокон и развитие фуникулярного миелоза. Дефицит фолиевой кислоты приводит к накоплению гомоцистеина, токсичной промежуточной формы обмена метионина. Гомоцистеин является аминокислотой, содержащей тиоловую группу и принимающей участие в процессах ре- и деметилирования метионина [H'AngpHn A, Selhud J, 1997]. Развитие

гипергомоцистеинемии ассоциируется ч и огоксине$Ыш повреждением

эндотелия и повышением прокоагулянтного потенциала крови, что рассматривается как важное звено в патогенезе тромбозов и сердечнососудистых заболеваний. [Баркаган З.С., Коспоченко Г.И., 2002, 2004; Шмелева В.М., 2000, 2001; Malinow M.R., Bostom A., Krauss R., 1999; Clarke R, Daly L, Robinson K, 1991].

Значительное место в метаболизме гомоцистеина принадлежит реакциям транссульфирования, протекающим при участии ферментов, зависимых от витамина В12 и фолатов.

«Анемия хронических заболеваний» (АХЗ) составляет значительную часть (более 50%) от общего числа анемий [Павлов Ч.С. 2000; Сысоева Е.З. 2001] и имеет существенные отличия от истинной железодефицитной анемии. Однако провести уверенную дифференциальную диагностику АХЗ и железофицитной анемии не представляется возможным без специальных лабораторных исследований. Информативным лабораторным критерием истинного дефицита железа является содержание в сыворотае гсрови растворимого трансферринового рецептора.

Трансферриновый рецептор (ТфР) - мембранный гликопротеин, выполняет роль медиатора в передаче железа из плазмы в клетку [Thorstensen К., Romslo L., 1990]. Экстрацелшолярная часть трансферринового рецептора, освобождающаяся с поверхности клеток при их созревании, остается в циркуляции и представляет собой растворимый фрагмент ТфР. Концентрация растворимого ТфР в плазме (сыворотке) коррелирует с общей массой рецепторов на незрелых эритроидиых клетках и может использоваться для характеристики эршропоэза.

Содержание витамина В12 в сыворотке крови здоровых лиц составляет 300-900 пг/мл, в эршроцитах - 150-450 пг/мл, фолатов - 4-12 нг/мл и 100-300 нг/мл, соответственно. Уровень гомоцистеина в сыворотке крови в норме варьирует в пределах от 5 до 12 мкМ, содержание растворимого трансферринового рецептора - от 1,5 до 2,5 мкг/мл. Для определения данных показателей используют высокочувствительные иммунохимические методы и коммерческие наборы реакгавов импортного производства. Отечественные наборы реагентов для определения витамина В12, фолатов, гомоцистеина и трансферринового рецептора отсуствуют.

Цель исследования

Цель исследования - разработка и внедрение в клиническую практику иммуноферментных методов количественного определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора.

Задачи исследования

1. Разработать методику синтеза конъюгатов витамина В12 с бычьим сывороточным альбумином (БСА), фолатов с БСА, S - аденозил - L -гомоцистеин (SAH) с БСА, SAH с полиакриловой кислотой (ПАК),

необходимые при проведении иммуноферментного анализа для использования в качестве антигенов и иммуносорбентов.

2. Оптимизировать параметры проведения иммуноферментной реакции для количественного определения В12, фолатов, гомоцистеина (Нсу).

3. Провести эксперименты по получению реагентов для иммуноферментного анализа ТфР (очищенного препарата ТфР и кроличьих антисывороток к ТфР) и разработать методику количественного определения ТфР методом твердофазного ИФА.

4. Изучить аналитические характеристики сконструированных тест-систем (специфичность, чувствительность, воспроизводимость, сходимость результатов) и провести сравнительный анализ полученных результатов с данными других иммунохимических методов.

5. Оценить клиническую информативность разработанных методов количественного определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферриновго рецептора.

Научная новизна

Разработан оригинальный подход для получения антисыворотки против гомоцистеина на основании использования конъюгата Б-аденозил-Ь-гомоцистеина с полимером (полиакриловой кислотой), обеспечивший получение антисывороток с высоким уровнем специфических антител и высокой константой аффинности, необходимых для целей ИФА.

Разработаны иммуноферменгные количественные методы анализа витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора.

Показана высокая информационная значимость комплексного определения витамина В12, фолиевой кислоты и трансферринового рецептора для дифференциальной диагностики анемий.

Показана целесообразность контроля уровня гомоцистеина у больных с повышенным риском развития тромбозов и микроциркуляторными нарушениями для выбора оптимальной тактики лечения.

Практическая значимость

1. Разработаны высокочувствительные и специфичные методики количественного определения витамина В12, фолатов, гомоцистеина и трансферринового рецептора на основе твердофазного иммуноферментного анализа.

2. Разработаны и утверждены Ученым Советом Гематологического научного центра РАМН методические рекомендации «Иммуноферментный метод определения витамина В12 и фолиевой кислоты» (протокол № 4 от 28 мая 2002 г.).

3. С 2001 г. разработанные лабораторные тесты внедрены в клиническую практику ГНЦ РАМН.

4. Показана целесообразность динамического контроля уровня гомоцистеинау больных с повышенным риском развития тромбозов.

Положения, выносимые на защиту

1. Созданные иммуноферментные тесты для количественного определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферриновго рецептора, обладают высокой специфичностью, чувствительностью и воспроизводимостью.

2. Разработанные методы количественного определения в крови витамина В12, фолиевой кислоты и трансферринового рецептора являются информативными лабораторными критериями в дифференциальной диагностике анемических синдромов.

Апробация работы

Материалы, изложенные в диссертации, доложены на научной конференции ГНЦ РАМН (Москва, 2004 г.). Результаты диссертации обсуждены на заседании проблемной комиссии «Опухоли лимфатической системы, патология красной крови, порфирии» ГНЦ РАМН (Москва, 1 июля 2004 г.).

Публикации

Основные положения диссертации отражены в 6 печатных работах.

Объем и структура диссертации

Диссертация общим объемом 80 стр. состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 11 отечественных и 115 зарубежных источников. Текст диссертации содержит 36 таблиц и 15 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе использовали моноклональные антитела (МКАт) к витамину В12 и фолиевой кислоте фирмы "Sigma" (США, кат. № V9505, клон CD-29 и кат. № F5766, клон VP-52 соответственно). Согласно сертификатам на эти реактивы, антитела к витамину В12 не реагировали с фолатами, БСА-фолат, метилтетрагидрофолиевой кислотой и БСА, а антитела к фолатам не давали перекрестных реакций с тетрагидрофолиевой, фолиниевой, дигидро-фолиниевой кислотами, а также с витамином В12.

Моноклональные антитела к ТфР (1 и 2) были получены из Московского государственного университета им. М.В, Ломоносова (рук. лаборатории Катруха А.Г)-

В сравнительных экспериментах использовали иммуноферментные наборы реагентов для количественного определения гомоцистеина (фирма «Axis»,Норвегия), трансферринового рецептора (Ну Test, Финляндия).

Конъюгаты витамина В12 и фолиевой кислоты с бычьим сывороточным альбумином (БСА) - В12-БСА и фолат-БСА, конъюгаты S-

аденозил-Ь-гомоцистеина (SAH) с БСА и полиакриловой кислотой (ПАК) -SAH-БСА и SАН-ПАК получали карбодиимидным методом. На первом этапе проводили реакцию модифицирования карбоксильного производного витамина В12 и фолиевой кислоты в органическом растворителе - ДМФА. В случае гомоцистеина модифицировали БСА и ПАК в водной среде, а затем к активированным БСА и полимеру присоединяли производное гомоцистеина -Б-аденозил-Ь-гомоцистеин (SAH).

Антисыворотку к SAH получали путем иммунизации двух кроликов породы «Шиншилла» весом 2,5 кг конъюгатом SAH -ПАК. Антиген вводили в дозе 100 мкг/мл с полным адьювантом Фрейнда в соотношении 1:1 в 3 точки в область подмышечных и паховых лимфоузлов 1 раз в неделю в течение 4 - б-х месяцев. После каждых 4-х инъекций делали перерыв в течение трех недель и затем цикл иммунизации повторяли. Уровень антител контролировали после каждого цикла инъекций методом непрямого твердофазного ИФА: АГ + исследуемая сыворотка + антивидовой конъюгат, меченный пероксидазой из корня хрена.

ТфР выделяли по методу Takubo Т., Kumura Т., 2000. Чистоту препарата контролировали методом электрофореза в 7,5 % ПААГ. Белок определяли методом Лоури, используя коммерческие наборы.

Антисыворотку к ТфР получали иммунизацией кроликов очищенным препаратом ТфР: антиген вводили в дозе 100 мкг/мл с полным адьювантом Фрейнда в соотношении 1:1. Общий цикл иммунизации составил 3 месяца. Антителопродукцию контролировали выше описанным методом.

Для получения конъюгатов антитела метили пероксидазой. Условия проведения ИФА на всех этапах анализа соответствовали общепринятым требованиям.

Определение витамина В12, фолатов, гомоцистеина проводили методом конкурентного ИФА, трансферринового рецептора - ИФА в сэндвич-модификации.

Конъюгаты В12-БСА, фолат-БСА, SAH-BCA, антитела к ТфР иммобилизовали на поверхности лунок полистироловых планшетов ("Nunc", Дания, кат. №_439454,"Greiner", Германия, кат. № 655061) в 0,01 М фосфатном буферном растворе pH 7,5 , в концентрации 1, 2 и 2-2,5 мкг/мл, соответственно. При определении витамина В12 и фолатов антивидовым конъюгатом служил анти-IgG-IlX мыши, а при определении гомоцистеина -анти-IgG-nX кролика. В качестве субстрата использовали раствор тетраметилбензидина с перекисью водорода (фирма «ДиаПлюс», Москва). Для каждого анализируемого соединения были подобраны оптимальные условия проведения ИФА.

Для определения витамина В12 и фолатов в эритроцитах проводили водный гемолиз предварительно отмытых клеток по методу Rossi-Fanelli [Rossi-Fanelli А., Antonini Е, 1958]. Рассчитывали на г Hb, используя коэффициент экстинкций для Hb при 541 нм равный 11,7 М "'см

Аналитические характеристики ИФА-тестов изучали общепринятыми методами. Оценивали чувствительность, точность, воспроизводимость.

С помощью разработанных методов исследованы образцы сывороток крови и эритроцитов 895 человек, из которых 150 практически здоровых людей и 745 больных гематологического профиля, находившихся на лечении в отделениях ГНЦ РАМН, детской клинической больницы, гематологического центра больницы им. Боткина и института ревматологии в период с 2001 года по 2004 год. Диагнозы были верифицированы с использованием данных клинических, инструментальных и лабораторных исследований.

Обработку цифровых данных и взаимосвязь признаков устанавливали при помощи непараметрических методов корреляции Спирмепа и Кендола. Расчет коэффициентов корреляции проводили при помощи пакета статистических программ STATISTIKA, версия 5.5. [Реброва О.Ю., 2002]. Работа проведена совместно с отделением компьютеризации ГНЦ РАМН (зав. отд. Б.В.Зингерман).

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Создание методов определения витамина В12, фолиевой кислоты и гомоцистеина.

В основу метода был положен принцип твердофазного конкурентного ИФА: на первом этапе происходит конкуренция свободного (определяемого) и иммобилизованного на твердой фазе антигена за центры связывания специфических антител. После отделения не связавшихся реагентов количество прореагировавших с носителем антител определяют с помощью универсального меченого реагента - анти-IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена - (аши-IgG-nX) Количество определяемого вещества обратно пропорционально регистрируемой оптической плотности продукта ферментативной реакции. Для выполнения анализа необходимы следующие реагенты: антиген, который можно иммобилизировать на планшете, и специфические антитела. Витамин В12, фолиевая кислота и гомоцистеин являются гаптенами, поэтому их участие в иммунохимической реакции АГАТ возможно в виде конъюгатов этих соединений с носителем (белками, полимерами). В связи с этим на первом этапе работы были синтезированы конъюгаты В12-БСА, Фол-БСА, SAH-БСА, SAH-ПАК. Работа выполнена совместно с кафедрой высокомолекулярных соединений химического факультета МГУ. Подробные методики получения конъюгатов показаны на схемах. 1 и 2.

Степень модификации БСА циапкобаламином и фолиевой кислотой определяли спектрофотометрически, используя молярные коэффициенты экстинкций: 8700 М "'смпри 1=550 нм для витамина В12 и 29100 М "'см при длине волны 297 нм для фолатов, учитывая молекулярную массу БСА равную 68 Д (М). Расчет проводили по формулам:

R = Д 550 х разв х M/k х С - для цианкобаламина, R =Д 297 х разв х M/k х С - для фолатов.

Согласно расчетам степень модификации составила 5 молей витамина В12 и 3 моля фолатов на моль белка.

Схема 1. Синтез конъюгатов витамина В12 и фолатов сБСА.

1. Модификация витамина В12 и фолиевой кислоты Фолиевая кислота (17мкМ)-10 мг цианкобаламин-СООН (7мкМ)-10 мг

Растворить в 2 мл ДМФА + 2 мг дициклогексилкарбодиимида (10 мкМ) +5 мг Н-гидроксисукцинтшда (43 мкМ)

Инкубация в темноте 2-3 суток, комн. темп, супернатант супернатант

№гидроксисукцини- И-гидр оксисукцинимидил-

мидилфолат кобаламин

2. Конъюгирование сБСА супернатант + БСА (6,5 мл/10 мг/мл) 0,1 М карбонатный буфер, рН 9,2, инкубация в темноте, б часов Диализ - 0,01М трис-НО буфер/0,15М№С1, рН 7,2,4 °С.

Конъюгат фолат-БСА Коньюгат В12-БСА

Синтез конъюгатов гомоцистеина имеет особенности по сравнению с синтезом конъюгатов витамина В12 и фолиевой кислоты. В его молекуле присутствуют карбоксильные группы, активация которых может приводить к образованию полимеров и изменению иммунохимических свойств. В связи с этим необходимо было провести предварительную активацию носителей, а затем соединить их с 8-аденозил-Ъ-гомоцистеином (SAB).

Для получения антисывороток к гомоцистеину использовали конъюгат SAH с носителем - полиэлекгролитом - полиакриловой кислотой (ПАК). Этот подход был ранее развит в работах Кабанова [Кабапов В.А., Петров Р.В., Хаитов P.M., 1982]. Показано, что иммобилизация гаптенов на полиэлектролитных носителях значительно усиливает их иммуногенные свойства. Предполагается, что эффект обусловлен повышением сродства гаптенов к антиген-презентирующим клеткам в результате многоточечного взаимодействия полиэлектролитов с поверхностью клеток. Активации иммунного ответа способствует и неспецифическое пролиферативное действие, оказываемое полиэлектролитами.

Степень модификации ПАК гомоцистеином рассчитывали, исходя из концентрации Hey в 1 мл раствора, измеренной с использованием коммерческого набора для определения Hey фирмы Axis и концентрации ПАК, определенной с помощью потенциометрического титрования. Степень модификации составляла 15 остатков Hey на цепь полимера. Степень модификации SAH-BCA определяли, исходя из значений гомоцистеина (СО и

концентрации белка, определенной по методу Лоури (Сг), и молекулярной массы БСА по формуле: 11= С1 х разв. х М /С2. Она составила 7 молей на моль белка.

Схема 2. Получение коныогатов гомоцистеина с БСА и ПАК.

1. Модификация белка и полимера 35мкМ ПАК растворить в 2,5мл даст воды, 25мг БСА(3,7нМ) рН довести до 5,0 + 74 мг (17,5 нМ) 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил) карбодиимид _

инкубация 40 мин, 20°С

активированный белок или полимер 2. Соединение с S-аденозил-Ь-гомоцистеином (SAH) активированный белок или полимер инкубация 3 суток, + 5 мг (ОДЗнМ) SAH J 20°С

диализ против дист.воды

Коныогаты SАН-ПАК и SAH- БСА.

Одной из главных задач при создании количественных иммунохимических методов анализа является приготовление калибровочных проб. В результате проведенных экспериментов было показано, что оптимально использовать для приготовления стандартов пулированные сыворотки крови, в которых концентрация определена разработанным методом и референтными (коммерческими) наборами реактивов (Abbot, США; Axis,Норвегия; Chiron Diagnostic, США). В качестве нулевой пробы применяли пул сывороток здоровых доноров, обработанный активированным углем (Norit A, Serva, Германия) с целью удаления витамина В12, фолатов, гомоцистеина.

Для определения витамина В12 использовали калибраторы, содержащие 800 пг/мл, 400 пг/мл, 200 пг/мл ,100 пг/мл и 0 пг/мл; для фолатов -10 нг/мл, 5 нг/мл, 2,5 нг/мл ,1 нг/мл и Онг/мл; для гомоцистеина - 40 мкМ, 20 мкМ, 10 мкМ, 5 мкМ, 0 мкМ. Следует отметить, что в работах Refsum (2004) и других авторов доказано, что применение сывороток в качестве матрикса для калибраторов дает наиболее стабильные результаты.

Следующий этап работы был посвящен огработке условий проведения анализа, включающий:

• выбор схемы ИФА (конкурентный, последовательного насыщения или вытеснения),

• определение оптимальной концентрации и времени иммобилизации коныогатов витамина В12 и фолатов на твердой фазе,

• определение времени инкубации антигена с антителами, т.е. наилучшего периода конкурентной реакции,

• расчет рабочей концентрации коньюгата анти -1§Сг-ПХ.

При выборе оптимальных для анализа концентраций реагентов руководствовались тем принципом, что точка, соответствующая «нулевой» концентрации определяемого вещества, должна лежать на кривой титрования в диапазоне, близком к 50% связывания антигенов с антителами, при этом значение оптической плотности должно лежать в пределах 1,2-1,0 оптических единиц. На рис. 1-3 представлены данные по определению оптимальных концентраций антигенов и антител. Установлено, что оптимальная концентрация коньюгата В12-БСА, сорбированного на твердой фазе, составляла 1,0 мкг/мл, коньюгата фолат-БСА - 2,0 мкг/мл (рис. 1,2). В следующей серии подобных экспериментов показано, что оптимальное для анализа разведение антител к витамину В12 равнялось 1/1000, антител к фолиевой кислоте -1/500 (рис. 3,4).

Максимальная сорбционная способность конъюгатов на поверхности лунок полистиролового планшета была достигнута при использовании 0,01 М фосфатного буфера, рН 7,4. Оптимальное время иммобилизации конъюгатов В12-БСА, фолат-БСА составило 12-14 час при 4°С. Время проведение конкурентной реакции - 12-14 ч при 4 °С; иммуноферменхной с анта-1^-ПХ -1ч при 37 °С при разведении -1/2500 и для витамина В12 и для фолатов. Изучение трех схем ИФА витамина В12 и фолатов -конкурентного метода, последовательного насыщения и вытеснения -показало что в обоих случаев лучшим является конкурентный вариант (таблицы 1,2).

Концентрация витамина В12, пг/мл

Рисунок 1. Калибровочные графики определения витамина В12 в зависимости от концентрации коньюгата В12-БСА, сорбированного в лунках полистиролового планшета.

[с]=1,0 мкг/мл

"[с]=2,0 мкг/мл

- -[с]=2;5 мкг/мл

•[с]=3,0 мкг/мл

концентрация фолиевой кислоты, нг/мл

Рисунок 2. Калибровочные графики определения фолиевой кислоты в зависимости от концентрации конъгагата БСА-фолат.

-1/500 •1/1000 1/2000

200 400 600 800 1000 концентрация витамина В12 пг/мл

Рисунок 3. Калибровочные кривые определения витамина В12 в зависимости от разведения антител.

концентрация фолиевой кислоты нг/мл

Рисунок 4. Калибровочные кривые определения фолиевой кислоты в зависимости от разведения антител.

Таблица 1.

Показатели оптических плотностей калибровочных проб для определения витамина В12 в зависимости от метода проведения твердофазного анализа: а) - конкурентный метод; б)-метод последовательного насыщения; в)- метод вытеснения.

Концентрация (пг/л) ОП450 ( а) ОП450(б) ОП450 (в)

0 0,9 0,7 0,73

50 0,75 0,6 0,7

100 0,4 0,55 0,68

200 0,33 0,3 0,66

400 0,23 0,2 0,66

800 0,08 0,12 0,66

Таблица 2.

Показатели оптической плотности калибровочных проб для определения фолатов в зависимости от метода проведения твердофазного анализа: а) - конкурентный метод; б) - метод последовательного пасыщения; в)- метод вытеснения.

Концентрация (нг/мл) ОП450 (а) ОПш(б) ОП450(В)

0 0,9 0,7 0,8

1 0,65 0,6 0,7

2,5 0,4 0,5 0,68

5 0,28 0,35 0,66

10 0,13 0,38 0,66

20 0,08 0,22 0,66

Так как в организме витамин В12 и фолаты присутствуют в виде нескольких дериватов, перед анализом они должны быть восстановлены и переведены в CN-форму. Для этого пробы обрабатывают ДТТ в растворе KCN-NaOH.

Ниже приведена схема определения витамина В12 и фолатов.

Схема 3. Оптимальные условия определения витамина В12 и фолатов.

Сенсибилизация планшетов коныогатами Витамин В12- БСА - 1мкг/мл (по 100 мкл) Фолаты-БСА - 2мкг/мл (по 100 мкл) 12 -14 ч при 4°С в 0,01 МФСБ, pH 7,2

1 стадия ИФА Внесение антител

к витамину В12 в рабочем разведении 1:1000 (по 100 мкл) к фолиевой кислоте в рабочем разведении 1:500 (по 100 мкл) и анализируемых проб

11-14 4, при 4'С

2 стадия ИФА

Внесение коныогата анга -IgG-ПХ мыши (рабочее разведение 1:1000)

1 ч при 37'С Отмывка планшета Регистрация результатов

Гомоцистеин в плазме крови присутствует в нескольких формах: свободной и связанной с белками, и перед определением в иммунохимическом тесте он должен быть восстановлен, т.е. переведен в SAH-форму. С этой целью исследуемые пробы обрабатывают ферментом S-аденозил-Ь-гомоцистеингцдролазой в избытке аденозина. Принцип твердофазного ИФА основан на конкуренции между SAH в образце и SAH, иммобилизованным на поверхности лунок полистиролового планшета за сайты связывания с поликлональными анти-SAH антителами.

В связи с этим основной задачей при разработке теста для Определения гомоцистеина было получение специфической антисыворотки. Ашисыворотка была получена путем иммунизации кроликов SАН-ПАК. Специфичность антисывороток против 8-аденозил-Ь-гомоцистеина (SAH) была изучена на наличие перекрестной реактивности с родственными соединениями: аденозином, цистеином и гомоцистеином. Было показано, что полученная антисыворотка специфична к SAH, а антитела не имеют сродства к другим производным гомоцистеина и БСА. Процент перекрестной реакции с аденозином был равен 2 %, с цистеином - 3,5%, а с гомоцистеином - 7%.

Работа по подбору оптимальных параметров ИФА для определения гомоцистеина была аналогична выше описанной. Схема проведения иммуноферментного анализа представлена ниже.

Схема 4. Определение гомоцистеина.

1. Сенсибилизация планшета 100 мкл раствора БАН-БСА в лунку (1мкг/мл) 12-14 с, 4'С

2. Подготовка проб

0,3 мл раствора (ФСБ/БСА + БАН-гл) инкубация 1 час, 37°С + 15 мкл стандарта или образца }

+ 0,3 мл тимирозала ' инкубация 15 мин, 20°С

+ 0,3 мл раствора дезаминазы I инкубация 5 мин, 20°С

1 стадия ИФА

25 мкл обработанных проб + 0,20 мл антисыворотки анти-БАН

инкубация 1 час, 37'С

2 стадия ИФА

В лунки планшета по 100 мкл анти-1зСг-ПХ кролика инкубация 1 час, 37'С

Отмывка планшета Регистрация результатов

Было показано, что оптимальными условиями для проведения иммунохимической реакции являются: концентрация ЭАН-БСА -2,0 мкг/мл; разведение антисыворотки -1:100; разведение антаГ^-ПХ - 1:2500; время сорбции коныогата на планшете - 10 -12 ч при температуре 4 "С; время проведения конкурентной стадии ИФА - 1 час при 37 °С.; инкубация с конъюгатом антител, меченных пероксидазой из корня хрена - 30 мин при температуре 37°С. На рисунке 5 представлена типичная кривая для определения концентрации гомоцистеина.

Результаты изучения аналитических параметров созданных методов, представленные в таблице 3, свидетельствуют, что они соответствуют требованиям, предъявляемым к ИФА-наборам.

Коэффициент корреляции между результатами полученными с использованием коммерческих наборов реактивов и реактивов разработанных авторами составляет- для витамина В12 - 0,85, гомоцистеина -0,9.

Рисунок 5. Калибровочная кривая определения концентрации гомоцистеина.

Таблица 3.

Аналитические характеристики методов определения витамина В12, фолатов и гомоцистеина.

Метод Наименование параметра Результат

Определение витамина В12 Диапазон определяемых концентраций 100-1000 пг/мл

Чувствительность 70 пг/мл

Коэффициент вариации, %, не более 8,5

Тест на открытие, в пределах 85-112%

Определение фолатов Диапазон определяемых концентраций 1-20 пг/мл

Чувствительность 0,5 нг/мл

Коэффициент вариации, %, не более 9,0

Тест на открытие, в пределах 88-95 %

Определение гомоцистеина Диапазон определяемых концентраций 5-50 мкМ

Чувствительность 4 мкМ

Коэффициент вариации, %, не более 9,5

Тест на открытие, в пределах 87-115%

10 20 30 40 5 концентрация гомоцистеина мк!

Реагенты для проведения иммуноферментного анализа (планшеты с сенсибилизированными антителами, концентрированные растворы копъюгатов антител, меченных пероксидазой из корня хрена) сохраняли свои

свойства на протяжении 6 месяцев хранения при температуре 4°С (срок наблюдения).

Иммуноферментный анализ трансферринового рецептора

Для определения ТфР был использован метод твердофазного ИФА, «сэндвич-модификация». На первом этапе работы были приготовлены следующие реагенты:

• выделен высокоочищенный препарат ТфР;

• получены кроличьи антасыворотки к ТфР;

• выделена IgG фракция антител к ТфР;

• синтезированы конъюгаты моно- и поликлональных антител к ТфР, меченных пероксидазой из корня хрена:

• синтезирован конъюгат поликлональных антител, меченных биотином.

Для повышения специфичности и чувствительности анализа в качестве

твердой фазы использовали полистироловые планшеты, сенсибилизированные моноклональными антителами к ТфР в концентрации 3,5 мкг/мл. Сравнительные опыты показали, что лучшие результаты были получены при использовании конъюгата МКАт-ПХ по сравнению с конъюгатом ПКАт-ПХ: чувствительность метода составляла 0,5 мкг/мл и 5 мкг/мл, соответственно. Применение в анализе поликлональных антител было возможно только в системе «биотин-авидин». Поэтому как наиболее простой и удобный выбран сэндвич-вариант на основе МКАт. Изучение аналитических характеристик метода показало, что минимальная определяемая концентрация равнялась 0,5 мкг/мл, а также выявило, что коэффициент вариации составлял не более 8 % и в области определяемых концентраций (0,5-20 мкг/мл) зависимость концентрации ТфР в калибровочных пробах от оптической плотности имела линейный характер (рис.6).

концентрация трансферринового рецептора мкМ

Рисунок 6. Калибровочная кривая определения концентрации трансферринового рецептора.

Применение разработанных методов в клинической практике

На первом этапе экспериментов определили нормальное содержание витамина В12, фолатов, гомоцистеина, ТфР в сыворотке и эритроцитах крови доноров [п=150] (таблица 4).

Таблица 4.

Контроль уровня витамина В12, фолатов, гомоцистеина, ТфР в сыворотке крови доноров.

Наименование параметра Концентрация

В сыворотке В эритроцитах

Витамин В12 300-900 пг/мл 80-300 пг/гНЬ

Фолаты 4-14 нг/мл 3-15 нг/гНЬ

Гомоцистеин До 12 мкМ -

Трансферриновый рецептор 1,5-2,5 мкг/мл -

Далее провели исследования у больных с анемиями: В12-дефицитной (n=65), фолиево-дефицитной (п=47), аутоиммунной гемолитической (п=15), железодефицитной (п=385) и «анемией хронических заболеваний» (п=188), а также у больных с миелодиспласгаческим синдромом (п=27) и хроническими миело- и лимфопролиферативными заболеваниями (п=18).

У 95,5% больных с В12-дефицитной анемией наблюдалось резкое снижение концентрации витамина В12 в сыворотке (117,7±12 пг/мл) и эритроцитах (13,9±3,3 пг/гНЬ). После адекватной терапии содержание витамина В12 у всех больных повышалось до нормальных показателей (в сыворотке и эритроцитах - 350±98 пг/мл и 75±31пг/гНЬ, соответственно).

У 3 (4,5 %) больных с клиническим диагнозом В12-дефицитная анемия уровень витамина В12 в сыворотке крови был на нижней границе нормы, в эритроцитах - повышен. После лечения наблюдалось снижение концентрации витамина В12 в сыворотке и эритроцитах. Подобные случаи описаны (Wickramasinghe S.N. и соавт., 1999). Предполагается, что данный феномен связан с нарушением связывания и/или транспорта кобаламинов. Характерной особенностью данных клинических случаев является наличие неэффективного эритропоэза.

Содержание фолатов в сыворотке крови больных В12 дефицитной анемией не отличалось от нормы, содержание фолатов в эритроцитах -было сниженным у 74 % больных (до 2,0±0,9 нг/гНЬ).

При фолиево-дефицитной анемии имели место низкие показатели фолатов в сыворотке (2,1±0,8 иг/мл) и эритроцитах крови (1,б±0,44 нг/гНЬ). Концентрация витамина В12 составляла в сыворотке крови 267,8±45 пг/мл, в эритроцитах 280,8±76,1 пг/гНЬ, что соответствует нормальному значению.

Таким образом, определение концентрации витамина В12 в сыворотке и эритроцитах крови позволило подтвердить клинический диагноз В12 дефицитной анемии и контролировать эффективность специфической терапии.

При железодефицитной анемии (ЖДА) выявили достоверное повышение уровней витамина В12 (1048±6б,7 пг/мл) и фолатов (18±3,1

нг/мл) в сыворотке крови и эритроцитах (499±77,6 пг/гНЬ и 19,3±2,5 пг/гНЬ, соответственно), что, по-видимому, связано с резким снижением потребления этих витаминов для синтеза эритробластов в условиях железодефицита. После курса ферротерапии и нормализации показателей обмена железа наблюдали снижение концентрации витамина В12 и фолиевой кислоты в сыворотке (276±33,9 пг/мл и 9,2±2,5 пг/гНв) и эритроцитах (128±29,0 пг/гНЬ и 10,5±2,9 нг/гНЬ, соответственно).

При аутоиммунной гемолитической анемии (АИГА) в большинстве случаев (67%) отмечались нормальные показатели витамина В12 (490±187 пг/мл) и фолатов (9,2±1,9 пг/мл) как в сыворотке крови, так и в эритроцитах (249±56,9 пг/гНЬ и 6Д±2,0 нг/гНЬ). На фоне купирования гемолитического процесса и нормализации уровня гемоглобина происходило резкое (временное) снижение уровня В12 до 60 пг/мл, фолатов - до 0,9-2,5 нг/мл, что указывает на целесообразность назначения в этот период больным препаратов фолиевой кислоты и витамина В12.

При хронических лимфо- и миелопролиферативных заболеваниях уровень витамина В12 в сыворотке крови находился в пределах нормы, в эритроцитах - был несколько повышенным. Концентрации фолатов была сниженной у больных с хроническими миелопролиферативными заболеваниями.

В таблице 5 приведены средние значения уровней витамина В12 и фолатов при анемиях различной этиологии.

Таблица 5.

Уровень витамина В12 и фолатов при анемиях различной этиологии.

Группа больных Сыво ротка Эритроциты

Витамин-В12 лг/мл Фолаты нг/мл Фолаты нг/гНЬ Витамин В12 пг/гНЬ

В-12 дефицит^ ная анемия до лечения /п=65/ 117± 22* 9,7±2,6 2,0±0,9 13,9± 3,3*

после лечения /п=56/ 350 ±98** 4,5± 1,9 10 ± 2,3 75± 31**

Фолат-дефицитная анемия /п=47/ 267± 45 2,1± 0,8* 1,6± 0,44- 280,8±76,1

ЖДА до лечения /п=215/ 1048±66,7* 18Д±ЗД* 19,3± 2,5* 499+ 77,6*

после лечения /п=150/ 276±33,9** 9,2±2,15** 10,5 ±2,9** 20± 3,9**

АИГА/п=15/ 490± 187 9,2± 1,9 6Д± 2 29,6± 5,8

МДС/п=27/ 420± 99,8 14,5± 3,7 7,4± 2,5 635+ 165*

ХМПЗ /п=18/ 487,8±98,7 12,9±4,9 7,9± 3,1 255,8± 98

АХВЗ/п=188/ 406± 189 11,8± 5,2 3,2 ±0,9 13,6± 4,7

Доноры /п-57/ 690±150 9,7±4,2 5,5±2,5 195±48

* - достоверные изменения по сравнению с нормой (р/0,05 - 0,03). фф - достоверные изменения в результате терапии (р^0,05 - 0,04).

Анализ содержания гомоцистеина показал, что данный показатель был повышенным в 2-2,5 раза у больных с микрогемореологическими нарушениями, независимо от нозологической формы заболевания. Не обнаружено достоверной связи между повышением сывороточного гомоцистеина и наличием мутации гена МТГФР. В связи с этим вопрос о клиническом значении гипергомоцисгеинемии требует дальнейшего изучения.

Уровень растворимого ТфР был резко повышен у больных железодефицитной анемией до начала терапии (10±1,5; в 4 раза), что согласуется с данными литературы (Пю^епБеп К, 1990). После курса ферротерапии у большинства больных содержание ТфР снижалось, приближаясь к нормальным значениям - 4,3±1,1 (рис. 7).

У больных с «анемией хронических заболеваний» уровень ТфР не отличался от нормы (3±0,8мкг/мл) и был достоверно ниже, чем у больных ЖДА (р<0,01). Так как показатели сывороточного железа у больных этих групп могут быть сходными, определение концентрации ТфР, наряду с ферриганом сыворотки, в данной ситуации может служить дополнительным информативным дифференциально-диагностическим критерием.

У больных с анемиями другой этиологии (АИГА, наследственные гемолитические анемии, анемический синдром на фоне хронических миелопролиферативных заболеваний) уровень ТфР варьировал в широких пределах (от сниженных показателей до повышенных). В соответствии с этим, можно заключить, что определение ТфР наиболее информативно для дифференциальной диагностики железодефицитной анемии и «анемии хронических заболеваний». При других патологических состояниях данный тест не имеет самостоятельного значения, но существенно расширяет возможности диагностики и динамического контроля эффективности лечения анемии.

<0 о. 1 10

=г

а. £ 8

о со о

X я а. 6

1 4

Л X

я а 2

□ До лечения .

□ После лечения

ЖДА

АХВЗ В12д АИГА доноры

Рисунок 7. Уровень трансферинового рецептора у гематологических

больных.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали информативность созданных методов и целесообразность их использования в клинической практике для дифференциальной диагностики анемий и контроля за эффективностью проводимой терапии.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и внедрены в клиническую практику высокочувствительные и специфичные иммуноферментные методы количественного определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и растворимых трансферриновых рецепторов.

2. Разработан оригинальный метод получения моноспецифической антисыворотки против гомоцистеина посредством иммунизации кроликов конъюгатом Б-аденозил-Ь-гомоцистеин с полиакриловой кислотой.

3. Получены и охарактеризованы конъюгаты витамина В12 с бычьим сывороточным альбумином, фолатов с бычьим сывороточным альбумином, Б-аденозил-Ь-гомоцистеина с бычьим сывороточным альбумином для приготовления иммуносорбентов - полистироловых планшетов, для проведения иммуноферментного анализа.

4. Определены аналитические характеристики разработанных методик: чувствительность, коэффициент вариации, тест на открытие.

5. Показана информативность определения концентраций витамина В12, фолиевой кислоты и растворимого трансферринового рецептора для дифференциальной диагностики анемий и контроля за эффективностью проводимой терапии.

Основные публикации по теме диссертации

1.Казюкова Т.В., Самсыгина Г.Л. Левина A.A., Коколина В.Ф., Коган А.Н, Катруха А.Г. Определение трансферриновых рецепторов в плазме крови -новый метод оценки эффективности ферротсрапии у девочек - подростков с ювенильнымикровотечениями, //Гинекология-2002,-т. 4. № 6. 261-266.

2. Левина A.A., Мамукова Ю.И., Цветаева Н.В. Иммуноферментный метод определения гомоцистеина. //Патогенез - 2004- № 3. В печати.

3.Левина A.A., Цветаева Н.В., Мамукова Ю.И., Катруха А.Г., Коган А.Н. Определение растворимых трансферриновых рецепторов для дифференциальной диагностики анемий Клиническая и лабораторная диагностика. -2003.- № 6 С.55-56.

4. Левина A.A., Цветаева Н.В., Мамукова Ю.И., Рахнянская A.A., Мелик-Нубаров Н.С. Разработка иммуноферментного метода определения витамина В12 и фолатов //Патогенез-2003- № 2. 80-84.

5. Хорошко Н.Д., Левина A.A., Мамукова Ю.И., Цветаева Н.В., Рахнянская A.A., Мелик-Нубаров Н.С., Кузьмина Н.С. Иммунохимический метод определения витамина В12 и фолиевой кислоты. Методические рекомендации. Утверждены Ученым Советом ГНЦ РАМН (протокол № 4 от 28 мая 2002 г.)

6. Цветаева Н.В., Левина A.A., Мамукова Ю.И., Рахнянская A.A., Мелик-Нубаров Н.С. Определение витамина В12 и фолатов иммуноэнзимным методом //Клиническая и лабораторная диагностика,.-2001.- № 4.-С.53-55.

7. Цветаева Н.В., Левина A.A., Мамукова Ю.И., Рахнянская A.A., Мелик-Нубаров H.A., Использование иммуноферментного метода определения витамина В12 и фолатов для дифференциальной диагностики анемий. //Гематология и трансфузиология, 2003- № 3, 25-27.

Отпечатано в ООО «Аведа» 117342, Москва, ул. Введенского, д.8, тел. 332-50-94.

Формат 60x90/16. Тираж 100 экз. 1,0 п. л. Бумага New SvetoCopy.

РНБ Русский фонд

2007-4 17903

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мамукова, Юлия Иосифовна

Введение

1.Обзор литературы

1.1 Значение определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора

1.2 Характеристика современных методов анализа, используемых для определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового 17 рецептора

Собственные результаты

2. Материалы и методы

2.1 Получение конъюгатов В12-БСА и фол-БСА

2.2 Получение конъюгатов Нсу-ПАК и Нсу-БСА

2.3 Получение антисывороток

2.4 Проведение иммуноферментного анализа

3. Результаты исследований

3.1 Разработка иммуноферментного метода определения витамина В12, фолатов и гомоцистеина.

3.2 Приготовление растворов калибраторов

3.3 Оптимизация иммуноферментного анализа витамина В

3.4 Разработка и оптимизация твердофазного иммуноферментного анализа для определения фолиевой кислоты

3.5 Постановка иммуноферментного анализа для количественного определения 40 витамина В12 и фолатов

3.6 Разработка метода определения гомоцистеина

3.7 Разработка метода определения трансферринового рецептора

3.8 Клиническое использование разработанных тестов

3.8.1 Определение витамина В12 и фолиевой кислоты при ряде 51 гематологических заболеваний

3.8.2 Определение гомоцистеина при гематологических и микрореологических заболеваниях

3.8.3 Определение трансферринового рецептора при гематологических 56 нарушениях

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммуноферментные тесты определения витамина B12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора в гематологической практике"

Дифференциальная диагностика анемий по-прежнему остается актуальной проблемой гематологии. В связи с этим разработка и внедрение в практику лабораторных методов, позволяющих уточнить характер анемий, обусловленных разными причинами, имеет существенное значение как с научной, так и с практической точек зрения. Показано, что определение и контроль уровней витамина В12 и фолатов целесообразно в клинической гематологии. Витамин В12 и фолаты необходимы для нормального метаболизма в организме (синтез ДНК, обмен жирных кислот и др.). Дефицит этих витаминов вызывает нарушение функции быстро пролиферирующих клеток и в первую очередь мегалобластную анемию, а также неврологические и нейропсихические изменения. Кроме того, по концентрации витамина В12 в ряде случаев проводится дифференциальная диагностика хронических миелопролиферативных заболеваний. Нарушение обмена фолиевой кислоты и вызванное этим увеличение в крови концентрации гомоцистеина (Нсу), как продукта метаболизма фолатов, ведет к сердечно-сосудистым заболеваниям и тромбозам, в основе которых лежит токсическое действие гомоцистеина на эндотелий сосудов. Метаболизмы витамина В12 и фолиевой кислоты тесно взаимосвязаны, и дефицит одного из них влияет на биохимические реакции, контролируемые этими витаминами. Биохимические механизмы, посредством которых дефицит этих витаминов приводит к анемиям, на сегодня еще не полностью ясен, хотя и доказано, что наблюдается дефект синтеза ДНК при сохранном синтезе РНК и белков. Скорее всего, появление дефектной ДНК вызвано нарушениями в реакции превращения урацил-монофосфата в тимидин-монофосфат, который, включаясь в ДНК, необходим для образования ее больших тяжей, требуемых для формирования хромосомы. Таким образом, поскольку содержание в организме витамина В12, фолиевой кислоты и гомоцистеина взаимосвязаны, определение их концентраций важно для точной диагностики заболеваний, а также для контроля проводимой терапии.

Среди анемий различной этиологии значительное место занимают анемии хронических воспалительных заболеваний (АХВЗ). По ряду признаков они отличаются от истинных железодефицитных анемий. Однако, без дополнительных исследований их трудно дифференцировать с истинным дефицитом железа. Одним из информативных дифференциальных показателей является концентрация трансферринового рецептора. Трансферриновый рецептор (ТфР) является мембранным гликопротеином, выполняющим роль медиатора в передаче железа из плазмы в клетку. Этот процесс осуществляется путем связывания трансферрина плазмы, насыщенного железом, с трансферриновым рецептором с последующей интернализацией образовавшегося комплекса в эндоплазматическую везикулу путем эндоцитоза, где железо освобождается из комплекса с белком при уменьшении рН. ТфР освобождается из ретикулоцитов во время их созревания до эритроцитов. ТфР, находящийся в плазме, представляет собой растворимые фрагменты экстрацеллюлярной части рецептора. Уровень растворимого трансферринового рецептора, присутствующего в плазме, позволяет судить о состоянии гемопоэза, поскольку при недостатке в клетке свободного железа происходит увеличение синтеза ТфР, а следовательно, и увеличение поступления железа в клетку. При избытке железа в клетке синтез рецептора прекращается. Эритроидные клетки содержат основную массу трансферринового рецептора в организме. В норме плазма содержит небольшое количество ТфР (1,5 -2,5 мкг/мл). Концентрация ТфР в плазме хорошо коррелирует с общей массой рецептора на незрелых эритроидных клетках. В связи с этим при истинных ЖДА уровень растворимого трансферринового рецептора резко повышен в отличие от анемии воспалений и хронических заболеваний. Поэтому определение уровня трансферринового рецептора включают в методы дифференциальной; диагностики этих анемий:

Поскольку все указанные соединения находятся в сыворотке крови; в крайне незначительных количествах, определение их возможно лишь современными высокочувствительными методами анализа, такими как радио-, флюро- или ферментоиммунными.

В настоящее время отечественных наборов для определения витамина В12, фолатов, гомоцистеина и ТфР нет, а выпускаемые за рубежом — дороги и их применение возможно только при наличии специального оборудования - автоматизированных «закрытых» систем.

В связи с этим целью нашей работы является разработка и внедрение в клиническую практику иммуноферментных методов количественного определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора.

Задачи исследования

1. Получить конъюгаты витамина В12 с бычьим сывороточным альбумином (БСА), фолатов с БСА, S - аденозил - L - гомоцистеина (SAH) с БСА, SAH с полиакриловой кислотой; (ПАК), необходимые при проведении иммуноферментного анализа для использования в качестве антигенов и иммуносорбентов.

Научная новизна

Разработаны иммуноферментные количественные методы анализа витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора.

Практическая значимость

1. Разработаны высокочувствительные и специфичные методики количественного определения > витамина В12, фолатов, гомоцистеина и трансферринового рецептора на основе твердофазного иммуноферментного анализа.

3. С 2001 г. разработанные лабораторные тесты внедрены в клиническую практику ГНЦ РАМН.

4. Показана целесообразность динамического контроля уровня гомоцистеина у больных с повышенным риском развития тромбозов.

Апробация работы

Материалы, изложенные в диссертации, доложены на научной конференции ГНЦ РАМН (Москва, 2004). Результаты диссертации обсуждены на заседании проблемной комиссии «Опухоли лимфатической системы, патология красной крови, порфирии» ГНЦ РАМН (Москва, 1 июля 2004).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мамукова, Юлия Иосифовна

ВЫВОДЫ

1. Разработаны высокочувствительные и специфичные иммуноферментные методы для количественного определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора.

2. Разработан оригинальный метод получения моноспецифической антисыворотки против гомоцистеина посредством иммунизации кроликов конъюгатом SAH-IIAK.

3. Получены и охарактеризованы конъюгаты витамин В12 -БСА, фолат-БСА,. SAH-BCA для приготовления иммуносорбентов — полистироловых планшетов для проведения иммуноферментного анализа.

5. Показана высокая информативность определения концентраций витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора для дифференциальной диагностики анемий, выбора тактики лечения и контроля за проводимой терапией.

Заключение

Дифференциальная диагностика анемий является актуальной проблемой гематологии. В связи с этим разработка и внедрение в практику лабораторных методов, позволяющих уточнить характер анемий, обусловленных разными причинами, имеет существенное значени. Анемии, вызванные дефицитом витамина В12 и фолиевой кислоты, встречаются во всех странах мира. Эти витамины ответственны за пролиферативную активность клеток.

Структурно витамин В12 относится к кобаламинам в состав которых входит корриновое кольцо, в центре его находится атом кобальта, верхний лиганд, ковалентно связанный с кобальтом, и нуклеотидная боковая цепь. Фолиевая кислота относится к птероглютаминовым кислотам: и состоит из трех компонентов: птероидинового кольца, парааминобензойной и глутаминовой кислот. Как витамин В12, так и фолаты имеют много дериватов. Среди известных витаминов кобаламины и фолаты занимают первое место по структурной сложности и разнообразию, а по концентрации в организме - одно из последних. Однако, реакции, в которых они принимают участие, крайне важны для нормального метаболизма. Это прежде всего реакции переноса метальных и формальных групп на. гомоцистеин и другие соединения, участие в метаболизме метионинсинтетазы, которая является одним из звеньев в каскаде реакций, ответственных за проведение нервных импульсов, а также реакция мугазного типа по превращению метилмалонила-СоА в сукцинил-СоА. Витамин В12 и фолаты участвуют в нормальном эритробластическом кроветворении путем образования из уридин-монофосфата тимидин-монофосфата, включаемого в ДНК. Крайне важным является также участие витамина В12 в обмене жирных кислот, в результате чего образуется янтарная кислота из метилмалоновой кислоты, а при дефиците витамина В12 накапливается метилмалоновая кислота, являющаяся токсичной для нервной ткани и вызывающая демиелинизацию нервных волокон и развитие фуникулярного миелоза. При развитии дефицита кобаламинов и фолатов наблюдаются нарушения в созревании эритробластов, что приводит к появлению гигантских клеток, в которых сохраняется аномальное ядро, нарушается развитие тромбоцитарного и лейкоцитарного рядов, а также образование эпителия желудочно-кишечного тракта. Дефицит фолиевой кислоты приводит к накоплению гомоцистеина, токсичной промежуточной формы обмена метионина, что может вызывать изменения в свертывающей системе крови и в окислительно-восстановительных реакциях в организме, приводящие к сердечно-сосудистым нарушениям. Метаболизм витамина В12 и фолиевой кислоты тесно взаимосвязаны, и дефицит одного из них влияет на биохимические реакции, контролируемые этими витаминами. Гомоцистеин является аминокислотой, содержащей тиоловую группу и принимающей участие в процессах ре- и деметилирования метионина. В то же время гомоцистеин является промежуточным звеном в метаболизме витамина В12 и фолиевой кислоты. Значительное место в катаболизме гомоцистеина принадлежит транссульфированию, причем эти реакции протекают под действием ферментов, зависимых от витамина В12 и фолатов.

Таким образом, поскольку содержание в организме витамина В12, фолиевой кислоты и гомоцистеина взаимосвязаны, определение их концентраций важно для точной диагностики заболеваний, а также для контроля за состоянием больного и проводимой терапией.

Поскольку уровень трансферринового рецептора связан с активностью эритропоэза, этот показатель вызывает законный интерес исследователей и с точки зрения диагностики, и с научной.

Нормальные значения для витамина В12 в сыворотке - 300-900 пг/мл, для фолатов - 412 нг/мл, в эритроцитах витамин В12 содержится в количестве 150-450 пг/мл, фолаты - 100300 нг/мл или 80-300 пг/г НЬ и 3-10 нг/г НЬ. Уровень гомоцистеина в сыворотке крови составляет в норме от 5 до 12 мкМ . Концентрация трансферринового рецептора также мала и измеряется мкг/мл (1,5-2,5 мкг/мл). Низкие концентрации этих соединений обуславливают необходимость в использовании высокочувствительных методов анализа. Для их определения чаще всего используются иммунохимические методы с различными системами детекции. В связи с этим, разработка относительно недорогого иммуноферментного метода, приспособленного для «открытой» системы, позволяющего проводить исследования достаточно большому контингенту больных, является актуальной проблемой. Аналогичные импортные коммерческие наборы приспособлены для «закрытых» систем и очень дороги.

Мы разработали методы для количественного определения витамина В12, фолатов, гомоцистеина и трансферринового рецептора позволяющие работать в «открытой» иммуноферментной системе. Поскольку витамин В12, фолиевая кислота и гомоцистеин являются гаптенами, их участие в иммунохимической системе возможно лишь в виде конъюгатов этих соединений с белком или полимером.

В настоящее время для определения гаптенов чаще всего используется конкурентный вариант иммуноферментного твердофазного анализа.

Трансферриновый рецептор - белок, а наиболее распространенным методом определения белков является сэндвич-вариант иммуноферментного анализа. Критериями идеального метода анализа как для гаптенов, так и для белков являются: специфичность (метод должен быть специфичен к определяемому антигену и его дериватам и неспецифичен к другим антигенам); точность и надежность, необходимые для клинических целей; простота, позволяющая проводить анализ относительно быстро и на недорогом оборудовании; отсутствие влияния на результаты анализа других белков и компонентов сыворотки; высокая чувствительность метода, позволяющая использовать небольшие количества образца.

Иммунохимические методы определения антигенов обладают всеми указанными достоинствами.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) создать методику для определения уровня витамина В12, фолиевой кислоты и гомоцистеина, которые могут работать в фотоколориметрической системе детекции;

2) получить и охарактеризовать конъюгаты (витамин В12-БСА, фолат-БСА, SAH-BCA, SAH-TIAK), необходимые для проведения иммобилизации антигенов на твердой фазе и получения антисывороток;

3) разработать методику определения ТфР для расширения возможностей дифференциальной диагностики анемий;

4) определить аналитические характеристики разработанных тест-систем (специфичность, чувствительность, воспроизводимость, сходимость результатов);

5) оценить клинико-диагностическую значимость определения концентраций витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора в крови и сравнить полученные результаты с данными других аналитических методов;

6) представить методические рекомендации по определению витамина В12, фолатов и гомоцистеина в биологических жидкостях для использования в клинико-диагностической практике.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мамукова, Юлия Иосифовна, Москва

1. Воробьев А.И. Руководство по гематологии, Москва, Ньюдиамед, 2002, т.1,стр. 55-60.

2. Дасон Р.Справочник биохимика,пер.с анг.,Москва, 1996, стр.327.

3. ЕгоровАМ.,Осипов А.П., Дзаитиев Б.Б., Теория и практика Иммуноферментного анализа, Москва, Высшая школа, 1991, стр.35-49.

4. Инструкция по определению общего белка в сыворотке крови по биуретовой реакции, приказ Мин.здр.290 от 11апр. 1972 г

5. Кабанов В.А.,Петров Р.В., Хаитов P.M., Новый принцип создания искусственных иммуногенов, Журн.Всесоюзн. хим. общ-ва им. Менделеева, 1982, 27,4,417-424.

6. Капустин С.И., Блинов М.Н.,Филановская Л.И., Генетические детерминанты наследственной тромбофилии в патогенезе венозного тромбоза., Тер.арх., 2003,10,78-80

7. Ким Б.Б. Физико-химические закономерности взаимодействия пероксидазы хрена с поликлональными и моноклональными антителами. Диссерт. на соискание уч. степ. канд. хим. наук, Москва, 1990 г.

8. Колосова А.Ю. Иммуноферментный анализ антибиотиков и принципы его использования для лекарственного мониторинга и контроля продуктов питания, Диссерт. на соискание уч. степ. канд. хим. наук, Москва, 2000 г.

9. Конопкайте С. Кобаламины, Вильнюс, Мокслас, 1978 г.

10. Реброва О.Ю.Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTDCA, Москва, Медио Сфера, 2002 г.

11. Шевченко О.П.,Олефиренко Г. А., Червякова Н.В., Гомоцистеин, Москва, Реафарм, 2002 г.

12. Andrews N.C, The molecular regulation of iron metabolism. 5-th congressof European. Haemotol. associat., 2000,Birmingham, session 14.

13. Andrews N.C., Levy J.E., Iron is hot: an update on the pathophysiology of hemochromatosis. Blood, 1998,92,1845-1851.

14. Applegarth D.A.,Hardwick D.F., Ingram C.F., et.al., Excretion of S-adenosil-L-homocysteine in homocysteinuria. N.Eng.J.Med. 1971,285, 1265-1268.

15. Bianco I., Mastropietro F., D'Asero C., et.al., Serum levels of eiythropoietin and soluble transferrin receptor in the course of pregnancy in non P-thalassemia and P-thalassemia women. Haemotol., 1994, 79, 6, 493-499.

16. Blount В С, Ames В N, DNA damage in folate deficiency, Baillere's Clinical Haematology, 1995, 8, 3, 461-476.

17. Blount B.C., MackM.M., Wehr C.M., et.al., Folate deficiency causes uracil misincorporation into human DN A and chromosome breakage: implication for cancer and neuronal damage. PNAS USA, 1997, 94, 3290-3295.

18. Brattstrom L.E., Israelsson В., Jeppsson J.O., et.al., Folic acid an innocuous means to reduce plasma homocysteine Scand.J.Clin.Lab. Invest., 1988,48,215-221.

19. Cassola M., Beguin Y., Bergamaschi G., et.al., Soluble transferrin receptor as a potential determination of iron loading in congenital anaemias due to ineffective erythropoiesis. Brit. J. Haemot., 1999,106, 3, 752-755.

20. Castle W.B ., The conquest of pernicious anemia in Wintrobe. Blood and eloquet, New York N Y, McGano-Hill, 1980, 283-317.

21. Chadefaux B, Coude M, Harmet M, AupetitJ., Kamoun P, Rapid determination of total homocysteine in plasma, Clin Chem, 1989, 35, 2002-5.

22. Chanarin J., Deacon N., Lumb M., et.al:,Vitamin В12 regulates folate metabolism by the supply. Lancet, 1980, 2, 505-507.

23. Chanarin J., The megaloblastic anaemies, 1979, Oxford, UK, Blackwell scientific, 4556.

24. Christensen В., Refsum H., Vintermyr O.,et.al., Homocysteine export from cells cultured in presence of physiological or superfluous levels of methionine. J. Cell Biol., 1991, 1, 146-152.

25. Christensen В., Rosenblatt D.C., Effect of folate deficiencyon embryonic development. Bailliere's Clin.Haemot., 1995,8,617-637.

26. Cichwicz D. J., Shane B. Mammalian folypoly-y-glutamate sythetase. Substrate specificity and kinetic properties. Biochemistry, 1987, 26, 513-521.

27. Citro G., Perotti D., Cucco C., Inhibition of leukemia cell proliferation by receptor-mediated uptake of c-myb antisense oligodeoxynucleotides. PNAS USA, 1992, 89, 7031-7035.

28. Clarke R, Evans J.G.,Schneede J.,et. al., Vitamin B12 and folate deficiency in later life. Age and ageing, 2004, 33, 34-41.

29. Clarke R and Stansbie D. Assessment of homocysteine as a cardiovascular risk factor in clinical practice. Ann Clin Biochem, 2001, 38,624-632.

30. Clarke R., Smith A.D., Jobst K.A., et.al., Folate,- vitamin B12 and serum total homocysteine levels in confirmed Alzheimer disease., Arch Neurol., 1998, 55, 14491455.31. d'Angello A., Selhud J., Homocesteine and thrombotic disease, Blood, 1997,1,1-11.

31. Daley S., Mills J.L., Molley A.M., et.al., Minimum effective dose of folic acid for food fortification to prevent neural tube defects. Lancet, 1998; 350, 1666-1669.

32. Den Heijer M., Koster Т., Blom H.J., et.al., Hiperhomocysteinemia as a risk factor for deep vein thrombosis. N.Engl.J.Med., 1996, 334,759-762.

33. Di Minno G., Davi G., Margaglione M., Abnormally high thromboxane biosyntesis in homozygous homocystinuria. J. Clin. Invest., 1993, 92, 1400-1405.

34. Didman N.P.B., Wileken D.E.L., Wang J., et.al., Disordered methionine homocysteine metabolism in premature vascular disease., Arterioscl., Thromb., 1993, 13, 1253-1258.

35. Engel W.D., Khana P.L., Effective method of receaving conjgates for immunoassay., J.Immun.Meth., 1992, 150, 1-2, 99-102.

36. Ferguson B.J., SkikneB.S., Simpson K.M., et.al., Serum transferrin receptor distinguishes the anemia of chronic disease from iron deficiency anemia., J.Lab.Clin.Med., 1992, 19, 385-390.

37. Fermo I, De Vecchi E, Arcelloni С et al, Methodological aspects of total plasma homocysteine measurement, Haematologica, 1997,82,246-250.

38. Finkelstein J.D., Kyle W.E., Martin J.J., et.al., Activation of cystathione syntase by adenosylmethionine and adenosylthionine., Biochem.Biophys.Res.Commun.,1975, 66,81-87.

39. Fiskenrstrand T, Refsumm H, Kvalheim G, UelanP M, Homocysteine and other thiols in plasma and urine: automated determination and sample stability,Clin Chem, 1993, 39, 263-71.

40. Fleming R.E., Ahmann J.R., MigesM.C., et.al., Targeted mutagenesis of the murine transferrin receptor-2 gene produces hemochromatosis., PNAS USA, 2002, 99, 16, 10653-10658.

41. Flowers C.H., Skikne B.S., Covell A.M., The clinical measurement of serum transferrin receptor., J.Lab.Clin. Med.,1989, 114,368-377.

42. Fowler В., Kraus J., Packman S., et.al., Homocystinuria: evidance for there distinct classes of cysthathionine-P-syntase mutant in cultured fibroblasts., J.Clin.Invest., 1978, 61,645-653.

43. Frantzen F., Faaren A.L., Altheim J., Enzyme conversation immunoassay for determining total homocysteinein plasma or serum., Clin.Chem., 1998, 44, 311-316.

44. Frenkel E.P., Abnormal fatty acid metabolism in peripheral nerves of patients with pernicious anemia., J.Clin.Invest., 1973,52,1237-1245.

45. Friguet В., Chatfote A.F., Djavadi-Ohaniance A. et.al., Measurements of true affinity constant in solution antigen-antibody complexes by enzyne-linked immunosorbent assay., J. Immun.Meth., 1985, 77,305-319.

46. Frosst P., Blom H.J., Milos R., et.al., A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in MTHFR:, Nat.Gen., 1995, 10, 111-117.

47. Frost Т., Blom H.J., Milos R., et.al., A common genetic risk factor for vascular disease, Am.J.Hum.Genet., 1995, 58, 35-41.

48. Georqiet M.K., Berry S.A., Wobken J.D., Increased placental iron regulatory protein-1 expression in iron deficiency., Placenta, 1999, 20, 1, 87-93.

49. Glueck C.J., Shaw P., LangJ.E., et.al., Evidence that homocysteine is independent riskfactor for atherosclerosis in hyperlipidemic patient., Am.J.Cardiol., 1995,72,132-137.

50. Green R, Joshua W., Miller O., Folate deficiency beyond megaloblastic anemia: hyperhomocysteinemia and other manifestations of dysfunctional folate status., Semin. In Hematol., 1999,36,1,47-64.

51. Green R., Metabolite assays in cobalamin and folate deficiencies., Baillieres Clin. Haemot., 1995, 8, 533-566.

52. Harding C.O., Georgianne A., Lewis A.B., et.al;, Functional methionine synthase deficiency due to cblG disorder: a report of two patients and a review. , Am.J.Med.Genet., 1997,71,384-390.

53. Hash R.B., Sargent M.A., Katner H:, Anemia secondary to combined deficiencies of iron and cobalamin., Arch. Fam.Med., !996, 5, 585-588.

54. Herbert V., Folic acid in Modern nutrition in health and disease, Philadelphia P. A., 1999,434-446.

55. Herbert V., Protecting millions of elderly from early morbility., Blood, 1999,93,125128.

56. Herbert V., The assay and nature of folic acid activity in human serum., J. Clin.Invest., 1961,40,81-91.

57. Herbert V., Zalusky R., Interrelation of vitamin В12 and folic acid metabolism: folic acid clearance studies., J.Clin.Invest., 1962,41,1263-1276.

58. Hibbard E.D., Smithells R.W., Folic acid metabolism and human embryopathy., Lancet, 1965, 1, 1254-1258.

59. Hoffbrand A.V., Herbert V., Nutriotional anemias. Seminars in Hematol., 1999, 36,4, 13-23.

60. Hyland K., Smith J., Bottiglieri Т., et.al., Demyelination and decreased S-adenosylmethionine in 5,10-MTHFR deficiency., Neurology, 1988, 38,459-462.

61. Iacopetta B.J., Morgan E.H., YeohG.C.T., Transferrin receptor and iron uptake during erythroid cell development., BBA, 1982, 687, 204-210.

62. Ingram C.F., Davidoff A.N., Marais E., Evalution of DNA analysis for evidence of apoptosis in megaloblastic anaemia., Br.J.Haemot., 1997, 96, 576-583.

63. Kang S.S., Passen E.L., Ruggie N., et.al., Thermolabile defect in MTHFR in coronary artery disease., Circulation, 1993,88,1463-1469.

64. Kang S.S., Wong P.W.K., Susmano A., et.al., Thermolabile MTHFR: an wherited risk factor for coronary artery disease., Am.J.Hum.Genet., 1991,48,536-540.67

Информация о работе

Мамукова, Юлия Иосифовна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Иммуноферментные тесты определения витамина B12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора в гематологической практике - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы